التصور والقياس لتزاوج قواعد الحمض النووي الريبي بين الجزيئات في مجموعات RNA في المختبر باستخدام مراسلي RNA مقسمين للبروكلي

Summary

يصف هذا البروتوكول اختبارا بصريا باستخدام مراسلي RNA مقسمين للبروكلي لاكتشاف وقياس اقتران القواعد بين الجزيئات في مجموعات RNA في المختبر.

Abstract

يمكن أن يحدث تجمع الحمض النووي الريبي، المدفوع بتفاعلات RNA وRNA متعددة الجزيئات، في المختبر في غياب البروتينات. بينما تم استخدام الاستطلاع الكيميائي والمحاكاة الحسابية للتنبؤ بهذه التفاعلات، لا تزال طرق التقييم المباشر لاقتران القواعد بين الجزيئات في مجموعات الحمض النووي الريبي محدودة. تقدم هذه الدراسة اختبارا بصريا يعتمد على مراسلين من RNA البروكلي المنقسم ومرتبطين برنا RNA موسوم بالفلورية محل الاهتمام. يتيح الاختبار الكشف وقياس التزاوج القاعدي بين الجزيئات في عناقيد الحمض النووي الريبي. يحتوي نظام البروكلي المنقسم على تسلسلات مراسل مكملة تتغير لتشكيل حمض البروكلي RNA aptamer. يرتبط الهيكل الناتج بالحمض النووي الريبي الثنائي DFHBI-1T، وهو فلوروفور يصدر فلورة خضراء عند الربط. عند تجميع الحمض النووي الريبي، يظهر ظهور الفلورة الخضراء تقارن قواعد يتم توسيطه بواسطة تسلسلات المراسلين التكميلية بين الحمض النووي الريبي المعني. يمكن قياس فلورة DFHBI-1T من التقييم الكمي لكيفية تأثير ظروف تجمع الحمض النووي الريبي في المختبرات على اقتران القواعد بين الجزيئات بين هذه التسلسلات.

Introduction

يمكن للحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر أن يتجمع نفسه إلى مجموعات مرئية عند إضافة الأملاح ومواد التكدس^{الجزيئي} 1,2,3,4,5. ومن الجدير بالذكر أن هذه التجمعات يمكن أن تتشكل في غياب مكونات خلوية أخرى، بما في ذلك البروتينات، مما يشير إلى أنه تحت ظروف محددة، تكون التفاعلات بين الجزيئات بين RNA وRNA كافية لدفع تكاثف RNA في المختبر.

من بين أنواع التفاعلات بين الجزيئات بين RNA–RNA، حظي اقتران القواعد بين الجزيئات باهتمام كبير في حقل المكثفات 1,2,4,6,7,8,9,10. يمكن أن تدفع هذه التفاعلات بواسطة تسلسلات مكملة مكشوفة ("رموز بريدية") بين النسخ المكتوبة، كما يتضح من خلال التجميع المشترك بين mRNA من BNI1 وSPA2 في الفطر الخيطي Ashbya gossypii² أو قليلة الحمض النووي الريبي الأوسكار في ذبابة الفاكهة ^6,7. بدلا من ذلك، يمكن تعزيز اقتران القواعد بين الجزيئات من خلال إعادة تشكيل البنى الثانوية للحمض النووي الريبي، مما يكشف عن تسلسلات مكملة تكون متدمجة هيكليا في الخارج. لوحظت هذه الآلية في الحمض النووي الريبي المتكرر في سيلكو⁹ وريبوسويتشات الجوانيدين في المختبر¹⁰. يمكن قياس كل من التسلسلات التكميلية المكشوفة وإعادة تشكيل هيكل الحمض النووي الريبي باستخدام الاستقصان الكيميائي ^11,12 أو أساليب المحاكاة 4,9,13,14. ومع ذلك، لا تزال الطرق التي تصور مباشرة اقتران القواعد بين الجزيئات في اختبارات تجميع الحمض النووي الريبي في المختبر محدودة.

اختبارات سحب الحمض النووي الريبي باستخدام روابط متقاطعة القاعدة 15,16,17 والرحلان الكهربائي الهلامي ^4,6,7 تستخدم عادة لدراسة اقتران قواعد الحمض النووي الريبي بين الجزيئات في المختبر. ومع ذلك، تفتقر هذه الطرق إلى الدقة المكانية لتمييز اقتران القواعد داخل المجموعات عن تلك التي خارجها. علاوة على ذلك، يعد عزل عناقيد الحمض النووي الريبي للتحليل اللاحق تحديا تقنيا، لأنه يتطلب الحفاظ على استقرار العنقود مع ضمان توافق المخزن المؤقت مع الاختبارات اللاحقة.

تم استخدام اختبار بصري يعتمد على مراسلي RNA بروكلي^{منقسمين 18} مرافق مع RNA موسوم بالفلورية محل الاهتمام سابقا لتمكين الكشف المباشر عن اقتران القواعد بين الجزيئات أثناء تكثف RNA في المختبر⁴. في هذا السياق، يبلغ نظام بروكلي المنقسم عن احتمالية حدوث تفاعلات بين جزيئات بين المراسلين أو بين الحمض النووي الريبي الذي يحملهم تحت ظروف التجمع المختبرية المحددة. لذا، يفحص الاختبار كيف تؤثر سياق التسلسل والعوامل البيئية على الميل إلى اقتران القواعد بين الجزيئات ضمن بيئة شبيهة بعنقود RNA.

يتكون نظام البروكلي المنقسم من سلسلتين مكملتين من RNA، الأعلى والأسفلي، اللذان يتزايجان لإعادة تكوين جهاز الحمض النووي الريبي للبروكلي (الأشكال 1A–C)¹⁸. عند الازدواج، يرتبط الأبتيمر بالفلوروفور DFHBI-1T، مما ينتج عنه فلورة خضراء (الأشكال 1A–C)¹⁸. باستخدام هذا النظام، يظهر مدى اقتران القواعد بين الجزيئات بين تسلسلات المبلغين التكميلية داخل مجموعات RNA يعتمد على طي RNA. من خلال مقارنة نسبة تألق DFHBI-1T إلى مستويات الحمض النووي الريبي عبر ظروف تجريبية مختلفة، يمكن تقييم تأثير الظروف المخبرية على اقتران القواعد بين الجزيئات التي يتوسط المبلغون ضمن تجمعات RNA بشكل كمي.

يكمل هذا الاختبار طرق سحب الحمض النووي الريبي والرحلان الكهربائي الهلام لدراسة اقتران القواعد بين الجزيئات في تجمعات الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، قد يتطلب الكشف القوي للإشارة مواد تجمع جزيئية، وتحدد الحساسية بكفاءة الثنائية والطي للحمض النووي النووي الريبي العلوي والسفلي للبروكلي المنقسم.

Protocol

يوفر هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتنفيذ هذا الاختبار ويناقش تطبيقاته. المواد والكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد قوالب الحمض النووي لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر

1. أضف تسلسل منشط T7 إلى نهاية 5′ لكل قالب DNA يحتوي على تسلسلات أبتامر البروكلي المنقسمة لنسخ RNA في المختبر. استخدم تسلسلات البروكلي المنقسمة (الأعلى والأسفل) وحدها أو أدخلها في أي موقع أسفل محفز T7، مع أو بدون تسلسل RNA إضافي محل اهتمام.
   ملاحظة: تسلسلات مروج T7، ومراسلي البروكلي المقسم، والبادئات المستخدمة لتضخيم قوالب الحمض النووي مدرجة في الجدول 1.
   ملاحظة: يفضل بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بشدة بدء النسخ بحرف "G" في موضع +1. وجود Gs إضافية مباشرة أسفل التيار عند المواقع +2 و +3 يمكن أن يزيد من إنتاج النسخ^{بمقدار 19}. ومع ذلك، عندما يبدأ تسلسل التيار السفلي ب G، كما في البنى العليا والسفلية التي تبدأ بحرفي G، يمكن أن يبدأ النسخ في مواقع^{مختلفة 20}. نتيجة لذلك، قد تحمل النسخ صوت G واحد أو اثنان أو ثلاثة في نهاية 5 أقدام (مثل GATCC، GGATCC، أو GGGATCC)، مما قد يؤثر على تفسير اقتران القواعد في البنى المصممة.
2. استخدم كتل جينية مصنعة تجاريا، أو بلازميدات، أو شظايا DNA كقوالب لعلاج PCR. إذا لم يحتوي القالب الأصلي على مروج T7، استخدم تمهيد أمامي مع بروز 5′ T7 مع الأساس العكسي المناسب.
3. تحضير تفاعل PCR بسعة 50 ميكرولتر في أنبوب PCR بسعة 200 ميكرولتر يحتوي على 2.5 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومولار بالبادئات الأمامية والعكسية، وقالب DNA بوزن 20 نانوغرام، وخليط رئيسي عالي الدقة 2× بسعة 25 ميكرولتر، وماء خال من النوكليز. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا واستخدام الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 2 ثوان.
4. تشغيل تفاعل PCR في جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي: 98 °C لمدة 30 ثانية (دورة واحدة)؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، ودرجة حرارة التلدين المثلى ل 30 ثانية، و72 درجة مئوية ل 30 ثانية لكل كيلو قاعدة (35 دورة); 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين (دورة واحدة).
   ملاحظة: حدد درجة حرارة التلدين المثلى باستخدام أداة إلكترونية مثل حاسبة Tm. يمكن تخزين منتجات PCR عند 4 درجات مئوية بعد الانتهاء.
5. اخلط منتج PCR سعة 2 ميكرولتر مع 8 ميكرولتر ماء خالي من النوكلياز و2 ميكرولتر صبغة تحميل 6×. حمل الخليط على جل أغاروز بنسبة 1٪ للرحلان الكهربائي.
   ملاحظة: يجب أن يظهر منتج PCR كنطاق واحد. إذا لوحظت عدة نطاقات، قم بإزالة الشريط الصحيح وتنقيته باستخدام مجموعة استخراج هلام قبل المتابعة.
6. قم بتنقية منتج PCR أو الحمض النووي المستخرج بالجل باستخدام مجموعة تنقية DNA، وسحب الأنبوب في ماء خالي من النوكلياز بسعة 20–30 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
7. قياس تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام مطياف ميكروحجم. تأكد من أن A260/A280 تقريبا 1.8 وA260/A230 أكبر من 2.0.
   ملاحظة: إذا كانت A260/A230 أقل من 2.0، قم بإجراء خطوة تنقية إضافية.
8. خزن قالب الحمض النووي عند −20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تحضير تفاعل نسخ الحمض النووي الريبي في المختبر

1. امسح سطح العمل، ورفوف الأنابيب، والماصات بمحلول إزالة التلوث RNase. استخدم رؤوس مصفاة خالية من RNase.
2. تم تزويد مخزن تفاعل الذوبان ومحاليل النيوكليوتيدات (ATP، CTP، GTP، UTP) المرفقة مع مجموعة النسخ T7، مع UTP-Cy5، على الثلج. قم بالطرد المركزي بجميع الأنابيب بقوة 2000 × جرام لمدة ثانيتين قبل الاستخدام.
   ملاحظة: حماية UTP-Cy5 من الضوء.
3. احسب عدد قواعد الثايمين في قالب الحمض النووي (باستثناء محفز T7) وحدد الأحجام المطلوبة من UTP وUTP-Cy5 لتفاعل نسخ بمقدار 20 ميكرولتر. حافظ على كثافة تصنيف متسقة عبر أنواع الحمض النووي الريبي.
   ملاحظة: على سبيل المثال، لتسمية RNA يحتوي على 100 قاعدة يوراسيل مع حوالي ثلاثة يراسيل موسومة ب Cy5، أضف 4.5 ميكرولتر من 1 مللي مولار UTP-Cy5 و1.9 ميكرولتر من 75 مللي مولار UTP.
4. تحضير تفاعل نسخ بسعة 20 ميكرولتر عن طريق دمج 2 ميكرولتر من كل من ATP وCTP وGTP، وأحجام محسوبة من UTP (جميعها مزودة مع المجموعة) وUTP-Cy5، 2 ميكرولتر 10× مخزن تفاعل، 2 ميكرولتر من إنزيم، 200 نانوغرام قالب DNA، وماء خال من النوكليز. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا واستخدام الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 2 ثانية.
5. حضن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
6. أضف 1 ميكرولتر DNase المرفق مع المجموعة. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا واستخدام الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 2 ثانية.
7. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إضافية.
8. نقل التفاعل (~20 ميكرولتر) إلى أنبوب بسعة 1.5 مل. أضف 115 ميكرولتر ماء خال من النوكلياز و15 ميكرولتر محلول توقف أسيتات الأمونيوم المرفق مع الطقم. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا واستخدام الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 2 ثانية.
   ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة تنقية RNA تجارية بدلا من الخطوات 2.9–3.7.
9. أضف 150 ميكرولتر فينول/كلوروفورم وامزج بلطف.
   تحذير: التعامل مع الفينول/الكلوروفورم في غطاء أبخرة كيميائي.
10. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
11. انقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد.
    ملاحظة: تجنب إزعاج الطور الداخلي؛ قد تبدو الطبقة السفلية زرقاء بسبب الصبغة غير المدمجة.
12. أضف كمية مماثلة من الكلوروفورم وامزج جيدا.
    تحذير: التعامل مع الكلوروفورم في غطاء بخار كيميائي.
13. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
14. كرر الخطوات 2.11–2.13.
15. انقل الطبقة المائية (~100–150 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد. أضف 900 ميكرولتر من إيزوبروبانول وامزج جيدا.
16. أليكوت إلى ثلاثة أحجام متساوية في أنابيب منفصلة.
    ملاحظة: كل أليكوت يكفي لتفاعلات تجمع RNA متعددة.
17. تخزين عند −20 درجة مئوية طوال الليل أو حتى شهر واحد.

3. تنقية الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر

1. قم بطرد الريبي بعينة الحمض النووي الريبي في إيزوبروبانول بحرارة 16,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإزالة الأيزوبروبانول بعناية دون الإخلال بحبيبات RNA.
3. أضف 1 مل من الإيثانول 70٪ محضر في ماء خال من النوكليز.
4. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
5. أزل الإيثانول وكرر الخطوات 3.3–3.4.
6. خلال الغسل النهائي بالإيثانول، قم بإزالة معظم الإيثانول باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر. قم بعمل طرد مركزي لفترة وجيزة بقوة 2000 × جرام لمدة 2 ثانية في جهاز الطرد المركزي المصغر على طاولة وإزالة أي إيثانول متبق باستخدام ماصة بسعة 20 ميكرولتر.
7. جفف حبيبات RNA بالهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين عند درجة حرارة الغرفة (RT).
8. أعد تعليق حبيبة RNA في مياه خالية من النوكلياز بسعة 20 ميكرولتر. احتفظ بالعينة على الثلج وحمها من الضوء.
9. قياس تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف ميكروحجم. تأكد من أن A260/A280 تكون تقريبا 2.0 وأن A260/A230 أكبر من 2.0.

4. تحضير تفاعل تجمع الحمض النووي الريبي في المختبر

ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتطلب تحفيز تجميع الحمض النووي الريبي سبيرمين وPEG 8000، استنادا إلى الدراسات السابقة ^2,4,5. تحديدا، تم جمع محلول مخزون رباعي هيدروكلوريد بسعة 100 ملم من سبيرمين في ماء خال من النوكلياز إلى عدة أنابيب طرد مركزية دقيقة بسعة 1.5 مل وتم تخزينه عند −20 درجة مئوية.

1. قم بإذابة أنبوب يحتوي على محلول سبيرمين بسعة 100 ملليمول و50٪ من PEG 8000 على الثلج.
   ملاحظة: بعد الفتح، يجب استخدام 50٪ من PEG 8000 لمدة لا تزيد عن شهرين بسبب احتمال تدهورها.
2. لتحضير 500 ميكرولتر جديد مصنوع 10× RNA لإعادة طي، اجمع 50 ميكرولتر 2M KCl و50 ميكرولتر 1M MgCl₂ و50 ميكرولتر 1M Tris (درجة حموضة 7.0)، و350 ميكرولتر ماء خال من النوكليز. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنبوب لأعلى وأسفل. الطرد المركزي بقوة 2000 × جرام لمدة 2 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة.
   ملاحظة: يجب تجهيز مخزن إعادة الطي في يوم تجربة تجميع الحمض النووي الريبي.
   ملاحظة: تعتمد الخطوات 4.3-4.4 على ظروف التجربة ويمكن تعديلها حسب الحاجة. يتم شرح حالتين مثاليتين لتجميع الحمض النووي الريبي المستخدمة في هذه الدراسة أدناه. تم تكييف حالة الطي المشترك من طريقة تستخدم لتلدين الأوليجونكليوتيدات المضادة للحس إلى RNA². في هذه الطريقة، يتم خلط الحمض النووي الريبي في مخزن ملحي وتسخينها معا لتعزيز اقتران القواعد بين الجزيئات الريبية الحاملة لتسلسلات مكملة. على النقيض من ذلك، في حالة الطي المنفصلة، يتم طي كل RNA بشكل فردي قبل الخلط. تهدف هذه الحالة إلى تقريب سيناريو خلوي يتم فيه طي الحمض النووي الريبي قبل التفاعل.
3. الطي المشترك
   ملاحظة: تعزز هذه الحالة اقتران القواعد بين الجزيئات بين الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على التسلسلات العليا والسفلية . يعمل كضابط إيجابي لاقتران القواعد بين الجزيئات المدفوع بالمراسل تحت حالة تجميع الحمض النووي الريبي.
   1. في أنبوب PCR بسعة 200 ميكرولتر، اجمع 16 ميكرولتر من كل RNA منسخ في المختبر يحمل إما تسلسلا علويا أو سفليا ، و2 ميكرولتر من 10× مع إعادة طي RNA، وماء خال من النوكلياز إلى حجم نهائي 14 ميكرولتر. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بالمصاصات صعودا وهبوطا. الطرد المركزي بقوة 2000 × جرام لمدة ثانيتين في جهاز الطرد المركزي المصغر على الطاولة.
      ملاحظة: لحساب كتلة RNA المقابلة ل 16 بيكو مول.
   2. سخن عينة الحمض النووي الريبي على درجة حرارة 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
   3. انقل العينة فورا إلى RT وحميها من الضوء. حضن التفاعل عند RT لمدة ساعة واحدة.
4. الطي المنفصل
   1. سخن عينة الحمض النووي الريبي على درجة حرارة 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم ضعها فورا على الثلج لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
   2. في أنبوب PCR بسعة 200 ميكرولتر، اجمع 16 بيمولتر من RNA منسوخ في المختبر يحمل إما تسلسلا علويا أو سفليا ، و1 ميكرولتر من 10× مع إعادة طي RNA، وماء خال من النوكلياز إلى حجم نهائي 7 ميكرولتر.
      ملاحظة: لحساب كتلة RNA المقابلة ل 16 بيكو مول.
   3. حضن التفاعل عند RT لمدة 30 دقيقة، محميا من الضوء.
   4. ادمج عينات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على التسلسلات العليا والأسفلية في أنبوب PCR واحد. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنبوب لأعلى وأسفل. الطرد المركزي بقوة 2000 × جرام لمدة ثانيتين في جهاز الطرد المركزي المصغر على الطاولة. حضن التمارين في RT لمدة 30 دقيقة.
5. أضف 6 ميكرولتر من خليط 1:2 (v/v) يحتوي على 100 ملليمول سبيرمين و50٪ PEG 8000. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنبوب لأعلى وأسفل. الطرد المركزي بقوة 2000 × جرام لمدة 2 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة.
   ملاحظة: 50٪ PEG 8000 لزجة جدا. بيبيتي ببطء وحذر.
6. أضف 2 ميكرولتر من 1 مللي مولار DFHBI-1T إلى التفاعل. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنبوب لأعلى وأسفل. الطرد المركزي بقوة 2000 × جرام لمدة 2 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. يجب أن يظهر التفاعل بلون الأصفر والأخضر.
   ملاحظة: لتحضير محلول مخزون DFHBI-1T بسعة 20 ملليمول من 1 ملغ من صبغة DFHBI-1T (ميغاوات: 320.21) المصنوعة من الليوفيل، أضف 156 ميكرولتر من DMSO اللامائي بدرجة علم الأحياء الجزيئي. أليكوت المخزون بكميات صغيرة في عدة أنابيب طرد مركزي دقيق وخزن في -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة للصبغة. حضر محلول عمل مخفف حديثا بسعة 1 مللي مول DFHBI-1T عن طريق تخفيف مخزون 20 ملليمول في ماء خال من النوكلياز وتخزينه على الثلج.
7. حمل التفاعل في زجاج زجاجي بغرف زجاجية.
8. حضن الحجرة عند RT لمدة 4 ساعات في الظلام مع وضع الغطاء لتقليل التبخر.

5. التحضير للتصوير

1. التقاط صور ثلاثية الأبعاد باستخدام مجهر إضاءة منظم أو مجهر كونفوكال مزود بأشعة ليزر وأهداف مناسبة.
   ملاحظة: يتطلب الأمر المجهر الكونفوكالي لتقليل الضوء غير الواضح.
2. قم بتكوين المجهر لتصوير كل منطقة ذات اهتمام (ROI) باستخدام قناة Cy5 أولا عند كل مستوى z، ثم تصوير نفس العائد على الاستثمار باستخدام قناة GFP.
3. اضبط وقت التعريض إلى 500 مللي ثانية لجميع القنوات. اضبط طاقة الليزر على 80٪ ل GFP و40٪ ل Cy5.
4. تخيل منطقة انزلاق غطاء خارج قطرة التفاعل عند RT باستخدام حجم خطوة z 150 نانومتر.

6. قياس اقتران القواعد بين الجزيئات

1. استيراد الصور إلى برنامج تحليل الصور²¹. تحديد قنوات GFP (DFHBI-1T) وCy5 (RNA).
2. ارسم عائد على الاستثمار بمقدار 5 × 5 بكسل داخل عنقود RNA وقس الكثافة المتكاملة لكلا القناتين على نفس مستوى z. اختر 5–8 عوديات ROI من مجموعات RNA مختلفة في كل صورة.
   ملاحظة: قم بضبط حجم العائد حسب إعداد الكاميرا، لكن حافظ على الاتساق عبر التجارب.
3. اختر 5–8 عائد على المؤشرات خارج قطرة التفاعل لقياس الخلفية وحساب متوسط الكثافة المتكاملة لكلا القناتين.
4. احسب شدة DFHBI-1T الموحدة لكل عائد استثمار باستخدام:
   

7. المشاكل الشائعة وحل المشكلات

1. إذا لم يلاحظ وجود حبيبات RNA بعد الطرد المركزي، فكر في تحلل RNA، وقت النسخ غير الكافي، البوليميراز غير النشط، الأملاح المتبقية، أو انخفاض تركيز RNA. استخدم كواشف خالية من RNase، ومدد وقت النسخ، واستخدم إنزيم جديد، وقم بتنقية القوالب.
2. إذا لم تلاحظ أي عناقيد RNA موسومة ب Cy5، فكر في تحلل RNA أو تحلل PEG 8000 أو UTP-Cy5. استخدم كواشف جديدة وظروف خالية من RNase.
3. إذا لم تلاحظ إشارة DFHBI-1T تحت ظروف الطي المشترك، فكر في جودة الصبغة الرديئة، أو نقص تكوين بنية البروكلي، أو النسخات المقطوعة. استخدم صبغة جديدة، وتأكد من تركيب المخزن المناسب، وتحقق من حجم النسخة بواسطة تحليل الجل.
4. إذا كانت إشارة الفلورة تبييض، قلل من طاقة الليزر ووقت التعرض، وقلل خطوات التصوير، وحماية العينات من الضوء أثناء الحضانة.

Results

في هذه التجربة التوضيحية، تم تقييم قدرة مراسلي الحمض النووي الريبي العلوي والسفلي وحدهم على الاقتران القاعدي وتشكيل بنية البروكلي أولا باستخدام بروتوكول تجميع الحمض النووي الريبي المضغوط في المختبر ⁴ الذي وصف سابقا. الاقتران القاعدي بين الأعلى والأسفل يولد ذراعين من البروكلي، كل منهما قادر على تداخل جزيء DFHBI-1T واحد (الأشكال 1A–C)^18,22.

عند تحفيز تجمع الحمض النووي الريبي مع السپرمين وPEG 8000، تشكل كلا الرنا تجمعات إما بشكل فردي أو معا (الأشكال 1D–Eii). عند فحص الحمض النووي الريبي العلوي أو السفلي بمعزل عن بعض، كان فلورة DFHBI-1T داخل مجموعات الحمض النووي الريبي أقل بكثير من حالة الطي المتزامن، حيث تم دمج الريزان قبل إزالة الطبيعة بالحرارة وإعادة الطي (الشكل 1F). في حالة الطي المشترك، قدرت النسبة المولية ل DFHBI-1T (0.1 ميليمتر) إلى الأعلى (0.8 ميكرومتر) والأسفل (0.8 ميكرومتر) ب 125:1:1. وهذا يعادل فائضا يقارب 62.5 ضعف من DFHBI-1T بالنسبة لأقصى عدد ممكن من هياكل البروكلي.

إشارة DFHBI-1T المنخفضة ولكن غير الصفرية التي لوحظت فقط في الأعلى والأسفل تتوافق مع تقارير سابقة أظهرت تألجا منخفضا جدا من DFHBI-1T عندما يعبر عن كل مراسل بشكل فردي¹⁸. كما أظهر DFHBI-1T تألق خلفية منخفض جدا لكنه قابل للكشف في غياب الحمض النووي الريبي (الشكل 1F). تظهر هذه النتائج معا أن DFHBI-1T متوافق مع اختبار تجميع الحمض النووي الريبي الخام في المختبر ، وأن الطي المشترك يعزز اقتران القواعد بين الحمض النووي الريبي العلوي والسفلي .

بعد التطبيع إلى شدة الحمض النووي الريبي، وصلت شدة الفلورة DFHBI-1T المتطابعة في حالة الطي المشترك إلى 1.03، وهو أعلى بشكل ملحوظ من شدة الأعلى والأسفل وحدهما (0.054 و0.023 على التوالي) (الشكل 1D، الشكل 1Ei، والشكل 1F). ثم تم فحص تجمعات RNA التي تشكلت من خلط RNA العلوي والسفلي والتي تم طيها بشكل منفصل قبل التجميع (الشكل 1D، الشكل 1Eii، والشكل 1F). في هذه الحالة المنفصلة للطي، كانت إشارة DFHBI-1T المطبعة 0.031، مماثلة لمستويات الأساس التي لوحظت في الضوابط السلبية (الأعلى أو الأسفل فقط) (الشكل 1F). تشير هذه النتائج إلى أن الطي المشترك يعزز اقتران القواعد بين الحمض النووي الريبي العلوي والسفلي، بينما يقيد الطي المنفصل مثل هذه التفاعلات.

تم إدخال التسلسلات العليا والسفلية بعد ذلك في المنطقة غير المترجمة (UTR) بحجم 3′ لإغلاق ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر (shu)، وهو mRNA حبيبي جرثومي ^4,23,24، ونظيره المضاد (shu^anti). تم اختيار UTR شوي 3′ لأن أعمالها السابقة أظهرت أن هذا الحمض النووي الريبي موجود بشكل رئيسي كمونومر في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ولا يتلاشى حتى عند تركيزات مولية عالية في اختبارات جل الحمض النووي^{الريبي 4,24}. بالإضافة إلى ذلك، لا يشكل شو-توب وشو-بوتوم هومويدايمرات في هلام RNA⁴، مما يسمح بتقييم أكثر مباشرة للتفاعلات بين الجزيئات بين الأعلى والسفلي وتأثير تسلسلات الالتفاف المشتقة من شو.
قوالب الحمض النووي لشو-توب، شو-بوتوم، شو^مضاد للتوب، و شو^مضاد للأسفل مدرجة في الجدول 2. تم إدخال التسلسلات العليا والسفلية في منتصف ال shu أو ^{شو anti} 3′ UTR، مما تطلب إعادة تشكيل هيكلية لتسهيل التفاعل ومحاكاة تفاعلات RNA الفسيولوجية بشكل أفضل، حيث تكون المناطق المتفاعلة عادة ما تدمج ضمن النصوص⁴.

عند تحفيز تجمع الحمض النووي الريبي، أظهرت كل واحدة من الشوا-توب، شو-بوتوم، ^{شوا مضاد} الأعلى، وشوا^{المضادة} للقاع بشكل فردي فلورة DFHBI-1T، مشابهة للأعلى والسفلي فقط (الأشكال 2A و2B). بشكل مستمر، كان طي شو-توب مع شو-بوتوم أو شو ^مضاد للتوب مع شو^مضاد القاع ينتج إشارة DFHBI-1T أعلى من الطي المنفصل (الأشكال 2Ci و Cii). بعد التطبيع إلى شدة RNA والتحكم السلبي (التعريف بأنه متوسط إشارة DFHBI-1T الطبيعية من كل RNA فقط)، أدى طي شو-توب وشو-بوتوم إلى زيادة بنسبة 5.63 ضعف في فلورة DFHBI-1T الطبيعية (الأشكال 2Di و 2Dii). في المقابل، أظهر الطي المنفصل زيادة بمقدار 1.04 ضعف فقط، مماثلة للمستويات الأساسية التي لوحظت للشو-توب والشو-بوتوم بشكل فردي. لوحظت اتجاهات مماثلة لشوا^مضاد للقمة وشو^مضاد للأسفل تحت ظروف طي مشترك وطي منفصل (الأشكال 2Di و 2Dii). تشير هذه النتائج إلى أن الطي المنفصل لا يعزز اقتران القواعد بين الشوا-توب والشو-بوتوم أو شو^مضاد للتوب وشو^مضاد للقاع، بينما يعزز الطي المشترك هذه التفاعلات، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تسلسلات المبلغات المدرجة.

لاختبار ما إذا كان شو ^{وشو مضاد} العلبة يتوافقان مع القاعدة القوة، تم خلط شو-توب مع شوا^مضاد للبوتوم، وشو^مضاد للتوب مع شو-بوتوم. أظهرت كلتا التركيبتين فلورة DFHBI-1T أعلى تحت ظروف الطي المشترك والطي المنفصل مقارنة بشو-توب مع شو-بوتوم أو شوا^مضاد للسطح مع شو-بوم مضاد للأسفل (الأشكال 2Ci و 2Cii). بعد التطبيع، أدى طي شو-توب مع شوا^مضاد القاع وشو^مضاد للتوب مع شو-بوتوم إلى زيادة بمقدار 61.86 و82.60 ضعف في فلورة DFHBI-1T على التوالي (الأشكال 2Di و 2Dii). في المقابل، أدى الطي المنفصل إلى زيادة بمقدار 2.69 و4.94 طية فقط على التوالي (الأشكال 2Di و 2Dii). على الرغم من أن هذه القيم كانت أقل بكثير من ظروف الطي المشترك، إلا أنها كانت أعلى من تلك التي لوحظت في الشو-توب مع شو-بوتوم أو شوا^مضاد للتوب مع شو^مضاد القاع (1.04 و1.16 على التوالي).

تشير هذه النتائج معا إلى أن المراسلين الذين يحملون تسلسلات مكملة إضافية لديهم قدرة أكبر على الاقتران القاعدي مقارنة بمن لا يملكون مثل هذه التسلسلات. ويعزز هذا التأثير أكثر تحت شرط الطي المشترك، الذي يعزز التفاعلات بين الجزيئات.

الشكل 1: التبنى الثانوية المتوقعة للحمض النووي الريبي العلوي والسفلي وقياس اقتران القواعد بين الجزيئات في عناقيد الحمض النووي الريبي في المختبر. (أ–ب) أمثلة على هياكل ثانوية من الأعلى (A) والأسفل (B) مطوية بشكل فردي، كما تنبأ بها RNAfold²⁵. عند طيها بشكل منفصل، لا يعيد تشكيل الأبتامر البروكولي، وتنتج DFHBI-1T (النجم الرمادي) فلورة قليلة. (ج) مثال على البنية الثانوية للحمض النووي الريبي العلوي والسفلي المزدوج القاعدي، كما تنبأ به RNAcofold²⁵. يعيد اقتران القواعد بين الحمض النووي الريبي الجزيئيين تشكيل ذراعين للبروكلي¹⁸، مما يمكن من ارتباط DFHBI-1T وينتج عنه فلورة خضراء قوية (نجوم خضراء). (د) صور ل DFHBI-1T وحده (التحكم بالصبغة فقط) ومجموعات RNA في المختبر (الأرجواني) التي تشكلت بواسطة RNA العلوي والسفلي في وجود DFHBI-1T (الأخضر). (Ei, ii) تجمعات RNA في المختبر (ماجنتا) تتكون من RNA العلوي والسفلي تحت ظروف طي مشترك (i) وطي منفصل (ii) في وجود DFHBI-1T (الأخضر). بالنسبة لللوحين D وE، تم تصنيف الحمض النووي الريبي ب Cy5 بحيث يحتوي حوالي ثلث الحمض النووي الريبي على يوراسيل واحد موسوم ب Cy5، بينما الثلثان المتبقيان غير معنون. تمثل الصور متوسط إسقاطات Z ل 27 شريحة تم الحصول عليها بحجم خطوة 150 نانومتر، باستخدام نفس التعريض وقوة الليزر لكل قناة عبر جميع الظروف. تم تطبيع فلورة DFHBI-1T إلى نفس نطاق الشدة عبر الظروف. أشرطة المقياس: 2 ميكرومتر (F) تم تطبيع شدة DFHBI-1T إلى وفرة RNA، كما تم قياسها بواسطة فلورة Cy5. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM. قيم P لاختبار t ذو الذيلين (**** مقابل طي مشترك): 1.0 × 10⁻²² (صبغة فقط)، 2.3 × 10⁻²² (الأعلى)، 4.9 × 10⁻²³ (الأسفل)، و7.0 × 10⁻²³ (طي منفصل). n = 30 منطقة للحالة التي تعتمد فقط على الصبغة و30–31 تجمعا RNA لجميع الحالات الأخرى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: صور تمثيلية وقياس اقتران القواعد بين الجزيئات لمراسلي الحمل العلوي والسفلي لشوا ^{وشوا المضاد}. (أ) صور ل DFHBI-1T وحده (التحكم بالصبغة فقط) ومجموعات RNA في المختبر (الأرجواني) التي تتكون من RNA شو-توب، شو-بوتوم، ^{شو مضاد} للتوب، وشو^مضاد للقاع في وجود DFHBI-1T (أخضر). تم تصنيف الحمض النووي الريبي ب Cy5 بحيث تم دمج ثلاث يوراكيلات UTP-Cy5 في المتوسط أثناء النسخ الصناعي. تمثل الصور متوسط إسقاطات Z ل 27 شريحة تم الحصول عليها بحجم خطوة 150 نانومتر، باستخدام نفس التعريض وقوة الليزر لكل قناة عبر جميع الظروف. تم تطبيع فلورة DFHBI-1T إلى نفس نطاق الشدة عبر الظروف. أشرطة الميزان: 2 ميكرومتر (B) تم تطبيع شدة DFHBI-1T إلى وفرة RNA، كما تم قياسها بواسطة فلورة Cy5. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM. n.s.، غير ذات دلالة. قيم P لاختبار t ذو الذيلين (مقابل الصبغة فقط): 3.1 × 10⁻³ (**; SHU-top)، 1.7 × 10⁻¹ (NS؛ شو-بوتوم)، 2.9 × 10⁻³⁵ (***؛ شو^مضاد للتوب)، و2.2 × 10⁻² (; شو^ضد القاع). n = 30 منطقة لحالة الصبغ فقط و30–32 مجموعة RNA لجميع الحالات الأخرى. (Ci, ii) صور لتجمع RNA في المختبرات (الأرجواني) التي تتكون من خلط شو-توب مع شو-بوتوم، شو-أي-توب مع شو^مضاد القاع، شو-توب مع شو^مضاد القاع، وشو^مضاد للتوب مع شو-بوتوم في وجود DFHBI-1T (أخضر) تحت الطي المشترك (i) وطي منفصل ( ii) الشروط. تمثل الصور متوسط إسقاطات Z ل 27 شريحة تم الحصول عليها بحجم خطوة 150 نانومتر، باستخدام نفس التعريض وقوة الليزر لكل قناة عبر جميع الظروف. بالنسبة للنطاق المنخفض، تم تطبيع فلورة DFHBI-1T إلى نفس نطاق الشدة كما في الشكل 1D–Eii والشكل 2A. بالنسبة للنطاق العالي، تم تطبيع فلورة DFHBI-1T إلى نطاق شدة أعلى ولكن ثابت عبر جميع الظروف في لوحات Ci و Cii. أشرطة المقياس: 2 ميكرومتر (Di, ii) تم تطبيع شدة DFHBI-1T أولا إلى شدة RNA ثم إلى نقاط التحكم السلبية، وتعرف بأنها الإشارة المتوسطة المطبعة DFHBI-1T من كل RNA فقط. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM. n.s.، غير ذات دلالة. (i) قيم P لاختبار t ذو الذيلين (**** مقابل shu-top + shu-bottom): 1.1 × 10⁻³¹ (شو^مضاد للقمة + شو^مضاد القاع)، 1.1 × 10⁻²² (شو-توب + شو^مضاد القاع)، و4.3 × 10⁻²⁷ (شو^مضاد للقمة + شو القاع). (ii) قيم P لاختبار t ذو الذيلين (مقابل shu-top + shu-bottom): 2.2 × 10⁻¹ (n.s.; شو^مضاد للقمة + شو^مضاد للقاع)، 1.9 × 10⁻⁹ (; شو-توب + شو^مضاد للقاء)، و1.3 × 10⁻¹⁵ (؛ شو^مضاد للأعلى + شو القاسي). n = 29–32 تجمعات RNA لجميع الظروف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الاسم	التسلسلات (5′-3′)
مروج T7	TAATACGACTCACTATAG
الأعلى	GGATGATGGAGACGGTCGGGTC كاغاتكاتكاتكاغاك GGTCGGGGCAGATGATGCGGAT
الأسفل	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCAACTACTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
مهاجم T7 في القمة	TAATACGACTCACTATAG GGATGATGGAGACGGTCG
العلوية-الخلفية	ATCCGCATCATCTGGACCC
المسار السفلي T7 للأمام	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCTGTGTCGA
الأسفل إلى الخلف	GGATGATGGAGCCCACACT
تحتوي البادئات الأمامية على بروز تسلسل مروج T7 (مكتوب بالخط العريض)، يليه تسلسلات تستهدف نهاية 5 أقدام من RNA.

الجدول 1: تسلسلات من محفز T7، ومراسلي بروكلي مقسم، وبادئات تستخدم لتضخيم قوالب الحمض النووي لنسخ T7. تم استخدام البادئات المدرجة لإنشاء قوالب DNA لنسخ العينات الرنوية العلوي والسفلي في المختبر، والتي استخدمت لاحقا في اختبارات تجميع الحمض النووي الريبي الموصوفة في هذه الدراسة.

الاسم	التسلسلات (5′-3′)
شو-توب	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATCATATTCTTACTCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGGCCAGGATCATTGGCAAGAGACGGTCGGGTCAGATGATGCGGA تاااكاتاكاتغاا AGTTATTCGATATTAGCAACATGAATATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAACCACAATAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
شو-بوتوم	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATATCATCATATATCATTACTCAAAAAAGGATCCGCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCATGTGTGTGTGTCAACCCACATACTGATG ATCCTGTGAGTAGAGTGTGGGCTCATCATCCAAAAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGAGTATCATTAGTTATCGATATATATCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTTTTAA AAACCACAATAAAAGTAATGCACCGGCAGCTACAT
شومضاد للسقف	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTAACAACTTAAGGTCTACGTGCTCTAA ATAACAAAAACGTTAACATCGTGTGCTTACGAATATATCATGTTGCTAATATCGAAAAAC TAATGATACTGCTCTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTGTGTATGTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTGAGTAAGATATGAAATGAAATACTGGGGCTTAGTAAGC
شومضاد القاع	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTTTTGTGGTTTTTAACACTTAAGGTCTACGTGCTCTA AATAACAAAAACGTTAACATCGTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTGTGTATGTTTTTTTTTTTTT GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCATGTGTGTGTGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCATCATCCTTTTGAGT GATATGAATATGAAATACTGGGGCTTTAGTAAGC
شو-توب أو شو-بوتوم-تي7 للأمام	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCAGT
شو-توب أو شو-بوتوم-الرجوع إلى الخلف	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
شومضاد للأعلى أو شومضاد للأسفل - T7 للأمام	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
شومضاد للتوب أو شومضاد للقاع -الرجوع إلى الخلف	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
تحتوي البادئات الأمامية على بروز تسلسل مروج T7 (مكتوب بالخط العريض)، يليه تسلسلات تستهدف نهاية 5 أقدام من RNA. تم تضمين عدد أو اثنين إضافيين من G بين مروج T7 وجهاز shu-top و shu-bottom أو shuanti-top و shu anti-bottom و shuanti-bottom على التوالي. وذلك لأن وجود Gs في موقعي +2 و +3 يمكن أن يزيد بشكل كبير من عائد النسخ19. ومع ذلك، قد تؤثر هذه النقاط الإضافية على تفسير اقتران القواعد في البنى المصممة. انظر الملاحظة في الخطوة 1.1.

الجدول 2: تسلسلات من شو-توب، شو-بوتوم، شو^مضاد للتوب، شو^مضاد للبوتوم، والبادئات المستخدمة لتضخيم قوالب الحمض النووي لنسخ T7. تم استخدام النماذج المدرجية لتوليد قوالب الحمض النووي لنسخ الحمض النووي في المختبر لحمض شو ^{وشو المضاد} للحمض النووي الريبي الذي يحمل المراسلين العلوي والسفلي، والتي استخدمت لاحقا في اختبارات تجميع الحمض النووي الريبي الموصوفة في هذه الدراسة.

Discussion

في هذه الدراسة، تم تكييف نظام البروكلي المنقسم¹⁸ للرؤية المباشرة وقياس اقتران القواعد بين الجزيئات تحت ظروف تجمع الحمض النووي الريبي في المختبر. يتيح هذا النهج تقييم اقتران القواعد بين الجزيئات عبر ظروف مختبرية مختلفة ويكمل الفحوصات الكيميائية الحيوية اللاحقة، مثل تجارب سحب الحمض النووي الريبي باستخدام روابط الربط القاعدي 15,16,17 والرحلان الكهربائي الهلام ^4,6,7. على عكس هذه الطرق الكيميائية الحيوية، التي تفتقر إلى الدقة المكانية لتمييز اقتران القواعد داخل عناقيد RNA عن تلك التي تحدث خارجها، يتيح هذا النهج التصور المكاني المباشر لهذه التفاعلات داخل المجموعات. على وجه التحديد، يسمح بمراقبة اقتران القواعد بين RNA العلوي والسفلي، أو RNA التي تحمل هذه المراسلين، تحت ظروف تجميع RNA محددة. بالإضافة إلى ذلك، يوفر قراءة كمية في الوقت الحقيقي لاقتران القواعد بين RNA المراسلين دون الحاجة إلى الربط المتقاطع أو استخراج RNA، مما يقلل من فقدان العينة وعدم توافق المخزن.

باستخدام المجهر الفلوري، تم قياس اقتران القواعد بين الجزيئات بين تسلسلات البروكلي المنقسمة من قبل البروكلي كميا عبر إشارة DFHBI-1T، مما أظهر توافق DFHBI-1T مع بروتوكول تجميع الحمض النووي الريبي في المختبر . اختلفت مدى اقتران القواعد بين الجزيئات حسب ظروف طي الحمض النووي الريبي، كما لوحظ تحت ظروف الطي المشترك والطي المنفصل (الشكل 1F والشكل 2Di–2Dii). تشير هذه النتائج إلى أن ظروف طي الحمض النووي الريبي تؤثر بشكل حرج على تفاعلات الحمض النووي الريبي بين الجزيئات ويجب أخذها في الاعتبار بعناية عند تفسير نتائج التجريب.

يوفر هذا الاختبار أيضا منصة لتقييم ما إذا كانت التسلسلات التي تحيط بالمراسلين العلوي والسفلي تعزز الاقتران بين القواعد الجزيئية، كما هو موضح باستخدام شو. كان فلورة DFHBI-1T أعلى للشو-توب مع شوا^مضاد للقاع وشو^مضاد للقمة مع شو-قاع مقارنة بشو-توب مع شو-بوتوم أو شو^مضاد للقمة مع شو مضاد للقاع، مما يشير إلى أن التفاعلات بين الجزيئات التي تشمل شو ^{وشو المضادة} ويعزز إشارة البروكلي بشكل أكبر. تشير هذه الملاحظات إلى أن إشارة الفلورة DFHBI-1T التي تم الحصول عليها من طي المراسلين العلوي والسفلي وحدها لا تمثل الحد الأعلى للاختبار.

امتد فلورة DFHBI-1T المقاسة في هذه التجارب عبر نطاق ديناميكي واسع، من زيادة بمقدار 1.04 ضعف (شو-توب مع شو-بوتوم تحت طي منفصل) إلى زيادة 82.60 مرة (شو^مضاد للقمة مع شو-قاع تحت ظروف طي مشترك). تمكن هذه الدائرة الديناميكية من اكتشاف الفروق في تفاعلات الحمض النووي الريبي بين الجزيئات الريبية التي تحمل هذه المراسلين.

تعد عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة للكشف الناجح عن اقتران قواعد RNA بين الحمض النووي الريبي المضمضي بين الحمض النووي الريبي العلوي والسفلي المنقسم في مجموعات RNA. يجب استخدام الحصص الجديدة ل PEG 8000 لتحفيز تجمع الحمض النووي الريبي بشكل موثوق، ويجب تقليل دورات التجمد والذوبان المتكررة بسبب عدم استقرار الكواشف. يجب أن يتم تجعيد DFHBI-1T وتخزينه عند −20 درجة مئوية للحفاظ على خصائص التألق. يجب تحليل منتجات النسخ في المختبر على جل RNA مغير قبل التجميع لتأكيد حجم النسخ الصحيح. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحفاظ على ظروف خالية من RNase، بما في ذلك بيئة عمل نظيفة وغرفة تصوير، أمر ضروري لأن قطرات RNA تحتضن في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة قبل التصوير.

أحد قيود هذا الاختبار هو أن DFHBI-1T يبلغ تحديدا عن اقتران قواعد بين جزيئيا يتم توسيطه بواسطة التسلسلات العليا والسفلية . لا يمكن اكتشاف أحداث اقتران القواعد بين الجزيئات الأخرى التي تحدث في مناطق مختلفة من الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك، فإن بنية البروكلي المكونة من اقتران القواعد بين الخيوط العلوية والسفلية مستقرة حراريا²⁶ وقد لا تعكس بشكل كامل تفاعلات أضعف أو عابرة، مثل تلك التي تتكون من القواعد المتناثرة والمكشوفة على السطح، كما لوحظ في مجموعات mRNA حبيبات جرثومة ذبابة الفاكهة ⁴.

علاوة على ذلك، يمكن أن تكون التفاعلات بين الجزيئات بين RNA وRNA متقطعة وغير محددة، وقد تؤثر التسلسلات التي تحيط بالمراسلين العلوي والسفلي على فلورة DFHBI-1T. قد تتفاعل هذه المناطق الجانبية مباشرة مع تسلسلات المراسل، مما يثبط تكوين البروكلي أو يغير بنية الحمض النووي الريبي، مما يؤثر على التفاعلات بين الحمض النووي الريبي الحامل للمراسلين. وبناء عليه، يعكس الاختبار التأثيرات المشتركة لبنية الحمض النووي الريبي، واقتران القواعد من الأعلى إلى الأسفل ، والتفاعلات بين التسلسلات الجانبية، والتفاعلات بين تسلسلات الالتفاف والمراسلين.

يوفر هذا الاختبار فرصا للتحقيق المستقبلي. على سبيل المثال، قد يؤثر تغيير تسلسلات الحمض النووي الريبي التي تحيط بالصحفيين، أو إدخال هيليكازات أو شابرونات RNA، أو تعديل ظروف الملح على اقتران القواعد بين الجزيئات في تجمعات RNA. يمكن تقييم هذه التأثيرات بقياس إشارة DFHBI-1T تحت ظروف طي مشترك وطي منفصل. نظرا لأن مبترات RNA مشابهة قد استخدمت في الخلايا والبكتيريا والخميرة 26,27,28,29,30، يمكن توسيع هذا النهج ليشمل في أنظمة السيلولو أو الكائنات النموذجية لفحص اقتران القواعد بين الجزيئات في مجموعات mRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	ميليبور سيغما	M1028	يستخدم لتحضير 10&00 مرة؛ مخزن إعادة طي الحمض النووي الريبي.
2M KCl	ثيرمو فيشر ساينتفيك	AM9640G	يستخدم لتحضير 10&00 مرة؛ مخزن إعادة طي الحمض النووي الريبي.
50٪ PEG 8000	NEB	M0204S	مكون من مجموعة ليغاز الحمض النووي الريبي T4؛ يستخدم ككاشف للتكدس الجزيئي لتحفيز تجمع الحمض النووي الريبي.
الإيثانول المطلق، 200 درجة	ثيرمو فيشر ساينتفيك	T038181000CS	يستخدم لتحضير مخزن غسيل RNA.
الفينول الحمضي: الكلوروفورم، درجة الحموضة 4.5 (مع IAA، 125:24:1)	ثيرمو فيشر ساينتفيك	AM9722	يستخدم لتنقية الحمض النووي الريبي.
أمينواليل-UTP-Cy5	جينا بيوساينس	NU-821-CY5	يستخدم لوضع علامات الحمض النووي الريبي أثناء النسخ الصناعي.
زجاج الغطاء الحجري	ثيرمو فيشر العلمي	155409PK	غرفة تصوير تفاعلات تجمع RNA.
الكلوروفورم	ثيرمو فيشر ساينتفيك	C298-500	يستخدم لتنقية الحمض النووي الريبي.
DFHBI-1T	لوسيرنا	410	يستخدم كفلوروفور للكشف عن أبتامر RNA للبروكلي.
DMSO	ثيرمو فيشر ساينتفيك	D12345	لامائية؛ درجة علم الأحياء الجزيئي؛ يستخدم لتحضير DFHBI-1T.
DNA كلين & مجموعة التركيزات	زيمو	D4014	يستخدم لتنظيف منتجات الحمض النووي قبل نسخ T7.
مجموعة استخراج جل الحمض النووي	NEB	T1020L	يستخدم لاستخراج الجل.
حمام جاف	معيار العلوم	BSH1001	يستخدم لتسخين عينات RNA في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
فيجي/إيميج جي	المعاهد الوطنية للصحة (NIH)	لا يوجد	برمجيات تحليل الصور مفتوحة المصدر؛ يستخدم لقياس شدة الفلورة وتحليل العائد على الاستثمار.
نظام الرحلان الكهربائي الهلامي	ثيرمو فيشر العلمي	B2-BP	يستخدم لإجراء الرحلان الكهربائي بجل الحمض النووي.
صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6&00;)	NEB	B7024S	يستخدم كصبغة تحميل لتحليل كهرباء هلام الحمض النووي.
مجهر الإضاءة الفوري الهيكل	فيسي تك الدولية	VT-iSIM	مجهر كونفوكلي قادر على تصوير فلورة GFP وCy5.
إيزوبوبانول	ثيرمو فيشر ساينتفيك	327272500	يستخدم لتنقية الحمض النووي الريبي.
مجموعة النسخ MEGAscript T7	ثيرمو فيشر ساينتفيك	AM1334	يستخدم في النسخ الصناعي T7. تتضمن المجموعة محاليل النيوكليوتيدات (ATP، CTP، GTP، UTP) وDNase.
أنابيب الطرد المركزي الدقيق	جينيسي ساينتيفك	22-284	أنبوب 1.5 مل؛ يستخدم لتخزين قوالب الحمض النووي للنسخ الصناعي، ومنتجات RNA، ومجموعات من الحيوانات المنوية وDFHBI-1T.
جهاز طرد مركزي صغير	معيار العلوم	Z763845	يستخدم للطرد المركزي لفترة وجيزة.
مطياف نانوسدروب ون	ثيرمو فيشر العلمي	13-400-518	مطياف الفوتومترين الميكروحجمي لقياس تركيز وجودة الحمض النووي النووي والحمض النووي الريبي.
ماء خال من النوكليز	ثيرمو فيشر ساينتفيك	AM9937	يستخدم لإعادة تعليق حبيبات RNA، وتحضير مخازن غسل وإعادة طي RNA، وتخفيف السپرمين وDFHBI-1T.
حاسبة الكتلة المولية عبر الإنترنت	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية (NEB)	لا يوجد	أداة إلكترونية تستخدم لحساب كتلة RNA من الكمية المولية (مثل pmol).
أنابيب البولي بروبيلين PCR	كورنينغ	3745	200 μ أنابيب PCR L المستخدمة في تفاعلات PCR، والنسخ الصناعي، وتفاعلات تجمع RNA
مزود الطاقة الأساسي لباور باك	بيو-رادي	1645050	يستخدم لإجراء الرحلان الكهربائي بجل الحمض النووي.
جهاز دورة الحرارة PCR من Proflex	ثيرمو فيشر العلمي	44-840-73	يستخدم في PCR، والنسخ المختبري، وتسخين عينات RNA في أنابيب PCR.
Q5 عالي الدقة 2×؛ ماستر ميكس	NEB	M0492S	يستخدم ك 2×؛ مزيج ماستر عالي الدقة.
جهاز الطرد المركزي المبرد	إبندورف	5424R	يستخدم لتنقية الحمض النووي الريبي وتكوين الحبيبات.
محلول إزالة التلوث RNase	ثيرمو فيشر ساينتفيك	AM9782	يستخدم لتنظيف طاولات وأسطح المختبرات لتقليل تلوث RNase.
سبيرمين   رباعي الهيدروكلوريد	سيغما-ألدرتش	S1141-1G	يستخدم لتحفيز تجمع RNA.
قاعدة تريس	ميليبور سيغما	T1503-1KG	يستخدم لتحضير مخزن تريس (درجة الحموضة 7.0).
الأجاروز فائق النقاء	ثيرمو فيشر ساينتفيك	16500500	يستخدم في الرحلان الكهربائي الهلامي للحمض النووي.