يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وزراعة خلايا البطانة الوعائية الدقيقة في دماغ الفأر

151 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

يوليو 17, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

في هذه المقالة

ملخص

تم تقديم بروتوكول لعزل وزراعة الخلايا البطانية الدقيقة الوعائية في الدماغ (BMECs) من نسيج دماغ الفئران الوليدية لإنشاء نموذج مخبري قوي لدراسة وظيفة الحاجز الدموي الدماغي في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

الملخص

تعد خلايا البطانة الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMECs) المكون الخلوي الرئيسي لحاجز الدم والدماغ (BBB) وتلعب دورا رئيسيا في تنظيم النقل الجزيئي والحفاظ على توازن الجهاز العصبي المركزي. تعد النماذج الموثوقة في المختبر لبطانة الدماغ ضرورية لدراسة فسيولوجيا وخلل بطانة الدماغ في الأمراض العصبية والجهازية. تم وصف بروتوكول قابل للتكرار لعزل وزراعة BMECs الأولية من قشرة دماغية الفأر الوليدية. تشمل الطريقة تشريح الأنسجة القشرية، والتفكك الميكانيكي والإنزيمي، وإزالة بقايا الميالين باستخدام تدرج كثافة ألبومين المصل البقري (BSA)، وإثراء الخلايا البطانية باستخدام الانتقاء المناعي القائم على CD31. تزرع الخلايا المعزولة لاحقا على صفائح مغطاة بالكولاجين وتتميز بالتقييم الشكلي، وكشف العلامات البطانية بالتألق المناعي، واختبارات تكوين الأنابيب الوعائية، وقياسات المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER) لتقييم خصائص الحاجز. يوفر هذا البروتوكول نهجا موثوقا للحصول على مزارع BMEC الأولية المناسبة لدراسة بيولوجيا BBB، وإشارات البطانة، والتفاعلات العصبية الوعائية تحت ظروف فسيولوجية ومرضية.

المقدمة

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو بنية متخصصة للغاية تنظم بدقة تبادل المواد بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) والدورة الدموية الجهازية1. يتكون BBB بشكل أساسي من خلايا بطانة الدماغ الدقيقة الوعائية المتصلة بوصلات مشدودة. تعمل هذه الخلايا البطانية ضمن نظام متعدد الخلايا يعرف بالوحدة العصبية الوعائية (NVU)، والذي يشمل أيضا الخلايا النجمية، والحضاءات، والخلايا العصبية، والخلايا الدبقية، والغشيةالقاعدية 2. من بين هذه المكونات، تلعب خلايا البطانة الدقيقة الوعائية في الدماغ (BMECs) دورا مركزيا من خلال تكوين طبقة مستمرة ذات وصلات ضيقة، وآلاف أنظمة النقل الانتقائية، وحركة الهوويصلات المحدودة، وتقييد تسرب الخلايا المناعية من خلال التعبير المنخفض عن جزيئات الالتصاق التي تحد من مرور المذابات والخلايا إلى نسيج الدماغ3،4.

بالإضافة إلى دورها كحاجز فيزيائي وانتقائي، تشارك BMECs بنشاط في العمليات الأساسية، بما في ذلك الإشارات العصبية الوعائية، وتنظيم تدفق الدم الدماغي، والاستجابات المناعية المحلية، وخاصة تكوين الأوعية الدموية الدماغية5. هذه العملية الأخيرة مهمة أثناء تطور الجنين، لكنها تعاد تنشيطها أيضا في حالات مرضية مثل السكتة الدماغية أو نقص التروية أو الالتهاب. تستجيب العضلات العضلية للإشارات المسببة للأوعية مثل عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) وعامل نمو المشيمة (PLGF)، منسقة تكوين ونضج الأوعية الجديدة. لذا، فإن خلل بطانة الدماغ سيضعف بشكل كبير سلامة الكتلة الدماغية وتوازن الدماغ الداخلي.

دراسة BMECs في المختبر تتيح لنا نمذجة فسيولوجيا الدماغ الضخم والآليات التي تنظم تكوين الأوعية الدموية في الدماغ. ومع ذلك، فإن عزل هذه الخلايا عن أنسجة الدماغ يشكل تحديات تقنية كبيرة بسبب تعقيد الأنسجة العصبية، ووفرة الميلين، والحاجة إلى زراعة ذات نقاء بطاني مرتفع. على الرغم من توفر خطوط الخلايا الخالدة، إلا أن لديها محدوديات كبيرة من حيث تمثيلها الظاهري والوظيفي8.

في هذا السياق، تشكل بروتوكولات الزراعة الأولية لمواد BMEC من نماذج الفأر حديثي الولادة أداة تجريبية قوية، لأنها تحافظ على العديد من الخصائص الشكلية والجزيئية والوظيفية لبطانة الدماغ في الجسم الحي. ومع ذلك، تعتمد عدة بروتوكولات معتمدة لعزل BMEC في الفئران على التفكك الميكانيكي مع تدرجات الكثافة (ديكسترن أو بيركول)، وغالبا ما تؤدي إلى تثبيث بطاني متغير وتلوث متبقي بواسطة الصخور المحيطة والخلايا النجمية وحطام الميالين9. يحسن التنقية القائمة على المضادات الحيوية باستخدام البيوروميسين نقاء بطانة البطانة (حتى ~95٪) لكنها قد تسبب إجهادا خلويا بسبب تثبيط تخليق البروتين والتأثيرات المحتملة على النمط الظاهريللبطانة 10. بدلا من ذلك، توفر الطرق القائمة على فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) مجموعات سكانية عالية التنقية لكنها تتطلب معدات متخصصة ومعالجة واسعة، مما قد يقلل من قابلية الاستمرار والتوسع11. تتجنب البروتوكولات الحديثة لحديثي الولادة تدرجات الكثافة وتقلل عدد خطوات الطرد المركزي، مما يحسن الإنتاجية مع الحد من التلوث12.

استنادا إلى هذا الخلفية، يصف هذا العمل بروتوكولا محسنا لعزل وزراعة الخلايا البطانية من الأوعية الدقيقة في دماغ الفئران الوليدية. تجمع هذه الطريقة بين التشريح الدقيق، والهضم الإنزيمي الفعال، وإزالة الميالين باستخدام تدرج ألبومين مصل البقر (BSA)، والإثراء عن طريق الانتقاء المناعي باستخدام الكرات المغناطيسية المصاحبة مع علامة CD31. يتيح البروتوكول الحصول على زراعة أولية قابلة للحياة، قابلة للتكرار، ومغنية، مناسبة لدراسات تكوين الأوعية الدموية الدماغية، والتفاعل العصبي الوعائي، والإشارات البطانية، وخلل BBB في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافقت لجنة الأخلاقيات الحيوية والسلامة الحيوية في جامعة بيو-بيو على هذا المشروع (منحة فونديسيت 1240925). تم تنفيذ العمل مع الحيوانات وفقا للمبادئ الأساسية للمبادئ الثلاثة R في استخدام الحيوانات التجريبية13 ووفقا لتوصيات إرشادات العناية واستخدام الحيوانات المخبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة14. تم الاحتفاظ بالحيوانات في بيئات مناسبة في بيوتيريوم جامعة بيو-بيو تحت ظروف سكن قياسية (دورة ضوء/ظلام 12 ساعة، درجة حرارة محكومة 22 ± 2 درجة مئوية ، مع إمكانية الوصول إلى الأعلاف والماء).

للحصول على الخلايا، تم استخدام فئران حوامل من النوع البري (WT) (C57BL/6)، تتراوح أعمارها بين 4 و6 أشهر. بعد الولادة، بقي الجراء مع الأم حتى اليوم الخامس بعد الولادة (P5). في هذه المرحلة، تم تخدير النسل بعمق بالإيزوفلوران حتى فقدان ردود الفعل قبل القتل الرحيم. كان انخفاض حرارة الجسم يستخدم فقط كمكمل لتقليل الحركة، وتبعه مباشرة قطع الرأس. تم إجراء جميع الإجراءات وفقا لإرشادات الجمعية الأمريكية للطب البيطري (AVMA) لقتل الحيوانات (2020)15 واللوائح الدولية لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية (NIH)14. تم عزل القشرة الدماغية واستخدامها لتطوير هذا البروتوكول التجريبي (انظر خطوة البروتوكول 3). يسرد جدول المواد المواد والأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحضير وسط زراعة البطانة

  1. لتحضير 500 مل من وسط الزراعة لخلايا بطانة دماغ الفأر، في وعاء معقم، اخلط 250 مل من DMEM مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS)، و250 مل من وسط زراعة الخلايا البطانية مع 10٪ FBS.
    ملاحظة: يوفر وسط الزراعة عوامل نمو بطانية أساسية ويدعم تكاثر الخلايا. إذا لم يكن المنتج المشار إليه (انظر جدول المواد) متوفرا، يمكن إضافة مكملات خلايا بطانة بطانة (مثل تخطيط القلب الكهربائي، الهيدروكورتيزون، وL-جلوتامين) إلى DMEM + FBS لتحقيق ظروف نمو مماثلة16.
  2. قم بترشيح الوسط بالكامل (10٪ FBS) عبر فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر لضمان التعقيم.
  3. خزن الوسط المحضر عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. حضر وسطا طازجا كل 2-4 أسابيع للحفاظ على نشاط عامل النمو.

2. تغطية ألواح الزراعة

ملاحظة: لتعزيز التصاق الخلايا والحفاظ على النمط البطاني الداخلي، يجب طلاء ألواح الزراعة مسبقا بكولاجين النوع الأول. خطوات هذه العملية هي كما يلي:

  1. جهز محلول الطلاء المسبق بخلط كولاجين النوع الأول (0.1 ملغ/مل)، وM من حمض الخليك لإذابة الكولاجين، ووسط قاعدي معقم ليصل إلى حجم إجمالي 15 مل. اخلط بلطف حتى يذوب الكولاجين بالكامل واضبط المحلول إلى درجة حموضة 4.0 إذا لزم الأمر. قم بترشيح المحلول بترشيح معقم عبر فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر واحتفظ به على الثلج حتى استخدامه للحفاظ على ثبات الكولاجين.
    ملاحظة: الكولاجين من النوع الأول يحاكي الغشاء القاعدي، ويدعم التصاق الخلايا البطانية، ويساعد في الحفاظ على النمط الظاهري للخلية.
  2. توحيد المحلول في ظروف عقيمة. طبق المحلول بشكل متساو لتغطية سطح ألواح الزراعة بالكامل.
    ملاحظة: يستخدم فقط الحجم اللازم لتغطية السطح.
  3. حضن الصفائح عند 37 درجة مئوية طوال الليل (12–16 ساعة) للسماح للكولاجين بامتصاص الجسم. قبل زرع الخلايا، قم بإزالة محلول الطلاء الزائد واغسل الألواح مرتين بمحلول ملحي معقم بفوسفات (1x PBS، pH 7.4) لإزالة الحمض المتبقي والكولاجين غير المرتبط.

3. عزل زراعة الخلايا المختلطة في الدماغ

ملاحظة: هذا البروتوكول يبني على التقارير السابقة 9,17 التي هدفت إلى عزل BMECs عن قشرة دماغ فئران P5.

  1. التضحية بخمسة جراء P5 باستخدام تخدير عميق باستخدام الإيزوفلوران؛ استخدم انخفاض حرارة الجسم فقط كمساعد، يليه قطع الرأس من عنق الرحم.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يجب إجراء جميع الإجراءات في خزانة أمان بيولوجي بتدفق طبقي.
  2. اجمع الأدمغة (الشكل 1A) وضعها في PBS بارد معقم (1x) في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل حتى يتم معالجة جميع الأدمغة.
  3. افصل السحايا عن طريق لف كل دماغ بعناية على غشية نيتروسلولوز معقمة. انقل الأدمغة إلى صفيحة بحجم 100 مم تحتوي على PBS باردة (1x). باستخدام مشرط معقم، قم بإزالة جذع الدماغ، المخيخ، المهاد، والبصلة الشمية (الشكل 1B,C).
  4. اجمع قشرات الدماغ الخالية من السحايا واحتزنها في قشرة الدماغ الباردة (1x). انقل فورا جميع قشرة الدماغ إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على 5 مل من PBS 1x على الجليد (الشكل 1D).
  5. قم بتفكيك النسيج ميكانيكيا باستخدام مقص معقم، يليه ماصة بحجم 1 مل حتى لا تلاحظ أي قطع، ويصبح التعليق متجانسا (الشكل 1E).
    ملاحظة: يمكن قطع رأس الماصة لتقليل الإجهاد الميكانيكي أثناء التفكك. يتم تحقيق تفكك الأنسجة من خلال الشفط المتحكم به واستخدام الماصات اللطيف، بينما يقلل فتحة الأطراف الأوسع من قوى القص والتحلل الميكانيكي للخلايا، مما يحافظ على حيوية الخلية.
  6. اجمع جميع الأنسجة وضعها في أنابيب بحجم 15 مل.
  7. لهضم الأنسجة، انقل العينة إلى أنبوب مخروطي معقم بحجم 15 مل يحتوي على 2 مل من محلول الكولاجيناز (2 ملغ/مل في DMEM) وحضن العينة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية على هزاز مداري بسرعة 180 دورة في الدقيقة.
  8. بعد الهضم، أضف 5 مل من DMEM مع 10٪ FBS إلى التعليق والطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة 10 دقائق (انظر الشكل 1F). تخلص من السوبرناتانت.
  9. لإزالة المايلين، أعد تعليق الحبيبات في 4 مل من 20٪ BSA في PBS (بدون الوت) والطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة 20 دقيقة (الشكل 1G). بعد الطرد المركزي، قم بإزالة الطبقة العلوية اللبنية التي تحتوي على المايلين باستخدام ماصة باستور بحذر وتخلص من أي فائق متبق (الشكل 1H).
  10. أعد تعليق الحبيبة في 2 مل من DMEM يحتوي على 10٪ FBS، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 3,000 × جرام لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبرناتانت، ثم أعد تعليق الرصاصة الأخيرة بلطف في 1 مل من DMEM يحتوي على 10٪ FBS.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، تحتوي إعادة التعليق النهائية على مجموعة غير متجانسة من الخلايا المشتقة من الدماغ الناتجة عن تفكك الأنسجة. قد يشمل هذا المزيج خلايا بطانة الدماغ الميكروفوعية، والخلايا النجمية، والبيرسيتات، وخلايا عصبية أخرى. تتطلب خطوات لاحقة من التنقية والزراعة لإثراء ال BMECs بشكل انتقائي.
  11. قبل طلاء الخلايا المعزولة، قم بإزالة محلول الطلاء من ألواح الزراعة المحضرة (انظر الخطوة 2.3) وشطف كل بئر مرتين ب PBS معقم (مرة واحدة).
  12. زرع الخلايا المعلقة (الخطوة 3.10) على الألواح المطلية (موصى بها: أطباق 60 مم).
    ملاحظة: عادة ما يتم توزيع كامل التعليق الخلوي المستخرج من عزل واحد في طبق أو طبقين مغطين، كل منهما يحتوي على 5 مل من وسط نمو البطانة.
  13. الحفاظ على الزراعة في وسط خلايا بطانة الرحم عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ CO₂. استبدل الوسيط كل يومين إلى ثلاثة. عندما تصل الزراعة إلى 90–100٪ من التقاء العلاقات، استمر في الانتقاء المناعي باستخدام خرزات مغطاة ب CD31 لإثراء الخلايا البطانية.
    ملاحظة: بعد العزل وتركيب الزراعة الأولية، ينتج الإجراء عادة حوالي 5 × 10إلى 6 خلايا في كل تحضير، تلتصق بألواح مغطاة بالكولاجين وتطور الشكل المرصوف المميز للطبقات الأحادية البطانية.

4. عزل خلايا البطانة الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMECs) باستخدام خرز مغناطيسي CD31

  1. تحضير وفصل الخلايا
    1. عندما تصل الزراعة إلى 90–100٪ من التقاء العلاقات، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (مرة واحدة) لإزالة الوسط المتبقي.
    2. أضف 1 مل من التربسين (0.5٪ 1x) إلى الصفيحة وحضن لمدة 3–5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
    3. قم بتحييد التربسين بإضافة 1 مل من وسط زراعة البطانة مع 10٪ FBS. انقل تعليق الخلية (~2 مل) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وجهاز طرد مركزي عند 220 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  2. تحضير خرز CD31 المغناطيسي
    1. ضع 8 ميكرولتر من خرز CD31 المغناطيسي في أنبوب جديد بسعة 15 مل. اغسل الخرزات بمحلول هانك 1٪ بسعة 1 مل، ثم أعد تعليقها بلطف عن طريق تحريك الأنبوب.
    2. ضع الأنبوب على مغناطيس لمدة دقيقتين لترسيب الخرز. أزل الفائق بعناية دون إزعاج الخرز. كرر خطوة الغسل ثلاث مرات.
      ملاحظة: اعمل دائما بالقرب من المغناطيس لتجنب فقدان الخرزات، وقم بهذه الخطوة في ظروف معقمة لمنع تلوث مزرعة الخلايا الأولية.
  3. حضانة الخلايا ذات الخرزات
    1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول هانك 1٪ يحتوي على FBS (لتقليل الارتباط غير النوعي).
    2. انقل الخلايا إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المغسولة مسبقا باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر. حضن الخليط على الثلج مع هز لطيف لمدة 20 دقيقة.
  4. الانفصال المغناطيسي لخلايا البطانة
    1. ضع الأنبوب على مغناطيس لمدة 3 دقائق لترسيب خلايا بطانية مربوطة بالخرز.
    2. أزل السوبرناتينت بحذر.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تنقية نوعين من الخلايا المعزولة—خلية بطانية واحدة (انظر الخطوة 4.5)، ومزيج من أنواع مختلفة من خلايا الدماغ. في هذه المرحلة، هناك خياران متاحان.
      1. قم بإزالة وتخلص من المادة الفائقة (أي خليط خلايا الدماغ) مع إبقاء الأنبوب على المغناطيس. اغسل الخلايا المرتبطة بالخرزات (أي خلايا CD31+ ) بمقدار 2 مل من محلول هانك وكرر العملية 3 مرات.
      2. استخدم المادة الفائقة التي تحتوي على الحطام الخلوي لتوليد ثقافة جديدة تحتوي على خلايا غير مختارة (مثل الخلايا الليفية، الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية الدقيقة، الخلايا العصبية، الحضيضات، وغيرها).
  5. زراعة ال BMEC المنقاة
    1. أعد تعليق الخلايا البطانية المرتبطة بالخرزات في 7 مل من وسط بطانة كامل (10٪ FBS).
    2. زرع الخلايا على صفيحة بحجم 60 مم مغطاة سابقا بالكولاجين طوال الليل (انظر القسم 2). حضن تحت ظروف قياسية (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون).
      ملاحظة: يتم الحفاظ على النمط الظاهري للبطانة حتى المقطع (ص) 3 تحت ظروف الزراعة الموصوفة. للحفاظ على خصائص الحاجز الدموي والدماغي، يوصى بإجراء اختبارات تجريبية باستخدام مقاطع مبكرة (p0–p3).

5. توصيف الخلايا

  1. الملاحظة المجهرية للخلايا الملتقطة بالخرزات
    ملاحظة: في ظل ظروف الزراعة الموضحة في هذا البروتوكول، يمكن عادة الحفاظ على ال BMECs الأولية لمدة تصل إلى ثلاث مقاطع (p3) مع الحفاظ على شكلها الداخلي المميز ونمطها الظاهري. اعتمادا على كثافة البذور ومعدل النمو، يمكن عادة الحفاظ على الزراعة لمدة تصل إلى حوالي 2-3 أسابيع في المختبر قبل حدوث تغييرات ظاهرية كبيرة.
    1. بعد الانتقاء المناعي باستخدام خرز مغناطيسي CD31، لاحظ الخلايا المتصلة تحت مجهر تباين الطور (الشكل 2A).
      1. ابحث عن خلايا بطانة الحوض الموجبة ل CD31 تظهر شكل حصى نموذجي وتشكل طبقات أحادية متجانسة خلال 5–7 أيام.
        ملاحظة: أثناء الانتقاء المناعي، ترتبط الخرزات المغناطيسية المغطاة ب CD31 تحديدا بخلايا البطانة، مما يثري تجمع البطانة. بعد عملية الانتقاء، قد تظل الخرزات (قطرها حوالي 4.5 ميكرومتر) مرتبطة أو مستوعبة بواسطة الخلايا البطانية خلال الممرات المبكرة. عادة ما تقل هذه النقاط مع الغسلات اللاحقة وصيانة الزراعة ولا تتداخل مع قدرة BMEC على بقاء أو نمو الخلايا (الشكل 2B).
      2. استخدم الشكل الموحد وغياب الخلايا الممدودة أو الشبيهة بالخلايا النجمية لتقدير نقاء مجموعة البطانة.
  2. التألق المناعي ل CD31 و GLUT1
    1. البذور 2 × 103 BMECs على أغطية مغطاة بالكولاجين وزراعة حتى وصلت إلى التقاء بنسبة 80–90٪.
    2. ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (22–25 درجة مئوية) واغسل ب PBS.
    3. استخدم النفخ ب Triton X-100 بنسبة 0.1٪ لمدة 5 دقائق واستخدم التثبيت غير المحدد مع 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة.
    4. حضن الزراعة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد CD31 وGLUT1 (ناقل الجلوكوز الخاص بطانة الدماغ).
    5. اغسله ب PBS وحضن لمدة ساعة واحدة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة.
    6. نوى التلوين المضادة باستخدام 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) وتركيب الغطاء باستخدام وسط تركيب مضاد للتلاشي.
    7. تخيل تحت المجهر الفلوري أو المجهر الكونفوكلي. ابحث عن CD31 موضع عند حدود الخلايا (الشكل 3A)، بينما يظهر GLUT1 توزيعا سيتوبلازميا وغشائيا، مما يؤكد الهوية البطانية ونمط بطانة الدماغ (الشكل 3B).
      ملاحظة: تظهر الصور الممثلة من عزلات BMEC المستقلة الشكل والتعبير النموذجي للعلامات في BMECs المذروعة. يمكن أيضا استخدام وجود بروتينات الوصلات الضيقة، مثل كلودين-5، لتوصيف بطانة الدماغ. لتقييم نقاء الزراعة البطانية بشكل أعمق، يمكن إجراء تلوين مضاق مناعي إضافي باستخدام مؤشرات سلبية لأنواع الخلايا العصبية الأخرى. على سبيل المثال، يمكن استخدام البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للكشف عن الخلايا النجمية، وجزيء محول ارتباط الكالسيوم المؤين 1 (Iba1) لتحديد الخلايا الدقيقة الدنبقية. غياب التلوين لهذه العلامات يؤكد عدم وجود تلوث من هذه المجموعات غير البطانية (الشكل 3C,D).
  3. اختبار تكوين الأنابيب
    ملاحظة: تظهر خلايا البطانة القدرة على التسبب في الأوعية الدموية في اختبارات Matrigel18، ويمكن تأكيد هوية البطانة باستخدام هذا الاختبار.
    1. قم بطلاء صفيحة ذات 96 بئر بمادة ماتريجيل ودعها تبلمر لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. البذور 1 × 104 BMECs لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسط بطاني كامل (10٪ FBS). حضن عند 37 درجة مئوية وراقب تكوين الأنابيب لمدة 4–8 ساعات باستخدام مجهر تباين الطور (الشكل 4A).
    3. قم بقياس الطول الكلي للأنابيب، وعدد الوصلات، والشبكات باستخدام ImageJ (إضافة تحليل الأومجيوجينيسيس)19. (الشكل 4B).
      ملاحظة: قدرة BMECs على تكوين هياكل أنبوبية مترابطة تؤكد إمكاناتها الوعائية ووظائفها البطانية.
  4. قياس المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER)
    ملاحظة: يجب أن تشكل خلايا بطانة الدماغ حاجزا مشدودا، لأنها عنصر أساسي في BBB20. يجب تأكيد قدرة البطانة على توليد حاجز كهربائي.
    1. زرع 20,000 حبة BMEC على إدخالات ترانسويل مغطاة بالكولاجين (حجم المسام 0.4 ميكرومتر) في الحجرة العلوية والزراعة حتى تصل إلى التقاء.
    2. قم بقياس TEER باستخدام مقياس فولتوهممتر ظهاري لتقييم سلامة الطبقة الواحدة. تسجيل قيم TEER يوميا حتى الاستقرار؛ تشير زيادة المقاومة إلى تكوين وصلات ضيقة بين الخلايا، وهي سمة مميزة للحواجز البطانية الوظيفية (الشكل 4C).
      ملاحظة: يمكن استخدام بقايا خليط الخلايا غير المختار، بما في ذلك الخلايا النجمية، لتوليد نظام الزراعة المشتركة. يتطلب هذا التكوين تحسينا دقيقا لنسبة الخلايا بين القسمين العلوي (BMECs) والسفلي (خليط الخلايا غير المختار)، والذي يجب توحيده في كل مختبر. تم تكييف هذا التكوين من نماذج BBB21 التي تم وصفها سابقا.
    3. زرع خليط الخلايا غير المختار (الخطوة 4.4.2.2) في البئر السفلي للوحة الزراعة وBMECs على الجانب العلوي من غشاء إدخال ترانسويل.
      ملاحظة: تم تضمين تجربة تمثيلية تقارن بين ظروف الزراعة الأحادية والزراعة المشتركة لتقييم شد الحواجز من خلال قياسات TEER (الشكل 4C).

6. توسيع وصيانة ال BMECs المنقاة

  1. ظروف الزراعة
    1. حافظ على ال BMECs المنقاة في وسط زراعة بطاني كامل (10٪ FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة (95٪ رطوبة) مع 5٪ CO₂. غير وسط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة أيام لتوفير مغذيات جديدة والحفاظ على حيوية الخلية.
  2. مراقبة نمو الخلايا وشكلها
    1. راقب الزراعة يوميا تحت مجهر تباين الطور لمراقبة ارتباط الخلايا ونموها وشكلها. ابحث عن الشكل المرصوف المميز للحصى في BMECs، التي تشكل طبقة أحادية متزامنة خلال 5–7 أيام.
  3. الزراعة الفرعية والانتقال
    1. عندما تصل الزراعة إلى 80–90٪ من التقاء العلاقات، يتم فصل الخلايا باستخدام 0.05–0.1٪ تريبسين لمدة 3–5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بتحييد التربسين بحجم متساو من الوسط الكامل، والطرد المركزي عند 220 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وأعد تعليق الحبيبة في وسط بطاني جديد.
    3. زرع الخلايا على ألواح مغطاة بالكولاجين بالكثافة المطلوبة لاستمرار التمدد.
      ملاحظة: حدد ممرات BMEC إلى 3–5 للحفاظ على النمط الظاهري للبطانة والسلامة الوظيفية.
  4. الحفظ بالتبريد الاختياري
    1. للتخزين طويل الأمد، أعد تعليق BMECs في وسط تجميد (10٪ DMSO في وسط بطاني كامل). قم بالتجميد تدريجيا إلى -80 درجة مئوية في فريزر بمعدل مضبوط، ثم انقله إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتوكول الموضح هنا يتيح عزل وزراعة BMECs الأولية من فئران حديثة الولادة (P5). تعد هذه الخلايا المكون الخلوي الرئيسي في BBB، وبالتالي فهي أداة تجريبية قيمة لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية الدماغية والفيزيولوجيا المرضية. تم إثبات العزل الناجح وزراعة خلايا بطانة الأوعية الدماغية الدقيقة (BMECs) من خلال تقييمات شكلية، وفينوتيبية، ووظيفية.

أدى سير العمل العزلي إلى تعليق خلوي مشتق من قشرة دماغية مقسومة بعد إزالة المناطق غير القشرية، والهضم الإنزيمي، وإزالة الماي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد عزل BMECs أداة أساسية لدراسة الآليات التي تنظم فسيولوجيا BBB وخلله في مختلف أمراض الجهاز العصبي المركزي(CNS) 4,9، بما في ذلك السكتة الدماغية. على عكس خطوط الخلايا الخالدة، تحافظ مزارع BMEC الأولية على السمات الظاهرية والوظيفية الرئيسية لبطانة الدماغ، بما في ذلك التعبير عن البروتينات المرتبطة بإحكام، وقدرة الأوعية المنشأة تمثل النسيج الحي. السياق8،10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

تمت كتابة أجزاء من هذه المخطوطة باستخدام ChatGPT من OpenAI (نسخة GPT-4، يوليو 2025) لتحسين الوضوح واللغة والتماسك. قام المؤلفون بمراجعة نقدية وتحرير ووافق على جميع المحتوى المدعوم بالذكاء الاصطناعي. لم تستخدم أي أدوات ذكاء اصطناعي لتحليل البيانات أو تفسير النتائج أو توليد الاستنتاجات العلمية.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفون في شكر الباحثين التابعين لمنظمة GRIVAS Health وNEUROVAS على مساهماتهم القيمة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل فونديسيت ريجوال 1240295.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
60 mm culture platesكورنينج430166
96 Well culture platesكورنينج41122107
Acetic acidسيجما-ألدريتشA6283
Antibiotic-Antimycotic (optional)جيبكو15240062
Anti-CD31سانتا كروزsc-466941:100
Anti-GFAPثرمو فيشر ساينتفك13-03001:500
Anti-GLUT1أباكامab1157301:200
Anti-Iba1سانتا كروزsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye)ثرمو فيشر ساينتفكA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor (488 Dye)ثرمو فيشر ساينتفكA-110081:500
Automatic and serological pipettesأكسفورد إل بيOXL.OXL.OSP-5C
Basal medium (for collagen solution)جيبكو (دي إم إي إم)11965092
Bovine Serum Albumin (BSA)سيجما-ألدريتشA9647
Collagenase type IIسيجما-ألدريتشC6885
DAPIثرمو فيشر ساينتفك622481 ميكروغرام/مل
DMEM (high glucose)ثرمو فيشر ساينتفك11965092
EndoGRO-MV Complete Mediumميرك ميليبوروSCME004Endothelial cell growth medium
Falcon tubes (15 & 50 mL)كورنينج352096 / 352070
Fetal Bovine Serum (FBS)جيبكو (ثرمو فيشر)16000044
Fluorescence MicroscopeموتيكBA410
Gloves, masks, lab consumablesVarious suppliers—
Heparin (100 U/mL)سيجما-ألدريتشH3393
Inverted MicroscopeأوليمبوسCKX41
Magnetic separation magnetEasySepNC9284020
Orbital Shaker (37 °C)ثرمو فيشر ساينتفكSK-0180-S
ParafilmبيميسPM996
PBS (1×)ثرمو فيشر ساينتفك10010023
Refrigerated CentrifugeهيتاشيCT5RE
Scalpelفاين ساينس تولزVarious
Scissors and fine tweezersفاين ساينس تولزVarious
Sterile nitrocellulose membraneبيو-راد1620094
Type I collagenكورنينج30394

المراجع

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

علوم الأعصابالعدد 233العدد 233هذا الشهر في JoVEالعددالخلايا البطانية الدماغيةالمزرعة الأوليةالحاجز الدموي الدماغيتكوين الأوعية الدموية في الدماغ

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.