مقالة منهجية

تحديد الهيستونات المعدلة كركائز ارتباط لعضو عائلة سبيندلين البشري 4 (SPIN4) بواسطة مصفوفات الببتيدات وسحب النيوكليوسوم الأصلي

DOI:

10.3791/70934

⸱

مارس 27, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم مؤخرا تحديد متغيرات جينية في عضو عائلة سبيندلين البشري 4 (SPIN4) لدى مرضى يعانون من فرط نمو العظام، وهو اضطراب تطوري جديد. تم تقديم بروتوكول ونتائج جديدة تصف التعرف الكيميائي الحيوي للهستونات المعدلة في سياق النيوكليوسومات كركائز ارتباط SPIN4.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العضو الرابع من عائلة سبيندلين البشري (SPIN4) ظهر للتو كمنظم جديد لنمو العظام. تم تحديد متغيرات فقدان الوظيفة في SPIN4 لدى المرضى الذين أظهروا متلازمة النمو الزائد قبل وبعد الولادة، والتي تروث بطريقة مسيطرة مرتبطة ب X. يحتوي SPIN4 على ثلاث تكرارات متتالية لمجالات تيودور، كل منها يشكل قفصا عطريا فرديا. تعتبر هذه المجالات التيودورية مجالات قارئ فوق جيني لبقايا الأرجينين والليسين المثيلة في الهيستونات بناء على تشابه التسلسل. ومع ذلك، لا تزال ركائز الارتباط الدقيقة ل SPIN4 غير واضحة. تم توليد SPIN4 البشري، في كل من أشكاله البرية والطفرة المسببة للأمراض، بنجاح عبر نظام تعبير خلية حشرية. من خلال مصفوفة ببتيدات تعديل الهيستون، تم تحديد التقارير التفاضلية بين النوع البري والطفراة SPIN4. أظهرت الاختبارات الوظيفية أيضا أن SPIN4 هو قارئ حقيقي لمثيلة هيستون H3 ليسين 4 (H3K4me)، كما يتضح من السحب الكيميائي الحيوي للأحاديات النيوكليوسومات الأصلية. يسهل هذا النهج المتكامل تحديد أهداف الارتباط السريع لبروتينات قارئ اللاجينية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عضو عائلة سبيندلين 4 (SPIN4) هو قارئ فوق جيني وقد تم اتهامه مؤخرا بمتلازمة فرط النمو، حيث يظهر بمجموعة من النمو الزائد قبل وبعد الولادة وطولالقامة 1,2. فأر Spin4 Knockout (KO) أعادت النموذج البشري الدقيق، داعما للسببية. حتى الآن، يعد SPIN4 القارئ اللاجيني الوحيد الحصري الذي ينظم نمو العظام بشكل سلبي. ومع ذلك، لم يتم توصيف الخصائص الكيميائية الحيوية ل SPIN4، وهو قارئ فوق جيني حيوي للنمو، مما يترك فجوة معرفية حاسمة في فهم الآليات الأساسية المسببة للأمراض في هذا الاضطراب التطوري الجديد. يحتوي SPIN4 على ثلاث تكرارات متتالية لمجالات تيودور، والتي تعتبر عموما مجالات بروتينات قارئ هيستون ميثيل الأرجينين أو الليسين3. تم مؤخرا تحديد متحور SPIN4D82H الخاطئ لدى مريض يعاني من متلازمة فرط نمو العظام قبل الولادة وبعدها. تؤثر هذه الطفرة على المجال الأول من تيودور في SPIN4؛ ومع ذلك، لا تزال ركائز الارتباط ذات الصلة لهذه المجالات التيودورية غير واضحة، مما يحد من التشريح الوظيفي لتنظيم الكروماتين والتعبير الجيني المعتمد على SPIN4 أثناء تطور العظم.

تحديد ركائز جديدة مرتبطة بالهيستون في مجالات بروتين قارئ لا يعتمد على نهج موحد واحد. تحدث التعديلات بعد الانتقال (PTMs) للهيستون غالبا عند ذيول الهيستون التي تبرز من جسيمات النيوكليوسوم الأساسية. التعرف على PTMs على ذيول الهيستون بواسطة مجالات بروتينات القارئ متغير للغاية وغالبا ما يتطلب تفاعلات كهروستاتيكية متعددة التهميات تشمل الحمض النووي النوويكليوزومي، وحمض الرابط DNA، و/أو مجالات هيستون أخرى لتثبيت تفاعل القارئ والهدف بشكل جماعي4. حاليا، تم تصنيع PTMs من ببتيدات ذيل الهيستون على شكل ميكروآراي وتسويقها من قبل عدةبائعين. بينما يعد فحص PTM المعتمد على ببتيدات ذيل الهيستون لأهداف الارتباط في مجالات البروتين القارئ عالي الإنتاجية، إلا أنه غالبا ما يعطي نتائج إيجابية كاذبة في غياب النيوكليوسومات. علاوة على ذلك، فإن الظروف التجريبية لمثل هذه الشاشات تجريبية للغاية وتختلف من بروتين لآخر، مما يجعلها صعبة المعالجة تقنيا. يوفر فحص أو سحب PTM المعتمد على النيوكليوسومات الاصطناعية قراءة أكثر قوة، لكنه أكثر تكلفة وأقل إنتاجية، لأن إعادة تكوين النيوكليوسومات التي تحمل تركيبات متغيرة من PTMs يعد تحديا بطبيعته.

يصف هذا البروتوكول نهجا سريعا لتحديد PTMs الهيستونية في النيوكليوسومات كأهداف ارتباط ل SPIN4. تم إعادة تكوين SPIN4 المؤتلف وفحصه مقابل مصفوفة ببتيدات PTM هيستونية تجارية لتحديد أهداف ارتباط محتملة. تم توليد نوكليوسومات أحادية أصلية تحتوي على PTMs هيستونية داخلية متنوعة لاحقا من خلايا حية. مكن سحب SPIN4 للنوكليوسومات الأحادية التحقق المستهدف من الأجسام المضادة لنماذج PTM الهيستونية بعد الفحص الأولي. تظهر هذه الاستراتيجية الكيميائية الحيوية المتكاملة نهجا إثباتا للمبدأ لاكتشاف الأهداف الاقتصادي والاقتصادي ويمكن تطبيقها بسهولة لتحديد ركائز الارتباط لبروتينات قارئة فوق جينية أخرى ذات توصيف ضعيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية التي تشمل الخلايا HEK293FT وفقا لإرشادات لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) التابعة لجامعة فيرجينيا كومنولث.

1. تنقية SPIN4 البشري المؤتلف.

  1. نسخ SPIN4 أو SPIN4D82H البري الكامل الطول مع علامة FLAG على طراز N 1× إلى ناقل فيروسي باكولوفيروسي 6,7.
  2. تحضير فيروس الباكولو عن طريق نقل خلايا Sf9 بناقلات الباكولوفيروس، وجمع الفيروسات عند انفجار الخلايا، وتحليل الفيروس عند −80 درجة مئوية 6,7.
  3. في قارورة إيرلينماير بسعة 500 مل، أضف وسط نمو بسعة 100 مل، و1.5 × 108 خلايا Sf9، و1 مل من فيروس باكولوفيروس P1.
  4. حضن الثقافة عند 27.5 درجة مئوية في حاضنة هزاز مدارية مضبوطة على 125 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة في الظلام.
  5. قم بتنقية FLAG-SPIN4 باستخدام جل الألفة FLAG في محلول تحلل BC150 يحتوي على مثبطات بروتياز وسحب البروتين باستخدام 1× ببتيد FLAG بتركيز 0.1 ملغ/مل.
  6. لإزالة ببتيد 1× FLAG بالكامل، قام بإزالة الببتيد FLAG-SPIN4 بخلاف مخزن تخزين البروتين BC150 عند 4 درجات مئوية بالترتيب التالي:
    1. الغسيل الأول: 1 لتر، 1 ساعة.
    2. الغسيل الثاني: 2 لتر، طوال الليل.
    3. الغسيل الثالث: 1 لتر، 1 ساعة.
  7. تركيز البروتين المحلول إلى الحجم المطلوب (ل SPIN4، من 600 ميكرولتر إلى 150 ميكرولتر).
  8. تحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينكونينيك (BCA)، وحساب تركيز الأضراس وفقا لذلك.
  9. يتم تلخيص كمية البروتين الخام المستخرجة في كل خطوة تنقية والإنتاجيات المقدرة المقابلة في الجدول التكميلي 1. تم إجراء التنقية من 250 مل من زراعة Sf9 باستخدام 400 ميكرولتر من خليط الهلام المضاد للألفة FLAG.
  10. تخفيف SPIN4 المركز بمقدار 10× في مخزن تخزين البروتين BC150 (الجدول التكميلي 2). قم بتحميل 1، 2، 5، 10، و20 ميكرولتر على جل SDS–PAGE بنسبة 15٪ وتصور بواسطة صبغة Coomassie Blue (الشكل 1A).
  11. قم بقياس شدة النطاق باستخدام برنامج تحليل الصور لتحديد شدة الإشارة النسبية بين المسارات المحملة بنفس الحجم.
  12. اقسم نسبة الشدة على الوزن الجزيئي لكل بروتين للحصول على النسبة المولية.
  13. استخدم هذه النسبة المولية لتصحيح التركيز المولي المقدر في الخطوة 1.8.
  14. يقوم ببروتين Aliquot المنقي، ثم يجمده بسرعة في النيتروجين السائل، ويخزن عند −80 درجة مئوية. للاستخدام قصير الأمد، خزن عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل الانتقال إلى التجربة التالية.

2. مصفوفة ببتيدات هيستون

  1. تحضير مخزن حجب مصفوفة الببتيدات عن طريق إذابة ألبومين مصل البقر (BSA) بوزن 5 جرام في مخزن تخزين البروتين BC150 إلى حجم نهائي يبلغ 100 مل.
  2. اختياريا، تحديد منطقة التفاعل على مصفوفة الببتيدات باستخدام قلم علامة كاره للماء لتقليل استهلاك المواد المتفاعلة.
  3. ضع عدة أوراق، الفلتر، في طبق بتري بقطر 15 سم ورطبها بالماء.
  4. ضع مصفوفات الببتيدات على أوراق الترشيح المبللة.
  5. أضف بعناية مخزن حجب بسعة 300 ميكرولتر لتغطية كل منطقة مصفوفة بالكامل.
  6. غط طبق البتري وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1–3 ساعات.
  7. جهز FLAG-SPIN4 في مخزن حجب إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر.
  8. تحضير 1× ببتيد FLAG في حاجز حاجز إلى تركيز نهائي 1 ميكرومول.
  9. لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل الخلفية غير المرغوبة، قم بتنفيذ الخطوات التالية في غرفة باردة. انقل المصفوفات المحجوبة (مع طبق البتري) إلى الغرفة الباردة قبل إضافة البروتينات.
  10. أزل حاجز الحاجز الزائد من المصفوفات.
  11. أضف بعناية بروتين FLAG-SPIN4 المطلوب أو ببتيد FLAG كعنصر تحكم على كل كتلة.
  12. غط طبق البتري وحضنه طوال الليل في الغرفة الباردة.
  13. أضف تقريبا 50 مل من محلول غسل ببتيدات إلى صندوق غسيل Western Blot وأحضره إلى الغرفة الباردة.
  14. تخلص من محلول البروتين وانقل المصفوفات فورا إلى مخزن الغسيل، مع اتجاه التفاعل للأعلى.
  15. اغسل المصفوفات خمس مرات كما يلي: الغسلتان الأوليان لمدة دقيقة لكل منهما، والثلاث غسولات المتبقية لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  16. اشطف المصفوفات بمحلول حاجز ببتيدات لإزالة المنظفات المتبقية، ثم أعدها إلى طبق بتري.
  17. حضر محلول الأجسام المضادة المضادة ل-FLAG في تخفيف 1:2000 وأضف 300 ميكرولتر لكل كتلة.
  18. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
  19. كرر الخطوات من 2.14 إلى 2.16 لغسل المصفوفات.
  20. حضر محلول الماعز المضاد للفئران (IgG) المضاد للفأر (HRP) في تخفيف 1:6000 وإضافة 300 ميكرولتر لكل كتلة.
  21. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
  22. كرر الخطوات من 2.14 إلى 2.16 لغسل المصفوفات.
  23. ضع المصفوفات داخل واقي صفائح شفاف.
  24. أضف حوالي 1 مل من ركيزة التولأ الكيميائي المحسن (ECL)، لضمان تغطية متساوية لسطح التفاعل.
  25. إزالة فقاعات الهواء والتقاط صور كيميائية مضيئة وصور ساطعة باستخدام نظام تصوير مناسب (مثل المصورات الرقمية أو الأفلام الذاتية الإشعاعية) (الشكل 1B).
  26. تحليل شدة الإشارة وفقا لبرنامج مصفوفة الببتيدات والأدوات الإلكترونية المرتبطة به (الشكل 2A–C).

3. التعبير واسع النطاق ل FLAG-SPIN4 لاختبار سحب الأسفل

  1. في قارورة إيرلينماير بسعة 500 مل، أضف 125 مل ESF921 متوسطة، 1.8 × 108 خلايا Sf9، و1.2 مل P1 باكولوفيروس يعبر عن FLAG-SPIN4 أو FLAG-SPIN4D82H.
  2. الحضانة عند 27.5 درجة مئوية في حاضنة هزاز مداري (125 دورة في الدقيقة) لمدة 72 ساعة.
  3. الثقافة كما يلي:
    1. 4 مل من الزراعة في أنبوب بسعة 15 مل للمعايرة.
    2. 30 مل من الزراعة في أربعة أنابيب بسعة 50 مل.
  4. قم بطرد المركزي بالأنابيب عند 600 × جرام لمدة 15 دقيقة ثم تخلص من السوبرناتان.
  5. قم بتجميد الحبيبات في النيتروجين السائل وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. معايرة نسبة الخرزات إلى التحلل ل FLAG-SPIN4 و FLAG-SPIN4D82H

  1. أضف 1 مل من محلول التحلل BC150 إلى كل من حبيبات Sf9 من 5 مل من زراعة Sf9 الموصوفة في القسم 3، الخطوة 3.1.
  2. قم بسونيك الليزات لضمان الاضطراب الكامل: 30٪ سعة، 5 ثوان تشغيل/5 ثوان إيقاف، ليصبح إجمالي وقت السونيك 15 ثانية.
  3. قم بالطرد المركزي عند 20,000 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق، ونقل المادة الفائقة إلى أنابيب جديدة بسعة 1.5 مل.
  4. حضر 20 ميكرولتر من خليط جل مضاد للألفة FLAG لكل تفاعل سحب للأسفل (60 ميكرولتر لثلاث معايرات)
  5. اغسل الخرزات باستخدام محلول تحلل BC150:
    1. أضف 1 مل من مخزن التحليل BC150 والدوامة لفترة وجيزة.
    2. الطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
    3. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
  6. أعد تعليق الخرزات في مخزن تحلل BC150 بسعة 40 ميكرولتر لكل تفاعل سحب واحد (120 ميكرولتر لثلاث معايرات).
  7. ادمج الليزات في أنابيب بحجم 1.5 مل تحتوي على حاجز التحلل BC150، وتعليق الخرزات (الجدول التكميلي 3)
  8. حضن الأنابيب على دوار أنابيب مضبوطة على 15 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  9. الطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة دقيقة واحدة واستنشاق السوبرناتان.
  10. اغسل الخرزات ثلاث مرات كما يلي:
    1. أعد تعليق الخرزات في مخزن ودوامة تحلل BC150 بسعة 500 ميكرولتر لفترة وجيزة.
    2. الطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
    3. استنشق السوبرناتان.
  11. أعد تعليق الخرزات في مخزن Laemmli 1× 20 ميكرولتر وحضن عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  12. الطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
  13. شغل المادة الفائقة على جل SDS–PAGE بنسبة 15٪ وصبغ بلون أزرق Coomassie لتقدير إنتاج البروتين.
  14. استنادا إلى البيانات، اختر نسبة الليزات إلى الخرزة التي تشبع مواقع ارتباط الأجسام المضادة على الخرزات. في التجارب، كان ≥300 ميكرولتر من اللايزات لكل 20 ميكرولتر من الخرزات كافيا لتحقيق القدرة الكاملة على الارتباط.
    ملاحظة: يعرف "تشبع مواقع ارتباط الأجسام المضادة" بأنه النقطة التي لا يؤدي فيها زيادة حجم اللايزات إلى استعادة أكبر للبروتين المستهدف.
    ملاحظة: عند نفس المولارية، يظهر SPIN4D82H تقاربا أقل لجل الألفة FLAG مقارنة بنظيره من النوع البري.
    ملاحظة: في هذا الإطار التجريبي، تم اشتقاق 1 مل من اللايزات من 6 ملايين خلية Sf9 (محسوبة ب 1.5 × 106 خلايا/مل × 4 مللتر)، مما يشير إلى أن SPIN4 المعبر عنه من ~6 ملايين خلية Sf9 كاف لتشبع 20 ميكرولتر من خليط هلام الألفة المضادة ل FLAG.

5. تحضير واسع النطاق لمادة FLAG-SPIN4 المغلفة بجل مضاد للألفة FLAG كطعم

  1. لكل بروتين سيتم اختباره، اجمع حبيبتين من زراعة 30 مل. أعد تعليق كل حبيبة في مخزن تحلل BC150 بسعة 6 مل، ثم انتقل إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل، وضبط الحجم الكلي إلى 13 مل باستخدام مخزن التحلل BC150.
  2. قم بسونيكات كل عينة على الجليد عند سعة 100٪، 15 ثانية تشغيل/30 ثانية إيقاف، ليصبح إجمالي وقت السونيك دقيقتين.
  3. انقل الليزات إلى أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة المبردة مسبقا وجهاز الطرد المركزي عند 20,000 × جم، 4 درجات مئوية، لمدة 15 دقيقة.
  4. أضف 200 × (عدد العينات + 1) × 1.1 ميكرولتر من خليط جل مضاد للألفة FLAG إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل.
  5. اغسل الخرزات بحجم >5 أعمدة (CV) من مخزن تحليل BC150 مرة واحدة.
  6. أعد تعليق الخرزات في 400 × (عدد العينات + 1) × 1.1 ميكرولتر من مخزن التحلل BC150.
  7. انقل المواد الفائقة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4 إلى أنابيب الطرد المركزي بحجم 15 مل.
  8. أضف 500 ميكرولتر من نظام تعليق الخرز Step 5.7 إلى كل أنبوب.
  9. في أحد الأنبوب، أضف 3 مل من محلول التحلل BC150 و60 ميكرولتر من ببتيد 1× FLAG (100 ملم مول) كمادة تحكم سالبة.
  10. حضن العينات على مدور أنابيب مضبوط على 120 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  11. الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت.
  12. أعد تعليق الخرز بكمية مناسبة من الفائق الفائق وانقل إلى أنابيب بحجم 1.5 مل.
  13. الطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة دقيقة واحدة واستنشاق السوبرناتانت.
  14. اغسل الخرزات خمس مرات باستخدام مخزن التحلل BC150 كما يلي:
    1. أعد تعليق الخرزات في مخزن تحلل BC150 بسعة 1 مل.
    2. في الغسلتين الرابعة والخامسة، ضع العينات على دوار أنابيب مضبوط على 20 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. الطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة دقيقة واحدة واستنشاق السوبرناتان.
  15. أعد تعليق الخرزات في مخزن تحلل BC150 بسعة 200 ميكرولتر.
  16. خذ 9 ميكرولتر من تعليق الخرز/المخزن وحلل محتوى البروتين بنسبة 15٪ SDS–PAGE تليها صبغة Coomassie Blue.
  17. نظرا لأن البروتين المدخل يتجاوز قدرة ارتباط الخرز، يجب أن تكون كمية البروتين المرتبط لكل حجم خرزة متشابهة عبر العينات. قم بقياس شبه كمية شدة النطاق من خلال تحليل الصور الرقمية وضبط كميات الخرزات للتفاعلات اللاحقة.

6. تحضير النيوكليوسومات الأحادية من خلايا HEK293FT

  1. ننمو HEK293FT الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة بحجم 15 سم حتى تصل إلى حوالي 90٪ باستخدام 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في وسط DMEM عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بتركيزثاني أكسيد الكربون 5٪.
  2. يتم الحصول على خلايا HEK293FT المرورية المبكرة تجاريا ويتم التحقق منها من خلال تصنيف STR.
    ملاحظة: طبق واحد بحجم 15 سم ينتج ~27 مليون خلية، وهو ما يكفي لتفاعل سحب إلى أسفل من 1 إلى 2. لست تفاعلات (بما في ذلك الضوابط السلبية)، حضر على الأقل ثلاث أطباق بحجم 15 سم. إذا كان تعديل الهيستون المستهدف بعد الترجمة (PTM) نادرا أو غير مستقر، قم بزيادة عدد الخلية من 2 إلى 10× وفقا لذلك.
  3. (اختياري) اعتمادا على تعديل الهيستون المعني، أضف مثبطات PTM المناسبة (الجدول التكميلي 2) إلى وسط الزراعة وحضانة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: قد يتم حذف هذه الخطوة إذا كانت هناك وفرة من PTMs الهيستونية.
  4. عندما تصل الخلايا إلى تقارب 100٪، اجمعها كما يلي:
    1. استنشق وسيط الثقافة.
    2. اشطف الخلايا بلطف ب 10 مل من PBS بارد جدا، ثم استنشقها.
    3. أضف 5 مل من PBS البارد جدا.
    4. قم بكشط الخلايا على الثلج ونقلها إلى أنبوب 50 مل (يمكن دمج جميع الأطباق).
    5. جهاز الطرد المركزي عند 13,000 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق.
    6. تخلص من السوبرناتانت.
  5. (اختياري) إما أن تتابع فورا أو تجمد حبيبة الخلية لاستخدامها لاحقا:
    1. قدر حجم الحبيبات.
    2. أعد تعليق 9× حجم حبيبات من محلول G المؤقت للوصول إلى تركيز نهائي للجليسرول بنسبة 20٪.
    3. تجميد النيتروجين السائل وخزنها عند −80 درجة مئوية.
  6. إذا كنت تستخدم الحبيبات المجمدة، قم بإذابة الحبيبة على الثلج، ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 1,300 × و4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتانت.
  7. أعد تعليق الحبيبات (الطازجة أو المذابة) في حجم 10× من محلول TMSD (40 ملليموتر تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 5 ملليمولار ملغي كلر2، 250 ملليمولار السكروز، 1 ملليمولار DTT) التي تحتوي على مثبطات بروتياز باستخدام ماصنة مصلية.
  8. جهز 10٪ من NP-40 في مخزن TMSD طازجا، وأضف 0.11× إجمالي حجم تفاعل لتحقيق تركيز نهائي ل NP-40 ~1٪.
  9. حضن نظام التعليق على دوار الأنبوب مضبوطا على 120 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. اخلط 10 ميكرولتر من التعليق مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو، وراقب تحت المجهر لمراقبة التلوين النووي. تأكد من أن النوى معزولة تماما عن السيتوسول (الشكل 3A).
  11. عندما تكون حوالي 95٪ من النوى موجبة باللون الأزرق التراباني، انتقل إلى الخطوة التالية. بالنسبة لخلايا HEK293FT، عادة ما يكون حضانة NP-40 لمدة 5 دقائق كافية بنسبة 1٪. بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى، تحقق من وقت الحضانة وعدل.
  12. الطرد المركزي عند 1,300 × جم، 4 درجات مئوية، لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتان.
  13. أعد تعليق الحبيبة في حجم 10× من مخزن TMSD.
  14. كرر الخطوات من 6.12 إلى 6.13 خمس مرات لإزالة بقايا NP-40 تماما.
  15. أعد تعليق الحبيبة في حجم 5× من المخزن B.
  16. أضف وحدة واحدة من النوى الدقيقة (MNase) لكل 10,000 نواة، وحضن في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. أحيانا تحرك الأنبوب أثناء الحضانة للحفاظ على تعليق النوى بشكل متساو
  17. عند نقاط الزمنية المحددة (0.5، 1، و2.5 ساعة)، اسحب 50 ميكرولتر من التفاعل إلى أنابيب بحجم 1.5 مل، أضف فورا 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA-Na (رقم الرقم الهيدروجيني 8.0)، ودوامة.
  18. استخرج الحمض النووي من كل نقطة زمنية باتباع الإجراء أدناه:
    1. أضف 80 ميكرولتر H₂O، 30 ميكرولتر 10٪ SDS، و20 ميكرولتر 5 M NaCl؛ دوامة.
    2. أضف 200 ميكرولتر فينول/كلوروفورم؛ دوامة بشكل كامل.
    3. الطرد المركزي عند 20,000 × جم، RT، 3 دقائق.
    4. انقل الفائق بحذر إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل.
    5. أضف 1 مل إيثانول 100٪ و20 ميكرولتر 3 مولار أسيتات الصوديوم (درجة حموضة 5.2)؛ دوامة.
    6. الطرد المركزي عند 20,000 × جرام، RT، 5 دقائق.
    7. أزل سوبرناتانت، أضف 1 مل إيثانول بنسبة 70٪.
    8. الطرد المركزي عند 20,000 × جم، RT، دقيقة واحدة.
    9. أزل السائل العلوي وجفف الحبيبة على درجة حرارة 55 درجة مئوية مع فتح الغطاء لمدة 10 دقائق.
    10. أعد تعليق الحبيبة في مخزن TE بسعة 50 ميكرولتر.
  19. شغل عينات على جل أجاروز TBE بنسبة 1٪ لتأكيد حجم الحمض النووي أحادي النيوكليوسوم (147 بيستا في القاعدة) (الشكل 3B).
  20. (اختياري) تختلف كفاءة هضم نيوكلياز الميكروكوكي (MNase) من نوع لمختلف الخلايا، ويمكن إضافة MNase إضافية أثناء التفاعل إذا لزم الأمر لإزالة البولي نيوكليوسومات بالكامل. على سبيل المثال، إذا بدت عيناتي 1 ساعة و2 ساعة متشابهة، أضف المزيد من MNase عند 3 ساعات.
  21. عندما يلاحظ نطاق سائد ~147 بيزان، أو عندما لا تغير MNase إضافية/حضانة ممتدة حجم الجزء، توقف التفاعل بإضافة 0.5 M EDTA-Na (pH8.0) إلى تركيز نهائي 2 مللي مو.
  22. الطرد المركزي عند 1,300 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 5 دقائق. اجمع المادة الفائقة (S1).
  23. أعد تعليق الحبيبة في حجم 10× من منشطات TE + بروتياز، وحضن العينة على مدور أنابيب مضبوط على 20 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
    ملاحظة: تختلف كفاءة استخراج النيوكليوسوم الأحادي من أنواع الخلايا. يمكن استخدام NaCl بحجم 0-300 ملليمول لاستخراج النيوكليوسومات بكفاءة.
  24. الطرد المركزي عند 1,300 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 5 دقائق. اجمع الفائق (S2).
  25. انقل 50 ميكرولتر لكل من S1 و S2 إلى أنابيب منفصلة بحجم 1.5 مل.
  26. تحليل جميع الكسور باستخدام الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز (الخطوات 6.17 إلى 6.18) لتقييم توزيع حجم الحمض النووي وكفاءة الاستخلاص. توجد معظم النيوكليوسومات الأحادية في الجزء S2 (الشكل 3C).
  27. انقل S2 إلى أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة وادوران عند 20,000 × جم، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.
  28. اجمع المادة الفائقة وقم بتحليل الداليز ضد محلول تحلل BC150 (بدون مثبطات):
    1. الغسيل الأول: 1 لتر، 1 ساعة.
    2. الغسيل الثاني: 2 لتر، طوال الليل.
  29. بعد الغسيل الكلوي، استخدم الطرد المركزي مرة أخرى على حرارة 20,000 × جم، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق لإزالة أي بقايا غير قابلة للذوبان متبقية.
  30. اجمع السوبرناتانت الأخير.
  31. اخلط 5 ميكرولتر من المادة الفائقة مع 35 ميكرولتر من محلول التحلل BC150 و10 ميكرولتر من 5× لامملي، وسخن على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وحمل 1، 2، 5، 10، و20 ميكرولتر على جل SDS–PAGE بنسبة 15٪.
  32. الحمل 1، 2، و5 ميكرولتر بمقدار 0.1 ملغ/ملليتر BSA في مخزن لايملي كمرجع لتقدير العائد.
  33. صبغ باللون الأزرق الكوماسي، وتقدير عائد النيوكليوسوم بشكل شبه كمي باستخدام برنامج تحليل الصور (الشكل 3D).

7. سحب النيوكليوسوم المعدل للأسفل

  1. جهز 2× مخزن حجب الخرزات عن طريق إذابة 1 جرام BSA في مخزن التحلل BC150 إلى حجم نهائي يبلغ 10 مل، ثم الدوامة حتى تذوب بالكامل.
  2. انقل خرزات FLAG-SPIN4-WT و FLAG-SPIN4D82H التي تحتوي على كميات مولية مكافئة من البروتين (من القسم 5، الخطوات 5.16 إلى 5.17) إلى أنابيب منفصلة بحجم 1.5 مل.
  3. أضف حجما متساويا من خرزات التحكم السلبية (من القسم 5، الخطوة 10) إلى عينة FLAG-SPIN4-WT.
  4. قم بضبط الحجم الكلي لجميع عينات الخرزات ليكون متطابقا باستخدام مخزن التحلل BC150.
  5. أضف حجم متساوي 2× عازل حجب الخرزات لكل أنبوب يحتوي على خرزات ومخزن تحلل BC150.
  6. حضن العينات على مدور أنابيب مضبوط على سرعة 20 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية طوال الليل (O/N).
  7. قم بإذابة كمية مناسبة من 1× نيوكليوسوم مستخرج من HEK293FT الخلايا على الجليد. الحجم المطلوب يعتمد على نسبة النيوكليوسوم إلى SPIN4 المولية المطلوبة. للتحسين الأولي، استخدم نسبة مولية 1:1 بين النيوكليوسوم وSPIN4.
  8. اخلط 1× نيوكليوسوم بحجم متساو 2× وبامن حجب الخرزات جيدا.
  9. ادمج خليط الخطوة 7.8 مع الخرزات المسدودة مسبقا في أنبوب بسعة 15 مل.
  10. حضن الخليط على مدور أنابيب مضبوط على 20 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات أو طوال الليل.
  11. الطرد المركزي عند 3000 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 3 دقائق.
  12. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
  13. أعد تعليق الخرزات في مخزن تحلل BC150 بسعة 1 مل ثم انتقل إلى أنابيب بحجم 1.5 مل.
  14. اغسل الخرزات ثلاث مرات كما يلي:
    1. الطرد المركزي عند 3000 × جرام، دقيقة واحدة، واستنشاق السوبرناتانت.
    2. أعد تعليق الخرزات في مخزن تحلل BC150 بسعة 1 مل.
    3. أحيانا حرك الأنبوب للحفاظ على تعليق الخرزات بشكل متساو أثناء الغسيل.
  15. اغسل الخرزات مرتين إضافيتين كما يلي:
    1. الطرد المركزي عند 3000 × جرام، دقيقة واحدة، واستنشاق السوبرناتانت.
    2. أعد تعليق الخرزات في مخزن تحلل BC150 بسعة 1 مل.
    3. قم بالتدوير عند 20 دورة في الدقيقة، 4 درجات مئوية، لمدة 10 دقائق.
  16. بعد الغسيل، أعد تعليق الخرزات في 9 أعمدة (CV) من مخزن التحلل BC150.
  17. خذ 160 ميكرولتر من كل عينة، وامزجه مع 40 ميكرولتر 5× لامملي، وسخنه على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يوصى بإخراج ببتيدات FLAG لمركب البروتين-النيوكليوسوم، مما يعطي نتائج أنظف مع خلفية أقل.
  18. الطرد المركزي عند 3,000 × جرام، درجة حرارة الغرفة، لمدة 5 دقائق.
  19. قم بتحميل 5 ميكرولتر من المادة الفائقة على جل SDS–PAGE بنسبة 15٪ وقم بصبغ الفضة (الشكل 4A).
  20. تحميل 5 ميكرولتر أخرى من المادة الفائقة على جل SDS–PAGE بنسبة 15٪، ثم انقله إلى غشية PVDF، واستفحص الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة لنماذج PTM الهيستونية المستهدفة (الشكل 4B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة ركائز الارتباط في SPIN4 البشري، تم إعادة تكوين SPIN4 من النوع البري وطفرة مشتقة من المريض مرتبطة بمتلازمة النمو الزائد باستخدام نظام تعبير خلية حشرية Sf9. تحديدا، هذا هو طفرة خاطئة من حمض الأسبارتيك (D) إلى الهيستيدين (H) عند البقايا 82 (D82H)، والتي تقع ضمن المجال الأول من تيودور في SPIN4، مما يشير إلى دوره في تنظيم ارتباط الركيزة في SPIN4. تم استخدام ناقل فيروسي باكولوفيروسي يشفر SPIN4 واحد محمل علامة FLAG للتعبير عن البروتين في خلايا Sf9، تلاه تنقية ألفة FLAG بخطوة واحدة واستلق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقديم طريقة فعالة من حيث الوقت والتكلفة لتحديد PTMs الهيستونية تحديدا كأهداف لبروتين ضعيف التوصيف بشكل جيد، ولتقييم كيف تؤثر طفرته المرتبطة بالمرض على ألفة الارتباط للهدف. ميزة هذه الطريقة أنها لا تتطلب إعادة تكوين مكلفة أو مستهلكة للوقت للنيوكليوسومات الصناعية. استفاد هذا النهج من سهولة مصفوفات الببتيدات PTM الهيستونية التجارية مع ضمان أن يكون SPIN4 قارئا حقيقيا ل H3K4me باستخدام مونونيوكليوسومات أصلية كركائز ارتباط فسيولوجية ذات صلة. خطوة حاسمة في هذه الطريقة هي إعادة تشكيل بروتين م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون جميع الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر يو وجي على دعمهم الفني. حظي جي.-آر.ي. بدعم جائزة NIH NIGMS لتعظيم أبحاث الباحثين (MIRA) R35GM160046. يا. كان ج مدعوما من قبل مستشفى الأطفال الوطني ومعهد أبحاث الأطفال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملسارستيدت72.690.001تجارب عامة
طبق زراعة الأنسجة بطول 15 سمسارستيدت83.3903.300تجارب عامة
أنابيب الطرد المركزي المخروطية بسعة 15 ملسارستيدت62.554.101تجارب عامة
أنابيب الطرد المركزي المخروطية بسعة 50 ملسارستيدت62.548.004تجارب عامة
قارورة إيرلنماير بسعة 500 ملستيلار ساينتيفكCT229809زراعة الخلايا في Sf9
كاميرا أميرشام إيمج كوانت 800 CCDسيتيفاIMQ800نظام تصوير CCD
جل الألفة M2 المضادة للعلمسيغما-ألدرتشA2220سحب كيميائي حيوي
الجسم المضاد M2 مضاد FLAGسيغما-ألدرتشF1804البقعة الغربية
أبروتينينميدكيم إكسبريسHY-P0017مثبط البروتيز
تحليل المصفوفة Sofrwareالنمط النشطhttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipتحليل بيانات مصفوفة الببتيدات المعدلة
ASI أغاروز LEالقلوية العلميةA7700جل الحمض النووي
نظام التعبير عن فيروس باكولوفيروس باك إلى باكثيرمو ساينتفيك10359016التعبير الفيروسي الباكولوجي
هيدروكلوريد البنزاميدينميدكيم إكسبريسهاي-W018781مثبط البروتيز
مصل البقر الألبومين (BSA)سيغما-ألدرتشA9647معيار قياس كمية البروتين
بروموفينول بلوثيرمو ساينتفيكA18469.08مخزن لاميلي
كومسي بريليانت بلو R-250ثيرمو ساينتفيك20278صبغ جل البروتين
ديثيوثرايتول (DTT)سيغما-ألدريتش D5545مخزن التحليل
EDTAمنتجات أبحاث RPIE58100مخزن التحليل
ركيزة التلميض الكيميائي المعزز (ECL)سيتيفاRPN2232البقعة الغربية
وسط زراعة خلايا الحشرات ESF 921أنظمة التعبير96-001زراعة الخلايا في Sf9
الإيثانول (200 بروف)سبكتروم كيميكالET107ترسيب الحمض النووي
نظام تصوير EVOS M5000إنفيتروجينM5000التصوير العام
ببتيد FLAGميدكيم إكسبريسHY-P7006إخراج السحب للأسفل
الجلسرولسيغما-ألدريتش G77893مخزن التخزين
الأجسام المضادة H3K4me1 النمط النشط39300البقعة الغربية
الأجسام المضادة H3K4me2  الإشارات الخلوية9725Tالبقعة الغربية
الأجسام المضادة H3K4me3  الإشارات الخلوية9751Tالبقعة الغربية
HEK293FT الخلاياثيرمو ساينتفيكR70007خط الخلايا الليفية الكلوية الجنينية البشرية
هيبسسيغما-ألدريتش H3375مخزن التحليل
ImageJالمعاهد الوطنية للصحةhttps://imagej.net/ij/download.html  برنامج معالجة الصور المعتمد على جافا
نصف كبريتات ليوبتينميدكيم إكسبريسHY-18234Aمثبط البروتيز
النيوكلياز الميكروكوكي (MNase)NEB M0247Sالإندونوكلياز لهضم الكروماتين
موديل 120 سونيك ديسميبريتورفيشر ساينتيفكFB120110سونيكيشن
مصفوفة ببتيدات هيستون المعدلةالنمط النشط13005اختبار ارتباط البروتين
الببستاتين Aميدكيم إكسبريسHY-P0018مثبط البروتيز
جزء بيروكسيداز IgG وحيد النسيلة لمضاد الفأر IgG، نوع السلسلة الخفيفةجاكسون إيمينوريسيرش115-035-174البقعة الغربية
pFastBac1-Flag-SPIN4ثيرمو ساينتفيك10360014ناقل التعبير الفيروسي الباكولوجي
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82Hثيرمو ساينتفيك10360014ناقل التعبير الفيروسي الباكولوجي
الفينول: الكلوروفورم: الكحول الأيزوأميل (25:24:1)سيغما-ألدرتشP2069تنقية الحمض النووي
مجموعة اختبار البروتين BCA من بيرس رابيد جولدثيرمو ساينتفيكPIA53226كمية البروتين
مجموعة بقع الفضة من بيرسثيرمو ساينتفيك24612اكتشاف البروتينات
مثبط بروتياز PMSFثيرمو ساينتفيك36978مثبط البروتيز
جل بولي أكريلاميدصنع داخليالا يوجدجل البروتين
خلايا الحشرات Sf9ATCCCRL-1711خط خلية الحشرات لتعبير فيروس الباكولوفيروس
جهاز غسيل الكلى Slide-A-Lyzer MINI، 10K MWCOثيرمو ساينتفيك69572غسيل الكلى البروتيني
أسيتات الصوديومسيغما-ألدرتشS8750ترسيب الحمض النووي
كلوريد الصوديوم فيشر BP358-1الحافظات العامة
كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)سيغما-ألدريتش L3771الحافظات العامة
محلول تريبان بلو (0.4٪)ثيرمو ساينتفيك15250061تلوين النوى

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
  4. Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).
  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
  8. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).
  9. Fuhrmann, J., Thompson, P. R. Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation. ACS Chem Biol. 11, 654(2015).
  10. Zhao, F., et al. Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1. J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).
  11. Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).
  12. Greschik, H., et al. The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development. Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

مقالات ذات صلة