بروتوكول مبسط لمجهر تحديد موقع جزيء واحد في نوى الأرابيدوبسيس

Summary

يقدم هذا البروتوكول سير عمل فعال لتصوير المجهر لتحديد موقع جزيء واحد لنوى الأرابيدوبسيس المعزولة، باستخدام العزل والتثبيت ووضع العلامات المحسنة لتحقيق تصور موثوق على نطاق نانوي للكروماتين وبوليميراز RNA II. يمكن تكييف هذا النهج بسهولة مع بروتينات أخرى مرتبطة بالكروماتين أو تعديلات الهيستونات للتصوير عالي الدقة.

Abstract

بينما قدم المجهر الفلوري الكونفوكالي رؤى قيمة حول تنظيم الكروماتين في نوى النباتات، فإن دقته المحدودة الحيود تقيد دراسة بنية الكروماتين، مما يحفز استخدام تقنيات فائقة الدقة مثل مجهر تحديد الموقع للجزيء الواحد (SMLM). من بين هذه الأساليب، يوفر المجهر البصري العشوائي المباشر (dSTORM) دقة نانوية في الخلايا الفردية، مما يتيح رؤية دقيقة لمجالات الكروماتين، وتعديلات الهيستون، والتنظيم النووي. بينما يتم تطبيق هذه الطرق بشكل متزايد في أنظمة الثدييات، لا يزال استخدامها في علم الأحياء النباتي محدودا، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى التحديات التقنية في تحضير العينات.

هنا، نقدم سير عمل مبسط وقابل للتكرار لتصوير SMLM للنوى المعزولة من الأرابيدوبسيس ثاليانا. يبدأ هذا البروتوكول بتثبيت الشتلات للحفاظ على الشكل النووي، يليه تقطيع الأنسجة بلطف وطرد مركزي لإثراء النوى السليمة. ثم يتم وضع علامات على الفلوروفور في وسط سائل وتثبيتها على وسادات أغاروز منخفضة الانصهار، وهي استراتيجية تعزز الاستقرار خلال جلسات التصوير الطويلة لجزيء واحد. تقلل هذه الخطوات مجتمعة من التألق الخلفي، وتحسن اتساق الوسم، وتزيد من قابلية التكرار عبر النسخ البيولوجية.

توفر التحضيرات الناتجة وضوحا معززا لرؤية تعديلات الكروماتين والبنية النووية في المنشآت. من خلال خفض الحواجز التقنية لتنفيذ تصوير SMLM في الأرابيدوبسيس، يوفر هذا البروتوكول وسيلة متعددة الاستخدامات للتحقيق في تنظيم اللاجينات، وتنظيم الكروماتين، والتغيرات الطوبولوجية النووية على المستوى النانوي. يؤسس هذا العمل أساسا منهجيا لتطبيق SMLM على النباتات، مما يجسر الفجوة مع بيولوجيا خلايا الثدييات ويفتح فرصا جديدة لدراسة كيف تساهم العمارة النووية في تنظيم الجينوم استجابة للإشارات التطورية والبيئية في أنظمة النباتات.

Introduction

لطالما كان المجهر حجر الأساس لدراسة تنظيم الكروماتين وبنية النواة، حيث يكشف كيف تنظم الحمض النووي والبروتينات المرتبطة بالهيستونات ضمن الفضاء النووي ثلاثي الأبعاد وتؤثر على تنظيم الجينات ^1,2. قدم المجهر الفلوري التقليدي رؤى قيمة حول مجالات الكروماتين واسعة النطاق مثل مناطق الكروموسومات، ومراكز الكرومو، والأجسام النووية ^3,4، والتي يمكن تحقيقها في الموقع، خاصة في أنسجة الجذور للنباتات ^3,5,6. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات مح....

Protocol

ملاحظة: المعلومات التفصيلية حول المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول متوفرة في جدول المواد. ما لم يذكر خلاف ذلك، يتم إزالة المخازن على مرشحات 0.2 ميكرومتر ذات الأبيروجين. يستخدم H₂O فائق النقاء مزدوج التقطير (ddH₂O) في هذا البروتوكول. تجرى خطوات الطرد المركزي في أنابيب دقيقة بحجم 1.5 مل باستخدام دوار بزاوية ثابتة.

1. تثبيت الشتلات وإطلاق النوى

1. ضع لوحة زراعة مكونة من 6 آبار على الثلج تحت غطاء البخار، ثم أضف إلى كل بئر حوالي 4 مل من محلول التثبيت البارد المثلج الذي تم تحضيره بشكل عفائي تحت غطاء بخار (4٪ (v/v) فورمالديهايد مثبت بالميثان....

Results

البروتوكول الموضح أعلاه يتيح تحضير نوى أرابيدوبسيس ثاليانا عالية الجودة المناسبة للاستكشاف الصغير واللئي. تم إجراء عدة جولات من التحسين لتحسين سلامة النواة وتقليل الحطام السيتوبلازمي والخلوي الذي يؤثر سلبا على جودة الصورة. بعد كل خطوة تحسين، تم تقييم جودة التحضيرات النووية بواسطة التصوير الكونفوكلي باستخدام مجهر Olympus IX81 ذو القرص الدوار قبل الانتقال إلى اكتساب الدقة الفائقة.

التصوير الكونفوكلي
الإجراء الموضح أعلاه متوافق بالفعل.......

Discussion

يتطلب تحضير نوى الأرابيدوبسيس ثاليانا لميكروسكوب تحديد الموقع الجزيء الواحد (SMLM) عدة خطوات حاسمة تؤثر بشكل كبير على جودة العينة النهائية. كما هو موضح سابقا^19،35، فإن تقطيع الأنسجة بشكل شامل ومتسق ضروري لتعظيم تعافي النوى السليمة. استخدام شفرات الميكروتوم بدلا من شفرات الحلاقة القياسية ينتج تجزئة الأنسجة أنظف وأكثر انتظاما، مما يحسن من إطلاق النوى. خطوات الغسل والطرد المركزي اللاحقة مهمة بنفس القدر لتقليل الحطام. تنفذ ه.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
الأجسام المضادة المضادة لمضاد RNA بوليميراز II CTD YSPTSPS (فوسفو S2)	أبكام	ab5095	الجسم المضاد الأولي المستخدم عند تخفيف 1/200 في محلول التلوين المناعي لرؤية الشكل النشط للبوليميراز (الأجسام المضادة متعددة النسيرات التي تم تربيتها في الأرنب)
برامج الاستحواذ	آبلايت	NEO LiveImaging الإصدار 2.18
مصل البقر ألبومين	سيغما-ألدرتش	A7906
الكاتالاز	سيغما-ألدرتش	C40
أجاروز منخفض الذوبان المعتمد	بيو-راد	1613111
سمك غطاء الغطاء 1.5H طلقة	مارينفيلد	117640	&أوسلاش: 24 مم
D-(+)-جلوكوز، لامائي، 99٪	ثيرمو ساينتفيك	A16828-36
المرآة ثنائية اللون	سيمروك	Di03-R405/488/561/635-t1	المرآة ثنائية اللون لفصل الإثارة/الانبعاث
دولبيكو' s محلول ملحي مخزن الفوسفات 10´	بيوويست	X0515 - 500	العمل في ظروف معقمة
شفرات إبريديا ألترا القابلة للتخلص من الميكروتوم	فيشر ساينتفيك	12191830	منخفض الارتفاع، استخدام واحد
لوحة زراعة خلايا متعددة الآبار من فالكون ذات 6 آبار من قاع صاف مسطح معالج ب TC، مع غطاء	فالكون	353046
محلول الفورمالديهايد 37٪	كارل روث	7398	العمل تحت غطاء البخار
أكسيداز الجلوكوز	سيغما-ألدرتش	G2133
الجلسرول	VWR	24388.295
الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب IgG (H+L) عالي الامتصاص المقاطع، Alexa Fluor Plus 647	ثيرمو ساينتفيك	A32733TR	استخدم عند 1/200 كجسم مضاد ثانوي مرتبط ب AF647
حل Hoechst 33258	سيغما-ألدرتش	94403	تستخدم عند 1/500 لتغطية صبغة الحمض النووي، وأضيفت إلى وسادة الأغاروز
محلول حمض الهيدروكلوريك	مختبر الكيمياء	CL05.0311.1000
JF549-هوشست	مختبر لافيس وفريق الكيمياء المفتوحة (جانيليا)	JF549-هوشست	يستخدم لطلاء الحمض النووي مضاد، وأضيف إلى وسادة الأغاروز عند تركيز نهائي 1.5 نانومتر
مجموعة مطحنة الأنسجة KIMBLE Dounce	سيغما-ألدرتش	D8938	أنبوب 2 مل مع مدقات كبيرة (0.0030-0.0050 بوصة) وصغيرة (0.0005-0.0025 بوصة) بطول
وحدة الليزر	أوكسيوس	L6Cc	مجهزة بستة ليزر: 405 نانومتر - 100 ميلاواط، 488 نانومتر - 200 ميلاواط، 532 نانومتر - 500 ميلي واط، 561 نانومتر - 300 ميلي واط، 640 نانومتر - 500 ميلي واط، 730 نانومتر - 30 ميلاواط
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم	كارل روث	HN03
ميركابتوإيثيلامين (MEA)	سيغما-ألدرتش	30070
MOPS صوديوم ملح 98٪	فيشر ساينتيفك SAS	352590010
مرشح الانبعاث متعدد النطاقات	سيمروك	FF01-446/523/600/677	ترشيح الانبعاث متعدد النطاقات لحجب ضوء تشتت الليزر
النانودايموندز	تقنيات أداماس النانوية	NDNV100nmHiWGA2ml	المخزون 1 ملغ/مل
كاميرا ORCA-Fusion الرقمية CMOS	هاماماتسو	C14440-20UP
طبق بتري، 100/20 مم، PS، شفاف، مع فتحات تهوي، معقم	غرينر بيو-ون	664161	كنت أزرع النباتات على نصف متوسط MS
طبق بتري، مربع، PS، شفاف، 120/120/17 مم، معقم	غرينر بيو-ون	688161	يستخدم عند تقطيع شتلات النباتات
مصفاة خلية صغيرة pluriStrainer	pluriSelect	43-10030-50	حجم الشبكة 30 وميكرو؛ m، مناسب لأنبوب إبندورف بسعة 1.5 مل
كلوريد البوتاسيوم	سيغما-ألدرتش	P9333
مرشح الانبعاث ذو النطاق الواحد	سيمروك	FF01-698/70	مرشح انبعاث محدد لقناة AF647
مرشح الانبعاث ذو النطاق الواحد	الكروما	ET600/50m	مرشح الانبعاث المحدد لقناة JF549
كلوريد الصوديوم (99.5٪)	يوروميديكس	1112-أ
انزلاقات ستار-فروست بحجم 76 × 26 مم	نيتل	VS112711FKB.01
فلتر حقنة معقم وأوسلاش؛ المسامية 33 مم 0.2 وميكرو؛ مخروط قفل لوير	كليرلاين	146560
نظام الدقة الفائقة	آبلايت	SAFe360	أوليمبوس IX83 مجهزة بهدف غمر زيت بقوة 100x NA1.5
ثلاثي الصوديوم سترات 2H2O جين-أبيكس بيومول	برولابو	PRO-33615.268
درجة تريس بيس في علم الأحياء الجزيئي	بروميغا	H5135
هيدروكلوريد تريس(2-كربوكسي إيثيل)فوسفين (TCEP)	ثيرمو ساينتفيك	20491
ترايتون X-100	يوروميديكس	2000-B
20 سنة	يوروميديكس	2001-B
توينسيل سبيد	بيكودنت	13001002	مادة العزل السيليكونية
نظام تنظيف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية فرن UVOCS	شركة UVOCS	T10X10	تعريض لمدة 20 دقيقة لتنظيف الغطاء
مضخة التفريغ	فاكوبراند	VP 100C
جهاز الطرد المركزي هيرايوس ميغافوج 16R	ثيرمو ساينتفيك		دوار TX-400 75003629. يتم إجراء الطرد المركزي باستخدام أنابيب إيبندورف.