يعمل دواء بروبينتوفيلين على تخفيف فرط التألم في مكان الشق الجراحي عن طريق تنظيم فسفرة ERK1/2 في الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي

Xu Jin; Na Zhou; Lixiong Tuo; Yisa Shi

doi:10.3791/70927

مقالة بحثية

يعمل دواء بروبينتوفيلين على تخفيف فرط التألم في مكان الشق الجراحي عن طريق تنظيم فسفرة ERK1/2 في الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي

DOI:

10.3791/70927

⸱

أغسطس 14, 2026

Xu Jin¹ , Na Zhou² , Lixiong Tuo¹ , Yisa Shi³

¹Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, ²Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, ³Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تبحث هذه الدراسة في تأثير مادة propentofylline التي يتم إعطاؤها داخل القراب على تخفيف فرط التألم الجراحي، وما إذا كان هذا التأثير مرتبطاً بتغيرات في واسمات الخلايا الدبقية الشوكية وفي فسفرة البروتينات extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 في الجرذان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط الخلايا النجمية النخاعية، والخلايا الدبقية الصغيرة، والكيناز 1 و2 المنظم للإشارات خارج الخلية (ERK1/2) بعمليات معالجة الألم. بحثت هذه الدراسة فيما إذا كان حقن البروبنتوفيلين (PPF) داخل القراب قبل الجراحة يخفف من فرط التألم الجراحي الحاد في الجرذان، وما إذا كان هذا التأثير مرتبطاً بمؤشرات الخلايا الدبقية النخاعية وفسفرة ERK1/2. تم توزيع ستة وستين جرذاً من ذكور سلالة Sprague–Dawley عشوائياً على مجموعات: المجموعة الضابطة، ومجموعة الألم الجراحي، والمحلول الملحي العادي، وثنائي ميثيل سلفوكسيد، وPPF، وU0126. تم تقييم فرط التألم الميكانيكي والحراري عند نقطة الأساس وبعد 2 و4 و8 و24 و72 ساعة من الشق الجراحي. كما تم تقييم المؤشرات العصبية والدبقية النخاعية، وp-ERK1/2، والوسطاء الالتهابيين باستخدام لطخة ويسترن والومضان المناعي. بالإضافة إلى ذلك، استُخدمت تجارب على الخلايا النجمية النخاعية الأولية لفحص إطلاق الوسطاء الالتهابيين المعتمد على ERK1/2. أدى حقن PPF داخل القراب قبل الجراحة إلى تخفيف فرط التألم الميكانيكي والحراري طوال فترة الملاحظة التي استمرت 72 ساعة، بينما خفف U0126 من فرط التألم بشكل أساسي خلال الفترة المبكرة بعد الشق الجراحي. وبعد 4 ساعات من الشق، ارتبط كلا العلاجين بانخفاض تعبير GFAP وIba-1 وp-ERK1/2 النخاعي، وانخفاض التفاعل المناعي لـ TNF-α وCOX-2. وفي الخلايا النجمية المستزرعة، قلل PPF من إطلاق الوسطاء الالتهابيين المحفز بواسطة LPS، بينما أدى نشاط ERK1/2 التلقائي إلى إضعاف هذا التأثير. تدعم هذه النتائج وجود ارتباط بين التأثير المضاد لفرط التألم لـ PPF وتعديل الاستجابات الدبقية النخاعية، والاستجابات المرتبطة بـ ERK1/2، والاستجابات الالتهابية بعد الشق الجراحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يستمر ألم الشق الجراحي، وهو نوع شائع من الألم الحاد الذي يلي الإجراءات الجراحية، عادةً لأكثر من 7 أيام، ولكنه ينطوي على آليات مرضية معقدة تختلف عن آليات الألم الالتهابي والألم العصبي¹^,². وإذا لم يتم التحكم في ألم الشق الجراحي بشكل جيد أثناء تطوره، فقد يتطور بشكل أكبر إلى متلازمة الألم المزمن، وقد تتحول طبيعته من ألم إصابة الأنسجة الحادة إلى ألم عصبي أو مختلط³. وبوجه عام، يعد إعطاء المسكنات، مثل الأفيونيات ومضادات الالتهاب غير الستيرويدية، الشكل الأكثر شيوعاً لتسكين الآلام بعد الشق الجراحي. ومع ذلك، قد تحدث العديد من الآثار الجانبية مع الاستخدام المستمر أو الجرعات العالية من هذه الأدوية، وهو أمر يبرز الحاجة إلى استراتيجيات تسكين أكثر أماناً وفعالية.

تشير الأدلة الموثوقة إلى أن مادة propentofylline (PPF) تخفف من فرط التألم عبر عمليات الألم المختلفة⁴^,⁵. وعلاوة على ذلك، يمكن تحقيق التأثير المسكن لـ PPF جزئياً من خلال تثبيط التعبير الشوكي لبروتينات كينازات البروتين المنشطة بالميتوجين (MAPKs)، مثل p38 وكينازات c-Jun N-terminal kinases (JNKs)⁶. وعلى الرغم من إثبات تأثيرات PPF على مسارات p38 وJNK، إلا أن قدرتها المحتملة على تعديل مسار كيناز ERK1/2 (الكيناز المنظم للإشارات خارج الخلية 1 و2)، وهو فرع آخر مهم من عائلة MAPK متورط في إشارات الألم، لا تزال غير مستكشفة في حالات الألم الحاد الناتج عن الشق الجراحي. وتكتسب هذه الفجوة المعرفية أهمية خاصة نظراً لأن تنشيط ERK1/2 يظهر أنماطاً زمنية وخلوية متميزة مقارنة بـ p38 وJNK، مما يشير إلى وجود فرص علاجية فريدة محتملة.

كان يُعتقد في البداية أن الخلايا الدبقية، بما في ذلك الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية قليلة التغصن، تمثل مجرد الهيكل الرابط والداعم للأنسجة العصبية. ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة تلعب دورًا مهمًا في تنظيم اللدونة التشابكية ونقل معلومات الألم⁷. وبوصفها البالعات المقيمة في الدماغ والنخاع الشوكي، يمكن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بواسطة عدة إشارات تحفيزية خارج خلوية في المرحلة المبكرة جدًا من عملية الألم، ومن ثم تتكاثر وتفرز كميات كبيرة من السيتوكينات الالتهابية، مما يزيد من توصيل إشارات الألم من النخاع الشوكي إلى الدماغ⁸^,⁹. وبالتزامن مع ذلك، يمكن للخلايا النجمية المنشطة أن تزيد من إفراز الناقل العصبي الاستثاري glutamate وترسل المعلومات مباشرة إلى العصبونات الحسية عن طريق تعزيز التواصل بين الخلايا¹⁰.

أظهرت الدراسات أن تنشيط الخلايا النجمية يحدث في المرحلة المبكرة (خلال أول 24 h) من الألم الناجم عن الشق الجراحي، بينما يظهر تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في وقت لاحق بكثير¹¹^,¹². بالإضافة إلى ذلك، أشارت إحدى الدراسات إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة لها تأثير محدود على فرط التألم الميكانيكي في الألم الناجم عن الشق الجراحي¹³. وتسلط هذه النتائج الضوء على الأسئلة المستمرة حول الأدوار المتميزة للخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في الألم الحاد. وقد تم الإبلاغ عن أن مادة Propentofylline، وهي عامل معدل للخلايا الدبقية، تخفف من فرط التألم عن طريق تنظيم تنشيط الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة بعد إصابة تضييق العصب المزمنة، وإصابة العصب الحادة، وإصابة الأنسجة الحادة⁴^,⁵. ومع ذلك، وبناءً على المعرفة الحالية، لم تدرس أي دراسة تأثيرات PPF على تنشيط الخلايا النجمية أو الخلايا الدبقية الصغيرة في الألم الحاد الناجم عن الشق الجراحي.

يُعدُّ كيناز ERK1 و2 المنظم للإشارات خارج الخلوية، وهو عائلة فرعية رئيسية من MAPK يتم تنشيطها في مرحلة تالية لـ mitogen-activated protein kinase 1 and 2 (MEK1/2)، متورطاً بشكل واسع في عمليات معالجة استقبال الألم واللدونة العصبية¹⁴^,¹⁵. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) يمكن تحفيزه في العصبونات الشوكية عن طريق التحفيز المسبب للألم، كما يمكن اكتشافه في الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في حالات الألم الالتهابي أو الاعتلال العصبي¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. بالإضافة إلى ذلك، أفادت التقارير أن التثبيط الدوائي لمسار إشارات MEK1/2–ERK1/2 يؤدي إلى تخفيف فرط التألم الميكانيكي والحراري في عدة نماذج للألم²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵.

ومع ذلك، لا يزال التوزيع الخلوي لـ ERK1/2 في النخاع الشوكي، خاصة في الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة، والتي يتم تنشيطها عن طريق شق جراحي حاد ودورها في الألم الناجم عن الشق، غير محدد بشكل كافٍ. وتشير الدراسات السابقة التي أجرتها المجموعة البحثية إلى أن PPF يخفف من فرط التألم الناتج عن الشق الحاد في الجرذان عن طريق تقليل إشارات JNK و p38 في النخاع الشوكي، ولكن ما يزال من غير الواضح ما إذا كان PPF ينظم أيضاً الإشارات المرتبطة بـ ERK1/2 في الخلايا الدبقية بالنخاع الشوكي أثناء الألم الناجم عن الشق. وبناءً على ذلك، يجب اعتبار الدراسة الحالية امتداداً للأطر الحالية المتعلقة بالخلايا الدبقية و MAPK في أبحاث الألم بدلاً من كونها نموذجاً ميكانيكياً مستقلاً تماماً. ويكمن تميزها الرئيسي عن الأعمال السابقة في تركيزها تحديداً على ألم الشق الحاد، وفحصها لـ ERK1/2 بدلاً من p38/JNK كعنصر MAPK محل الاهتمام، وتقييمها للتوزيع الخلوي المبكر لـ p-ERK1/2 في النخاع الشوكي فيما يتعلق بالعلاج بـ PPF.

صُممت هذه الدراسة للتحقيق فيما إذا كان إعطاء PPF داخل القراب قبل الجراحة يقلل من فرط التألم الجراحي في نموذج شق باطن قدم الجرذ، وما إذا كان هذا التأثير مرتبطاً بفسفرة ERK1/2 أو تغيرات في تعبير العلامات العصبية والدبقية النخاعية والوسطاء الالتهابيّين، عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) وسيكلوأكسيجيناز-2 (COX-2). وبشكل أكثر تحديداً، تختلف هذه الدراسة عن التقارير السابقة في دمجها بين التقييم السلوكي وتحليل Western blot الزمني؛ ومقارنتها الدوائية مع مثبط MEK1/2 وهو U0126؛ وتحديد موقع p-ERK1/2 نوعياً باستخدام التألق المناعي في الخلايا العصبية النخاعية، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة ضمن نموذج ألم جراحي حاد. وعلى الرغم من أن إطارها الآلي يعتمد على الدراسات السابقة التي تربط بين التعديل الدبقي وإشارات MAPK والألم، فإن العمل الحالي يهدف إلى تقديم أدلة إضافية على الاحتمالية القائمة لمشاركة الاستجابات الدبقية المرتبطة بـ ERK1/2 في النخاع الشوكي في المرحلة المبكرة من فرط التألم الجراحي.

بالمقارنة مع المسكنات التقليدية المستخدمة بعد الجراحة، يمكن للنهج التي تستهدف مسارات معينة اختبار مكون إشارات محدد، ولكنها قد توفر فائدة محدودة زمنياً وقد تتطلب طرق إيصال باضعة؛ وقد أظهر تثبيط MEK1/2–ERK1/2 تأثيرات مضادة لفرط التألم في العديد من نماذج الألم التجريبية²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. ويختلف PPF عن مثبطات المسار الواحد لكونه ينظم الاستجابات الدبقية وقد تم ربطه بأكثر من عملية واحدة مرتبطة بـ MAPK⁴^,⁵^,⁶. ولا يزال التطبيق العملي محدوداً بسبب التصميم قبل السريري، والإعطاء داخل القراب قبل الجراحة، واستخدام ذكور الجرذان فقط، وغياب دراسات تحديد الجرعات والدراسات المتعلقة بالسلامة في نماذج جراحية أكبر.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على التجارب التي أُجريت من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى التابع الثاني لجامعة لانتشو، بمقاطعة غانسو، الصين (رقم الموافقة الأخلاقية 2017-070). اتبعت جميع الإجراءات إرشادات الجمعية الدولية لدراسة الألم²⁶. تم استخدام ما مجموعه 66 من ذكور جرذان Sprague–Dawley البالغة التي تم الحصول عليها من مركز معتمد لحيوانات المختبر وتتراوح أوزانها بين 200–250 g. وقد شملت هذه الدراسة ذكور الجرذان فقط لتقليل التباين المحتمل المرتبط بالتأثيرات الهرمونية المعتمدة على الجنس. نُفذت جميع البروتوكولات وفقاً لإرشادات الجمعية الدولية لدراسة الألم²⁶، واتُخذت الجهود اللازمة لتقليل المعاناة. تتوفر معلومات مفصلة عن الكواشف والمواد الاستهلاكية والأجهزة والبرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

الحيوانات

تم إيواء الجرذان في أزواج قبل العملية وبشكل فردي بعد الشق الجراحي، مع توفير الغذاء والماء ad libitum. تم الحفاظ على الغرفة في دورة ضوء لمدة 12 ساعة وظلام لمدة 12 ساعة، مع التحكم في درجة الحرارة عند 24 °C ± 2 °C.

نموذج الحقن داخل القراب والألم الناتج عن الشق الجراحي

لإعطاء المحاليل عن طريق الحقن داخل القناة الشوكية، خُدرت الجرذان باستخدام sevoflurane بتركيز 1.5%–3% (عن طريق قمع أنفي) ووُضعت في وضعية الانكباب مع ثني العمود الفقري. تم حلق الفراء فوق المنطقة القطنية وتطهير الجلد فوق المسافة بين الفقرتين L5–L6. أُدخلت حقنة مجهرية عبر الجلد عند المسافة بين الفقرتين L5–L6. واستُدل على الدخول الناجح إلى الحيز تحت العنكبوتية من خلال نفضة مفاجئة للذيل أو حركته أثناء تقدم الإبرة، وتم التأكد من ذلك بشكل أكبر من خلال ظهور السائل الدماغي الشوكي عند السحب الخفيف. وفي حال عدم ملاحظة هذه العلامات، تم تعديل وضعية الإبرة قبل الحقن. لم يتم إجراء الحقن إلا بعد استيفاء كلتا معيتي التأكيد، واستُبعدت الحيوانات التي ظهرت عليها علامات عصبية غير طبيعية بعد الحقن. بعد ذلك، حُقن المحلول المعني ببطء، ونُظف الجلد مرة أخرى بعد الحقن. استغرقت العملية الجراحية حوالي 3 min، وعادت الجرذان عموماً إلى وعيها من التخدير خلال 5–10 min.

تم إنشاء نموذج ألم الشق الجراحي في الجرذان كما تم وصفه سابقاً²⁷. بعد التخدير، تم تعقيم السطح الأخمصي للقدم الخلفية باستخدام 10% povidone–iodine. أُجري شق طولي بطول 1 cm في الجلد الأخمصي، بدءاً من مسافة 0.5 cm تقريباً من العقب وامتداداً نحو الأصابع. اخترق الشق الجلد واللفافة. تم رفع العضلة الأخمصية برفق باستخدام ملقط عيني وشقها طولياً مع الحفاظ على استمرارية الأنسجة بشكل عام. ثم أُعيدت العضلة إلى موضعها، وطُبق ضغط خفيف لتحقيق الإرقاء، وأُغلق الجرح بغرزتين من نوع mattress sutures باستخدام 3-0 nylon. عُقم موقع الشق مرة أخرى بعد إغلاق الجرح. وعقب الجراحة، وُضعت الجرذان في أقفاص فردية وسُمح لها بالتعافي في بيئة هادئة ودافئة، محمية من الضوء القوي مع توفير وصول حر إلى الغذاء والماء. خضعت الحيوانات للمراقبة بعد العملية، واستُبعدت فوراً تلك التي لم تستوفِ المعايير المحددة مسبقاً. تم تحديد عدوى الجرح بناءً على الاحمرار، والتورم، وارتفاع درجة الحرارة الموضعية حول الجرح، ووجود إفرازات قيحية صفراء مخضرة غير طبيعية ذات رائحة كريهة، وتأخر التئام الجرح مع استمرار انفتاحه، والنخر والتوسع، بالإضافة إلى العلامات الجهازية بما في ذلك ارتفاع درجة حرارة الجسم، والخمول، والامتناع عن التغذية. وشملت معايير الاستبعاد الإضافية الفشل في الإفاقة من التخدير خلال 30 min، أو قطع العضلات أثناء العملية أو إصابة وعائية عصبية، أو تشويه الذات بعد الجراحة، أو عدم نجاح إنشاء النموذج، والعجز العصبي، مثل شلل الطرف الخلفي أو عدم القدرة على تحمل الوزن بشكل غير مرتبط بألم الشق الجراحي. كما استُبعدت الجرذان التي تعاني من عدوى الجرح أو انفصاله من الدراسة.

القياس السلوكي

تم قياس عتبة سحب المخلب الميكانيكية (PWMT) وفترة زمن سحب المخلب الحرارية (PWTL) بواسطة باحث لا يعلم توزيع المجموعات. أُجري الاختبار في غرفة هادئة في وقت ثابت من اليوم بعد فترة تأقلم لا تقل عن 10 min؛ وتم الحفاظ على ثبات enclosure، والأرضية الشبكية أو الزجاجية، والضوء المحيط، وشدة مصدر الحرارة عبر جميع المجموعات. لاختبار PWMT، تم تطبيق خيوط von Frey المعايرة (0.4 g، 0.6 g، 1.0 g، 1.4 g، 2.0 g، 4.0 g، 6.0 g، 8.0 g، 10.0 g، و15.0 g) بشكل عمودي على السطح الأخمصي المجاور للجرح حتى ينحني الخيط بمقدار 1–2 mm تقريباً. تم الفصل بين التحفيزات المتتالية بفاصل زمني قدره 2 min، وحُددت قيمة 50% PWMT باستخدام طريقة الصعود والهبوط²⁸. أما لاختبار PWTL، فقد وُضعت الجرذان في enclosures شفافة فردية على أرضية زجاجية، وتم محاذاة مصدر الحرارة الإشعاعي مع السطح الأخمصي بجانب الجرح. وُضع حد زمن قطع قدره 30 s لمنع إصابة الأنسجة، وفُصلت التعرضات المتتالية بفاصل 2 min، وسُجل متوسط ثلاثة قياسات²⁹. واعتُبر رفع المخلب أو هزه أو لعقه استجابة سحب إيجابية؛ وأُعيدت التجارب التي تأثرت بالتنظيف الذاتي أو الحركة أو فقدان محاذاة مصدر الحرارة بعد إعادة التأقلم.

تحليل لطخة ويسترن

في الأوقات المحددة مسبقاً، تم قتل الجرذان عن طريق الخلع العنقي، واستُؤصل النخاع الشوكي القطني L4–L6 بسرعة ووضع في محلول تحلل مخصص لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي مضاف إليه مثبط البروتياز بنسبة 100:1. تم تجنيس الأنسجة، وحفظها على الثلج لمدة 20 min، ثم طردها مركزياً بسرعة 15,000 × g لمدة 20 min عند 4 °C. خُلط السائل الطافي مع محلول تحميل 4× بنسبة 3:1، وسُخن في ماء مغلي لمدة 5 min، ثم خُزن عند −80 °C. فُصلت عينات البروتين (30 µg لكل حارة) على هلامات بولي أكريلاميد-دوديسيل كبريتات الصوديوم بنسبة 10% ونُقلت إلى أغشية بولي فينيليدين فلوريد بمسامية 0.45 أو 0.22 µm. تم التحقق من نجاح عملية النقل من خلال تأكيد الهجرة المتوقعة لعلامة الوزن الجزيئي المصبوغة مسبقاً وعدم وجود مناطق نقل غير متساوية أو منقطعة بشكل واضح. حُجبت الأغشية باستخدام 5% من الحليب منزوع الدسم و 3% من ألبومين المصل البقري لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة، وحُضنت طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد NeuN بنسبة (1:8,000)، أو GFAP بنسبة (1:4,000)، أو Iba-1 بنسبة (1:3,000)، أو p-ERK1/2 بنسبة (1:1,000)، أو t-ERK1/2 بنسبة (1:3,000)، أو GAPDH بنسبة (1:2,000). وبعد الغسل في محلول ملحي منظم بالتريس يحتوي على 0.05% من Tween 20 (pH 7.4)، حُضنت الأغشية مع الجسم المضاد الثانوي المقترن ببيروكسيداز الفجل المقابل بنسبة (1:5,000) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. تم تطوير الإشارات باستخدام التألق الكيميائي المحسن وتسجيلها على فيلم باستخدام نطاق تعريض مماثل لكل هدف. قام باحث لا يعرف توزيع المجموعات بتحليل كثافة النطاقات باستخدام برنامج لتحليل الصور. حُوّلت الصور إلى تدرج رمادي 8-bit، وطُبقت منطقة اهتمام مستطيلة متطابقة على كل نطاق، وطُرحت الخلفية المحلية من منطقة فارغة مجاورة، وسُجلت الكثافة المتكاملة. استُخدم نفس حجم المنطقة وإجراء الخلفية لجميع الحارات في اللطخة الواحدة. تم تطبيع NeuN و GFAP و Iba-1 و t-ERK1/2 بالنسبة إلى GAPDH، بينما طُبع p-ERK1/2 بالنسبة إلى t-ERK1/2، ثم عُبر عن القيم بالنسبة إلى المجموعة الضابطة.

التألق المناعي

في الأوقات المحددة مسبقاً، تم تخدير الجرذان باستخدام 3% pentobarbital sodium بجرعة (1.5 mL/kg)، ثم أُجري لها تروية عبر القلب باستخدام 300 mL من محلول phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4) بتركيز 0.01 mol/L مبرد مسبقاً، يليه 250 mL من 4% paraformaldehyde مبرد مسبقاً. بعد ذلك، تم إجراء تثبيت لاحق للحبل الشوكي في المنطقة L4–L6 في 4% paraformaldehyde لمدة 6 h، ثم حُميت الأنسجة من التجمد (cryoprotection) طوال الليل في 20%–30% sucrose–PBS عند 4 °C، وقُطعت إلى مقاطع بسمك 10 µm عند −22 °C. غُسلت المقاطع في 0.01 mol/L PBS، ثم حُجبت (blocked) في 10% goat serum لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، وحُضنت طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد NeuN (1:100)، أو GFAP (1:1,000)، أو Iba-1 (1:100)، أو p-ERK1/2 (1:100)، أو TNF-α (1:200)، أو COX-2 (1:50). وبعد ثلاثة غسلات بمحلول PBS، حُضنت المقاطع مع الجسم المضاد الثانوي المقابل والمقترن بفلوروفور أخضر أو أحمر (1:400) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، ثم غُسلت ثلاث مرات أخرى بمحلول PBS وثُبتت باستخدام وسط مانع للتلاشي (antifade medium) وغطاء شريحة. تضمنت كل دفعة تلوين مقاطع تحكم سلبية عولجت بدون الجسم المضاد الأولي. تم التقاط الصور بواسطة باحث تعمى عن معرفة المجموعات باستخدام مجهر فلوري. تم الحصول على صور عامة بتكبير منخفض باستخدام عدسة شيئية 10×، بينما تم الحصول على صور التفاعل المناعي الخلوي والتوطن المشترك (co-localization) باستخدام عدسات شيئية 20× أو 40× وفقاً للوحة الشكل المقابلة. ولإجراء المقارنات ضمن الشكل نفسه ودفعة التلوين ذاتها، تم تثبيت تكبير العدسة الشيئية، وكثافة الإضاءة، ووقت التعرض، وكسب الكاشف (detector gain)، وإعدادات الكاميرا، ومعايير معالجة الصور بعد تحسينها لتكون دون مستوى التشبع. تم التقاط قنوات الفلورسنت المنفصلة بالتتابع لتقليل تداخل القنوات. كما تم تصوير ثلاثة حقول غير متداخلة في القرن الظهري لنفس الجانب (ipsilateral dorsal horn) لكل حيوان. وتم قياس شدة الفلورسنت باستخدام برنامج لتحليل الصور بعد التحويل إلى 8-bit، وطرح الخلفية باستخدام منطقة خالية من الخلايا، وتطبيق منطقة اهتمام (region of interest) وعتبة (threshold) متطابقتين ضمن كل دفعة تلوين؛ ثم حُسب متوسط قيم الحقول للحصول على قيمة واحدة لكل حيوان. استُبعدت الحقول التي تعاني من التعرض المفرط، أو طي الأنسجة، أو التمزق، أو ضعف التركيز، أو عدم استواء الخلفية، وأُعيد تصويرها تحت نفس إعدادات عدم التشبع. قُبل التلوين عندما كانت بنية النسيج سليمة، وإشارة الهدف تتجاوز إشارة التحكم الخالية من الجسم المضاد الأولي، ولم يؤثر أي طي كبير أو تمزق أو منطقة مشبعة على التحليل.

In vitro تجارب الخلايا النجمية النخاعية الأولية

تم استزراع الخلايا النجمية الأولية من النخاع الشوكي للجرذان تحت ظروف تعقيم قياسية في وسط استزراع كامل عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂. استُخدمت الخلايا عندما وصلت درجة تلاقيها (confluence) إلى 70%–80% تقريبًا، وقُسمت إلى مجموعات: المجموعة الضابطة، ومجموعة محفزة بـ LPS، ومجموعة LPS + PPF، ومجموعة LPS + U0126، ومجموعة استعادة ERK1/2. أُضيف كل من PPF و U0126 بتركيز 10 µM. وجرى توحيد ظروف تحفيز LPS، والمعالجة الدوائية، وعمليات الحصاد في جميع الآبار المتوازية ضمن كل تجربة. ولتحليل انتقائية المسار، جُمعت مستخلصات الخلايا لإجراء تحليل Western blotting لبروتينات p-ERK1/2 و t-ERK1/2 و p-p38 و total p38 و p-JNK و total JNK وعنصر التحكم في التحميل (loading control) المقابل. كما جُمعت السوائل الطافية للاستزراع من الآبار المتوازية، ونُقيت عن طريق الطرد المركزي، وحُللت لقياس TNF-α و PGE2 و IL-6 باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. واتبع قياس الكثافة الضوئية لـ Western blot مبادئ تحليل الصور الموضحة أعلاه. وفي تجارب الاستعادة، تم تثبيط ERK1/2 الداخلي عن طريق ترانسفكشن siRNA، كما تم إدخال بنية تعبيرية لـ ERK1/2 نشطة بنيويًا (CA-ERK1/2) قبل المعالجة. وتم التأكد من كفاءة التثبيط (knockdown) والإفراط في التعبير (overexpression) بواسطة Western blotting قبل تفسير بيانات السيتوكينات. واستُخدمت الخلايا التي تعرضت لكاشف الترانسفكشن بدون siRNA نشط أو بنية تعبيرية كضوابط إجرائية عند الاقتضاء.

التصميم التجريبي

تقسيم الحيوانات التجريبية إلى مجموعات فرعية

تم توزيع الجرذان على ست مجموعات باستخدام طريقة جدول الأرقام العشوائية، واكتمل تخصيص المجموعات قبل إجراء الاختبارات السلوكية وجمع الأنسجة. تكونت المجموعات الست من مجموعة ضابطة فارغة (n = 6)، ومجموعة ألم الشق الجراحي (IP) (n = 18)، ومجموعة محلول ملحي طبيعي (NS) (0.9% NS، 10 µL؛ n = 9)، ومجموعة PPF (بتركيز 10 µg في 10 µL؛ n = 12)، ومجموعة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (10% DMSO، 10 µL؛ n = 9)، ومجموعة U0126 (بتركيز 10 µg في 10 µL؛ n = 12). لم تخضع الجرذان في المجموعة الضابطة الفارغة لشق أخمصي أو حقن داخل القراب، واستُخدمت كضوابط غير معالجة. خضعت الجرذان في مجموعة IP لشق أخمصي دون معالجة مسبقة بالحقن داخل القراب. وتلقت الجرذان في مجموعات NS وPPF وDMSO وU0126 إعطاءً داخل القراب للعوامل الخاصة بكل منها قبل 30 min من الشق الأخمصي. عملت مجموعة NS كضابط للمادة الحاملة لـ PPF، بينما عملت مجموعة DMSO كضابط للمادة الحاملة لـ U0126.

جرعات propentofylline وU0126

يُعد البروبنتوفيلين معدلاً للخلايا الدبقية، وقد تم اختيار جرعة 10 µg لأنها خففت من فرط التألم الحاد في دراسات سابقة أجراها الفريق البحثي. أما U0126 فهو مثبط لـ MEK1/2 غير تنافسي مع أدينوسين ثلاثي الفوسفات، ويُستخدم لمنع فسفرة ERK1/2. وقد أُبلغ عن جرعات فعالة داخل القراب تتراوح بين 1–10 µg في نماذج ألم مختلفة³⁰^,³¹^,³²؛ لذا استُخدمت جرعة 10 µg في الدراسة الحالية. تم إذابة U0126 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 10%، بينما أذيب PPF في محلول ملحي طبيعي بتركيز 0.9%. وكانت التركيزات النهائية 1 µg/µL. جُهزت العقاقير والمواد الناقلة قبل الجراحة، وحُفظت عند 4 °C، واستُخدمت خلال 12 h.

تأثير الإعطاء داخل القراب قبل الجراحة لـ propentofylline أو U0126 على فرط التألم

تم اختيار ستة جرذان من كل مجموعة عشوائياً لإجراء القياسات السلوكية قبل 24 h من العملية، واعتبرت قيم PWMTs و PWTLs الناتجة بمثابة خط الأساس. تم إعطاء الحقن داخل القراب قبل 30 min من العملية. ولتقييم آثار الإعطاء المسبق لـ PPF و U0126 داخل القراب على فرط التألم الميكانيكي والحراري، تم تقييم PWMT و PWTL عند 2 h و 4 h و 8 h و 24 h و 72 h بعد الشق الجراحي.

التصميم التجريبي لتقييم تأثيرات إعطاء البروبنتوفيلين أو U0126 داخل القراب قبل الجراحة على تعبير العلامات العصبية والدبقية في النخاع الشوكي بعد الشق الجراحي

لتحديد النقطة الزمنية المناسبة بعد الشق لتقييم تأثير العلاج، أُجري أولاً تحليل أولي للمسار الزمني في مجموعة IP. وتحديداً، تم قتل الجرذان في مجموعة IP رحمةً بعد 2 h و 4 h و 24 h و 72 h من الشق، وقِيست مستويات تعبير واسمات الخلايا NeuN و GFAP و Iba-1 في النخاع الشوكي باستخدام تقنية Western blot (n = 3 لكل نقطة زمنية). وبناءً على هذا التحليل الأولي، تم اختيار أول 4 h بعد الشق كنافذة ملاحظة مبكرة بعد الشق لأن تعبير NeuN وصل إلى أعلى مستوياته عند النقطة الزمنية 4 h ولأن التغيرات الجزيئية المبكرة اعتبرت الأكثر صلة بالتطور الأولي لفرط التألم الناجم عن الشق. ومع ذلك، لم يكن الهدف من النقطة الزمنية 4 h تمثيل جميع التغيرات الجزيئية الزمنية التي تلي الشق.

عند هذه النقطة الزمنية المحددة، تم قتل الجرذان التي خضعت للحقن داخل القراب من أجل تحليل Western blot لعلامات خلوية مختلفة (n = 3 لكل مجموعة) والتقييم المناعي الفلوري لمورفولوجيا أنواع الخلايا المختلفة (n = 3 لكل مجموعة). أما في المجموعة الضابطة (blank group)، فقد تم قتل الجرذان عشوائياً لتحديد مستويات التعبير الأساسية لعلامات خلوية مختلفة (NeuN وGFAP وIba-1) في النخاع الشوكي بواسطة Western blot (n = 3) ومورفولوجيا الخلايا المختلفة (العصبونات، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة) بواسطة التألق المناعي (n = 3). وبذلك، عملت المجموعة الضابطة كمرجع أساسي غير مشرح وغير معالج.

تأثيرات العلاج على p-ERK1/2 النخاعي والوسائط الالتهابية

لتحديد النقطة الزمنية المناسبة بعد الشق لتقييم تأثيرات العلاج على تعبير p-ERK1/2 ومستويات السيتوكينات الالتهابية، تم إجراء تحليل أولي للمسار الزمني أولاً في مجموعة IP. وتحديداً، تم قتل الجرذان في مجموعة IP رحمةً بعد 2 h و 4 h و 24 h و 72 h من الشق، وقيس تعبير p-ERK1/2 النخاعي بواسطة تحليل Western blot (n = 3 لكل نقطة زمنية). وبناءً على تجربة المسار الزمني هذه، وبالتزامن مع النقطة الزمنية التي كان فيها تعبير NeuN في أعلى مستوياته بعد الشق، تم اختيار 4 h بعد الشق كنقطة زمنية ثابتة للتقييم اللاحق لتأثيرات PPF أو U0126 التي تم إعطاؤها داخل القراب قبل الجراحة على تعبير p-ERK1/2 النخاعي والسيتوكينات الالتهابية. وقد تم اختيار هذه النقطة الزمنية كنافذة ملاحظة ميكانيكية مبكرة وليس كتمثيل شامل لجميع التغيرات الزمنية بعد الشق.

في هذه النقطة الزمنية المختارة، تم قتل الجرذان التي خضعت للحقن داخل القراب للقناة الشوكية رحيمًا لإجراء تحليل Western blot للتعبير عن p-ERK1/2 (n = 3 لكل مجموعة) وتقييم الفلورة المناعية للسيتوكينات الالتهابية (n = 3 لكل مجموعة). وفي المجموعة الضابطة (blank group)، تم إعدام الجرذان عشوائيًا لتحديد مستويات التعبير الأساسية لـ p-ERK1/2 في النخاع الشوكي بواسطة Western blot (n = 3) وللسيتوكينات الالتهابية (TNF-α و COX-2) بواسطة الفلورة المناعية (n = 3). وبذلك، عملت المجموعة الضابطة كمرجع أساسي غير خاضع للشق أو العلاج.

التوطين الخلوي لـ p-ERK1/2 النخاعي في العصبونات والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة

لإجراء مزيد من التقييم للتوزيع الخلوي لـ p-ERK1/2 في النخاع الشوكي بعد الشق، تم إجراء صبغ الفلورة المناعية في مجموعتي Blank و IP بعد 4 h من الشق (n = 3).

التحليل الإحصائي

يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. تم تحديد حجم العينة بالرجوع إلى دراسات سابقة أجرتها المجموعة البحثية وتجارب أولية. حُللت البيانات السلوكية باستخدام تحليل التباين (ANOVA) للمقاييس المتكررة ثنائي الاتجاه، مع اعتبار المجموعة كعامل بين المبحوثين والزمن كعامل داخل المبحوثين. كما قُيمت بيانات لطخة ويسترن (Western blot) المعتمدة على المسار الزمني بواسطة تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه، يليه مقارنات زوجية مُعدلة باختبار بونفيروني (Bonferroni). أما بيانات لطخة ويسترن والوميض المناعي (immunofluorescence) في أوقات محددة، فقد قُيمت بواسطة تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه مع مقارنات مخططة مُعدلة باختبار بونفيروني؛ بينما قُيمت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب (Student’s t-test). وتم تقييم التوزيع الطبيعي وتجانس التباين باستخدام اختباري شابيرو-ويلك (Shapiro–Wilk) وليفين (Levene)، على التوالي. واعتُبرت قيمة p ذات الطرفين < 0.05 ذات دلالة إحصائية. أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي المدرجة في جدول المواد. وبالنسبة لتجارب الخلايا النجمية in vitro، عوملت تجارب الزراعة المستقلة كوحدة للتحليل؛ وقورنت كثافة لطخة ويسترن وتركيزات السيتوكينات باستخدام تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه يليه مقارنات مخططة مُعدلة باختبار بونفيروني، أو اختبار t-test للطالب للمقارنات المحددة مسبقاً بين مجموعتين، حسبما كان مناسباً.

توافر البيانات:

البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة متوفرة في الملف التكميلي 1.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأثيرات الشق الجراحي والإعطاء داخل القراب قبل الجراحة لـ propentofylline أو U0126 على فرط التألم بعد الشق

فرط التألم الميكانيكي

لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في PWMTs بين المجموعات الست قبل 24 ساعة من العملية (p > 0.05؛ الشكل 1A،B). وفي مجموعة IP، انخفض PWMT بعد الشق الجراحي وظل أقل بشكل ملحوظ من خط الأساس من ساعتين إلى 72 ساعة بعد الشق (p < 0.05 مقارنة بخط الأساس؛ الشكل 1A). أما في مجموعتي NS وDMSO، فلم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في PWMTs بين النقاط الزمنية بعد الشق (p > 0.05 مقارنة بمجموعة IP؛ الشكل 1B). وفي مجموعة PPF، كان PWMT أعلى بشكل ملحوظ مما كان عليه في مجموعة IP من ساعتين إلى 72 ساعة بعد الشق (p < 0.05 مقارنة بمجموعة IP؛ الشكل 1A)، وعند 72 ساعة بعد الشق، لم يعد هناك فرق ذو دلالة إحصائية مقارنة بخط الأساس (p > 0.05 مقارنة بخط الأساس؛ الشكل 1A). وفي مجموعة U0126، كانت PWMTs أعلى بشكل ملحوظ من تلك الموجودة في مجموعة IP خلال أول 24 ساعة بعد الشق (p < 0.05 مقارنة بمجموعة IP؛ الشكل 1A)، ولكن هذا التأثير لم يستمر عند 72 ساعة بعد الشق، حيث ظل PWMT أقل بشكل ملحوظ من خط الأساس ولم يعد هناك فرق ذو دلالة إحصائية مقارنة بمجموعة IP (p < 0.05 مقارنة بخط الأساس؛ p > 0.05 مقارنة بمجموعة IP؛ الشكل 1A).

فرط التألم الحراري

لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في زمن سحب المخلب المفضل (PWTLs) بين المجموعات الست قبل 24 ساعة من العملية (p > 0.05؛ الشكل 1C،D). وفي مجموعة IP، انخفض PWTL من 24.85 s ± 1.06 s قبل العملية إلى 4.38 s ± 1.02 s بعد 4 ساعات من الشق الجراحي، ثم ارتفع جزئياً إلى 18.37 s ± 1.38 s بعد 72 ساعة من الشق، ولكنه ظل أقل بكثير من خط الأساس طوال فترة الملاحظة (p < 0.05 مقارنة بـ خط الأساس؛ الشكل 1C). أما في مجموعتي NS وDMSO، فلم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في PWTLs بين النقاط الزمنية بعد الشق الجراحي (p > 0.05 مقارنة بـ مجموعة IP؛ الشكل 1D). وفي مجموعة PPF، كان PWTL أعلى بكثير منه في مجموعة IP طوال فترة الملاحظة التي استمرت 72 ساعة (p < 0.05 مقارنة بمجموعة IP؛ الشكل 1C)، وبعد 72 ساعة من الشق الجراحي، عاد إلى مستوى لم يكن مختلفاً بشكل ملحوظ عن خط الأساس (p > 0.05 مقارنة بخط الأساس؛ الشكل 1C). وفي مجموعة U0126، كان PWTL أعلى بكثير منه في مجموعة IP خلال أول 24 ساعة بعد الشق الجراحي (p < 0.05 مقارنة بمجموعة IP؛ الشكل 1C)؛ ولم يستمر هذا التأثير بعد 72 ساعة من الشق الجراحي، حيث ظل PWTL أقل بكثير من خط الأساس ولم يعد مختلفاً بشكل ملحوظ عن مجموعة IP (p < 0.05 مقارنة بخط الأساس؛ p > 0.05 مقارنة بمجموعة IP؛ الشكل 1C).

تحليل لطخة ويسترن للتغيرات الزمنية في تعبير مؤشرات الخلايا النخاعية وفسفرة كيناز 1 و2 المنظم للإشارات خارج الخلية بعد إجراء الشق الجراحي

تم تحديد عدة حزم عند أوزان جزيئية دقيقة باستخدام أجسام مضادة محددة على أغشية PVDF، بما في ذلك NeuN (48 و 50 kD)، وGFAP (50 kD)، وIba-1 (17 kD)، وp-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD؛ p-ERK2 = 42 kD)، وt-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD؛ t-ERK2 = 42 kD)، وGAPDH (36 kD). واستُخدمت حزمة GAPDH كعنصر تحكم لـ NeuN وGFAP وIba-1 وt-ERK1/2، بينما استُخدمت حزمة t-ERK1/2 كعنصر تحكم لـ p-ERK1/2.

أظهرت بيانات لطخة ويسترن (Western blotting) من الحبال الشوكية في مجموعة IP زيادات بدرجات متفاوتة بعد الشق (الشكل 2A). ووصل تعبير البروتين النووي الخاص بالعصبونات إلى أعلى قيمة له بعد 4 ساعات من الشق (p < 0.001 مقارنة بـ baseline؛ الشكل 2A) وظل مرتفعاً بشكل ملحوظ بعد 72 ساعة من الشق (p < 0.001 مقارنة بـ baseline؛ الشكل 2A). وزادت مستويات البروتين الحمضي الليفي الدبقي تدريجياً على مدار فترة الملاحظة التي استمرت 72 ساعة (p < 0.001 مقارنة بـ baseline؛ الشكل 2A)، حيث لوحظ أعلى مستوى عند 72 ساعة من بين النقاط الزمنية المقاسة. وبالمثل، وصل Iba-1 أيضاً إلى مستوى مرتفع بشكل ملحوظ بعد 4 ساعات من الشق (p < 0.001 مقارنة بـ baseline؛ الشكل 2A) وتذبذب ضمن نطاق ضيق. ومن الجدير بالذكر أن بيانات لطخة ويسترن من الحبال الشوكية في مجموعة IP أظهرت أن تنشيط ERK1/2 قد زاد فقط خلال أول 24 ساعة بعد الشق (p < 0.05 مقارنة بـ baseline؛ الشكل 2B) ولكنه انخفض عند 72 ساعة بعد الشق (p < 0.05 مقارنة بـ baseline؛ الشكل 2B)، بينما لم يظهر تعبير t-ERK/2 أي تغيير ملحوظ في أي نقطة زمنية.

تحليل "وسترن بلوت" (Western blot) لتأثيرات الإعطاء داخل القراب قبل الجراحة لـ propentofylline أو U0126 على تعبير مؤشرات الخلايا و phospho-extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 في النخاع الشوكي

أظهرت بيانات لطخة وسترن (Western blotting) أن تعبير NeuN وصل إلى أعلى مستوياته بعد 4 ساعات من الشق الجراحي، وهو الوقت الذي كان فيه قياس السلوك عند أدنى عتبة له. وبناءً على ذلك، تم تقييم تأثيرات PPF وU0126 اللذين تم إعطاؤهما داخل القناة الشوكية قبل 30 دقيقة من العملية على تعبير وسم الخلية وفسفرة ERK1/2 بعد 4 ساعات من الشق الجراحي.

أظهرت بيانات لطخة ويسترن (Western blotting) أنه مقارنة بالمجموعة الضابطة (blank group)، زاد التعبير النخاعي لجميع واسمات الخلايا بشكل ملحوظ في مجموعة IP بعد 4 ساعات من الشق (p < 0.05 مقارنة بخط الأساس؛ الشكل 3). ومقارنة بمجموعة IP، أدى إعطاء PPF داخل القناة الشوكية قبل الجراحة إلى خفض التعبير النخاعي لكل من NeuN (p < 0.05 مقارنة بـ مجموعة IP؛ الشكل 3A)، وGFAP (p < 0.05 مقارنة بـ مجموعة IP؛ الشكل 3B)، وIba-1 (p < 0.01 مقارنة بـ مجموعة IP؛ الشكل 3C). ومقارنة بمجموعة IP، أدى إعطاء U0126 داخل القناة الشوكية قبل الجراحة أيضاً إلى خفض التعبير النخاعي لـ NeuN (p < 0.01 مقارنة بـ مجموعة IP؛ الشكل 3D)، وGFAP (p < 0.05 مقارنة بـ مجموعة IP؛ الشكل 3E)، وIba-1 (p < 0.01 مقارنة بـ مجموعة IP؛ الشكل 3F). ومع ذلك، عند المقارنة مع المجموعة الضابطة، ظل تعبير NeuN في مجموعة PPF أعلى بشكل ملحوظ من خط الأساس (p < 0.01 مقارنة بـ خط الأساس؛ الشكل 3A)، بينما كان تعبير NeuN في مجموعة U0126 أقل بشكل ملحوظ من تعبيره في المجموعة الضابطة (p < 0.01 مقارنة بـ خط الأساس؛ الشكل 3D). وبالنسبة لـ GFAP وIba-1، يركز النص الآن على المقارنة مع مجموعة IP، كما هو موضح في الشكل 3. ولم يكن لإعطاء NS وDMSO داخل القناة الشوكية قبل الجراحة أي تأثير ملحوظ على تعبير أي من واسمات الخلايا.

أظهرت بيانات لطخة ويسترن (Western blotting) أن تعبير t-ERK1/2 في النخاع الشوكي لم يختلف بشكل ملحوظ بين مجموعات Blank وIP وNS وPPF بعد 4 h من الشق (الشكل 4A). وفي المقابل، وبالمقارنة مع مجموعة blank، زاد تعبير p-ERK1/2 بشكل ملحوظ في مجموعتي IP وNS بعد 4 h من الشق (p < 0.001 مقابل مجموعة blank؛ الشكل 4B). وبالمقارنة مع مجموعة IP، أدى إعطاء PPF داخل القر الناخاعي قبل الجراحة إلى خفض تعبير p-ERK1/2 بشكل ملحوظ بعد 4 h من الشق (p < 0.001 مقابل مجموعة IP؛ الشكل 4B). وبالمقارنة مع مجموعة NS، كان تعبير p-ERK1/2 في مجموعة PPF أقل بشكل ملحوظ أيضاً (p < 0.01 مقابل مجموعة NS؛ الشكل 4B). ومع ذلك، وبالمقارنة مع مجموعة blank، ظل تعبير p-ERK1/2 في مجموعة PPF مرتفعاً بشكل ملحوظ بعد 4 h من الشق. وبالمثل، لم يختلف تعبير t-ERK1/2 في النخاع الشوكي بشكل ملحوظ بين مجموعات Blank وIP وDMSO وU0126 بعد 4 h من الشق (الشكل 4C). وبالمقارنة مع مجموعة blank، زاد تعبير p-ERK1/2 بشكل ملحوظ في مجموعتي IP وDMSO بعد 4 h من الشق (p < 0.001 مقابل مجموعة blank؛ الشكل 4D). وبالمقارنة مع مجموعة IP، أدى إعطاء U0126 داخل القر النخاعي قبل الجراحة إلى خفض تعبير p-ERK1/2 بشكل ملحوظ (p < 0.001 مقابل مجموعة IP؛ الشكل 4D). وبالمقارنة مع مجموعة DMSO، كان تعبير p-ERK1/2 في مجموعة U0126 أقل بشكل ملحوظ أيضاً (p < 0.001 مقابل مجموعة DMSO؛ الشكل 4D). ومن الملاحظ أنه بالمقارنة مع مجموعة blank، لم يكن تعبير p-ERK1/2 في مجموعة U0126 مختلفاً بشكل ملحوظ عن تعبيره في مجموعة blank بعد 4 h من الشق. ولم يكن للمعالجة المسبقة بـ NS أو DMSO أي تأثير ملحوظ على تعبير p-ERK1/2 عند مقارنتها بمجموعة IP.

ملاحظات التألق المناعي لعلامات الخلايا الشوكية والوسائط الالتهابية

أظهرت نتائج التألق المناعي نوعياً تفاعلية مناعية أقوى لـ NeuN في القرن الظهري لنفس الجانب بعد 4 h من الشق مقارنة بالجانب المقابل (الشكل 5). وفي المجموعة الضابطة، أظهرت الصور التمثيلية التفاعلية المناعية الأساسية لـ NeuN وGFAP وIba-1 في القرن الظهري للنخاع الشوكي في نفس الجانب (الشكل 6A–C). أما في مجموعة IP، فقد كانت التفاعلية المناعية لـ NeuN أقوى نوعياً مما كانت عليه في المجموعة الضابطة (الشكل 6D مقابل الشكل 6A)، كما كانت التفاعلية المناعية لـ GFAP أقوى أيضاً (الشكل 6E مقابل الشكل 6B)، وزادت التفاعلية المناعية لـ Iba-1 كذلك (الشكل 6F مقابل الشكل 6C). وبالتزامن مع ذلك، ظهرت الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في مجموعة IP متضخمة، مع أجسام خلوية أكبر واستطالات أكثر سمكاً وتفرعاً (الشكل 6E,F).

في مجموعة PPF، أشارت الصور التمثيلية إلى ضعف التفاعل المناعي لـ NeuN مقارنة بمجموعة IP (الشكل 6G مقابل الشكل 6D)، وضعف التفاعل المناعي لـ GFAP (الشكل 6H مقابل الشكل 6E)، وضعف التفاعل المناعي لـ Iba-1 (الشكل 6I مقابل الشكل 6F). وبالمثل، في مجموعة U0126، أشارت الصور التمثيلية إلى ضعف التفاعل المناعي لـ NeuN مقارنة بمجموعة IP (الشكل 6J مقابل الشكل 6D)، وضعف التفاعل المناعي لـ GFAP (الشكل 6K مقابل الشكل 6E)، وضعف التفاعل المناعي لـ Iba-1 (الشكل 6L مقابل الشكل 6F). وفي كل من مجموعتي PPF وU0126، بدت الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة أقل تضخماً، مع أجسام خلوية أصغر واستطالات أقل وأرفع (الشكل 6H،I,K,L). وقد جاء تحليل كثافة الفلورة المقابل لكل من NeuN وGFAP وIba-1 متسقاً مع ملاحظات التألق المناعي التمثيلية (الشكل 6M–O، على التوالي).

بعد 4 ساعات من إجراء الشق، زادت التفاعلية المناعية لـ TNF-α و COX-2 وكثافة الفلوريسنس النسبية في القرن الظهري في الجانب المصاب لدى مجموعة IP مقارنة بالمجموعة الضابطة. وكانت كلتا القراءتين أقل بعد العلاج قبل الجراحي بـ PPF أو U0126 عن طريق الحقن داخل القراب (الشكل 7A–C).

التوطين الخلوي لـ p-ERK1/2 في النخاع الشوكي عن طريق التألق المناعي

أظهرت نتائج التألق المناعي أنه في المجموعة الضابطة، كان التفاعل المناعي لـ p-ERK1/2 ضعيفاً في النخاع الشوكي ولوحظ فقط في العصبونات الموجبة لـ NeuN (الشكل 8A–C). وعلى النقيض من ذلك، فبعد 4 ساعات من الشق الجراحي، ازداد التفاعل المناعي لـ p-ERK1/2 بشكل ملحوظ في القرن الظهري للنخاع الشوكي في الجانب المصاب، وتوضع مشتركاً ليس فقط مع العصبونات، بل وأيضاً مع الخلايا النجمية الموجبة لـ GFAP والخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ Iba-1 (الشكل 8D–I). وتشير هذه النتيجة إلى أن الشق الجراحي أحدث توزيعاً خلوياً أوسع لـ p-ERK1/2، من العصبونات وحدها في الظروف الأساسية إلى العصبونات والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة بعد الإصابة.

In vitro التحقق من الآلية المعتمدة على ERK1/2 في الخلايا النجمية النخاعية

للمزيد من التقييم حول ما إذا كان PPF يمكن أن يثبط إفراز الوسائط الالتهابية من خلال تأشير ERK1/2 المرتبط على المستوى الخلوي، تم تحفيز الخلايا النجمية النخاعية الأولية للجرذ باستخدام LPS ومعالجتها بـ PPF أو U0126 (10 µM). وأظهر تحليل Western blot أن PPF خفّض تعبير p-ERK1/2 المستحث بـ LPS، في حين لم تتغير فسفرة p-p38 و p-JNK بشكل ملحوظ (الشكل 9A)، مما يدعم الانتقائية النسبية لمسار ERK1/2 في ظل هذه الظروف. وبالتوازي، خفّض PPF مستويات TNF-α و PGE2 (وهو منتج نهائي لنشاط COX-2) و IL-6 في السائل الطافي للمزرعة مقارنة بمجموعة Stim؛ وأنتج U0126 تأثيرات تثبيطية مماثلة (الشكل 9B).

لاختبار ما إذا كان التنشيط المستمر لـ ERK1/2 يمكن أن يضعف التأثير المضاد للالتهابات لـ PPF، تم إجراء تجارب إنقاذ. تم تقليل تعبير ERK1/2 الداخلي باستخدام siRNA، ثم تم إدخال بنية ERK1/2 نشطة بنيوياً (CA-ERK1/2) لاحقاً (الشكل 9C). وفي الخلايا النجمية التي تعبر عن CA-ERK1/2، لم يعد PPF يقلل مستويات TNF-α أو PGE2 أو IL-6 بنفس المدى (الشكل 9D)، مما يشير إلى أن تثبيط فسفرة ERK1/2 يساهم في التأثير المضاد للالتهابات لـ PPF في هذا النظام من الخلايا النجمية in vitro.

بشكل جماعي، توفر هذه النتائج in vitro دعماً ميكانيكياً على المستوى الخلوي يشير إلى أن PPF يقلل من إفراز الوسائط الالتهابية من خلال آلية تعتمد على ERK1/2 في الخلايا النجمية النخاعية، مما يكمل البيانات الرصدية in vivo.

figure-results-1
الشكل 1: تأثيرات حقن PPF أو U0126 داخل القناة الشوكية قبل الجراحة على فرط التألم الميكانيكي والحراري الناجم عن الشق الجراحي. (A) عتبة سحب مخلب اليد (PWMT) في مجموعات المجموعة الضابطة (blank)، وIP، وPPF، وU0126. (B) عتبة سحب مخلب اليد (PWMT) في مجموعات IP ومجموعة التحكم بالمركبة (vehicle-control). (C) عتبة سحب مخلب اليد الحرارية (PWTL) في مجموعات المجموعة الضابطة (blank)، وIP، وPPF، وU0126. (D) عتبة سحب مخلب اليد الحرارية (PWTL) في مجموعات IP ومجموعة التحكم بالمركبة (vehicle-control). البيانات تمثل المتوسط ± الانحراف المعياري (n = 6 جرذان لكل مجموعة) وتم تحليلها بواسطة اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه للقياسات المتكررة. ***p < 0.001 مقارنة بخط الأساس؛ #p < 0.05، و##p < 0.01 و###p < 0.001 مقارنة بمجموعة IP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: المخطط الزمني للتعبير عن مؤشرات الخلايا النخاعية وفسفرة ERK1/2 بعد الشق الجراحي. (أ) القياس الكمي وبلطات ويسترن ممثلة لـ NeuN وGFAP وIba-1 في مجموعة IP من نقطة الأساس وحتى 72 h بعد الشق. (ب) القياس الكمي وبلطات ويسترن ممثلة لـ t-ERK1/2 وp-ERK1/2 خلال الفترة نفسها. تم تطبيع القيم بناءً على المجموعة الضابطة (100%) وهي معروضة كمتوسط ± SD (n = 3 جرذان لكل نقطة زمنية). تم تحليل الاختلافات العامة باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه مع المقارنات الزوجية الموضحة. *p < 0.05، و**p < 0.01 و ***p < 0.001 مقارنة بنقطة الأساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تأثيرات PPF أو U0126 داخل القراب قبل الجراحة على واسمات الخلايا العصبية والدبقية الشوكية بعد 4 h من الشق الجراحي. (A–C) NeuN و GFAP و Iba-1 في مجموعات blank و IP و normal-saline و PPF. (D–F) NeuN و GFAP و Iba-1 في مجموعات blank و IP و dimethyl-sulfoxide و U0126. تظهر صور Western blots ممثلة جهة اليمين. تم تطبيع القيم بالنسبة لمجموعة blank (100%) وهي معروضة كمتوسط ± SD (عدد الن={n = 3 rats per group}). *p < 0.05 و **p < 0.01 و ***p < 0.001 مقارنة بمجموعة blank؛ و #p < 0.05 و ##p < 0.01 مقارنة بمجموعة IP؛ و Δp < 0.05 و ΔΔp < 0.01 و ΔΔΔp < 0.001 مقارنة بمجموعة المركبة (vehicle) المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تأثيرات PPF أو U0126 داخل القراب قبل الجراحة على فسفرة ERK1/2 الشوكية بعد 4 ساعات من الشق الجراحي. (A,B) t-ERK1/2 و p-ERK1/2 في مجموعات: المجموعة الضابطة (blank)، وIP، والمحلول الملحي العادي (normal-saline)، ومجموعة PPF. (C,D) t-ERK1/2 و p-ERK1/2 في مجموعات: المجموعة الضابطة (blank)، وIP، وثنائي ميثيل سلفوكسيد (dimethyl-sulfoxide)، ومجموعة U0126. تظهر لطخات ويسترن (Western blots) التمثيلية على اليمين. تم تطبيع القيم بالنسبة للمجموعة الضابطة (100%) وممثلة كـ متوسط ± SD (عدد الجرذان n = 3 لكل مجموعة). **p < 0.01 و ***p < 0.001 مقارنة بالمجموعة الضابطة؛ ###p < 0.001 مقارنة بـ IP؛ ΔΔp < 0.01 و ΔΔΔp < 0.001 مقارنة بمجموعة الناقل (vehicle) المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تفاعل NeuN المناعي في النخاع الشوكي في الجانبين المماثل والمضاد للجانب بعد الشق. يُظهر مقطع عرضي ممثل للنخاع الشوكي القطني من مجموعة IP بعد 4 h من الشق صبغة NeuN في القرون الظهرية في الجانبين المضاد والمماثل. الصورة ممثلة لـ n = 3 من الجرذان وهي مقدمة للمقارنة التشريحية النوعية. شريط المقياس = 500 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: تأثيرات PPF وU0126 على التفاعل المناعي للخلايا العصبية والدبقية في النخاع الشوكي بعد 4 ساعات من الشق الجراحي. (A–C) NeuN وGFAP وIba-1 في المجموعة الضابطة. (D–F) التلوين المقابل في مجموعة IP. (G–I) التلوين المقابل بعد العلاج بـ PPF. (J–L) التلوين المقابل بعد العلاج بـ U0126. (M–O) كثافات الفلورة النسبية لكل من NeuN وGFAP وIba-1 على التوالي. تمثل الأعمدة المتوسط ± SD (العدد = 3 جرذان لكل مجموعة)؛ *p < 0.05، و**p < 0.01 و ***p < 0.001 للمقارنات الموضحة. أشرطة المقياس = 200 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: التفاعلية المناعية لـ TNF-α و COX-2 في النخاع الشوكي بعد الشق والمعالجة. (أ) صور تمثيلية لـ TNF-α و COX-2 من مجموعات blank و IP و PPF و U0126 بعد 4 h من الشق. (ب) كثافة الفلورة النسبية لـ TNF-α. (ج) كثافة الفلورة النسبية لـ COX-2. تمثل الأعمدة المتوسط ± SD (العدد = 3 جرذان لكل مجموعة)؛ ***p < 0.001 للمقارنات الموضحة. أشرطة المقياس = 200 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-8
الشكل 8: التموضع الخلوي لـ p-ERK1/2 النخاعي بعد 4 ساعات من الشق. (A–C) صبغ مشترك لـ p-ERK1/2 مع NeuN و GFAP و Iba-1، على التوالي، في المجموعة الضابطة. (D–F) الصبغ المشترك المقابل في مجموعة IP؛ تشير الأسهم إلى الخلايا ذات التموضع المشترك التمثيلية. يشير اللون الأحمر إلى p-ERK1/2، والأخضر إلى واسمة الخلية، والأصفر إلى التموضع المشترك. (G–I) شدات الفلورة النسبية المرتبطة بالمناطق الموجبة لـ NeuN و GFAP و Iba-1، على التوالي. تمثل الأعمدة المتوسط ± SD (العدد = 3 جرذان لكل مجموعة)؛ **p < 0.01 و ***p < 0.001 للمقارنات الموضحة. أشرطة المقياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-9
الشكل 9: التأثيرات المضادة للالتهابات لـ PPF المعتمدة على ERK1/2 في الخلايا النجمية النخاعية الأولية للجرذان. (A) لطخات ويسترن تمثيلية تُظهر أن PPF قلل من p-ERK1/2 المستحث بواسطة LPS دون تأثير واضح على p-p38 أو p-JNK. (B) تركيزات TNF-α و PGE2 و IL-6 في الرواسب فائقة المزرعة بعد المعالجة بـ LPS أو PPF أو U0126. (C) لطخات ويسترن تؤكد تثبيط ERK1/2 بواسطة siRNA والتعبير عن ERK1/2 النشط بنيوياً (CA-ERK1/2). (D) تركيزات TNF-α و PGE2 و IL-6 بعد التعبير عن CA-ERK1/2 بوجود أو غياب PPF. تمثل الأعمدة المتوسط ± SD من تجارب in vitro مستقلة؛ ***p < 0.001 للمقارنات الموضحة؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعاني معظم المرضى من ألم حاد بعد الجراحة، ليس جسديًا فحسب بل وحتى نفسيًا في بعض الأحيان³³، ومع ذلك لا يزال هناك الكثير من الغموض حول الآليات التفصيلية للألم الحاد التالي للجراحة. وترافق التأثيرات القوية للأدوية المسكنة آثار جانبية لا مفر منها، مما يجعل استكشاف مسكنات أكثر أمانًا وفعالية أمرًا بالغ الأهمية. استندت هذه الدراسة إلى نموذج سابق تم التحقق من صحته لشق جراحي في الجرذ لمحاكاة الألم الحاد التالي للجراحة، والذي يتميز بسهولة وجدوى التحضير²⁷. وقد قيمت الدراسة الحالية التغيرات في المؤشرات العصبية والدبقية في النخاع الشوكي، وفسفرة ERK1/2، والوسائط الالتهابية بعد الشق الجراحي، وبحثت فيما إذا كان التأثير المضاد لفرط التألم الناتج عن إعطاء PPF داخل القراب قبل الجراحة مرتبطًا بتغيرات موازية في فسفرة ERK1/2 في النخاع الشوكي وتعبير السيتوكينات الالتهابية.

بعد إجراء الشق الجراحي، طورت الجرذان في مجموعة IP فرط تحسس ميكانيكي وحراري قوي، بينما لم يكن للمعالجة المسبقة بالمادة الناقلة (vehicle) أي تأثير ملموس على النتائج السلوكية أو الجزيئية. وتدعم هذه النتائج استقرار النموذج وتشير إلى أن التأثيرات الملحوظة في مجموعتي PPF و U0126 من غير المرجح أن تكون ناتجة عن إجراء الحقن أو المادة الناقلة نفسها. بالإضافة إلى ذلك، ورغم زيادة تعبير NeuN بعد الشق الجراحي، يجب تفسير هذا التغيير بحذر على أنه تغير في تعبير المؤشر العصبي وليس دليلاً مباشراً على التنشيط العصبي. ومعاً، توفر هذه الملاحظات الأساس لفحص الاستجابات المرتبطة بالخلايا الدبقية و ERK1/2 في المراحل المبكرة من تطور ألم الشق الجراحي.

لقد ثبت أن الخلايا الدبقية تؤدي دوراً هاماً في تكوين التشابكات العصبية، ونقل وتكامل المعلومات التشابكية، وتنظيم اللدونة التشابكية. وقد تؤدي الوظائف المناعية والمؤججة للالتهاب للخلايا الدبقية في معالجة الألم، ولا سيما الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في النخاع الشوكي، إلى تعزيز التحسس المركزي المشارك في التوسط في فرط التألم والتغيرات السلوكية بعد الجراحة⁷^,³⁴. قد تؤدي التغيرات العصبية غير التكيفية في النخاع الشوكي إلى زيادة الاستجابة للمنبهات الضارة أو غير الضارة. وتشير أدلة كبيرة إلى أن تنشيط الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي يشارك في تطوير واستمرار فرط التألم في نماذج إصابة الأعصاب الشوكية³⁵، والألم الناجم عن منشط البلازمينوجين النسيجي¹⁶، وألم الشقوق الجراحية¹¹^,¹²، وألم سرطان العظام¹⁹^,³¹. وبناءً على ذلك، يبدو أن التنشيط الدبقي الشوكي سمة مشتركة في حالات ألم متعددة، وقد يساهم المزيد من الاستكشاف لدوره في ألم الشقوق الجراحية في توسيع الفهم الحالي لآليات الألم بعد الجراحة.

تدعم النتائج الحالية وجهة النظر القائلة بأن الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي تشارك في الاستجابة الالتهابية العصبية المبكرة التي تلي الشق الجراحي¹². وبدلاً من إظهار أنماط زمنية متطابقة، أظهرت GFAP وIba-1 وp-ERK1/2 مسارات زمنية متمايزة جزئياً، مما يشير إلى أن العمليات المختلفة المرتبطة بالخلايا الدبقية قد تساهم في مراحل مختلفة من تطور الألم بعد الجراحة³¹^,³⁵. وعززت نتائج التألق المناعي هذا التفسير من خلال إظهار تغيرات مورفولوجية تضخمية في الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة بعد الشق الجراحي. وتتسق هذه الملاحظات، جنباً إلى جنب مع الزيادات في التفاعل المناعي لـ TNF-α وCOX-2، مع المفهوم القائل بأن الإشارات الالتهابية المرتبطة بالخلايا الدبقية تساهم في فرط التألم الحاد الناتج عن الشق الجراحي⁷^,³⁶.

دُرِس عقار البروبينتوفيلين (Propentofylline)، وهو أحد مشتقات الميثيلزانثين، في البداية كعقار نشط وعائياً في الدماغ نظراً لنشاطه المضاد للصفائح الدموية ودعمه للحفاظ على الذاكرة طويلة المدى³⁷. ومع ذلك، فإن التأثير التنظيمي للـ PPF على الخلايا الدبقية يجعله ذا قيمة محتملة كعقار مسكن للألم أيضاً. وتشير الدراسات إلى أن الـ PPF يمكن أن يعيق تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق تثبيط تفكك أحادي فوسفات الأدينوزين الحلقي داخل الخلايا وتقليل إعادة امتصاص الأدينوزين خارج الخلايا⁴^,⁵. وفي دراسة in vitro، ثبط الـ PPF تكاثر الخلايا النجمية عن طريق إعاقة مسار هدف الثدييات من الراباميسين (mammalian target of rapamycin pathway) المحفز بواسطة TNF-α⁶. وبناءً على ذلك، فإن التأثير التنظيمي للـ PPF على الخلايا الدبقية هو ما يجعل مشاركته في تعديل عمليات الألم ممكنة.

يدعم التأثير المستدام لـ PPF المضاد لفرط التألم في الدراسة الحالية، إلى جانب الانخفاض في تعبير GFAP وIba-1، التفسير القائل بأن التعديل الدبقي يعد مكوناً هاماً في مفعول PPF المسكن للألم في هذا النموذج. كما أشارت دراسات سابقة إلى أن PPF قد يثبط إشارات الالتهاب المرتبطة بالخلايا الدبقية في حالات الألم⁵^,³¹. بالإضافة إلى ذلك، يشير الانخفاض المتوازي في TNF-α وCOX-2 إلى أن PPF قد يخفف من ألم الشق الجراحي جزئياً عن طريق كبح الاستجابات الالتهابية المرتبطة بالخلايا الدبقية. ومع ذلك، ونظراً لأن البيانات الحالية ترابطية وليست ميكانيكية، يجب تفسير هذه النتائج كدعم لمشاركة الخلايا الدبقية بدلاً من كونها دليلاً على مسار سببي مباشر.

لقد ثبت تورط ERK1/2، وهما زوج من الكينازات المهمة المنظمة للإشارات داخل الخلايا، في تطور واستمرار عمليات الألم المختلفة (من خلال التوسط في الاستثارة العصبية واللدونة التشابكية في الدماغ والنخاع الشوكي)²¹. على سبيل المثال، أظهرت دراسة أن حقن الكابسيسين أو الفورمالين أدى إلى زيادة قصيرة وسريعة في p-ERK1/2 في النخاع الشوكي، ولكن استمر تنشيط ERK1/2 الشوكي لفترة أطول بكثير بعد حقن مساعد فروند الكامل أو سم النحل (بعد فترة كامنة قصيرة)³⁸^,³⁹. وعلى العكس من ذلك، فإن تنشيط ERK1/2 الشوكي الناجم عن إصابة العصب قد وصل إلى ذروته في وقت مبكر للغاية في دراسة أخرى واستمر لفترة من الوقت، مع تطور فرط التألم بعد ذروة p-ERK1/2³⁵. لذلك، قد تحدث فسفرة ERK1/2 في مراحل مختلفة في عمليات الألم المختلفة، وقد يكون ارتفاع مستوى p-ERK1/2 في النخاع الشوكي مهماً لكل من الحث الفوري والاستجابة الجينية طويلة المدى.

في الدراسة الحالية، زاد فسفرة ERK1/2 الناجم عن الشق الجراحي بشكل ملحوظ في أول 24 h بعد الشق مقارنة بالمجموعة الضابطة، ووصل تعبير p-ERK1/2 إلى ذروته بعد 4 h من الشق (كما وُصف سابقاً)²⁴، وهو ما يتزامن مع النقطة الزمنية التي كان فيها تعبير NeuN في أعلى مستوياته. وبالتزامن مع ذلك، وكما كشفت نتائج التألق المناعي، توزعت فسفرة ERK1/2 الناجمة عن الشق في آن واحد في العصبونات والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في القرن الظهري للنخاع الشوكي في الجانب نفسه من الإصابة، مما يدعم الرؤية القائلة بأن الإشارات المرتبطة بـ ERK1/2 ذات صلة خاصة بالمرحلة المبكرة من فرط التألم الناتج عن الشق الجراحي. بالإضافة إلى ذلك، أدى الإعطاء داخل القراب قبل الجراحة لـ U0126 إلى خفض تعبير علامات الخلايا الدبقية الشوكية، وNeuN، وp-ERK1/2 بعد 4 h من الشق، وخفف من فرط التألم الميكانيكي والحراري خلال الفترة المبكرة بعد الشق، مما يشير إلى أن p-ERK1/2 الشوكي قد يكون متورطاً في المرحلة المبكرة من فرط التألم الحاد بعد الشق. ومع ذلك، ونظراً لأن GFAP وIba-1 وp-ERK1/2 والنتائج السلوكية أظهرت ملفات زمنية مختلفة، فإن التفسير الميكانيكي الحالي يجب أن يقتصر على المرحلة المبكرة بعد الشق التي تمثلها النقطة الزمنية 4 h بدلاً من تعميمه على كامل فترة ما بعد الجراحة.

علاوة على ذلك، في الدراسة الحالية، أدى إعطاء PPF داخل القراب قبل الجراحة أيضاً إلى تقليل فسفرة ERK1/2 بعد 4 h من الشق الجراحي، مما يشير إلى أن التغيرات الملحوظة في تعبير NeuN وGFAP وIba-1 في النخاع الشوكي قد تكون مرتبطة، جزئياً على الأقل، بإشارات ERK1/2. كما أدى إعطاء U0126 داخل القراب قبل الجراحة إلى خفض التفاعلية المناعية لـ TNF-α وCOX-2، مما يدعم وجود ارتباط محتمل بين فسفرة ERK1/2 وتعبير الوسائط الالتهابية بعد الشق الجراحي. وقد وفرت تجارب الخلايا النجمية الإضافية in vitro الموضحة في الشكل 9 دعماً على المستوى الخلوي لوجود مكون مضاد للالتهاب يعتمد على ERK1/2، لأن التنشيط المستمر لـ ERK1/2 أضعف قدرة PPF على تقليل إفراز TNF-α وPGE2 وIL-6. ومع ذلك، ونظراً لأن تجارب الإنقاذ هذه أُجريت على خلايا نجمية مستزرعة بدلاً من النخاع الشوكي السليم، وبسبب عدم إجراء إنقاذ in vivo أو تلاعب انتقائي بنوع الخلايا، يجب تظل الاستنتاجات in vivo تُفسر كدعم بدلاً من كونها دليلاً قاطعاً على وجود آلية سببية تعتمد على ERK1/2.

ولمزيد من المناقشة حول العلاقات المحتملة بين تنشيط الخلايا الدبقية وتعبير p-ERK1/2 وإفراز السيتوكينات الالتهابية، تم النظر في أنماط التوطن المكاني الملحوظة باستخدام التألق المناعي. فبعد إجراء الشق الجراحي، تم التعبير المشترك عن p-ERK1/2 مع الخلايا النجمية الموجبة لـ GFAP والخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ Iba-1 في القرن الظهري للنخاع الشوكي بعد 4 h من الشق. وبالاقتران مع نتائج تحليل Western blot والتألق المناعي التي أظهرت أن كلاً من PPF و U0126 ارتبطا بانخفاض تعبير p-ERK1/2 و TNF-α و COX-2، تشير هذه البيانات إلى أن فسفرة ERK1/2 في الخلايا الدبقية الشوكية قد تكون متورطة في الاستجابة الالتهابية التي تلي الشق الجراحي. كما تدعم البيانات التي تم الحصول عليها in vitro من الخلايا النجمية الأولية وجود صلة خلوية مباشرة بين العلاج بـ PPF وتثبيط ERK1/2 وإفراز الوسائط الالتهابية. ومع ذلك، فإن الأدلة in vivo تثبت وجود ارتباط وتغيرات متوازية مرتبطة بالعلاج، بينما تكمل التجارب الخلوية التحقق السببي النوعي للخلايا in vivo ولكنها لا تحل محله. ونظراً لأن تحليل التألق المناعي استند إلى عدد محدود من الحيوانات والحقول، فينبغي تفسير هذه الملاحظات بحذر وبالتزامن مع نتائج Western blot والنتائج التي تم الحصول عليها in vitro.

تؤثر العديد من الخطوات الإجرائية بشكل غير متناسب على إمكانية تكرار النتائج. يتطلب الحقن داخل القراب (Intrathecal injection) استجابة مميزة في الذيل وتأكيداً بوجود السائل الدماغي النخاعي؛ لذا فإن وجود مقاومة أثناء الحقن، أو غياب التأكيد، أو ظهور عجز عصبي جديد يجب أن يستدعي استبعاد العينة بدلاً من إعادة الحقن في الموقع نفسه. كما أن الاختبارات السلوكية حساسة لعملية التأقلم، وظروف الحظيرة، وموضع المثير، وتوقعات الباحث، لذا فإن التعمية (blinding)، والفواصل الزمنية الثابتة، وظروف البيئة المتسقة تعد أموراً أساسية. وبالمثل، تبرز أهمية توقيت جمع الأنسجة، والنقل الموحد للبروتين، وحضن الأجسام المضادة، واستخدام إعدادات مجهرية متطابقة ضمن كل دفعة صبغ. وتشمل المشكلات الشائعة تباين عتبات الانسحاب نتيجة عدم التأقلم الكافي، وظهور حزم باهتة أو غير منتظمة في تحليل "وسترن بلوت" (Western blot) بسبب النقل غير المكتمل أو التعرض المفرط، وارتفاع خلفية الفلورة نتيجة عدم كفاية الغسيل، أو التركيز المفرط للأجسام المضادة، أو إعدادات الحصول على الصور المشبعة.

يمكن تعديل البروتوكول وفقاً للسؤال العلمي المطروح. حيث يمكن استخدام نطاق زمني أوسع عندما تكون الاستجابات الدبقية المتأخرة هي محل الاهتمام، كما يمكن إضافة نطاقات جرعات مختلفة أو طرق إعطاء بديلة عندما تكون الجدوى الانتقالية هي الأولوية. وبالمقارنة مع نماذج الألم الالتهابي أو الاعتلال العصبي، فإن نموذج الشق الأخمصي سريع وعملي نسبياً ويعيد إنتاج إصابة محددة بعد الجراحة²⁷. ويوفر الجمع بين الاختبارات السلوكية، وبصمة ويسترن، والفلورة المناعية المرتبطة بالخلايا معلومات وظيفية وجزيئية ومكانية متكاملة؛ ومع ذلك، فإن هذا النهج يستهلك موارد أكثر من المقايسة ذات النهاية الواحدة ولا يثبت بمفرده السببية الخاصة بنوع خلية معين. كما أن المقارنة الدوائية باستخدام U0126 تعزز تفسير المسار ولكنها تظل أقل تحديداً من التلاعب الجيني أو التلاعب الانتقائي لأنواع الخلايا²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵.

تشمل التطبيقات المستقبلية اختبار كلا الجنسين، والإصابات الجراحية الأكبر، وطرق إعطاء الجرعات الممكنة سريرياً، ونقاط زمنية إضافية بعد الجراحة، والتدخلات التي تستهدف مجموعات دبقية محددة. يعد سير العمل هذا عملياً لفحص العلاجات المرشحة لتسكين الألم أو تعديل الخلايا الدبقية لأن نموذج الشق الجراحي قصير، والنهايات السلوكية قابلة للتكرار، والمقاييس الجزيئية تستخدم طرقاً مخبرية قياسية. ومع ذلك، تعتمد إمكانية التكرار على معايير استبعاد محددة مسبقاً، وتقييم النتائج بطريقة التعمية، والاستحواذ المتسق على الصور، والإبلاغ الكامل عن البيانات الخام وإعدادات التحليل.

القيود

تنطوي هذه الدراسة على عدة قيود. أولاً، يمثل نموذج شق باطن القدم إصابة جراحية طفيفة نسبياً، وقد لا يعكس بشكل كامل الإجراءات الجراحية الأكبر، مثل بضع الصدر أو بضع البطن. لذا، يجب توخي الحذر عند تعميم النتائج الحالية على أشكال أخرى من آلام ما بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، شملت الدراسة ذكور جرذان Sprague–Dawley فقط، مما يحد من إمكانية تعميم هذه النتائج على كلا الجنسين. ونظراً للفروق المعروفة بين الجنسين في استجابات الألم، وتأثيرات المسكنات، وأنماط تنشيط الخلايا الدبقية، فإن هناك حاجة إلى إجراء دراسات إضافية تشمل الإناث.

تركزت الملاحظات الجزيئية والنسيجية الرئيسية على النقطة الزمنية بعد 4 h من الشق. ونظراً لأن نقاط النهاية المختلفة، بما في ذلك GFAP وIba-1 وp-ERK1/2 والنتائج السلوكية، قد أظهرت أنماطاً زمنية متميزة بعد الشق، فإن التفسير الميكانيكي للنتائج الحالية يجب أن يقتصر بشكل أساسي على المرحلة المبكرة بعد الشق. علاوة على ذلك، أُجريت التجارب الجزيئية الواردة هنا باستخدام حجم عينة محدود نسبياً، مما قد يقلل من القوة الإحصائية لهذه الملاحظات.

تم تقييم كيناز منظم الإشارات خارج الخلية 1 و2 معاً كـ p-ERK1/2؛ ولم يتم فحص مساهماتهما الفردية بشكل منفصل. وبناءً على ذلك، لم يتسنَّ تحديد الأدوار الخاصة بكل من ERK1 وERK2 في معالجة الألم الناجم عن الشق الجراحي في هذه الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، استند التكميم الكمي لشدة الفلورة إلى عدد محدود من الحيوانات والحقول، ولم يتضمن تعداد الخلايا بطريقة الستيريولوجيا أو معاملات التوضع المشترك الرسمية. لذا، يجب تفسير هذه الملاحظات بحذر، وبالتزامن مع نتائج تحليل ويسترن بلوت.

أخيرًا، على الرغم من أن تجارب إنقاذ الخلايا النجمية in vitro قد قدمت دعمًا ميكانيكيًا لتنظيم الوسائط الالتهابية المعتمد على ERK1/2، إلا أن الأحداث التنظيمية upstream بعد الشق والأحداث downstream في أنسجة النخاع الشوكي السليمة لم يتم استقصاؤها بعمق. كما لا يمكن لنظام الزراعة in vitro إعادة إنتاج التفاعلات بين العصبونات، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا المناعية المرتشحة في القرن الظهري للنخاع الشوكي بشكل كامل. وبناءً على ذلك، تدعم الدراسة الحالية آلية مرتبطة بـ ERK1/2 ولكنها لا تثبت سببية كاملة محددة للخلايا in vivo.

الخلاصة

تُظهر الدراسة الحالية أن الزيادات في تعبير NeuN وGFAP وIba-1 في النخاع الشوكي الناتجة عن الشق الجراحي قد خففت من خلال الإعطاء داخل القراب قبل الجراحة لـ PPF. وقد صاحب هذا التأثير تخفيف فرط التألم الميكانيكي والحراري الحاد وانخفاض في فسفرة ERK1/2 وتعبير TNF-α وCOX-2 بعد الشق الجراحي. ومع ذلك، فإن هذه النتائج تدعم (بدلاً من تقديم دليل ميكانيكي قاطع على) وجود ارتباط بين التأثير المضاد لفرط التألم لـ PPF وانخفاض فسفرة ERK1/2 في الخلايا الدبقية النخاعية (بالارتباط مع انخفاض تعبير الوسائط الالتهابية). استمر التأثير المضاد لفرط التألم لـ PPF طوال فترة الملاحظة التي تلت الشق الجراحي، بينما اقتصر تأثير مثبط MEK1/2 وهو U0126 بشكل أساسي على الفترة المبكرة بعد الشق. تشير هذه النتائج إلى أن إشارات ERK1/2 قد تكون ذات صلة خاصة خلال التطور المبكر لألم الشق الجراحي. ويشير التأثير طويل الأمد لـ PPF إلى أن آلية عمله قد تشمل مسارات إضافية تتجاوز تثبيط ERK1/2 وحده. وبالتالي، قد يمثل PPF تدخلاً علاجياً محتملاً، بدلاً من أن يكون هدفاً بيولوجياً، لتحسين إدارة الألم الحاد بعد الجراحة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بأنه لا توجد لديهم أي تضاربات مصالح شخصية أو مالية أو تجارية أو أكاديمية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتوجه المؤلفون بالشكر إلى Haijiao Zhou و Ming Wang على الدعم الفني.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
محلول منظم PBS بتركيز 0.01 M	Solarbio	P1020
محلول منظم Tris-HCl بتركيز 1.0 M (pH 6.8)	Solarbio	T1020
محلول منظم Tris-HCl بتركيز 1.5 M (pH 8.8)	Solarbio	T1010
سلفات دوديسيل الصوديوم (SDS) بتركيز 10%	Solarbio	S1010
محلول TBST المخزون بتركيز 10×	Solarbio	T1081
أكريلاميد بتركيز 30%	Solarbio	A1010
محلول تحميل البروتين بتركيز 4×	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
بيرسلفات الأمونيوم	Solarbio	A1030
جهاز آلي لصنع الثلج المجروش	Changshu Xueke	IMS-40
ألبومين المصل البقري (BSA)	Solarbio	A8020
ميكروتوم تجميدي Cryostat CM150	Leica	CM150
مقياس pH رقمي	—	PHS-3C
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	Solarbio	D8371
ميزان تحليلي إلكتروني	Cany	—
كاشف التألق الكيميائي المعزز (ECL)	Solarbio	PE0010
فيلم	Kodak	—
مجهر فلوري DP71	Olympus	DP71
وسط طمر للمقاطع المجمدة	Sakura	4583
جهاز الفصل الكهربائي للهلام	BIO-RAD	—
جليسرول	Solarbio	IG0910
جليسين	Solarbio	G8200
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للفأر Alexa Fluor 594	Proteintech	SA00013-3
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للفأر مقترن ببيروكسيداز الفجل	ZSGB-BIO	ZB2305
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للأرنب Alexa Fluor 488	Proteintech	SA00013-2
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للأرنب مقترن ببيروكسيداز الفجل	ZSGB-BIO	ZB2301
مصل الماعز	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة 3K15	Sigma	3K15
هزاز مداري أفقي TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
ميثانول	Tianjin Guangfu	—
جسم مضاد أولي من الفأر مضاد للجرذ GAPDH	Proteintech	60004-1-Ig
جسم مضاد أولي من الفأر مضاد للجرذ p-ERK1/2	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
بارافورمالدهيد	Biosharp	BL539A
شرائح مجهرية من الدرجة الباثولوجية	Shitai	—
فنيل ميثان سلفونيل فلوريد (PMSF)	Beyotime	ST506
جهاز اختبار الأخمص Plantar Test 37370	UGO BASILE	37370
غشاء بولي فينيليدين فلوريد	Solarbio	—
بروبينتوفيلين (PPF)	Taosu	T19812
جسم مضاد أولي من الأرنب مضاد للجرذ COX-2	Abcam	Ab179800
جسم مضاد أولي من الأرنب مضاد للجرذ GFAP	Proteintech	16825-1-AP
جسم مضاد أولي من الأرنب مضاد للجرذ Iba-1	Proteintech	10904-1-AP
جسم مضاد أولي من الأرنب مضاد للجرذ NeuN	Abcam	Ab279297
جسم مضاد أولي من الأرنب مضاد للجرذ t-ERK1/2	Proteintech	11257-1-AP
جسم مضاد أولي من الأرنب مضاد للجرذ TNF-α	Proteintech	29652-1-AP
محلول RIPA للتحلل	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
مسحوق حليب منزوع الدسم	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
تترا ميثيل إيثيلين ثنائي الأمين (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
مجمد درجة حرارة فائقة الانخفاض	Haier	—
مجمد درجة حرارة فائقة الانخفاض	Sanyo	—
نظام تنقية المياه فائقة النقاء	Heal Force	—
خيوط فون فراي von Frey filaments	North Coast Medical	—

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

يعمل دواء بروبينتوفيلين على تخفيف فرط التألم في مكان الشق الجراحي عن طريق تنظيم فسفرة ERK1/2 في الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة