توليد وتمايز الأعضاء الظهارية الشمية البشرية من الخلايا الجذعية البالغة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول نهجا راسخا لعزل الخلايا الشمية السلفية عن أنسجة القرينة العلوية البالغة البشرية لتوليد عضويات ظهارية شمية. كما يوضح استراتيجية استحث كيميائي لدفع تمايز هذه الأعضاء إلى خلايا عصبية حسية ناضجة وشمية، مما يمكن من نمذجة تكوين الخلايا العصبية الشمية البشرية.

الملخص

تمتلك الظهارة الشمية البشرية قدرة عصبية مذهلة، تدعمها مجموعة مقيمة من الخلايا الجذعية القاعدية؛ ومع ذلك، ثبت أن إنشاء نموذج ديناميكي في المختبر يعيد بأمانة عملية التجدد هذا التحدي الكبير. هنا، نقدم بروتوكولا معتمدا لتوليد الأعضاء الشمية من الخلايا السلفية المعزولة من نسيج القريني العلوي البالغ للبشر. تحافظ هذه الأعضاء على الجذع، كما يتضح من تعبير SOX2، وتظهر نمط تمايز منظم مكانيا، يتميز بتعبير موحد للعلامة العصبية غير الناضجة GAP43 وتحديد موقع محيطي لعلامة العصبون الحسي الناضجة OMP. التمايز المستهدف اللاحق مع مثبط نوتش LY411575، ومنشط Wnt CHIR-99021، وحمض الريتينويك الذي ولد علامات إيجابية لخلايا عصبية حسية شبيهة بالخلايا العصبية الشمية التي تعبر معا عن OMP والعلامة العصبية Tuj1 (الفئة الثالثة β-توبولين). يتجاوز هذا النموذج المستخرج من الإنسان قيود أنظمة الفأر ويوفر منصة قوية في المختبر لدراسة تكوين الأعصاب الشمية، والاضطراب العصبي المرتبط بكوفيد-19، وغيرها من الاضطرابات التنكسية العصبية المرتبطة بالشم.

المقدمة

يدعم الجهاز الشمي البشري التكوين العصبي ^{المستمر،1} وهي عملية تدفعها الخلايا الجذعية القاعدية في الظهارة الشمية، وبشكل خاص الخلايا القاعدية الأفقية (HBCs) والخلايا القاعدية الكروية (GBCs). ^2,3 خلايا الدم الخلفية تتمايز بشكل جزئي إلى خلايا عصبية حسية شمية (OSNs)، بينما تبقى الخلايا الهيدرونية في حالة سكونية حتى يتم تنشيطها بفعل الإصابة. ^يبدأ الإدراك الشمي عندما ترتبط جزيئات الشم بمستقبلات على الأهداب في شبكات الشم الشفافة، مما يؤدي إلى سلسلة نقل الإشارة التي تنقل المعلومات إلى البصلة الشمية والقشرة الشمية. ⁶ تطور وصيانة هذه الوظيفة الحسية يحكمها الظهارة الشمية.

غالبا ما تختفي اضطرابات الشم الناتجة عن الإهانات الجسدية أو الكيميائية أو البيولوجية بشكل تلقائي. ⁷ ومع ذلك، فإنه يؤثر على 1.5٪ إلى 25٪ من سكان العالم⁸ ويمكن أن ينتج عن أسباب متنوعة، بما في ذلك الصدمات، ⁹ العدوى، ^{واضطرابات} عصبية تنكسية مثل الزهايمر ومرض باركنسون¹¹؛ في هذه الحالات، غالبا ما يكون التعافي التلقائي غير مكتمل أو غائب. تظهر الأساليب العلاجية الحالية، مثل تدريب الشم وإعطاء الكورتيكوستيرويدات، فعالية محدودة. ^12,13 ينبع هذا الفجوة العلاجية من فهم غير كامل للآليات التي تحكم بقاء الظهارة العصبية الشمية وتجديدها بعد الإصابة، وهي فجوة معرفية تفاقمت بسبب عدم كفاية النماذج المختبرية الموجودة لدراسة علم الشم البشري.

في السنوات الأخيرة، أدى تطوير نماذج متنوعة للعضويات البشرية إلى خلق منصات تكنولوجية جديدة لدراسة الأمراض البشرية. تم إنتاج ¹⁴ عضوية مشتقة من الخلايا الجذعية البالغة (AdSCs)، المعروفة أيضا بالخلايا الجذعية المقيمة في الأنسجة، بنجاح لمجموعة من الأنسجة المشتقة من الإندودرم، بما في ذلك المعدة والكبد والبنكرياس والرئتين والمثانة. 15,16,17,18,19 على النقيض من ذلك، لا يزال تحديد عضويات الظهارة الشمية البشرية من اللوح الشمي المشتق من الأديم الخارجي تحديا تقنيا. التحدي العملي الرئيسي هو صعوبة الحصول باستمرار على نسيج ظهاري شموي صالح من التوربينات العلوية البشرية. تختلف مواقع ونطاق منطقة الشم بشكل كبير بين الأفراد وتخضع لتدهور واضح مرتبط بالعمر. التجمع غير المقصود للظهارة التنفسية بدلا من الرائحة الشمية يؤثر على نتائج الزرعة. لمعالجة ذلك، قمنا بتحسين بروتوكول 2021 الذي أعده رين وآخرون، الذين نجحوا في زراعة تجمعات الخلايا من الغشاء الشمي البشري،²⁰ لتوليد عضويات ظهارية شمية بشرية بشكل موثوق. يولد نهجنا عضويات ظهارية شمية بشرية ذات بنية ثلاثية الأبعاد منظمة هرميا ويدعم تمييزها إلى خلايا عصبية حسية شمية. يوفر هذا النموذج منصة تجريبية قيمة للتحقيق في الآليات التي تحدد مصير الخلايا الجذعية الظهارية الشمية ولفحص العوامل العلاجية المحتملة لاضطرابات الشم.

لتلخيص الأمر بشكل صريح، الهدف الأساسي من هذه الطريقة هو إنشاء سير عمل موحد لتوليد وتمايز الأعضاء الظهارية الشمية البشرية والخلايا السلفية البالغة. مبرر هذا النهج هو معالجة الفجوة الحرجة التي تنشأ بسبب غياب نماذج المختبر ذات الصلة الفسيولوجية لجهاز الشم البشري. مقارنة بمزارع الطبقة الأحادية التقليدية ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) أو نماذج الفئران، يقدم هذا النظام ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) المستمد من الإنسان ميزة مميزة تتمثل في إعادة تلخيص التنظيم المكاني المعقد والسياق الجيني الخاص بالإنسان للمخاط الشمي بأمانة تامة. لكي ينظر الباحثون في هذا البروتوكول، من الضروري أن ندرك أن العزل الدقيق للظهارة الشمية الحية عن التوربينات العلوية البشرية، مع تجنب التلوث بالظهارة التنفسية، يمثل تحديا استثنائيا ويتأثر بشدة بعمر المريض والاختلافات التشريحية الفردية. وبالتالي، فإن هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للباحثين الذين لديهم وصول مستمر إلى العينات السريرية البشرية ويسعون لنمذجة تكوين الأعصاب الشمية البشرية، أو فقدان النوم الناجم عن الفيروس، أو نقص الشم المرتبط بالاضطرابات التنكسية العصبية.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة بموافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) لمستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان (الموافقة رقم 2024 (31)). تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المرضى المشاركين قبل جمع الأنسجة ونشر البيانات. تم الحصول على عينات من أنسجة التوربينات العلوية من مرضى خضعوا لجراحة قاعدة الجمجمة بالمنظار أو جراحة الجيوب الغربالية لعلاج الأنف السائل الدماغي الشوكي.

1. معالجة ونقل عينات الأنسجة

1. بعد الجمع مباشرة، وضع عينات الأنسجة في وسط نقل معقم مبرد مسبقا، مكون من وسط قاعدي DMEM/F12/HEPES مع محلول 10٪ مصل أبقار جنيني و5٪ محلول بنسلين-ستريبتوميسين، ونقلها إلى المختبر عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يساعد المصل في الحفاظ على حيوية الخلية، بينما يمنع خليط المضادات الحيوية التلوث الميكروبي المحتمل أثناء النقل. حافظ على وقت النقل أقل من ساعتين للحفاظ على صلاحية الهاتف.

2. معالجة الأنسجة المسبقة (تجرى على الثلج)

1. انقل العينة إلى طبق زراعة معقم ومبرد، وأزل وسط النقل، واغسل النسيج باستخدام محلول PBS معدل يحتوي على محلول 5٪ من البنسلين--ستربتوميسين. قم بالغسل كما يلي: أضف 5 مل من محلول الغسل المبرد مسبقا إلى الطبق، ثم اضغط بلطف على المنديل 5–7 مرات، ثم استنشق السائل بالكامل. كرر دورة الغسل هذه ثلاث مرات لإزالة خلايا الدم وبقايا الأنسجة.
2. باستخدام المقص المعقم، قم بتقطيع النسيج إلى شظايا بحجم تقريبي من 1–2 مم³.
   ملاحظة: خلال هذه الخطوة، حافظ على ترطيب الأنسجة، وثبتها بملقط ذو طرف حاد، وتقليل وقت التقليم للحفاظ على حيوية الخلايا.

3. الهضم الإنزيمي

1. انقل النسيج المنفصل ميكانيكيا إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل وأضف 3 مل من محلول الهضم المركب المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (يحتوي على 0.125٪ تريبسين و10 U/mL DNase I)، مع الحفاظ على نسبة حجم الإنزيم إلى الأنسجة 3:1. حضن الأنبوب في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع تحريك خفيف لمدة 20 دقيقة. افحص العينة كل 5 دقائق لمراقبة تقدم الهضم ومنع تكتل الأنسجة.
2. أوقف الهضم بإضافة كمية متساوية من محلول الخاتمة، وسط قاعدة DMEM/F12/HEPES مع 10٪ سيروم أبقار جنيني. قم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل 10 مرات لضمان خلط كامل وتلامس فعال بين الإنزيمات والمكونات المثبطة.
   ملاحظة: α1-أنتيتريبسين الموجود في المصل يعادل نشاط التربسين بكفاءة.

4. تحضير نظام التعليق أحادي الخلية

1. ضع مصفاة خلية بحجم 40 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل. باستخدام رأس ماصة مقطوعة بحجم 1 مل، انقل الأنسجة المهضومة والسائل من أنبوب 15 مل إلى المصفاة. حرك المادة بلطف على الفلتر بطرف الماصة لتسهيل مرورها، ثم شطف المصفاة بمحلول إنهاء إضافي بمقدار 1–2 مل. بمجرد مرور كل السائل عبر المصفاة، انقل الترشيح من أنبوب 50 مل إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل.
2. قم بجهاز الطرد المركزي في نظام التعليق عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. راقب الحبيبة الخلوية المميزة في أسفل الأنبوب واستنشق السوبرناتانت بحذر، تاركا حوالي 100 ميكرولتر لتجنب إزعاج أو فقدان الحبيبة الخلية.

5. تأسيس نظام ثقافي ثلاثي الأبعاد

1. دون إعادة تعليق حبيبة الخلية في وسط الزراعة، قم بدمجها مباشرة مع ماتريجيل باستخدام رأس ماصة مبرد مسبقا ومنخفض الارتباط لتحقيق كثافة دقيقة تبلغ 10,000 خلية/ميكرولتر. قم بتوزيع 40 ميكرولتر من هذا الخليط بين الخلية-الماتريجيل في كل بئر من صفيحة تحتوي على 24 بئرا و20 ميكرولتر في كل طبق كونفوكال ذو قاع زجاجي. حضن الألواح على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للماترجيل بالبلمرة وتشكيل سقالة ثلاثية الأبعاد.
2. بعد تصلب المادة، أضف بلطف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الجذعية العصبية الخالية من المصل على طول جدار البئر لتجنب تعطيل الهلام. حافظ على الزراعة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، واستبدال الوسط كل 3 أيام بوسط جديد مسخن مسبقا.
   ملاحظة: يتكون وسط زراعة الخلايا الجذعية العصبية الشمية من DMEM/F12/HEPES مدعوم بالمكونات التالية: R-spondin 1 (200 نانوغرام/مل)، Noggin (100 نانوغرام/مل)، Wnt3a (50 نانوغرام/مل)، EGF (50 نانوغرام/مل)، Y-27632 (10 ميكرومول)، عامل مضاد للميكروبات أولي (100 ميكروغرام/مل)، مكمل N2 (1٪)، مكمل B27 (2٪)، وL-جلوتامين (1٪).

6. الانتقال والتمايز

1. قم بتبريد محلول استعادة العضوية على الثلج لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام؛ استنشق وسط الزراعة من الآبار، ثم أضف 1 مل من محلول الاسترداد البارد المثلج إلى كل بئر. قم بإمالة اللوح إلى زاوية 45° واستنشق المحلول بلطف ووزع المحلول 5–7 مرات لإزالة الأعضاء العضوية من مصفوفة الغشاء القاعدي ونقل التعليق الناتج إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل. حضن الأنبوب على الثلج لمدة 3–5 دقائق، ثم جهاز الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، وأزل السوبرناتانت بعناية، تاركا حوالي 100 ميكرولتر من السائل لمنع فقدان الحبيبة.
2. أضف 1 مل من مادة التفكك العضوي مباشرة إلى حبيبة الخلية وحضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع هز خفيف عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. توقف الهضم فورا بإضافة حجم متساو من محلول التوقف وقم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل 5 مرات لضمان التجانس. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع الخلايا المفككة.
3. إعادة تعليق حبيبات الخلية في ماتريجيل بحجم 40 ميكرولتر لكل بئر لألواح 24 بئر أو 20 ميكرولتر لكل بئر لأطباق الزراعة الكونفوكال ذات القاع الزجاجي؛ اخلط جيدا باستخدام رأس ماصة مبرد مسبقا ومنخفض الارتباط لضمان تعليق متجانس. بعد الزرع في الأطباق أو الأطباق المناسبة، حضن الهياكل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح ببلمرة الماتريجيل وتكوين السقالات ثلاثية الأبعاد. ثم أضف بلطف 500 ميكرولتر من وسط زراعة كروي متخصص خال من المصل لخلايا جذعية عصبية شمية على طول جدران البئر لتجنب إزعاج الهلام. حافظ على الزراعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و95٪ رطوبة نسبية.
4. بعد حوالي 7 أيام من الوفاة، وبعد أن يتحول الجيل الجديد من الأعضاء الظهارية الشمية إلى كرويدات، يتم استنشاق وسط التمدد من أطباق الكونفوكال ذات القاع الزجاجي واستبداله بوسط تفريق. استبدل وسط التمايز بوسط جديد مسخن مسبقا كل 3 أيام. عادة ما تظهر الخلايا العصبية الشمية المميزة شكليا تحت المجهر بعد حوالي 7 أيام من التمايز.
   ملاحظة: يتكون وسط التمايز من DMEM/F12/HEPES مدعوم ب R-Spondin 1 (200 نانوغرام/مل)، نوجين (100 نانوغرام/مل)، Wnt3a (50 نانوغرام/مل)، EGF (50 نانوغرام/مل)، Y-27632 (10 ميكرومولار)، LY411575 (5 ميكرومولار)، CHIR99021 (3 ميكرومولار)، حمض الريتينويك (روماتويد، 1 ميكرومول)، عامل مضاد للميكروبات أولي (100 ميكروغرام/مل)، مكمل N2 (1٪)، مكمل B27 (2٪)، وإل-جلوتامين (1٪).

7. التألق المناعي

1. استنشق وسط الزراعة وغسل العينات بلطف مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من PBS. أزل PBS، ثم أضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد وثبت العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. استنشق وتخلص من المثبت؛ ثم غسل العينات الثابتة ب PBS (3 × 500 ميكرولتر) وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة.
2. استنشق PBS وأضف 500 ميكرولتر من محلول النفاذية (0.2٪ ترايتون X-100 في PBS)، ثم حضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم استنشق وتخلص من المحلول. اغسل العينات ب 0.02٪ PBST (0.02٪ Triton X-100 في PBS؛ 3 × 500 ميكرولتر).
3. أضف 500 ميكرولتر من محلول الانسداد (3٪ BSA في PBS) وحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
4. استنشق محلول الانسداد واستبداله ب 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية، يتم تحضيره عن طريق تخفيف الجسم المضاد الأولي المناسب (مثل مضاد GAP43 عند 1:160، مضاد OMP عند 1:50، أو مضاد SOX2 عند 1:50) في محلول الحظر، وحضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، استنشق محلول الجسم المضاد الأساسي وغسل العينات ب PBST بنسبة 0.02٪ (3 × 500 ميكرولتر).
5. أضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية مترافقة من أليكسا فلور 488 أو أليكسا فلور 555 مخفف بمقدار 1:500 في محلول حاجب، وحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة واحدة. استنشاق محلول الأجسام المضادة الثانوية وإجراء غسلات إضافية ب PBST بنسبة 0.02٪ (3 × 500 ميكرولتر).
6. أضف 500 ميكرولتر من محلول DAPI العامل (DAPI مخفف في PBS) وحضن في الظلام لمدة 10 دقائق لصبغ النوى. استنشق محلول DAPI وغسل العينات ب PBST بنسبة 0.02٪ (3 × 500 ميكرولتر). تخزين العينات الملونة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل التصوير.

8. تصوير المجهر الكونفوكالي

1. إجراء المجهر الكونفوكالي باستخدام حجم محور Z 1 ميكرومتر للعضويات التي يبلغ قطرها ≤100 ميكرومتر، و0.5 ميكرومتر للعضويات التي يزيد حجمها عن 100 ميكرومتر. التقاط الصور في وضع التسلسلي متعدد القنوات، مع المسح بالترتيب التالي: DAPI، FITC، TRITC، وCy5. استيراد ملفات تسلسل الصور من Z-stack التي تم الحصول عليها إلى برنامج العرض ثلاثي الأبعاد (مثل Imaris). استخدم دالة العرض ثلاثي الأبعاد لتوليد نموذج ثلاثي الأبعاد كامل للأورجينويد. راقب هذا النموذج المعاد بناؤه لرؤية التوزيع المكاني لعلامات خلوية محددة (مثل SOX2، GAP43، وOMP) ولتأكيد نوعي البنية الهرمية وحالة التمايز العصبي للعضويات الظهارية الشمية كنقطة نهاية نهائية.

النتائج

عزل الأنسجة الظهارية الشمية وزراعة الأعضاء الظهارية الشمية الأولية
لإنشاء نظام زراعة للعضويات الظهارية الشمية، قمنا بعزل الظهارة الشمية من نسيج القريني العلوي البشري ودمجناها في مصفوفة ماتريجيل ثلاثية الأبعاد (الشكل 1). استنادا إلى ظروف الزراعة المحددة التي أبلغ عنها رين وآخرون، قمنا بالتحقق من صحة وضبط تركيزات عوامل النمو الرئيسية، EGF، Noggin، Wnt3a، وR-pondin 1، مع مثبط ROCK Y-27632. دعم هذا المزيج بقوة التوسع النسيلي وتكاثر العضوية ال...

المناقشة

تمثل الأعضاء نموذجا فريدا في المختبر لأن هيكلها الذاتي التنظيم ثلاثي الأبعاد يعكس عن كثب هيكل الأنسجة البشرية الأصلية، وفي بعض الحالات قد لا يمكن تمييزها نسيجيا عن الأعضاء الفعلية. ¹⁴ لذلك، فإن تأسيس نماذج العضويات البشرية أمر حاسم لدراسة الأمراض البشرية. هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد نظام زراعة عضوي من خلايا الشم الظهارية الأولية البشرية التي تتمايز بشكل موثوق إلى خلايا عصبية حسية ناضجة. يتغلب هذا النهج على قيود الطرق التقليدية التي اعتمدت حصريا على الظهارة...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM