ملاحظة سريرية لإضافة فيتامين د إلى نظام يعتمد على البروكول لدى مرضى اعتلال الكلى السكري

ملخص

قيمت هذه الدراسة الاستعادية فيتامين د المضاف إلى علاج الفالسارتان، والأتورفاستاتين، والبروبوكول في 150 مريضا يعانون من اعتلال الكلى السكري في المرحلة الثالثة خلال 8 أشهر. أظهر المرضى الذين تلقوا فيتامين د تحسنا أكبر في وظائف الكلى، والمعايير الأيضية، والعلامات المناعية، والمؤشرات الالتهابية مقارنة بالمرضى الذين تلقوا العلاج القياسي فقط.

الملخص

هدفت هذه الدراسة إلى دراسة الفعالية العلاجية لفيتامين د كمكمل للعلاج الثلاثي القائم على البروبوكول (فالسارتان + أتورفاستاتين + بروبوكول) لدى مرضى اعتلال الكلى السكري (DN) وتقييم تأثيره على وظيفة المناعة. تم تسجيل ما مجموعه 150 مريضا من مرض DN (المرحلة الثالثة من موغنسن) بأثر رجعي من يوليو 2022 إلى مايو 2024. استنادا إلى أنظمة الأدوية المختلفة التي تلقوها في الممارسة السريرية، تم تقسيمها إلى مجموعة ضابطة (n = 56) تتلقى علاجا ثلاثيا (فالسارتان + أتورفاستاتين + بروبوكول) ومجموعة مراقبة (n = 94) تتلقى علاجا رباعيا (علاج ثلاثي + فيتامين د). تم تحديد توزيع المجموعة بناء على العلاج الفعلي الذي تم إعطاؤه، وليس بالعشوائية. تلقت كلتا المجموعتين حقن يومية للأنسولين في نفس الوقت لمدة 8 أشهر. تم تقييم المعايير السريرية، بما في ذلك وظيفة الكلى (SCr، 24 ساعة UPE، UAlb/UCR)، ملفات الجلوكوز والدهون، مؤشرات المناعة (CD3+، CD4+ cells، نسبة CD4+/CD8+)، والعوامل الالتهابية (hs-CRP، IL-6، TNF-α، MCP-1)، قبل وبعد العلاج. أظهرت النتائج أن مجموعة المراقبة أظهرت تحسنا أكبر بشكل ملحوظ في وظائف الكلى، والتحكم في الجلايسيمية، وملفات الدهون، وتعديل المناعة (نسب مرتفعة من CD3+ وCD4+، ونسبة أعلى من CD4+/CD8+، وانخفاض مؤشرات الالتهاب) مقارنة بالمجموعة الضابطة (جميعها P <0.05). فيما يتعلق بالخروج السريري، أظهرت مجموعة المراقبة معدل أعلى (45.74٪ مقابل 39.29٪)، لكن هذا الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية (χ² = 0.596، P = 0.440). في الختام، ارتبط إضافة فيتامين د بفوائد سريرية أكبر من العلاج الثلاثي القائم على البروبوكول وحده في هذه المجموعة المسترجعة من مرضى DN، بما في ذلك تحسينات في وظائف الكلى، وملفات الجلوكوز والدهون، ومؤشرات وظيفة المناعة. تشير هذه النتائج إلى أن فيتامين د قد يكون عامل مساعد واعد لإدارة الحمض النووي، لكن هناك حاجة إلى المزيد من التجارب العشوائية المحكمة لتأكيد السببية.

المقدمة

اعتلال الكلى السكري (DN)، وهو مشكلة شديدة جدا في الأوعية الميكرووية في مرض السكري، هو الآن المساهم الرئيسي في فشل الكلى على مستوى^{العالم.} مع ارتفاع حالات السكري، تم التركيز أكثر على إدارة ومعالجة DN². ومع ذلك، وعلى الرغم من التقدم في علاج المرض المرضي، تظل نتائج المرضى سلبية، مما يؤثر بشكل كبير على رفاهيتهم ويفرض عبئا ماليا باهظا. لذلك، فإن اكتشاف علاجات أكثر فعالية لوقف تقدم DN وتقليل حدوث ESRD له أهمية سريرية واجتماعية حاسمة ^3,4.

ينشأ DN ويتطور عبر عمليات معقدة متعددة، تشمل اختلال تنظيم الجلوكوز، والتلف التأكسدي، والتفاعلات الالتهابية، واضطرابات تدفق الدم⁵. تتفاعل هذه الآليات لتعزيز إصابات الكلى والتليف. حاليا، يشمل علاج DN بشكل رئيسي التحكم في مستويات السكر في الدم، وضغط الدم، والدهون، وتطبيق ACEI أو ARB لتأخير تقدم المرض ^6,7. ومع ذلك، فإن فعالية هذه العلاجات محدودة، وغالبا ما ينتهي الأمر بالمرضى بداء ESRD، مما يحتاجه إلى الغسيل الكلوي أو زراعة الكلى⁸.

في السنوات الأخيرة، حظي دور فيتامين د في إدارة DN باهتمام كبير. إنه عنصر غذائي قابل للذوبان في الدهون ضروري لتوازن الكالسيوم والفوسفور، ونمو الخلايا وتخصصها،^ووظيفة المناعة. تشير الأبحاث إلى وجود علاقة قوية بين نقص فيتامين د وتلف الأوعية الدقيقة لدى السكري. يحمي فيتامين د صحة الكلى من خلال عدة آليات، مثل تحسين مقاومة الأنسولين، وتثبيط الاستجابة الالتهابية، وتقليل الإجهاد التأكسدي، وتنظيم RAS¹⁰. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لفيتامين د أن يقلل من البروتين البولي ويمنع تلف الخلايا الجسدية، مما يؤخر تقدم الحمض العصبي العصبي. لذلك، قد تصبح مكملات فيتامين د استراتيجية جديدة لعلاج DN¹¹. البروبوكول هو مضاد أكسدة يعاكس الإجهاد التأكسدي بشكل أساسي عن طريق تثبيط أكسدة الأحماض الدهنية وتقليل تكوين الجذور¹². في DN، يساهم الإجهاد التأكسدي بشكل كبير في تلف الكلى. تشير الأبحاث إلى أن بروبوكول يقلل بشكل فعال من مستويات البروتين البولي ويعزز وظيفة الكلى لدى المصابين بالحالة¹³. علاوة على ذلك، له البروبوكول أيضا تأثيرات في تنظيم دهون الدم وتثبيط تصلب الشرايين، مما يدعم تطبيقه في علاج DN¹⁴.

بعيدا عن الآليات الكلوية المحلية، أبرزت الدراسات الحديثة على مستوى الأنظمة أن الإجهاد التأكسدي والإشارات الالتهابية تلعب دورا مركزيا في العمليات العصبية الالتهابية والعصبية الطرفية، خاصة في الأمراض الأيضية والأوعية الدموية¹⁵. توفر التحليلات التكاملية لإشارات الأكسدة والاختزاز وتفاعلات أكسيد النيتريك وROS إطارا ميكانيكيا يربط بين خلل البطانة الداخلية، واختلال التوازن التأكسدي، وإصابة الأعضاء عبر اضطرابات القلب والأوعية الدموية والعصبية¹⁶. علاوة على ذلك، قد يؤثر التدخل في الوطاء في الالتهاب العصبي المرتبط بالتوتر وتنظيم الغدد الصماء العصبية على التوازن الأيضي الجهازي ونتائج الكلى¹⁷. تدعم هذه المنظورات الأوسع المنطق القائل بأن استهداف الالتهاب والإجهاد التأكسدي، كما نفعل مع فيتامين د والبروبوكول، يمكن أن يكون له فوائد متعددة الأنظمة تتجاوز الكلى، خاصة لدى مرضى السكري الذين يعانون من أمراض مصاحبة معقدة¹⁸.

في الختام، كل من فيتامين د والبروبوكول فعالان في إدارة الحمض العصبي، وقد يحقق دمجهما تأثيرا علاجيا مثاليا. لذلك، اكتسبت دراسة استخدام فيتامين د والبروبوكول معا لتحقيق التآزر زخما في أبحاث علاج DN. يكمل كل من فيتامين د والبروبوكول بعضهما البعض في طرق عملهما، وقد يعزز التطبيق المشترك تأثيرات مضاد الأكسدة، ومضادات الالتهابات، وتنظيم الاستجابة المناعية، لحماية وظائف الكلى^{بشكل أكثر} شمولا. بالإضافة إلى ذلك، قد يقلل فيتامين د من الالتهاب لدى مرضى DN من خلال تنظيم وظيفة المناعة، مما يحسن التوقعات بشكل أكبر. أظهرت الدراسات أن مرضى الخلايا التائية يعانون من خلل في المناعة، والذي يظهر من خلال اختلال في المجموعات الفرعية من الخلايا التائية ومستويات غير طبيعية من السيتوكينات^20,21. هذه الاضطرابات المناعية لا تشارك فقط في عملية إصابة الكلى، بل قد تؤثر أيضا على استجابة المريض للعلاج والتوقعات²². لذلك، فإن تقييم مؤشرات وظيفة المناعة أمر بالغ الأهمية لتوجيه إدارة DN.

نظرا للأدلة المباشرة المحدودة على الجمع بين فيتامين د والبروبوكول في DN، صممت الدراسة لاستكشاف ما إذا كان هذا النظام المركب يقدم فوائد سريرية إضافية وتأثيرات مناعية إضافية مقارنة بالعلاج الثلاثي فقط. باستخدام تصميم تجريبي دقيق وتقنيات تحليلية علمية، ستبحث هذه الدراسة بشكل شامل في الفوائد العلاجية لفيتامين د مع بروبوكول لدى مرضى DN وتأثيره على مؤشرات وظيفة المناعة. تماشيا مع الخلفية السابقة، اختارت الدراسة الحالية فالسارتان (ARB) للتحكم في ضغط الدم وتأخير تقدم الكلى، وأتورفاستاتين لإدارة خلل الدهون، والأنسولين للتحكم في السكر كنظام أساسي. تمت إضافة بروبوكول كمضاد أكسدة لاستهداف الإجهاد التأكسدي، وهو آلية رئيسية في تقدم الحمض التأكسدي. تم إضافة فيتامين د إلى مجموعة المراقبة بسبب دوره المتزايد في تعديل المناعة وحماية الأنف. وبناء عليه، تلقت مجموعة الضابط علاجا ثلاثيا (فالسارتان + أتورفاستاتين + بروبوكول)، بينما تلقت مجموعة المراقبة علاجا رباعيا (فالسارتان + أتورفاستاتين + بروبوكول + فيتامين د). تلقت كلتا المجموعتين تسريب يومي للأنسولين طوال فترة العلاج التي استمرت 8 أشهر. بعد العلاج، لوحظت تغيرات في وظائف الكلى، ومستويات جلوكوز الدم والدهون، ومجموعات الخلايا المناعية، ومؤشرات الالتهاب في كلا المجموعتين. تم تقييم الأهمية السريرية لفيتامين د مع بروبوكول لإدارة الحمض النووي من خلال نتائج علاجية متباينة. هدفه هو تقديم استراتيجيات مبتكرة لعلاج المرض العصبي، وتقديم خيارات علاجية أكثر فعالية للمرضى، وتحسين جودة حياتهم، وتخفيف النفقات الطبية.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى خبي العام (رقم الموافقة: 2025-LW-0265). نظرا للطبيعة الرجعية للدراسة، تم الحصول على موافقة الأخلاقيات بعد فترة جمع البيانات، والتي سمحت بها لجنة الدراسات غير التدخلية باستخدام بيانات سريرية مجهولة. تم التنازل عن شرط الموافقة المكتوبة المستنيرة.

اختيار المشاركين
تم استقطاب المشاركين المحتملين من قسم أمراض الكلى في مستشفى خبي العام بين يوليو 2022 ومايو 2024. تم فحص جميع المرضى وفقا لمعايير الإدراج والاستبعاد المحددة مسبقا.

كانت معايير الإدراج كما يلي: تشخيص اعتلال الكلى السكري (DN) في المرحلة الثالثة من موجينسن²³، يعرف بأنه بول ألبوميني مستمر بنسبة ألبومين بولي إلى كرياتينين (UAlb/UCR) 30–300 ملغ/جم في اثنين من ثلاث عينات بول موضعية تم جمعها على مدى 3–6 أشهر، دون وجود دموية في البول أو تدهور سريع في وظائف الكلى يشير إلى مرض الكلى غير السكري؛ معدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR) ≥45 مل/دقيقة/1.73 متر^مربع حسب معادلة CKD-EPI؛ التشخيص الأول لمرض DN دون وجود علاج سابق لفيتامين د أو البروبوكول أو مثبط المناعة؛ العمر <75 سنة؛ وحالة مستقرة سريريا دون مضاعفات سكري حادة مثل الحماض الكيتوني السكري أو حالة فرط التسمية المفرط، أو التهابات خطيرة نشطة خلال 4 أسابيع قبل التسجيل. لم تكن خزعة الكلى مطلوبة للتسجيل؛ ومع ذلك، تم استبعاد المرضى الذين لديهم مرض كلوي غير سكري مشتبه به، بما في ذلك رواسب البول النشطة، أو التهاب كبيبات الكلى المتقدم بسرعة، أو أمراض المناعة الذاتية الجهازية.

شملت معايير الاستبعاد الأمراض الجهازية الخطيرة مثل الأورام الخبيثة، أو أمراض القلب والأوعية الدموية الشديدة، أو أمراض المناعة الذاتية؛ معروف حساسية تجاه فيتامين د، أو بروبوكول، أو فالسارتان، أو أتورفاستاتين، أو الإنسولين؛ الحمل أو الرضاعة؛ والاستخدام الأخير للأدوية خلال 4 أسابيع قد تتداخل مع نتائج الدراسة، بما في ذلك مثبطات المناعة أو الكورتيكوستيرويدات.

توزيع المجموعات
ظل طبيب الفحص غافل عن التوزيع النهائي للمجموعات حتى تأكيد الأهلية.

تم تسجيل الخصائص الديموغرافية والسريرية الأساسية، بما في ذلك العمر والجنس ومدة السكري ومرض السكري وتاريخ ارتفاع ضغط الدم أو فرط شحم الدم.

استخدمت هذه الدراسة تصميما استعاديا وغير عشوائي محكما. لتقليل تحيز الاختيار ومعالجة العوامل المربكة المحتملة، بما في ذلك التغيرات الزمنية والتباين المرتبط بالطبيب، تم تخصيص المجموعات بناء على ترتيب القبول الزمني بدلا من تفضيل الطبيب أو المريض.

المرضى الذين تم قبولهم بين يوليو 2022 وديسمبر 2023 تلقوا علاجا ثلاثيا قياسيا يتكون من فالسارتان، أتورفاستاتين، وبروبوكول، وتم تعيينهم في مجموعة الضابط (عدد = 56). تم تعيين المرضى الذين تم قبولهم بين يناير 2024 ومايو 2024 والذين تلقوا علاجا رباعيا (فالسارتان، أتورفاستاتين، بروبوكول، وفيتامين د) في مجموعة المراقبة (عدد = 94).

عكس العدد الأكبر من المرضى في مجموعة المراقبة زيادة التطبيق السريري للعلاج المساعد بفيتامين د في مركز الدراسة بدءا من أوائل عام 2024، وذلك بعد ظهور الأدلة العليا. كانت الخصائص الديموغرافية والسريرية الأساسية قابلة للمقارنة بين المجموعات (الجدول 1؛ P>0.05)، ولم تحدث تغييرات كبيرة في معايير التشخيص أو طرق المختبر أو تكوين فريق الأطباء خلال فترة الدراسة.

إدارة نظام العلاج
تلقى جميع المشاركين نظام تسريب يومي موحد للأنسولين تحت الجلد للتحكم في السكر خلال فترة الدراسة التي استمرت 8 أشهر. تم تعديل جرعة الأنسولين بشكل فردي وفقا لمراقبة سكر الدم اليومي في الشعيرات. تلقى المرضى في المجموعة الضابطة فالسارتان (80 ملغ مرة يوميا على معدة فارغة)، وأتورفاستاتين (20 ملغ مرة يوميا)، وبروبوكول (250 ملغ مرتين يوميا) لمدة 8 أشهر. تلقى المرضى في مجموعة المراقبة نفس نظام الفالسارتان، والأتورفاستاتين، والبروبوكول بنفس الجرعات والجداول، إلى جانب مكملات فيتامين د الفموية اليومية.

تم تحديد جرعة فيتامين د وفقا لمستويات 25-هيدروكسي فيتامين د [25(OH)D] في المصل الأساسية التي تم قياسها عند التسجيل باستخدام اختبار المناعة الكهروكيميائي (ECLIA). تم تعريف كفاية فيتامين د بأنها 25(OH)D ≥30 نانوغرام/مل، ونقص فيتامين D بأنه 20 نانوغرام/مل ≤25(OH)D <30 نانوغرام/مل، والنقص بأنه 25(OH)D <20 نانوغرام/مل. المرضى الذين تلقوا مكملات لمنع النقص تلقوا 600–800 وحدة دولية يوميا، بينما تلقى المرضى الذين لديهم نقص أو نقص في فيتامين د 2000 وحدة دولية يوميا.

معايير مراقبة السلامة والتوقف
لضمان سلامة المشاركين خلال فترة العلاج التي تستمر 8 أشهر، تم قياس مستويات الكالسيوم والفوسفور وهرمون الغدة الجار درقية (PTH) في المصل في الأساس وكل 4 أسابيع لمراقبة فرط كالسيوم فيتامين د واختلال توازن الكالسيوم والفوسفور. تم إجراء تخطيط كهربائي للقلب (ECG) ب 12 رصاص في البداية وبعد 8 أشهر لتقييم إطالة فترة QTc المرتبطة ببروبوكول. في المرضى الذين لديهم QTc الأساسي ≥450 مللي ثانية عند الرجال أو ≥460 مللي ثانية عند النساء، تم تكرار تخطيط القلب في الشهر الأول.

تمت مراقبة معايير وظيفة الكلى، بما في ذلك الكرياتينين في المصل وeGFR، مع إلكتروليتات المصل، كل شهرين خلال الشهر الأول وشهريا بعده. تم توجيه المشاركين للإبلاغ عن أعراض جديدة فورا. شملت معايير إيقاف العلاج تصحيح الكالسيوم في المصل >10.5 ملغ/ديسيلتر (2.62 مليمول/لتر) تم تأكيده بإعادة الاختبار خلال 48 ساعة؛ فترة QTc >500 مللي ثانية أو زيادة >60 مللي ثانية من الأساس في تخطيط القلب المتتالي؛ مضاعفة الكرياتينين في المصل من البداية أو تطور إصابة الكلى الحادة وفقا لمعايير مرض الكلى: تحسين النتائج العالمية (KDIGO)؛ وأي حدث سلبي من الدرجة ≥3 وفقا لمعايير المصطلحات الشائعة للأحداث السلبية (CTCAE) يعتبر مرتبطا ب D أو Probucol بشكل مؤكد. تم الإبلاغ عن أحداث سلبية خطيرة إلى لجنة أخلاقيات المستشفى خلال 24 ساعة.

جمع العينات البيولوجية ومعالجتها
تم جمع عينات دم وبول قبل بدء العلاج وبعد إكمال فترة العلاج التي استمرت 8 أشهر. تم جمع جميع العينات في الصباح بعد صيام ليلي من 8 إلى 12 ساعة. تم جمع حوالي 20 مل من الدم الوريدي باستخدام تقنيات سحب الدم القياسية في فواصل المصل وأنابيب EDTA. تم السماح لعينات الدم بالجلط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وتم طرد مركزها عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم استنشاق المواد الشفافة في المصل بعناية دون إزعاج الجلطة أو الطبقة البوفي، وتم جمعها في التجميد لإجراء اختبارات مختلفة، وتم تصنيفها برقم المشارك، والتاريخ، ونوع العينة، وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى التحليل. يمكن تخزين عينات المصل عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.

في إخراج البروتين البولي لمدة 24 ساعة (24 ساعة UPE)، تخلص المشاركون من أول عينة بول صباحية في الساعة 7:00 صباحا من اليوم الأول، ثم جمعوا كل البول، بما في ذلك عينة البول الصباحية الأولى في الساعة 7:00 صباحا من اليوم الثاني، في حاوية جمع مقدمة. تم توجيه المشاركين لتبريد حاوية الجمع خلال فترة الجمع. تم تسجيل حجم البول الكلي، وخلطه جيدا، وتم جمعه للتحليل المخبري. تم تخزين العينات عند 4 درجات مئوية عند تحليلها خلال 24 ساعة أو عند −20 درجة مئوية للتحليل لاحقا.

بالنسبة لنسبة الألبومين إلى الكرياتينين في البول (UAlb/UCR)، تم جمع عينات بول منتصف التيار في الصباح الأول في حاويات معقمة ومعالجتها بنفس الطريقة. تم تكرار نفس الإجراءات بعد انتهاء فترة العلاج التي استمرت 8 أشهر.

تحليل المعلمات الكيميائية الحيوية والسريرية
تم إذابة عينات المصل المجمدة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية قبل تحليل الكرياتينين في المصل (SCr). تم قياس SCr باستخدام اختبار لوني إنزيمي على محلل كيميائي حيوي آلي، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء معايرة يومية باستخدام معايرة متعددة المستويات، وتم تضمين مستويين من مواد مراقبة الجودة التجارية في كل دفعة. تم تحليل العينات بشكل مكرر، وتم تكرار اختبارات بمعامل تباين >5٪. الحد الأدنى للكشف ل SCr كان 2.0 ميكرومول/لتر.

تم قياس تركيز البروتين في أليكوات البول لمدة 24 ساعة باستخدام طريقة البيروغالول الأحمر-الموليبدات. تم تحليل العينات في نسخ مكررة، وتم تضمين مواد مراقبة الجودة في كل جولة. تم تخفيف العينات التي تتجاوز نطاق المعايرة (>3.0 جم/لتر) باستخدام محلول ملحي عادي وإعادة تقييمها. تم حساب معدل البول البالغ 24 ساعة باستخدام تركيز البروتين البولي وحجم البول الكلي.

تم قياس تركيزات الألبومين والكرياتينين في البول في الصباح الأول باستخدام المحلل الكيميائي الحيوي، وتم حساب نسبة UAlb/UCR لاحقا.

تم قياس جلوكوز البلازما الصائم (FPG) وجلوكوز بعد الأكل لمدة ساعتين (2 ساعة إلى PPG) باستخدام جهاز قياس سكر الدم المعتمد وعينات دم بوخز الأصابع الدموية، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

تم تحليل الهيموغلوبين المغلوز (HbA1c) باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مع نظام تحليل HbA1c مخصص. تم توجيه المشاركين لتجنب أدوية خفض الدهون لمدة 7 أيام ووجبات عالية الدهون أو الكحول لمدة 24 ساعة قبل جمع الدم بعد العلاج. تم قياس الكوليسترول الكلي في المصل (TC)، والدهون الثلاثية (TG)، والكوليسترول عالي الكثافة (HDL-C)، والكوليسترول منخفض الكثافة (LDL-C) باستخدام اختبارات إنزيمية. تم تحليل مواد مراقبة الجودة ذات المستويين يوميا. تم قياس معلمات الدهون في البداية بالمفرد، وأعيد تقييم العينات ذات معامل التباين >10٪ في النسخة المكررة. كانت حدود الكشف 0.1 ملمول/لتر ل TC، 0.05 ملمول/لتر ل TG، 0.08 ملمول/لتر ل HDL-C، و0.10 ملليمول/لتر ل LDL-C. تم تحديد قيم LDL-C بواسطة الفحص المباشر أو بواسطة معادلة فريديوالد عندما كانت مستويات الدهون الثلاثية <400 ملغ/ديسيلتر.

تحليل وظيفة المناعة والعلامات الالتهابية
تم قياس تركيزات غلوبولين G المناعي في المصل باستخدام مجموعة ELISA تجارية بشرية من نوع IgG. كان نطاق الكشف بين الاختبارات 1.37–1000 نانوغرام/مل، والحساسية 0.52 نانوغرام/مل، ومعامل التغير داخل الاختبار <6٪، ومعامل التباين بين الاختبارات <9٪. تم تحليل جميع العينات في نسخ مكررة، وتم تضمين مواد ذات جودة عالية ومنخفضة الجودة التي تم تزويدها مع المجموعة على كل لوحة. تم رفض الألواح التي تحمل قيم QC خارج انحرافين معياريين عن القيم المستهدفة وتكرارها. تم تخفيف العينات التي تتجاوز الحد القياسي الأعلى بنسبة 1:2 وإعادة تقييمها.

تم تعديل جميع المواد الكيميائية وعينات المصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل التحليل. تم تخفيف عينات المصل وفقا لتعليمات المجموعة، عادة عند تخفيف 1:100,000. تمت إضافة عينات معيارية، وعينات مخففة، وقطع (100 ميكرولتر) إلى الآبار المناسبة من الألواح الدقيقة المطلية مسبقا وحضنتها عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. تم غسل الآبار ثلاث مرات قبل الحضانة باستخدام الأجسام المضادة للكشف البيوتينيلة لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد المزيد من الغسيل، أضيف بيروكسيداز الفجل الحار وتم حضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الغسيل، أضيف محلول الركيزة، وتم حضن الخليط في الظلام لمدة 15 دقيقة قبل إضافة محلول التوقف. تم قياس الكثافة البصرية عند 450 نانومتر مع أطوال موجية مرجعية تبلغ 570 نانومتر أو 630 نانومتر. تم توليد منحنيات قياسية لحساب تركيزات IgG.

تم تحليل مجموعات الخلايا اللمفاوية بواسطة قياس تدفق الخلايا على جهاز BD FACSCanto II المزود بليزر 488 نانومتر و640 نانومتر. تم ضبط جهد التشتت الأمامي على 300 فولت، والتشتت الجانبي على 350 فولت، وجهية أنابيب المضاعف الضوئي لقنوات FITC وAPC وPE إلى 400 فولت، 550 فولت، و480 فولت على التوالي. تم استبعاد الدوبليت باستخدام التغطية FSC-A مقابل FSC-H.

تم إجراء تلوين قابلية الحياة باستخدام 7-أمينوأكتينوميسين D (7-AAD)، ولم يتم تحليل سوى أحداث سلبية 7-AAD. تم توزيع عينات الدم الكاملة في أنابيب غير مصبوغة، وأنظمة التحكم في النظائر النفسية، وأنابيب اختبار. تمت إضافة أجسام مضادة مضادة للبشر CD3-FITC وCD4-APC وCD8-PE إلى أنابيب الاختبار، بينما أضيفت أجسام مضادة متطابقة من نوع التحكم في النظائر إلى أنابيب التحكم. تم حضن العينات في الظلام على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تم إعداد ضوابط التعويض باستخدام BD CompBeads، وتم تنفيذ التعويض التلقائي باستخدام برنامج FACSDiva. تم تحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام محلول تحلل الخلل الخلفي الحمراء، ثم غسلها وتعليقها في محلول تلوين يحتوي على 7-AAD.

تم استخدام إعداد جهاز قياس الخلايا اليومي وتتبع القطع لمراقبة الجودة. شملت هرمية البوابات استبعاد الدوبلت، واختيار الخلايا اللمفاوية، وتحديد القابلية للحياة، وتحديد CD3+، وتحديد المجموعات الفرعية ل CD4/CD8. تم جمع ما لا يقل عن 50,000 حدث لمفاوي حي لكل عينة، مع تراوح إجمالي الأحداث المكتسبة بين 100,000 و150,000. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo، وتم حساب نسب خلايا CD3+ وCD4+ وCD8+، بالإضافة إلى نسب CD4+/CD8+.

تم قياس تركيزات hs-CRP وIL-6 وTNF-α وMCP-1 في المصل باستخدام مجموعات ELISA التجارية التي تم الحصول عليها. كانت نطاقات الكشف والحساسية كما يلي: hs-CRP (0.07–12.5 نانوغرام/مل؛ الحساسية 0.022 نانوغرام/مل)، IL-6 (0.7–300 بيغرام/مل؛ الحساسية 0.35 بيغم/مل)، TNF-α (1.6–100 بيغرام/مل؛ الحساسية 0.8 بيغم/مل)، وMCP-1 (5–1000 بيغرام/مل؛ الحساسية 2.5 بيغم/مل). تم إجراء جميع الفحوصات بشكل مكرر. تم تضمين مواد تحكم منخفضة وعالية الجودة في كل لوحة. كانت معاملات التباين داخل الاختبار <8٪، ومعاملات التباين بين الاختبارات <10٪. تم تسجيل القيم التي تتجاوز حدود الكشف كنصف الحد الأدنى للكمية، في حين تم تخفيف وإعادة تقييم القيم فوق أعلى معيار. خضعت العينات لدورة تجمد ذوبان واحدة فقط قبل التحليل. اتبعت إجراءات ELISA السيتوكينية بروتوكولات مطابقة لتلك الموصوفة ل IgG ELISA، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة المتعلقة بعوامل التخفيف وظروف الحضانة ودرجات الحرارة.

تقييم النتائج السريرية وإدارة البيانات
في نهاية فترة العلاج التي استمرت 8 أشهر، قام الأطباء المعالجون، الذين كانوا غير معينين بتوزيع المجموعات، بتقييم الحالة السريرية للمشاركين. تم تصنيف المرضى كخروجهم عندما تم استيفاء جميع معايير التحسين السريري المحددة مسبقا لاعتلال الكلى السكري لمدة أسبوعين متتاليين على الأقل: انخفاض بنسبة ≥30٪ في فترة 24 ساعة من الاضطراب الداخلي مقارنة بالوضع الأساسي، واستقرار أو تحسن في معدل التعادل السطحي الكبير (eGFR) المعرف بانخفاض <5 مل/دقيقة/1.73^{متر مربع} من النقطة الأساسية، وغياب مضاعفات حادة سكري أو حالات أخرى تتطلب استمرار الرعاية الداخلية. تم تصنيف المشاركين الذين لم يستوفوا جميع المعايير على أنهم لم يتم تسريحهم. تم حساب معدلات الاستجابة السريرية لاحقا لكل مجموعة.

تم إدخال جميع البيانات الديموغرافية والمخبرية والسريرية المجمعة في قاعدة بيانات إلكترونية باستخدام إدخال مزدوج للبيانات من قبل باحثين مستقلين. تم إجراء فحوصات المدى وفحوصات الاتساق لضمان دقة البيانات. شملت النقاط النهائية الأساسية تغييرات من الأساس إلى 8 أشهر في معلمات وظائف الكلى، بما في ذلك 24 ساعة UPE وUAlb/UCR، ومعلمات وظيفة المناعة، بما في ذلك نسبة الخلايا التائية CD3+ ونسبة CD4+/CD8+. شملت النقاط الثانوية التغيرات من البداية إلى 8 أشهر في معايير السكر في الدم (FPG، 2h-PPG، HbA1c)، ملف الدهون (TC، TG، LDL-C، HDL-C)، العلامات الالتهابية (hs-CRP، IL-6، TNF-α، MCP-1)، ومعدل الاستجابة السريرية. تم تقييم جميع مقاييس النتائج في البداية، وخلال 48 ساعة قبل بدء العلاج، وبعد العلاج، خلال أسبوع واحد بعد انتهاء فترة العلاج التي استمرت 8 أشهر.

التحليل الإحصائي
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج SPSS. تم التعبير عن المتغيرات المستمرة ذات التوزيع الطبيعي كمتوسط ± انحراف معياري، بينما تم التعبير عن المتغيرات التصنيفية كتكرار ونسب مئوية. تم استخدام اختبارات t للعينات المستقلة للمقارنات بين المجموعات، واختبارات كاي تربيع للمتغيرات التصنيفية. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها P<0.05. نظرا للطبيعة الاستكشافية للدراسة والعدد الكبير من النتائج التي تم تقييمها، لم يتم تعديل النتائج الثانوية من حيث التعددية. لذلك، اعتبرت قيم P وصفية أكثر منها تأكيدية. وبسبب تصميم الدراسة غير العشوائية الاستعادية، لم يتم تعديل جميع المقارنات بين مجموعتي الضابطة والملاحظة للعوامل المحتملة، وقد يكون هناك خلط متبق. جميع المرضى المسجلين البالغ عددهم 150 (56 في مجموعة الضابطة و94 في مجموعة المراقبة) أكملوا فترة العلاج والمتابعة الكاملة التي استمرت 8 أشهر. لم يفقد أي مريض في المتابعة أو تم سحبهم أو استبعادهم بعد التسجيل. لم يتم تحديد بيانات مفقودة للخصائص الأساسية أو مقاييس النتائج، بما في ذلك وظيفة الكلى، وملفات الجلوكوز والدهون، والعلامات المناعية، والعوامل الالتهابية. لذلك، لم تكن هناك حاجة لإجراءات النسب.

النتائج

تم فحص ما مجموعه 238 مريضا مصابا باعتلال الكلى السكري (المرحلة الثالثة من موجينسن) في البداية بين يوليو 2022 ومايو 2024. بعد استبعاد 88 مريضا (44 لم يستوفي معايير الإدراج، و28 استوفى معايير الاستبعاد، و16 لديهم سجلات غير مكتملة)، تم تسجيل 150 مريضا مؤهلين. استنادا إلى الترتيب الزمني للقبول، تم تعيين 56 مريضا تم قبولهم بين يوليو 2022 وديسمبر 2023 في مجموعة الضابطة (فالسارتان + أتورفاستاتين + بروبوكول)، وتم تعيين 94 مريضا تم قبولهم بين يناير 2024 ومايو 2024 في مجموعة المراقبة (إضافة فيتامي...

المناقشة

الآلية المحتملة لعمل فيتامين د في DN
وجدت هذه الدراسة أن إضافة فيتامين د إلى نظام قائم على بروبوكول ارتبطت بتحسن أكبر في أيض الجلوكوز، ووظائف الكلى، ومستويات الدهون، والمؤشرات المناعية لدى مرضى DN. تشير هذه النتائج إلى دور مساعد محتمل لفيتامين د في إدارة DN، رغم أنه لا يمكن تحديد الآليات السببية من هذا التصميم الاستعادي.

أولا، التأثير الإيجابي لفيتامين د على استقلاب السكر معترف به على نطاق واسع. تربط العديد من الأبحاث نقص فيتامين د بزيادة خ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
−20°C Freezer	Standard laboratory supplier (e.g., Haier, Thermo)	ULT -20°C series	Storage of urine aliquots
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BioLegend, Inc.	420403	Viability staining; final concentration 1 µg/mL
−80°C Freezer	Thermo Fisher Scientific (e.g., Revco)	Revco RDE -80°C	Long-term storage of serum and plasma aliquots
96-well ELISA Microplates (High-binding)	Corning Inc. (Costar)	3590	High protein-binding surface; for ELISA assays
Anti-human CD3-FITC Antibody	BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA	300306 (clone OKT3, typical)	5 µL per test; flow cytometry
Anti-human CD4-APC Antibody	BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA	317416 (clone RPA-T4, typical)	5 µL per test; flow cytometry
Anti-human CD8-PE Antibody	BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA	301008 (clone HIT8a, typical)	5 µL per test; flow cytometry
Atorvastatin	Pfizer Inc.	H20051407	20 mg, oral, once daily
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	338960	Equipped with 488 nm (blue) and 640 nm (red) lasers
Blood Glucose Meter and Test Strips	Roche Diagnostics (Accu-Chek)	Accu-Chek Guide Kit	For FPG and 2h-PPG from capillary finger-prick blood
Centrifuge Tubes (15 mL, Conical)	Corning Inc.	352096	Polypropylene, sterile; for sample processing
Centrifuge Tubes (50 mL, Conical)	Corning Inc.	352070	Polypropylene, sterile; for large-volume sample processing
CompBeads Compensation Beads	BD Biosciences	552843	Single-stained compensation controls for flow cytometry
Cryovials (2 mL, External Thread)	Thermo Fisher Scientific (Nalgene)	5000-0020	For aliquoting serum/urine; storage at −80°C or −20°C
CS&T Beads (Cytometer Setup & Tracking)	BD Biosciences	641319	Daily quality control for flow cytometer performance
EDTA Vacutainer Tubes (K2 EDTA)	BD Vacutainer	367863	3 mL, lavender top; for whole blood collection (flow cytometry, HbA1c)
Enzymatic Colorimetric Assay Kit for Serum Creatinine	Roche Diagnostics GmbH	4492161190	Calibrators: Cfas (Roche); QC: Precinorm U, Precipath U (Roche)
Flow Cytometry Staining Buffer	BD Biosciences	554656	Phosphate-buffered saline with 1% BSA and 0.1% sodium azide
Flow Cytometry Tubes (12 × 75 mm)	BD Biosciences (Falcon)	352058	Polystyrene, round-bottom; for antibody staining and acquisition
FlowJo Software	BD Biosciences	version 10.8	Flow cytometry data analysis and visualization
HDL-C Assay Kit (Direct Method)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	431-52501	For high-density lipoprotein cholesterol measurement
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) System for HbA1c	Bio-Rad Laboratories, Inc.	D-10	For HbA1c measurement from EDTA whole blood
Hitachi 7180 Automated Biochemical Analyzer	Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan	7180	For SCr, lipid profile, and urinary albumin/creatinine measurement
hs-CRP ELISA Kit	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA	DCRP00	Detection range: 0.07–12.5 ng/mL; sensitivity: 0.022 ng/mL
Human IgG ELISA Kit	Cloud-Clone Corp., Houston, TX, USA	E-80HU	Detection range: 1.37–1000 ng/mL; sensitivity: 0.52 ng/mL; intra-assay CV <6%; inter-assay CV <9%
IBM SPSS Statistics Software	IBM Corporation	version 22.0	Statistical analysis platform -2
IL-6 ELISA Kit	R&D Systems, Inc.	D6050	Detection range: 0.7–300 pg/mL; sensitivity: 0.35 pg/mL
Insulin (for subcutaneous infusion)	Novo Nordisk A/S	00169-3004-01	Daily subcutaneous insulin infusion; dose individualized based on glucose monitoring
LDL-C Assay Kit (Direct Method)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	439-52501	For low-density lipoprotein cholesterol measurement
Lipid QC Materials (Precinorm Lipid, Precipath Lipid)	Roche Diagnostics GmbH	Precinorm Lipid: 04727379190; Precipath Lipid: 04727400190	Daily quality control for lipid panel
MCP-1 ELISA Kit	R&D Systems, Inc.	DCP00	Detection range: 5–1000 pg/mL; sensitivity: 2.5 pg/mL
Microplate Sealer / Adhesive Film	Bio-Rad Laboratories (Microseal)	MSB1001	For sealing ELISA plates during incubation
Multichannel Pipette (8-channel, 10–100 µL)	Eppendorf AG (Research Plus)	4861000695	For ELISA reagent dispensing
Multi-mode Microplate Reader	Molecular Devices, LLC (e.g., SpectraMax)	SpectraMax i3x	For ELISA OD measurement at 450 nm with reference wavelength 570 nm or 630 nm
Probucol	Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.	H10960126	250 mg, oral, twice daily
Pyrogallol Red-Molybdate Urine Protein Kit	Biosino Bio-Technology Co., Ltd., Beijing, China	UR-PR-100	For 24-hour urinary protein excretion measurement -1
RBC Lysis Buffer (1×)	BD Biosciences	555899	For red blood cell lysis in whole blood samples
Refrigerated 24-Hour Urine Collection Container	Dynarex Corporation	3144	Sterile, 3L capacity; kept refrigerated during collection
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf AG (e.g., 5810 R)	5810 R	For serum preparation: 1000 × g, 15 min, 4°C
Serum Separator Tubes (SST)	BD Vacutainer	367985	5 mL, gold top; for serum preparation (biochemistry, ELISA)
Sharps Disposal Container (