يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول مبسط لمجهر تحديد موقع جزيء واحد في نوى الأرابيدوبسيس

348 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70891

⸱

مايو 8, 2026

 ,  ,  , 
1Institut de Biologie Structurale, CEA, CNRS, Université Grenoble Alpes, 2Plant and Cell Physiology Lab (LPCV), Bioscience and Biotechnology Institute of Grenoble, Grenoble Alpes University - CNRS - INRAE - CEA, 3Integrated Structural Biology Grenoble (ISBG) CNRS, CEA, Université Grenoble Alpes

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول سير عمل فعال لتصوير المجهر لتحديد موقع جزيء واحد لنوى الأرابيدوبسيس المعزولة، باستخدام العزل والتثبيت ووضع العلامات المحسنة لتحقيق تصور موثوق على نطاق نانوي للكروماتين وبوليميراز RNA II. يمكن تكييف هذا النهج بسهولة مع بروتينات أخرى مرتبطة بالكروماتين أو تعديلات الهيستونات للتصوير عالي الدقة.

الملخص

بينما قدم المجهر الفلوري الكونفوكالي رؤى قيمة حول تنظيم الكروماتين في نوى النباتات، فإن دقته المحدودة الحيود تقيد دراسة بنية الكروماتين، مما يحفز استخدام تقنيات فائقة الدقة مثل مجهر تحديد الموقع للجزيء الواحد (SMLM). من بين هذه الأساليب، يوفر المجهر البصري العشوائي المباشر (dSTORM) دقة نانوية في الخلايا الفردية، مما يتيح رؤية دقيقة لمجالات الكروماتين، وتعديلات الهيستون، والتنظيم النووي. بينما يتم تطبيق هذه الطرق بشكل متزايد في أنظمة الثدييات، لا يزال استخدامها في علم الأحياء النباتي محدودا، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى التحديات التقنية في تحضير العينات.

هنا، نقدم سير عمل مبسط وقابل للتكرار لتصوير SMLM للنوى المعزولة من الأرابيدوبسيس ثاليانا. يبدأ هذا البروتوكول بتثبيت الشتلات للحفاظ على الشكل النووي، يليه تقطيع الأنسجة بلطف وطرد مركزي لإثراء النوى السليمة. ثم يتم وضع علامات على الفلوروفور في وسط سائل وتثبيتها على وسادات أغاروز منخفضة الانصهار، وهي استراتيجية تعزز الاستقرار خلال جلسات التصوير الطويلة لجزيء واحد. تقلل هذه الخطوات مجتمعة من التألق الخلفي، وتحسن اتساق الوسم، وتزيد من قابلية التكرار عبر النسخ البيولوجية.

توفر التحضيرات الناتجة وضوحا معززا لرؤية تعديلات الكروماتين والبنية النووية في المنشآت. من خلال خفض الحواجز التقنية لتنفيذ تصوير SMLM في الأرابيدوبسيس، يوفر هذا البروتوكول وسيلة متعددة الاستخدامات للتحقيق في تنظيم اللاجينات، وتنظيم الكروماتين، والتغيرات الطوبولوجية النووية على المستوى النانوي. يؤسس هذا العمل أساسا منهجيا لتطبيق SMLM على النباتات، مما يجسر الفجوة مع بيولوجيا خلايا الثدييات ويفتح فرصا جديدة لدراسة كيف تساهم العمارة النووية في تنظيم الجينوم استجابة للإشارات التطورية والبيئية في أنظمة النباتات.

المقدمة

لطالما كان المجهر حجر الأساس لدراسة تنظيم الكروماتين وبنية النواة، حيث يكشف كيف تنظم الحمض النووي والبروتينات المرتبطة بالهيستونات ضمن الفضاء النووي ثلاثي الأبعاد وتؤثر على تنظيم الجينات 1,2. قدم المجهر الفلوري التقليدي رؤى قيمة حول مجالات الكروماتين واسعة النطاق مثل مناطق الكروموسومات، ومراكز الكرومو، والأجسام النووية 3,4، والتي يمكن تحقيقها في الموقع، خاصة في أنسجة الجذور للنباتات 3,5,6. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات محدودة بشكل أساسي بحاجز الحيود للضوء، مما يقيد الدقة المكانية إلى حوالي 200 نانومتر جانبيا و500 نانومتر محوريا7. هذا القيد يحجب تفاصيل طي الكروماتين، وأنماط تعديل الهستون، والتقسيم النسخي التي تكمن وراء تنظيم اللاجينات. لتجاوز هذا الحاجز، تم تطوير طرق المجهر فائق الدقة (SRM) مثل المجهر الإضاءة الهيكلي (SIM)8، واستنزاف الانبعاث المحفز (STED)9,10، ومجهر تحديد الموقع للجزيء الواحد (SMLM)11,12 لتحقيق دقة تتراوح من 100 نانومتر إلى بضعة نانومتر13.

من بين تقنيات SRM، يقدم SMLM — بما في ذلك المجهر التموضعي المنشط ضوئيا (PALM)13 والمجهر البصري العشوائي المباشر (dSTORM) — دقة مكانية استثنائية مع خصوصية جزيئية14. من خلال اكتشاف مواقع الفلوروفورات الفردية عبر الزمن، يعيد SMLM بناء صور نانوية عالية الدقة لمجالات الكروماتين، وعلامات الهيستون، والهياكل النووية في خلايا منفردة15,16. لقد حولت هذه القدرة أبحاث الكروماتين في أنظمة الثدييات، حيث تم تطبيق SMLM لتصوير تجمع النيوكليوسومات، وضغط الكروماتين، وأنماط تعديل الهيستون بتفاصيل غير مسبوقة 15,16,17. وعلى النقيض من ذلك، لا يزال تطبيق SMLM على نوى النبات محدودا، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى التحديات التقنية المرتبطة بخصائص نسيج النبات — مثل ارتفاع التألق الذاتي، وصلابة جدار الخلية، ووجود مركبات تشتت الضوء مثل النشا والكلوروفيل18. علاوة على ذلك، تتطلب الطبيعة الحساسة للنوى أثناء العزل ووضع العلامات سير عمل محسنة للحفاظ على السلامة الهيكلية وتقليل الفلورة الخلفية خلال جلسات التصوير الطويلة.

تم تطوير البروتوكول الموضح هنا في الأصل بواسطة إليزابيث كراشيك-داير وسيليا بارو لاختبار المجهر التحفيزي لاستنزاف الانبعاثات (STED)رقم 19. تم تحسينه وتكييفه لاحقا لتلبية المتطلبات الخاصة لتصوير STORM مع دمج المعرفة المستمدة من تطبيقات علم الأحياء الدقيقة المنشورة 20,21,22. الهدف العام هو توفير سير عمل مبسط وقابل للتكرار لتصوير SMLM لنوى الأرابيدوبسيس ثاليانا المعزولة. من خلال دمج التثبيت الأمثل، والاضطراب الميكانيكي اللطيف، ووضع العلامات الفلورية في حالة تعليق، تحافظ هذه الطريقة على الشكل النووي مع إزالة الملوثات السيتوبلازمية التي غالبا ما تضر بجودة التصوير. يضمن تثبيت النوى الموسومة على وسادات الأغاروز منخفضة الانصهار الاستقرار الميكانيكي أثناء الاكتساب، مما يسمح بتصوير جزيء واحد طويل الأمد بدقة نانوية على مستوى النانو. مقارنة بروتوكولات SRM الموصوفة سابقا لنوى النباتات — خصوصا تلك المبنية على المجهر STED19,23 — يستخدم هذا السير الفلوروفورات القابلة للتبديل الضوئي (مثل AF647، JF549)، ويقلل من التألق الخلفي بفضل خطوات الغسل التي تتخلص من الكلوروفيل والحطام الأنسجي، ويحسن تجانس الوسم بإضافة جزيئات الوسم مباشرة إلى النوى الثابتة والمنفاذة. وبالتالي، يتيح التصور المتسق لتعديلات الكروماتين، والحجزات النووية، والأنماط اللاجينية في النوى الفردية. من خلال خفض الحواجز التقنية أمام تطبيق SMLM في النباتات، توسع هذه الطريقة إمكانية الوصول إلى التصوير على نطاق النانو وتوفر أساسا لدراسة كيفية مساهمة تنظيم الكروماتين والبنية النووية في تنظيم الجينات استجابة للإشارات التطورية والبيئية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: المعلومات التفصيلية حول المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول متوفرة في جدول المواد. ما لم يذكر خلاف ذلك، يتم إزالة المخازن على مرشحات 0.2 ميكرومتر ذات الأبيروجين. يستخدم H2O فائق النقاء مزدوج التقطير (ddH2O) في هذا البروتوكول. تجرى خطوات الطرد المركزي في أنابيب دقيقة بحجم 1.5 مل باستخدام دوار بزاوية ثابتة.

1. تثبيت الشتلات وإطلاق النوى

  1. ضع لوحة زراعة مكونة من 6 آبار على الثلج تحت غطاء البخار، ثم أضف إلى كل بئر حوالي 4 مل من محلول التثبيت البارد المثلج الذي تم تحضيره بشكل عفائي تحت غطاء بخار (4٪ (v/v) فورمالديهايد مثبت بالميثانول، 0.1٪ Triton X-100 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1× [PBS]).
  2. باستخدام ملقط نظيف، قم بإزالة الشتلات (بين 8 و15 يوما بعد الإنبات) التي تم زراعتها على أملاح موراشيغ نصف القوة الصلبة (0.8٪ أجار) وأملاح سكوج متوسطة 2.2 جم/لتر MS، و1٪ سكروز (مع الوزن)، ودرجة الحموضة 5.7، كما هو موصوف لشتلات MS في المرجع24، واغمرها فورا في محلول التثبيت. استخدم بئرا واحدا لحوالي 20 شتلة (كان هناك حاجة ل3 آبار للحصول على كمية كافية من المواد لكل عينة).
  3. ضع اللوحة في غرفة التفريغ المملوءة بالثلج وطبق تفريغ كهربائي عند ضغط متناوب بين 0.2 بار و0.8 بار لمدة 15 دقيقة لإزالة الهواء المحبوس والسماح باختراق عميق للمثبت في أنسجة النبات25. حرر المكنسة ببطء، حرك العينة، ثم طبق الفراغ لمدة 15 دقيقة إضافية.
  4. تحت غطاء البخار، أزل محلول التثبيت باستخدام ماصة، واغسل كل بئر 3 مرات لمدة 10 دقائق تحت تحريك خفيف، باستخدام 5 مل من PBS البارد جدا.
  5. قم بإزالة PBS واستخدم الملقط لنقل النسيج الثابت إلى طبق بتري بقياس 120 مم × 120 مم. أضف إلى الشتلات الثابتة 50 ميكرولتر من محلول عزل النوى (NIB)، المحضر كما وصفها كراسيك-داير وبارو (45 ملليمولار ملغ كلير2، 20 ملليمولار MOPS، 30 ملليمولار سترات الصوديوم، 0.3٪ ترايتون X-100). عدل إلى درجة الحموضة 7 باستخدام 1 N HCl)19. شريحة بشفرة.
    ملاحظة: اتضح أن شفرات Microtome أكثر كفاءة من شفرات الحلاقة التقليدية لهذه المهمة.
  6. اكشط النسيج المفروم إلى أحد أطراف طبق بتري بنفس الشفرة وأضف 600 ميكرولتر من الريشة النفخية، مع التأكد من غسل أي نسيج ملتصق بالشفرة أيضا.
  7. انقل خليط الأنسجة إلى أنبوب التجانس Dounce بسعة 2 مل وقم بتمرير 5–10 مرات بالمدقة الأصغر، ثم مع المدقة الأكبر حتى تتحرك بسلاسة داخل الأنبوب (عادة ما يتطلب ذلك 5–10 ضربات).
  8. ترشيح العينة المتجانسة الناتجة عبر فلتر شبك بحجم 30 ميكرومتر إلى أنبوب دقيق بحجم 1.5 مل.
  9. قم بعمل نظام التعليق المركزي لمدة 10 دقائق عند 800 × g باستخدام أدنى منحدر لكل من التسارع والتباطؤ. توجد كرة بيضاء صغيرة تظهر بين حطام الأنسجة الخضراء.
  10. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 150 ميكرولتر من NIB.
  11. قم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقائق على 800 × جرام وإزالة الفائق. إذا كان هناك بعض الحطام الأخضر الظاهر، اغسله للمرة الثانية. أعد تعليق القرص بين 50 ميكرولتر إلى 150 ميكرولتر من النيب، بناء على حجم الكريات.
  12. تخزين تعليق النوى المعزولة الناتج عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع كحد أقصى قبل إجراء التلوين. ومع ذلك، ينصح بالمضي قدما فورا.

2. التلوين (المناعي)

ملاحظة: في الخطوات التالية، يطبق البروتوكول على حجم 50 ميكرولتر من تعليق النوى، وهو ما يعادل عادة 20 شتلة. ما لم يتم تحديده، تتم الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة.

  1. قم بعمل الطرد المركزي للمحلول لمدة 10 دقائق عند 800 × جرام وتخلص من السوبرناتانت. كن حذرا من لمس الحبيبة.
  2. أعد تعليق النوى عن طريق التوصيل اللطيف في 50 ميكرولتر من المخزن الحاجب (143 ملليموتر NaCl، 4٪ BSA في PBS، مخزن عند 4 درجات مئوية). حضن لمدة 30 دقيقة تحت تحريك خفيف.
  3. قم بعمل الطرد المركزي للمحلول لمدة 10 دقائق عند 800 × جرام وتخلص من المادة الفائقة دون لمس حبيبات النوى.
  4. أعد تعليق النوى عن طريق التوصيل اللطيف بمقاصة 50 ميكرولتر من 1× PBS. استخدمت الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 800 × جرام. تخلص من السوبرناتانت كما في الأعلى.
  5. أعد تعليق النوى في 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المحضر في محلول مناعي مكون من 143 ملليمولم NaCl، 1٪ BSA، 0.05٪ Tween 20 في PBS (تم تفصيل الأجسام المضادة وتخفيف العمل في جدول المواد). حضن العينات لمدة 60 دقيقة تحت تحريك لطيف.
  6. تابع بغسلتين (كرر الخطوات 2.3 و2.4).
  7. أعد تعليق النوى في 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي AF647 المضاد للأرانب عند تخفيف 1/20026. لف الأنابيب بورق ألمنيوم لحماية الفلوروفور من الضوء. حضن الأنابيب لمدة 60 دقيقة تحت تحريك خفيف.
  8. تابع بغسلتين (كرر الخطوات 2.3 و2.4).
  9. أعد تعليق الرصاصة في 50 ميكرولتر من NIB. تخزين نظام التعليق في أنابيب دقيقة بحجم 1.5 مل مغلفة بورق الألمنيوم. العلامة مستقرة لعدة أسابيع عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

3. التركيب

  1. لتصوير العاصفة، حضر محلول أجاروز منخفض الانصهار (LMA 1.5٪ w/v) عن طريق إذابة المسحوق في 1.25× buffer B مكون من 50 ملليمولار Tris pH 8، 10mM NaCl، 10٪ جلوكوز. حضر محلول مخزون 1.25× وخزن عند 4 درجات مئوية.
  2. سخن على حرارة 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لإذابة المسحوق والحصول على محلول شفاف. قم بتبريد محلول LMA المنصاب عند 37 درجة مئوية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لتجنب إزالة الحرارة من مخزن الجلوكوز أكسيداز (GLOX) (حضر محلول مخزون 10 مرات مخزن عند -20°C مكون من 100 ملليمولار Tris pH 7.5، 25 ملليمولار KCl، 1 ملليمولار TCEP pH 7.0، 5 ملغ/ملليتر جلوكوز أكسيداز، 0.4 ملغ/ملليتر كاتالاز، 50٪ v/v جليسرول).
  3. بعد أن يصل محلول LMA إلى 37 درجة مئوية، جهز مخزن STORM بإضافة 100 ملليمول ميركابتوإيثيل أمين (MEA) وGLOX إلى محلول LMA الدافئ لتحقيق تركيز نهائي 1×. تخزين محلول المخزون MEA بسعة 1 M لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية، لكن ينصح باستخدام محلول طازج المعد حديثا. اخلط بلطف.
    ملاحظة: لوضع وسم DNA اختياري، أضف 1.5 نانوميل (تركيز نهائي، محلول مخزون 1 ملليمولار في DMSO) من هوشت JF549 المترافق. حافظ على التعليق عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. اخلط تعليق النوى بلطف مع النانودايموند عند تخفيف 1/1500. حضنها مع العينة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: تستخدم النانودايموند كعلامات ائتمانية لتصحيح انحراف العينة.
  5. ضع 10 ميكرولتر من الخليط على غطاء معالج بالأوزون بسعة 1.5H (20 دقيقة في نظام تنظيف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية) وانتظر 3 دقائق حتى تترسب النوى على غطاء الغطاء الداخلي.
  6. أزل السائل الزائد، وانتظر دقيقتين. أضف 10 ميكرولتر من اتفاقية LMA المعدة في الخطوة 3.3 إلى الغطاء وغطه فورا باستخدام شريحة المجهر.
  7. أغلق غطاء الغطاء باستخدام مادة سلب سيليكون. اخلط كميات متساوية من المحلولين A و B في طبق بتري صغير باستخدام طرف ميكروبايبت. ضع الخليط على حواف الغطاء لإغلاق العينة. مادة السيليكون المانعة تتصلب خلال 5 دقائق.
  8. بعد تركيبها، قم بتصوير الشرائح دون تأخير، وفي النهاية خلال 4–5 ساعات التالية، لتجنب فقدان خصائص جمع الأكسجين في منصة التثبيت.

4. التصوير

ملاحظة: يجب تحسين معلمات التصوير بعناية وفقا لطبيعة العينة، والخصائص الفيزيائية الضوئية للفلوروفورات، والتكوين البصري للمجهر. من الضروري ضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية لكل فلوروفور مع تقليل النزيف الطيفي والإثارة المتقاطع بين القنوات الفلورية. تمت ملاحظة العينات باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بهدف غمر زيت عالي NA 100x، ووحدة للحفاظ على التركيز، وLED أبيض للتصوير في المجال الساطع. كانت الملصقات الفلورية AlexaFluor647 (AF647) تثير عند 640 نانومتر وJF549-Hoechst عند 561 نانومتر. تم ترشيح الضوء المنبعث باستخدام مرآة ثنائية اللون ومصفح تمرير النطاق المتوافق، وأخيرا، تم جمع الصور باستخدام كاميرا علمية من نوع أكسيد المعادن التكميلية لأشباه الموصلات (sCMOS).

  1. ركبوا شريحة العينة وابحثوا عن التركيز. قم بتفعيل وحدة للحفاظ على التركيز إذا كان النظام يحتوي على واحدة (موصى به بشدة للاقتناء الطويل).
  2. ابحث عن نواة وركز عليها. من الأفضل وجود واحد أو عدد قليل من النانودايموند بالقرب من النواة المعنية لتصحيح الانجراف بشكل أكثر كفاءة أثناء إعادة البناء.
  3. (اختياري) التقاط لقطات محدودة الحيود للحقل الساطع وكل قناة فلورية عند طاقة ليزر منخفضة.
  4. عند إجراء التصوير ذو اللونين، ابدأ بالحصول على قناة الطول الموجي الأطول ثم انتقل إلى قناة الطول الموجي الأقصر (أي اقتناء قناة AF647 قبل JF549).
    ملاحظة: مثال على معلمات الاستحواذ المستخدمة في هذا العمل:
    القناة A - تصنيف الحواشي - AF647
    زمن التعريض: 20 مللي ثانية
    شدة الليزر: 640 نانومتر – 2.2 كيلوواط/سم2
    وضع الإثارة: هيلو27
    القناة B - وسم الحمض النووي - JF549-Hoechst
    مدة التعريض: 50 مللي ثانية
    شدة الليزر: 561 نانومتر - 1 كيلوواط/سم2
    وضع الإثارة: إبينفريوم
    عدد الصور المسجلة: 10,000-30,000 لكل قناة، مما يضمن بقاء كثافة الفلوروفورات في كل إطار متناثرة بما يكفي لتحديد موقع جزيء واحد بدقة، بينما تم تحديد العدد التراكمي للتوطين تجريبيا باستخدام تصنيف الصور الكمي فائق الدقة والإبلاغ عن مواقع الأخطاء (SQUIRREL)28، والذي يشير أيضا إلى عدد الإطارات الكافية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتوكول الموضح أعلاه يتيح تحضير نوى أرابيدوبسيس ثاليانا عالية الجودة المناسبة للاستكشاف الصغير واللئي. تم إجراء عدة جولات من التحسين لتحسين سلامة النواة وتقليل الحطام السيتوبلازمي والخلوي الذي يؤثر سلبا على جودة الصورة. بعد كل خطوة تحسين، تم تقييم جودة التحضيرات النووية بواسطة التصوير الكونفوكلي باستخدام مجهر Olympus IX81 ذو القرص الدوار قبل الانتقال إلى اكتساب الدقة الفائقة.

التصوير الكونفوكلي
الإجراء الموضح أعلاه متوافق بالفعل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتطلب تحضير نوى الأرابيدوبسيس ثاليانا لميكروسكوب تحديد الموقع الجزيء الواحد (SMLM) عدة خطوات حاسمة تؤثر بشكل كبير على جودة العينة النهائية. كما هو موضح سابقا19،35، فإن تقطيع الأنسجة بشكل شامل ومتسق ضروري لتعظيم تعافي النوى السليمة. استخدام شفرات الميكروتوم بدلا من شفرات الحلاقة القياسية ينتج تجزئة الأنسجة أنظف وأكثر انتظاما، مما يحسن من إطلاق النوى. خطوات الغسل والطرد المركزي اللاحقة مهمة بنفس القدر لتقليل الحطام. تنفذ ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر مختبر لافيس وفريق الكيمياء المفتوحة في جانيليا على توفير أصباغ JF وJFX بسخاء. نحن أيضا ممتنون لإليزابيث كراسيك-داير وسيليا بارو لمشاركتهما بروتوكولاتهما الكريمة، وكذلك لألين بروبست وغييرمو أورسي على النصائح العميقة. تم تنفيذ التصوير البصري على منصة التصوير M4D التابعة لمركز غرونوبل إنسترك-إريك (ISBG؛ UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) ضمن شراكة غرونوبل لعلم الأحياء البنيوي، بدعم من البنية التحتية الفرنسية لعلم الأحياء البنيوي المتكامل (ANR-10-INBS-0005-02) وتحالف غرونوبل لعلم الأحياء البنيوي المتكامل والخلوي، وهو مشروع تابع لكلية الدراسات العليا بجامعة غرونوبل ألب (Écoles Universitaires de Researchche) CBH-EUR-GS (ANR- 17-EURE- 0003). نشكر النصيحة العشرة على حزمة بايثون AnalyzeFRC التي تم تطويرها في قسم فيزياء التصوير (ImPhys)، كلية العلوم التطبيقية، جامعة TU Delft.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibodyAbcamab5095Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition softwareAbbelightNEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906  
CatalaseSigma-AldrichC40
Certified Low Melting AgaroseBio-Rad1613111
Coverslips thickness 1.5H roundMarienfeld117640Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%Thermo ScientificA16828-36 
Dichroic mirrorSemrockDi03-R405/488/561/635-t1Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´biowestX0515 - 500 Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome BladesFisherScientific12191830Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid Falcon353046
Formaldehyde solution 37%Carl Roth7398Work under the fume hood
Glucose oxidaseSigma-AldrichG2133
GlycerolVWR24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647Thermo ScientificA32733TRUsed at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solutionSigma-Aldrich94403Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid SolutionChem-LabCL05.0311.1000 
JF549-HoechstLavis lab and Open Chemistry team (Janelia)JF549-HoechstUsed to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder setSigma-AldrichD89382 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unitOxxiusL6CcEquipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrateCarl RothHN03
Mercaptoethylamine (MEA)Sigma-Aldrich30070
MOPS sodium salt 98%Fisher Scientific SAS352590010
Multiband emission filterSemrockFF01-446/523/600/677Multiband emission filtration to block laser scatter light
NanodiamondsAdamas NanotechnologiesNDNV100nmHiWGA2mlStock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS cameraHamamatsuC14440-20UP 
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterileGreiner Bio-One664161Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterileGreiner Bio-One688161Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainerpluriSelect43-10030-50Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333
Single band emission filterSemrockFF01-698/70Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filterChromaET600/50mSpecific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%) Euromedex1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mmKnittel VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock coneClearLine146560
Super-resolution systemAbbelightSAFe360Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex BiomoleProlaboPRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo Scientific20491
Triton X-100Euromedex2000-B
Tween 20Euromedex2001-B
Twinsil SpeedPicodent13001002Silicone sealant
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS ovenUVOCS Inc.T10X1020 min exposure for coverslip cleaning 
Vacuum pumpVacuubrandVP 100C
Heraeus Megafuge 16R CentrifugeThermo ScientificRotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes.

المراجع

  1. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128 (4), 787-800 (2007).
  2. Rowley, M. J., Corces, V. G. Organizational principles of 3D genome architecture. Nat Rev Genet. 19 (12), 789-800 (2018).
  3. Fransz, P., de Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (22), 14584-14589 (2002).
  4. Tessadori, F., Chupeau, M. C., Chupeau, Y., Knip, M., Germann, S. Large-scale dissociation and sequential reassembly of pericentric heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells. J Cell Sci. 120 (7), 1200-1208 (2007).
  5. Caballero, L., Pasternak, T., Riyazuddin, R., Pérez-Pérez, J. M. Connecting high-resolution 3D chromatin maps with cell division and cell differentiation at the root apical meristem. Plant Cell Rep. 43 (10), 232 (2024).
  6. Pavlova, P., van Zanten, M., Snoek, B. L., de Jong, H., Fransz, P. 2D morphometric analysis of Arabidopsis thaliana nuclei reveals characteristic profiles of different cell types and accessions. Chromosome Res. 30 (1), 5-24 (2022).
  7. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  8. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  9. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 19 (11), 780-782 (1994).
  10. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 24 (14), 954-956 (1999).
  11. Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative Single-Molecule Localization Microscopy. Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).
  12. Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).
  13. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  14. Heilemann, M., van de Linde, S., Schüttpelz, M., Kasper, R., Seefeldt, B. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  15. Ricci, M. A., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. P. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  16. Xu, J., Ma, H., Jin, J., Uttam, S., Fu, R. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  17. Nozaki, T., Imai, R., Tanbo, M., Nagashima, R., Tamura, S. Dynamic organization of chromatin domains revealed by super-resolution live-cell imaging. Molecular Cell. 67 (2), 282-293.e7 (2017).
  18. Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution microscopy in plant cell imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
  19. Kracik-Dyer, E., Baroux, C. 3D STED Imaging of isolated Arabidopsis thaliana nuclei. Methods Mol Biol. 2873, 263-280 (2025).
  20. Gaifas, L., et al. Combining live fluorescence imaging with in situ cryoelectron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 122 (19), e2425047122 (2025).
  21. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
  22. Vauclare, P., Wulffelé, J., Lacroix, F., Servant, P., Canfalonieri, F., et al. Stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans is associated with major changes in Heat Unstable (HU) protein dynamics. Nucleic Acids Res. 52 (11), 6406-6423 (2024).
  23. Schubert, V. Super-resolution microscopy – Applications in plant cell research. Front Plant Sci. 8, 531 (2017).
  24. Carles, C. C., Ha, C. M., Jun, J. H., Fiume, E., Fletcher, J. C., Hennig, L., Köhler, C. Analyzing Shoot Apical Meristem Development. Plant Developmental Biology: Methods and Protocols. , 105-129 (2010).
  25. Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
  26. Tse-Kang, S. Y., et al. Intestinal immunity in C. elegans is activated by pathogen effector-triggered aggregation of the guard protein TIR-1 on lysosome-related organelles. Immunity. 57 (10), 2280-2295.e6 (2024).
  27. Lim, D., Ford, T. N., Chu, K. K., Mertz, J. Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy. J Biomed Opt. 16 (1), 016014 (2011).
  28. Culley, S., et al. Quantitative mapping and minimization of super-resolution optical imaging artifacts. Nat Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Xue, M., et al. Single amino acid mutations in histone H3.3 illuminate the functional significance of H3K4 methylation in plants. Nat Commun. 16 (1), 4408 (2025).
  30. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plugin for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  33. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  34. Van Heel, M. Similarity measures between images. Ultramicroscopy. 21 (1), 95-100 (1987).
  35. Loureiro, J., et al. Isolation of plant nuclei for estimation of nuclear DNA content: Overview and best practices. Cytometry Part A. 99 (4), 318-327 (2021).
  36. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  37. Duncan, S., Olsson, T. S. G., Hartley, M., Dean, C., Rosa, S. A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12, 13 (2016).
  38. Gutzat, R., Mittelsten Scheid, O. Preparing chromatin and RNA from rare cell types with fluorescence-activated nuclear sorting (FANS). Methods Mol Biol. 2093, 95-105 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنظيم الكروماتينمجهرية فائقة الدقةتصوير dSTORMالبنية النوويةتعديلات الكروماتينوسم الفلورو فورعزل النوىالتنظيم فوق الجيني
بروتوكول مبسط لمجهر تحديد موقع جزيء واحد في نوى الأرابيدوبسيس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.