يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من عضلة الهياكل العظمية في الفأر ونخاع العظم بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

207 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70894

⸱

يونيو 23, 2026

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من عضلات الهيكل العظمي والنخاع العظمي للفئران باستخدام الهضم الإنزيمي والكروماتوغرافيا بإزالة الحجم، مما يتيح استعادة الكسور الغنية بالحويصلات من أنسجة بنية معقدة منخفضة الإنتاج لتحليل جزيئي لاحق.

الملخص

الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) هي جسيمات نانوية الحجم مرتبطة بالدهون تتوسط التواصل بين الخلايا من خلال نقل البروتينات والدهون والأحماض الريبونوكليتيكية (RNAs). لا يزال عزل ال sEVs من الأنسجة الصلبة مثل العضلات الهيكلية (SkM) ونخاع العظم (BM) تحديا بسبب انخفاض الإنتاج والتلوث من المكونات غير الحويصلية. يصف هذا البروتوكول سير عمل قابل للتكرار لعزل الخلايا الفضائية عن الفأر SkM وBM. يتم هضم SkM إنزيميا، بينما تتم معالجة BM مباشرة ثم تخضع لاحقا للطرد المركزي التفاضلي والكروماتوغرافيا بعزل الحجم (SEC). بالنسبة ل SkM، يتم التخلص من حجم الفراغ (~2.5 مل)، ويتم جمع ~1.6 مل التالي كأجزاء غنية ب EV، عادة ما تقسم إلى 400 ميكرولتر كسور متسلسلة (F1–F4). بالنسبة ل BM، يتم التخلص من حجم فراغ بحجم 700 ميكرولتر، يليه جمع جزء مغني ب EV بحجم ~850 ميكرولتر، يمكن تقسيمه إلى ~170 ميكرولتر كسور متتالية (F1–F5) وتجميعها بناء على إثراء علامات EV. باستخدام هذا النهج، يمكن عزل sEVs من أحجام أنسجة صغيرة (حوالي 500 ميكرولتر من عضلة الفخذ الرباعية و150 ميكرولتر من عظم الفخذ والساق المجمعين BM)، مما ينتج ~10 8 جسيمات· مل−1·ملغ−1 نسيج بأقطار الجسيمات <200 نانومتر). يتم التحقق من سلامة ونقاء الحويصلات باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، وتقنية الطباعة الغربية لمؤشرات EV القانونية، مع توصيف إضافي بواسطة الكشف التداخلي الجسيمي الواحد لقياس مجموعات الحويصلات المعرفة بالتتراسبانين. تتيح هذه الطريقة العزل القابل للتكرار للحويصلات العالية النقاء من الأنسجة المعقدة هيكليا باستخدام أقل كمية ممكنة من المواد المدخلة، مما يدعم التحليلات الجزيئية والوظيفية في المراحل النهائية للحويصلات المشتقة من الأنسجة.

المقدمة

الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) هي جسيمات نانوية الحجم مرتبطة بالدهون تتوسط التواصل بين الخلايا من خلال نقل البروتينات والدهون والأحماض النووية.1. يتم إفراز هذه العينات من جميع أنواع الخلايا وتوجد في جميع السوائل البيولوجية تقريبا، حيث تعمل كحاملات رئيسية للشحن النشط بيولوجيا، بما في ذلك الببتيدات والأحماض الريبونوكليك الدقيقة (RNAs)2. يتم فرز حمولتها بشكل انتقائي، مما يتيح إيصال إشارات محددة بدقة3، وتسمح بنيتها الحويصلية بتجاوز قيود التدرج والتخفيف المعتادة للعوامل التي تفرز بحرية من خلال توصيل حمولات جزيئية مركزة لمسافات طويلة4. على الرغم من أن EVs الناتجة عن السوائل الحيوية (مثل البلازما، المصل، واللعاب) توفر لمحة مريحة عن الإشارات الجهازية، إلا أنها تمثل مجموعة مختلطة للغاية تنشأ منالعديد من الأنسجة. وهذا يجعل من الصعب تحديد أي عضو ينتج إشارة بيولوجية محددة أو كيف يتم تنظيم التواصل مع EV على مستوى الأنسجة. نظرا لأن الإشارات الكهربائية المنتشرة مجتمعة معا، يمكن تخفيف أو إخفاء التغيرات الخاصة بالأنسجة، مما يحد من القدرة على تحديد المصدر الحقيقي للإشارات6.

العضلات الهيكلية (SkM) ونخاع العظم (BM) هما أنسجة رئيسية نشطة أيضيا ووظيفيا مع تركيبات خلوية وأدوار إشارة مميزة7،8. قد يطلق كلا النسيجين مجموعات من الكائنات الكهربائية الغنية بشحنات فريدة خاصة بالأنسجة؛ ومع ذلك، يمكن أن تطغى هذه الإشارات بسهولة في البلازما على قبل الإشارات الكهربائية من الأنسجة ذات الدوران العالي مثل خلايا المناعة 8,9. العزل المباشر للعضلات أو الأبطال يزيد من الحساسية ويتيح اكتشاف التكيفات الدقيقة الخاصة بالنسيج التي قد لا تكون ملحوظة في الدورة الدموية. لذلك، توفر الإشارات الخارجية المشتقة من الأنسجة معلومات تكميلية أساسية، تكشف عن متى يطلق عضو معين الإشعاعات، ومدة استمرار تلك الإشارات، وأي التكيفات حادة وأي المزمنة. على الرغم من الاهتمام المتزايد بالمركبات الكهربائية الكهربائية، تم تطوير معظم طرق العزل المعروفة للسوائل الحيوية (مثل البلازما والمصل) أو أنظمة زراعة الخلايا. في هذه السياقات، يمكن الحصول على المركبات الكهربائية بعائد مرتفع نسبيا وأقل قدر من الاضطرابات الهيكلية. ومع ذلك، فإن عزل المركبات الكهربائية مباشرة عن الأنسجة الصلبة مثل SkM وBM يشكل تحديات تقنية ملحوظة. هذه الأنسجة معقدة هيكليا وغير متجانسة، وتتطلب خطوات تفكك ميكانيكية أو إنزيمية قد تتسبب في ظهور الشوائب الفنية، بما في ذلك مستويات عالية من البروتينات القابلة للذوبان، وشظايا العضيات، والجسيمات النانوية غير الحويصلية، مما يصعب تحقيق تحضيرات EV عالية النقاء (EV).

تحد كبير آخر في عزل EV المستخرج من الأنسجة هو نقص سير العمل الموحد لتعريف الكسور والفصل10. الطرد المركزي التفاضلي وحده غالبا ما يؤدي إلى العزل المشترك لتجمعات البروتين والحويصلات الكبيرة، بينما الطرق المعتمدة على الطرد المركزي الفائق، رغم استخدامها الواسع، يمكن أن تؤدي إلى تجمع الحويصلات، والتشوه، والتعافي المتغير حسب نوع الدوار والظروف التجريبية. تحسن طرق تدرج الكثافة النقاء لكنها تستغرق وقتا طويلا، منخفضة الإنتاجية، ويصعب توحيدها عبر المختبرات11. وبالتالي، لا توجد حاليا طريقة معتمدة على نطاق واسع وقابلة للتكرار محسنة لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة عن الأنسجة الصلبة ذات النقاء العالي والعائد المتسق10.

برزت تقنية الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم (SEC) كبديل واعد لعزل EV لأنها تفصل الجسيمات بناء على الحجم دون تعريض الحويصلات لقوى طرد مركزية عالية. يتيح SEC الفصل الفعال للبروتينات الكهربائية الصغيرة عن البروتينات القابلة للذوبان والملوثات منخفضة الوزن الجزيئي مع الحفاظ على سلامة الحويصلات ووظيفتها البيولوجية. ومن المهم أن SEC يسمح بتعريف واضح لكسور الاستبعاد، مما يتيح التعرف المتكرر على الكسور الغنية ب EV وتحسين الاتساق عبر التجارب12. ومع ذلك، تتطلب سير عمل SEC تحسينا دقيقا للعينات المشتقة من الأنسجة، خصوصا فيما يتعلق بمعالجة الأنسجة في الأعلى، وإزالة الحطام، وجمع الكسور. لمعالجة هذه القيود، طورنا بروتوكولا قابلا للتكرار وموحدا لعزل المركبات الكهربائية الفضائية عن SkM وBM. تدمج هذه الطريقة الهضم الإنزيمي المسيطر عليه للأنسجة الليفية، والطرد المركزي التفريقي لإزالة الحطام، والتنقية المعتمدة على SEC لعزل الحويصلات عالية النقاء. تم تحسين سير العمل خصيصا لتقليل التلوث من المكونات داخل الخلية مع الحفاظ على سلامة الحويصلات وتمكين التعافي المستمر من الأنسجة منخفضة الإنتاجية.

يسد هذا البروتوكول فجوة منهجية حاسمة من خلال توفير نهج عملي وقابل للتوسع لعزل الذرات الفضائية المشتقة من الأنسجة مع تجزئة محددة ونقاء معتمد، يتم تحقيقه من خلال تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، والتلوين الغربي لمؤشرات EV القانونية، والمجهر الإلكتروني للتقييم الشكلي، وتحليل الجسيمات الكهربائية الواحدة باستخدام التقاط الأجسام المضادة، وقياس حجم التداخل القياسي، والتصوير الفلوري متعدد القنوات. وهو مناسب بشكل خاص للدراسات التي تتطلب تحليل EV الخاص بالأنسجة، حيث تكون الحويصلات المشتقة من السوائل الحيوية غير كافية لتحديد أصل الإشارات الخلوي. يجب على الباحثين استخدام هذه الطريقة عندما يكون الهدف الحصول على حويصلات ذات نقاء عالي من أنسجة صلبة مع أقل تلوث وسلامة حويصلات محفوظة. على النقيض من ذلك، قد تفضل الطرق المعتمدة على الطرد المركزي الفائق للتطبيقات ذات العائد العالي حيث يكون النقاء أقل أهمية، ويمكن اختيار طرق تدرج الكثافة عند عزل مجموعات فرعية محددة من المركبات الكهربائية رغم انخفاض معدل الإنتاجية. معا، يوفر هذا البروتوكول إطارا موحدا لعزل وتوصيف الجرثومات الجزيئية المشتقة من الأنسجة، مما يمكن من إجراء تحليلات جزيئية وكيميائية حيوية ووظيفية قابلة للتكرار في المراحل اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات بجامعة ماكجيل (DOUG10029) وأجريت وفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوانات.

1. بروتوكول عزل sEV المشتق من SkM (SkM-sEV)

  1. جمع العينات وتفكك الأنسجة
    1. حصاد الأنسجة وحفظها
      1. قم بتجميد نسيج SkM مباشرة بعد الاستئصال عن طريق غمه في ميثيل بوتان مبرد مسبقا.
        ملاحظة: لتحضير ميثيل بوتان مبرد مسبقا، ضع وعاء من الميثيلبوتان في حمام جاف وأضف تدريجيا قطعا صغيرة من الثلج الجاف مباشرة إلى السائل. إذا تركت المحلول يبرد، تكون درجة الحرارة عادة ضمن نطاق −70°م إلى −80°م. حافظ على الميثيلبوتان في حمام الثلج الجاف أثناء الاستخدام للحفاظ على درجة الحرارة. اغمر النسيج لمدة تقارب 3–4 ثوان حتى يتجمد تماما، كما يتضح من تصلب الأنسجة بالكامل وفقدان المرونة.
      2. انقل الأنسجة إلى التجميد البارد.
      3. ضع العينات على الثلج الجاف.
        ملاحظة: تخزين العينات عند −80°C حتى المعالجة الإضافية. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان. التجميد السريع يحافظ فعليا على المركبات الكهربائية عندما يتم إغلاق العينات بشكل صحيح. قد يحدث الجفاف أو تلف الحويصلات إذا تركت الأنسجة مكشوفة أو خضعت لدورات تجمد وذوبان متعددة13.
    2. تفكك الأنسجة
      ملاحظة: قم بجميع الخطوات في خزانة السلامة الحيوية باستخدام أدوات وقفازات معقمة لمنع التلوث، مما قد يؤثر سلبا على نقاء السيارة الكهربائية.
      1. وزن النسيج
        1. قم بتعقيم الملقط بنسبة 70٪ إيثانول ودعه ليجف بالهواء.
        2. انقل الأنسجة المجمدة إلى طبق زراعة تعليق موزن مسبقا.
        3. وزن النسيج باستخدام توازن الميليغرام (عادة ~80–120 ملغ لكل عينة، حسب عمر الفأر وجنسه).
          ملاحظة: تم التحقق من صحة البروتوكول لكتل الأنسجة المدخلة التي تتراوح ~80–120 ملغ. بالنسبة للعينات ضمن هذا النطاق، استخدم أحجام الكواشف المحددة في الخطوات 1.2.3.1، 1.3.1.3، و1.3.2.1 دون تعديل. بالنسبة للعينات خارج هذا النطاق، قم بقياس جميع أحجام المواد بشكل متناسب مع كتلة الأنسجة مع الحفاظ على النسبة المثبتة ل RPMI-1640، والكولاجناز D، وDNase I (1000:40:4 ميكرولتر لكل 100 ملغ). وهذا يعادل تقريبا 10 ميكرولتر RPMI-1640، و0.4 ميكرولتر كولاجناز D (مخزون 100 ملغ/مل)، و0.04 ميكرولتر DNase I (مخزون 20,000 يو/مل) لكل ملغ من الأنسجة. حافظ على هذه النسب للحفاظ على تركيزات الإنزيمات النهائية أثناء التفاعل. يجب التحقق من كفاءة الهضم وعائد EV تجريبيا عند العمل خارج نطاق 80–120 ملغ.
        4. أعد العينة إلى أنبوب مبرد مسبقا واحتفظ بها على الثلج.
      2. تحضير الإنزيمات
        1. إذابة كميات الكولاجيناز D (مخزون 100 ملغ/مل) وDNase I (مخزون 20,000 U/mL) على الجليد (انظر الملف التكميلي 1، الخطوة 1.4 لتحضير مخزون الإنزيمات). تضاف هذه الإنزيمات في الخطوة 1.3.2.1 لتحقيق تركيزات نهائية أثناء التفاعل تبلغ 3.8 ملغ/مل كولاجناز D و77 U/mL DNase I. حجم الهضم النهائي هو 1.044 مل.
        2. امزج DNase I بلطف عن طريق الانقلاب. لا تدع دوامة.
      3. تحضير الأنسجة للهضم
        1. أضف 800 ميكرولتر RPMI-1640 إلى طبق زراعة تعليق معقم يوضع على الثلج.
        2. انقل النسيج إلى الطبق.
        3. اقطع النسيج إلى 6–8 قطع بحجم متساوي تقريبا (2–3 مم لكل جانب) باستخدام مشرط معقم قابل للتخلص منه. ثبت الأنسجة باستخدام ملقط معقم أثناء القطع لضمان التفتت المتساوية. أكمل هذه الخطوة خلال دقيقة واحدة لكل عينة للحفاظ على الاتساق بين العينات.
        4. حافظ على الطبق في الثلاجة طوال العملية لتقليل التلف.
    3. نقل الأنسجة والهضم الإنزيمي
      1. نقل الأنسجة
        1. قم بقص نهاية طرف ماصة P1000 المعقمة باستخدام شفرة معقمة لتكوين فتحة قطرها 2–3 مم، كافية للسماح بمرور حر لشظايا الأنسجة الناتجة في الخطوة 1.2.3.3.
          ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم رؤوس ماصات واسعة القطر (ذات فتحة عريضة) بسعة 1 مل متوفرة تجاريا، والتي توفر فتحة موحدة (عادة قطر داخلي ~2–3 مم) وتقضي على التباين المرتبط بالتقليم اليدوي.
        2. انقل شظايا الأنسجة ووسط RPMI-1640 إلى أنابيب مسبقة العلامة بسعة 1.5 مل باستخدام ماصة P1000 مزودة بالطرف المعدل. قم بإجراء 2-3 طموحات متتالية لاستعادة الشظايا المتبقية والوسط. افحص الطبق وطرف الماصة بصريا بعد النقل واستخدم ملقط معقم لنقل أي شظايا متبقية للتأكد من عدم وجود نسيج مرئي.
        3. أضف 200 ميكرولتر من RPMI-1640 إلى كل أنبوب.
      2. الهضم الإنزيمي
        1. أضف 40 ميكرولتر من مخزون الكولاجنازات D (100 ملغ/مل) و4 ميكرولتر من مخزون DNase I (20,000 وحدة سنة/مل) إلى كل أنبوب من القطع المذابة على الثلج. ينتج عن ذلك تركيزات نهائية أثناء التفاعل تبلغ 3.8 ملغ/مل من كولاجناز D و77 U/mL DNase I. بالنسبة للعينات خارج نطاق الأنسجة 80–120 ملغ، قم بضبط حجم الإنزيمات بشكل متناسب كما هو موضح في الملاحظ التالي للخطوة 1.2.1.3.
          ملاحظة: يتم معايرة هذه الأحجام لتناسب كتل الأنسجة ضمن النطاق النموذجي 80–120 ملغ. بالنسبة لكتل الأنسجة خارج هذا النطاق، قم بقياس جميع أحجام الكواشف بشكل متناسب كما هو موضح في الملاحظة التالية للخطوة 1.2.1.3 (مخزون كولاجناز D 0.4 ميكرولتر ومخزون DNase I 0.04 ميكرولتر لكل ملغ من النسيج)، مما يحافظ على تركيزات إنزيمات التفاعل النهائية نفسها بغض النظر عن كتلة النسيج.
        2. أضف الإنزيمات إلى جميع العينات في نفس الوقت عند معالجة عدة عينات.
        3. حافظ على الأنابيب على الثلج أثناء إضافة الإنزيمات.
        4. اقلب الأنابيب بلطف لتخلطها. لا تدع دوامة.
        5. حضن الأنابيب عند 37°م لمدة 30 دقيقة على خلاط منشط (24 دورة في الدقيقة، زاوية ميل 20°؛ انظر جدول المواد). تأكد من خلط متساو أثناء الحضانة.
          ملاحظة: هضم كل عينة بحجم إجمالي قدره 1.044 مل (1000 ميكرولتر RPMI-1640، 40 ميكرولتر كولاجناز D، و4 ميكرولتر DNase I لكل عينة؛ ما يعادل ~25:1 نسبة المخزن إلى الكولاجناز).
    4. إزالة الحطام
      ملاحظة: ابدأ توازن عمود SEC في بداية أول عملية طرد مركزي (الخطوة 1.4.1.1). عمود SEC يتطلب من 20 إلى 25 دقيقة للتدفق والتوازن. يضمن بدء التوازن في هذه المرحلة أن يكون العمود جاهزا لتحميل العينة فور إكمال خطوة الترشيح (الخطوة 1.4.3).
      1. أول عملية طرد مركزي
        1. قم بعمل الطرد المركزي على العينات عند حرارة 300 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام غير المهضوم، والخلايا السليمة، وقطع الأنسجة المتبقية.
        2. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة الجديدة بسعة 1.5 مل دون إزعاج الحبيبة.
      2. الطرد المركزي الثاني
        1. قم بطرد المركزي بالعينات عند 2000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4°C لإزالة الحطام الكبير، والخلايا الميتة، والأجسام المبوطة، والحويصلات الكبيرة.
        2. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة الجديدة بسعة 1.5 مل دون إزعاج الحبيبة.
          ملاحظة: الطرد المركزي الثاني اختياري ويجب تضمينه عند الحاجة لإزالة الحطام الإضافية. قم بهذه الخطوة إذا بدا السائل الفائق عكرة بشكل واضح أو يحتوي على مواد جسيمية متبقية بعد أول عملية طرد مركزي. يوصى أيضا بهذه الخطوة إذا أظهرت التحضيرات السابقة تلوثا بعلامات داخل الخلية (مثل Calnexin أو BiP) في كسور SEC الغنية ب EV أو وجود جسيمات غير حويصلية بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل. يجب التحقق من الحاجة إلى هذه الخطوة أثناء تحسين البروتوكول الأولي لكل نوع من الأنسجة.
      3. الترشيح
        1. قم بعمل مصفاة خلايا معقمة بحجم 30 ميكرومتر مسبقا عن طريق شطفها ب RPMI-1640 لتوازن الغشاء وتقليل فقدان العينة. تخلص من الشطف.
        2. قم بترشيح كل عينة عبر مصفاة الخلية المبللة مسبقا بحجم 30 ميكرومتر إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة منخفضة البروتين بحجم 1.5 مل لإزالة الحطام الخلوي المتبقي والجسيمات الكبيرة قبل SEC.
        3. دع العينات تمر عبر المرشح بالجاذبية.
        4. اترك من 10 إلى 15 دقيقة لكل عينة للترشيح.
          ملاحظة: يكتمل الترشيح عندما لا يبقى سائل مرئي فوق غشاء المرشح ويكون حجم الترشيح في أنبوب الجمع مستقرا. إذا كان الترشيح أبطأ أو توقف عن العمل، فقد يشير ذلك إلى انسداد بسبب بقايا الحطام؛ في مثل هذه الحالات، فكر في تكرار خطوة التوضيح أو تقليل حمل العينة.
        5. اجمع 550–600 ميكرولتر من المادة الفائقة المفلترة للتحميل التالي على عمود SEC. لتحقيق الاتساق عبر العينات، قم بتطبيع حجم التحميل إلى 500 ميكرولتر لكل عمود (انظر الخطوة 2.2.1)، بغض النظر عن الحجم الإجمالي المسترجع.
  2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)
    1. عمود توازن لجنة الأوراق المالية والبورصات
      ملاحظة: قم بهذه الخطوة أثناء الطرد المركزي إذا أمكن.
      1. غسل عمود SEC ب 17 مل من 1× PBS (مرشح 0.22 ميكرومتر).
      2. يسمح بمرور الحجم الكامل عبر العمود بالجاذبية بمعدل تدفق متوقع 0.75 مل/دقيقة (20–25 دقيقة إجمالا لحجم تدفق 17 مل). قد تشير معدلات التدفق الأسرع أو الأبطأ إلى توازن عمودي غير مناسب أو انسداد.
      3. حافظ على العمود وPBS عند درجة حرارة الغرفة (RT، 21°C ±2°C) أثناء التوازن لضمان معدل تدفق ثابت وأداء عمودي مثالي.
      4. تحضير أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة البروتين بسعة 1.5 مل لجمع جميع الأجزاء.
      5. جهز أنبوبا إضافيا لجمع حجم الفراغ إذا لزم الأمر.
    2. تحميل العينات والاستنتاج
      1. تحميل 500 ميكرولتر من المادة الفائقة المفلترة على عمود SEC.
      2. دع العينة تدخل الراتنج بالكامل. تصل النقطة النهائية عندما يصل الغضروف الهلالي السائل إلى سطح طبقة الراتنج، دون أن يبقى سائل مرئي فوق الراتنج بينما يبقى الراتنج رطبا بشكل واضح.
      3. لا تدع الغضروف الهلالي ينخفض تحت سطح الراتنج أو أن يجف العمود، لأن ذلك يدخل الهواء إلى سرير الراتنج ويعطل عملية الخارج. عندما يصل الغضروف الهلالي السائل إلى سطح الراتنج (كما هو معرف في الخطوة 2.2.2)، تابع فورا إلى الخطوة 2.2.4 دون تأخير.
      4. أضف فورا 2 مل PBS لبدء التصويب.
      5. اجمع حجم الفراغ (~2.5 مل).
      6. تخلص من حجم الفراغ أو احتفظ به كجزء غير كهربائي.
      7. ابدأ بجمع الجزء المخصب بالطاقة الكهربائية فور انتهاء حجم الفراغ البالغ 2.5 مل.
      8. اجمع إجمالي 1.6 مل من المشروب المغني ب EV بعد حجم الفراغ، إما كجزء مستمر واحد في أنبوب واحد أو كأجزاء متسلسلة يتم تجميعها لاحقا.
      9. بدلا من ذلك، اجمع الكسور المتسلسلة بحجم 0.4 مل لتحسين النقاء مقابل الإنتاج. يوصى بأحجام الكسور الأصغر عندما تكون هناك حاجة إلى نقاء أعلى (مثل التحليلات البروتيومية أو التطبيقات الحساسة في المراحل اللاحقة)، بينما قد تستخدم الكسور الأكبر لتعظيم العائد الكلي للطاقة الكهربائية.
      10. تقييم الكسور لإثراء EV باستخدام طرق التوصيف (مثل Western blot لعلامات EV والملوثات، وNTA)، وجمع الكسور الغنية بEV كما هو معرف في قسم التوصيف.
        ملاحظة: حافظ على تدفق العمود باستمرار. وأثناء انتهاء جزء واحد، أضف PBS للحفاظ على سائل ثابت فوق طبقة الراتنج ومنع جفاف العمود. استخدم أنابيب منخفضة الارتباط بالبروتين وخالية من النوكلياز للجمع.
    3. التركيز
      1. تركيز عينات EV باستخدام مرشحات طرد مركزي (قطع وزن جزيئي 100 كيلو دالتون [MWCO]) للتطبيقات اللاحقة (مثل تسلسل الحمض النووي الريبي، البروتيوميك، أو البقعة الغربية).
      2. قم بغسل الفلاتر مسبقا باستخدام PBS قبل الاستخدام.
      3. قم بطرد العينات عند 4000 × جرام عند 4°C، وفحص كل 2–3 دقائق حتى يصل الحجم النهائي المطلوب (عادة 50–100 ميكرولتر). استخدم أحجام نهائية أقل (مثلا، ~50 ميكرولتر) للتطبيقات التي تتطلب تركيزا أعلى وأحجاما أعلى (مثل ~100 ميكرولتر) عندما يفضل تعظيم الاسترجاع.
        تحذير: تجنب التركيز الزائد عن طريق إيقاف الطرد المركزي بمجرد تحقيق الحجم المستهدف.
      4. استرجع الريتنات عن طريق العزف اللطيف على الماصة.
      5. سجل أحجام العينات قبل وبعد التركيز لتقدير التعافي، إذا لزم الأمر. قد يستخدم NTA لتقييم تركيز الجسيمات قبل وبعد التركيز، إذا كان متاحا.
    4. التخزين
      1. احتفظ بالأجزاء الغنية بالطاقة الكهربائية على التجميد أو عند 4°C للاختبارات الفورية (مثل NTA وميكروسكوب إلكتروني النقل [TEM]) وقم بمعالجة الأجزاء خلال 24 ساعة ل TEM وخلال 48 ساعة ل NTA.
      2. عينات Aliquot EV في أنابيب منخفضة الارتباط بالبروتين للتخزين.
      3. تخزين العينات عند −80°C للاستخدام طويل الأمد.
      4. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.

2. بروتوكول عزل sEV المشتق من BM (BM-sEV)

  1. جمع العينات وتفكك الأنسجة
    1. حصاد الأنسجة وحفظها
      1. لا تقم بتجميد العظام مباشرة بعد الاستئصال، لأن ذلك يشد النخاع ويعقد عملية الاستخراج باستخدام طريقة الأنبوب المغفور. بدلا من ذلك، حافظ على العظام على الجليد أو عند 4°C خلال فترات معالجة قصيرة قبل المعالجة أو التجميد كما هو موضح في الخطوة 3.1.1.4 (وضعها على الجليد الجاف قبل التخزين −80°C).
      2. إزالة العضلات المحيطة والأنسجة الضامة من العظام المقطوعة.
      3. انقل العظام إلى الدروع المجمدة.
      4. ضع العينات على الثلج الجاف.
        ملاحظة: تخزين العينات عند −80°C حتى المعالجة الإضافية.
    2. معالجة BM
      ملاحظة: قم بجميع الخطوات في خزانة السلامة الحيوية باستخدام أدوات وقفازات معقمة لمنع التلوث، مما قد يؤثر سلبا على نقاء السيارة الكهربائية.
      1. قم بوزن أنابيب الطرد المركزي بحجم 1.5 مل مسبقا ووضع علامة قبل إضافة أي مادة. احسب كتلة BM بمقارنة أوزان الأنابيب قبل وبعد الاستخلاص.
      2. جهز إعداد الأنبوب المثقوب بإدخال أنبوب PCR بسعة 0.2 مل (مع الغطاء سليم) في أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل مع تركيب محكم. قم بثقب أسفل أنبوب 0.2 مل مرة واحدة باستخدام إبرة معقمة بوزن 16 جيلون مثبتة عموديا على القاعدة، مما ينتج ثقبا واحدا موحدا بقطر ~1.6 مم. جهز إعدادا واحدا لكل ساق لكل فأرة.
      3. ضع الساق، بعد أن تم تنظيفها من جميع العضلات والأنسجة المحيطة، في طبق بترى معقم.
      4. افصل عظم الفخذ عن عظم الساق عن طريق قطع المسافة المفصلية.
      5. اقطع طرفي عظم الفخذ والساق لكشف النخاع الأحمر. ضع العظام في أنبوب PCR المثقوب الموجود داخل أنبوب 1.5 مل وأغلق التجميع باستخدام بارافيلم لضمان تثبيت آمن أثناء الطرد المركزي.
      6. قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 10 ثوان في جهاز طرد مركزي دقيق على طاولة عند حوالي 8,000 × جرام، أو أقرب إعداد ممكن في الجهاز المستخدم، في درجة حرارة الغرفة.
      7. تحقق من نجاح استخراج النخاع بثلاثة معايير: (1) تظهر العظام بيضاء بشكل واضح دون وجود نخاع أحمر متبقي، (2) الحبيبة في الأنبوب السفلي تبدو حمراء داكنة ومضغوطة، تملأ عادة الطرف المخروطي لأنبوب 1.5 مل، و(3) كتلة النخاع المقاسة (الخطوة 3.1.2.9) تقع ضمن النطاق المتوقع ~15–30 ملغ لكل فأر.
      8. أعد وضع العظام أو أعد قطع العظام وكرر الدوران القصير إذا بقي نخاع أحمر مرئي داخل العظم.
      9. وزن الأنابيب مرة أخرى لتحديد كتلة النخاع المستخرج (عادة ~15–30 ملغ لكل عينة، حسب عمر الفأر وجنسه وكفاءة الاستخلاص).
        ملاحظة: تم التحقق من صحة البروتوكول لإنتاجية النخاع التي تتراوح بين ~15–30 ملغ لكل عينة. نظرا لأن حجم إعادة التعليق في RPMI-1640 يبقى ثابتا عند 250 ميكرولتر بغض النظر عن كتلة النخاع (الخطوة 3.1.2.10)، يتم تطبيع العائد الكهربائي إلى كتلة النخاع الابتدائي المقاسة أثناء التحليل اللاحق (الجسيمات·مللترˆ�1·ملغ-1 نسيج النسيج). بالنسبة للعينات التي تقل جرعتها بكثير عن 15 ملغ، تجمع نخاع الفئران المطابقة (نفس العمر، الجنس، والعظم) قبل إعادة التعليق للحفاظ على مدخلات كافية لتوصيف المراحل التالية. بالنسبة للعينات التي تزيد عن 30 ملغ، إما تقسيم النخاع على معلقتين منفصلتين بسعة 250 ميكرولتر لكل منهما أو قم بقياس حجم RPMI-1640 بشكل متناسب (~12.5 ميكرولتر لكل ملغ من النخاع) لمنع إعادة التعليق غير الكاملة؛ في كلتا الحالتين، طبق نفس التطبيع لكل كتلة أثناء التحليل.
      10. أضف 250 ميكرولتر RPMI-1640 إلى كل أنبوب. حافظ على حجم ثابت عبر العينات بغض النظر عن كتلة النخاع للسماح بتطبيع العائد الكهربائي لكتلة النخاع الابتدائية. احتفظ بالعينات على الثلج.
      11. أعد تعليق النخاع عن طريق التوصيل بلطف للأعلى والأسفل 10–15 مرة باستخدام ماصة P1000 حتى يبدو التعليق متجانسا بصريا، دون بقاء أي كتلات أو شظايا نسيج سليمة. تجنب الحفر بقوة أو تكوين الفقاعات، التي قد تعطل سلامة الحويصلات.
  2. إزالة الحطام
    1. أول عملية طرد مركزي
      1. قم بعمل الطرد المركزي على العينات عند حرارة 300 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام غير المهضوم، والخلايا السليمة، وقطع الأنسجة المتبقية.
      2. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة الجديدة بسعة 1.5 مل دون إزعاج الحبيبة.
    2. الطرد المركزي الثاني
      1. قم بعمل الطرد المركزي للعينات عند 2000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الكبير.
      2. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة الجديدة بسعة 1.5 مل دون إزعاج الحبيبة.
    3. الطرد المركزي الثالث
      1. قم بطرد المركزي بالعينات عند 10,000 × جرام لمدة 30 دقيقة عند 4°C لإزالة الأجسام المبوتجة والحويصلات الكبيرة.
      2. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة الجديدة بسعة 1.5 مل دون إزعاج الحبيبة.
      3. تأكد من الحصول على حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر من المادة الفائقة.
  3. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)
    1. تحضير الأعمدة
      1. توازن عمود SEC عن طريق الغسل ب 6 مل من 1× PBS (مفلتر 0.22 ميكرومتر).
        ملاحظة: حجم التوازن مخصص للعمود ويجب أن يتطابق مع نوع العمود المدرج في جدول المواد. يتطلب هذا العمود حجم توازن 6 مل، وهو ما يختلف عن العمود المستخدم لعينات SkM.
      2. اسمح للحجم الكامل أن يمر عبر الجاذبية.
      3. حافظ على العمود وPBS عند RT أثناء التوازن لضمان معدل تدفق وأداء عمود مثاليان.
    2. تحميل العينات والاستنتاج
      1. تحميل 150 ميكرولتر من المادة الفائقة المفلترة على عمود SEC.
      2. دع العينة تدخل الراتنج بالكامل. تصل النقطة النهائية عندما يصل الغضروف الهلالي السائل إلى سطح سرير الراتنج دون أن يبقى سائل مرئي فوق الراتنج بينما يبقى الراتنج رطبا (كما هو موضح في الخطوة 2.2.2).
      3. لا تدع الغضروف الهلالي ينخفض تحت سطح الراتنج أو أن يجف العمود (انظر نقطة النهاية المحددة في الخطوة 3.3.2.2)، لأن ذلك يدخل الهواء إلى سرير الراتنج ويعطل عملية الخارج. عندما يصل الغضروف الهلالي السائل إلى سطح الراتنج، تابع فورا الخطوة 3.3.2.4 دون تأخير.
      4. أضف فورا 550 ميكرولتر PBS لبدء التفريغ.
      5. اجمع حجم الفراغ (700 ميكرولتر).
      6. تخلص من حجم الفراغ أو احتفظ به كجزء غير كهربائي.
      7. ابدأ بجمع الجزء المغني بالطاقة الكهربائية مباشرة بعد انفصال حجم الفراغ البالغ 700 ميكرولتر.
      8. اجمع 850 ميكرولتر من اللوات المخصي بالطاقة الكهربائية بعد حجم الفراغ البالغ 700 ميكرولتر.
      9. بدلا من ذلك، اجمع الكسور المتسلسلة بحوالي 170 ميكرولتر لتحسين النقاء مقابل الإنتاج.
        ملاحظة: يوصى بأحجام الكسر الأصغر عندما تكون هناك حاجة إلى نقاء أعلى (مثل التحليلات البروتيومية أو التطبيقات الحساسة في المراحل اللاحقة)، بينما يمكن استخدام الكسور الأكبر لتعظيم العائد الكلي للطاقة الكهربائية.
      10. قيم الكسور لمؤشرات المركبات الكهربائية واجمع الكسور الغنية بالمركبات الكهربائية حسب الحاجة.
        ملاحظة: حافظ على تدفق العمود باستمرار. وأثناء انتهاء جزء واحد، أضف PBS للحفاظ على سائل ثابت فوق طبقة الراتنج ومنع جفاف العمود.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتقييم فعالية هذا البروتوكول في عزل الجرعات السحابية المشتقة من الأنسجة، تعرض نتائج تمثيلية من عينات SkM وBM. تم تعريف العزل الناجح ب (1) إثراء علامات EV القياسية (TSG101، CD63، CD81، وCD9) في كسور SEC المبكرة، (2) الحد الأدنى من الكشف عن الملوثات داخل الخلايا (مثل Calnexin و BiP)، (3) توزيع أحادي النمط لحجم الجسيمات مع غالبية الجسيمات <200 نانومتر)، (4) تصور الحويصلات السليمة المرتبطة بالغشاء بواسطة TEM، و(5) تركيز أعلى للجسيمات في الكسور الغنية ب EV مقارنة بالكسور الغنية بالبروتينات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول نهجا قويا وقابلا للتكرار لعزل التحضيرات الغنية ب sEV مباشرة من SkM وBM، وهما أنسيان منخفضي الإنتاج ومتنوعان للغاية. بينما يعتبر عزل العزل الكهربائي الكهربائي مثبتا جيدا للسوائل الحيوية وأنظمة زراعة الخلايا، لا تزال الطرق الموحدة للسوائل الكهربائية المشتقة من الأنسجة محدودة بسبب التحديات المرتبطة بتفكك الأنسجة، والتلوث من المواد داخل الخلية، وتفاوت الإنتاجية. هنا، نستعرض خطوات حاسمة، واستراتيجيات استكشاف المشاكل، والقيود التي تؤثر على نقاء المركبات الكهربائية، والإنتاجي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر جيني يانغ، داريوش زورافك، وفولوديمير يركو على المساعدة الفنية والمناقشات المفيدة. نحن ممتنون لمنصة مركز الطب النانوي التطبيقي، وخاصة نديم تاويل ولورا مونتيرميني، لدعمهم في توصيف الحويصلات خارج الخلية وجمع البيانات. نشكر أيضا موظفي منشأة الحيوانات، جويلين غادوري وتارا طومسون، على مساعدتهم في التعامل مع الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

```html
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 mL centrifuge tubeSarstedt72.690.300General microcentrifuge tube used throughout protocol
1.5 mL low-protein-binding tubeSarstedt72.706.600Used for EV handling, SEC fraction collection, and storage
0.2 mL PCR tubeFisher Scientific14-222-262Used for poked-tube bone marrow extraction setup
16 G needleBD305197Used to puncture the 0.2 mL PCR tube
30 µm cell strainerMiltenyi Biotec 130-098-458Used for skeletal muscle sample filtration
70% ethanolSigma-Aldrich1.11727Used to sterilize tweezers
Biosafety cabinetNANAUsed for sterile tissue handling
Bone cutting instrumentFisher Scientific10-001-976Used to separate femur and tibia and expose marrow
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001Used for Western blot blocking and antibody dilution
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Used for HEPES buffer preparation
Carbon-coated copper grid, 200-meshSigma-Aldrich930342Used for TEM sample preparation
Centrifugal filter, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096Used for EV concentration
Collagenase DRoche11088858001Used for skeletal muscle enzymatic digestion
CryovialSarstedt72.690.300Used for tissue and bone storage
Deionized water (ultrapure)NANAUsed for buffer preparation and TEM washing steps
DNase IRoche11284932001Used for skeletal muscle enzymatic digestion
Dry iceNANAUsed for sample cooling and transport
Enhanced chemiluminescence substrateBiorad1705061Used for Western blot detection
Filter unit, 0.22 µmSarstedt83.3941.501Used to filter PBS where applicable
Forceps / tweezersMilliporeSigmaF3892Used for tissue handling
GlutaraldehydeNANAUsed for TEM fixation
GlycineNANAUsed in TEM grid washing steps
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095Used for DNase I stock preparation
HEPESBioShopHEP001.500Used for HEPES-NaOH buffer preparation
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinThermo FisherS911Used for Western blot detection
Imaging system for chemiluminescenceBiorad12003153Used to image Western blot membranes
KClBioShopPOC308Used for HEPES buffer preparation
Magnesium chloride (MgCl2)BioShopMAG510.500Used for HEPES buffer preparation
2-MethylbutaneThermo Fisher78-78-4Used for skeletal muscle snap-freezing
Milligram balanceMilliporeSigmaZ741359Used for tissue and marrow weighing
NaClBioShopSOD004.1Used for HEPES buffer preparation
Nano-particle tracking analysis instrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 used for particle sizing and counting
NaOHBioShopSHY500.500Used for pH adjustment
Nitrocellulose membraneBioRad1704271Used for Western blot transfer
Nutating mixerLabnet S0500Used during enzymatic digestion
P1000 pipetteMilliporeSigmaFA10006M-1EAUsed for tissue transfer
Pipette tip, 1 mLSarstedt70.3050.275Tip is trimmed to widen opening for tissue fragment transfer
Phosphate-buffered saline (PBS)WisentINC 811.012-FLUsed throughout protocol; also used for SEC equilibration and elution
Phosphatase inhibitorMilliporeSigma4906845001Used for Western blot lysate preparation
Petri dishMilliporeSigmaCLS351146Used for bone marrow preparation
Polyacrylamide gel, 4–20% gradient stain-freeBioRad4561094Used for Western blot separation
Protease inhibitorMilliporeSigma11697498001Used for Western blot lysate preparation
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR7388-500MLUnsupplemented; no FBS or antibiotics
RIPA buffer, 10×Merck20-188Used for protein extraction for Western blotting
Scalpel, sterile disposableUltident Paragon02-90000-10Used to mince skeletal muscle tissue
SEC column, original 70 nmIZONICO70PUsed for skeletal muscle SEC
SEC column, single 70 nmIZONICS70PUsed for bone marrow SEC
Sodium azideSigma-AldrichS2002Added to PBS for washing the column
Sodium cacodylate bufferNANAUsed for TEM fixation buffer
Luer Slip Single Use Syringe without Needle MedlineSYR101020Used during NTA acquisition if applicable
Transmission electron microscopeFEINATecnai G2 Spirit Twin 120 kV Cryo-TEM used for TEM imaging
Tween-20BioShopTWN508.1Used in PBS-T for Western blotting
Uranyl acetateNANAUsed for TEM negative staining
Whatman filter paperMilliporeSigmaWHA1003055Used to wick excess TEM stain
```

المراجع

  1. Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
  2. Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 27 (2024).
  3. Fonseka, P., Mathivanan, S. Extracellular vesicles biogenesis, cargo sorting and implications in disease conditions. Cells. 12 (2), (2023).
  4. Taraboletti, G., et al. Bioavailability of VEGF in tumor-shed vesicles depends on vesicle burst induced by acidic pH. Neoplasia. 8 (2), 96-103 (2006).
  5. Dakup, P. P., et al. Challenges and opportunities in state-of-the-art proteomics analysis for biomarker development from plasma extracellular vesicles. Proteomics. , (2025).
  6. Li, Y., et al. EV-origin: Enumerating the tissue-cellular origin of circulating extracellular vesicles using exLR profile. Comput Struct Biotechnol J. 18, 2851-2859 (2020).
  7. Shero, J. A., Lindholm, M. E., Sandri, M., Stanford, K. I. Skeletal muscle as a mediator of interorgan crosstalk during exercise: Implications for aging and obesity. Circ Res. 136 (11), 1407-1432 (2025).
  8. Vanhie, J. J., et al. The role of exercise- and high-fat diet-induced bone marrow extracellular vesicles in stress hematopoiesis. Front Physiol. 13, 1054463 (2022).
  9. Pinto, A. C., et al. Exploiting the therapeutic potential of contracting skeletal muscle-released extracellular vesicles in cancer: Current insights and future directions. J Mol Med (Berl). 102 (5), 617-628 (2024).
  10. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  11. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835 (2023).
  12. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145 (2021).
  13. Ahmadian, S., et al. Different storage and freezing protocols for extracellular vesicles: A systematic review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 453 (2024).
  14. Watanabe, S., et al. Skeletal muscle releases extracellular vesicles with distinct protein and microRNA signatures that function in the muscle microenvironment. PNAS Nexus. 1 (4), pgac173 (2022).
  15. Magalhaes-Gama, F., et al. Exploring cell-derived extracellular vesicles in peripheral blood and bone marrow of B-cell acute lymphoblastic leukemia pediatric patients: Proof-of-concept study. Front Immunol. 15, 1421036 (2024).
  16. Potter, D. R., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate pulmonary vascular permeability and lung injury induced by hemorrhagic shock and trauma. J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 245-256 (2018).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Org Biomol Chem. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Kim, T., Hong, J. W., Lee, L. P. Efficient methods of isolation and purification of extracellular vesicles. Nano Converg. 12 (1), 45 (2025).
  19. Bracht, J. W. P., et al. Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).
  20. Mo, W., et al. Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications. J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من عضلة الهياكل العظمية في الفأر ونخاع العظم بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.