حماية خلايا بيتا الجزيرة من الإصابة الناتجة عن فرط الحديد بواسطة الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر المعبر عنه الأمومة 3

ملخص

أدى فرط الحديد إلى تقليل تعبير MEG3 في أنسجة البنكرياس. قد يلعب MEG3 دورا وقائيا ضد استماتة الخلايا β في الجزر الناتجة عن الحديد، مما قد يتضمن تعديل مسار NF-ĸB. قد تساهم هذه الآلية في خلل الجزر لدى مرضى β-TM الذين يعانون من زيادة الحديد.

الملخص

المرضى المصابون بالثلاسيميا الكبرى (β-TM) غالبا ما يعانون من اضطرابات في أيض الجلوكوز، وتعتبر عوامل مثل فرط الحديد، فقر الدم المزمن، اختلالات هرمونية، خلل في الكبد ومقاومة الأنسولين المرتبطة بالالتهاب من العوامل المهمة في خلل الجزر البنكرياسية. تعرف بشكل متزايد أحماض الريبونوكليك غير المشفرة الطويلة (lncRNAs) بدورها التنظيمي في استماتة الخلايا وتوازن الجلوكوز. تستكشف هذه الدراسة وظيفة الحمض النووي الريبي اللامركزي، وهو الجين المعبر عنه الأم رقم 3 (MEG3)، في إصابة الخلايا β الناتجة عن الحديد. تم تحفيز نموذج فأر بحمل زائد الحديد عبر حقن الحديد دكستران داخل الصفاق. تم تقييم ترسيب الحديد وتلف الأنسجة في البنكرياس باستخدام صبغات بروسيا الأزرق والهيماتوكسيلين والإيوزين، وتم قياس تعبير MEG3 عبر تفاعل بوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (RT-PCR). في المختبر، تم نقل خلايا MIN6 إلى RNA صغير متداخل MEG3 لفحص الاستماتة عبر قياس تدفق الخلايا الخلية، وتم تقييم نشاط مسار الإشارة NF-kappa (ĸ)B بواسطة Western blotting. أكدت التلوين النسيجي وجود ترسيب كبير للحديد وأضرارا بنيوية في نسيج البنكرياس للفئران المحملة بالحديد بشكل زائد. كشف تحليل RT-PCR عن انخفاض ملحوظ في تعبير MEG3 في البنكرياس (p<0.05). في المختبر، أدى سقوط MEG3 إلى زيادة كبيرة في استماتة الخلايا في خلايا MIN6 مقارنة بالضابطين. أظهر تحليل البقعة الغربية مستوى مرتفعا من NF-ĸB، مما يشير إلى تنشيط مسار الإشارة NF-ĸB في الخلايا الصامتة بواسطة MEG3. تشير هذه النتائج إلى أن انخفاض تنظيم MEG3 قد يعزز الاستماتة المبرمجة في الجزر β عبر إشارات NF-ĸB تحت ظروف تحميل الحديد. قد يلعب جين MEG3 دورا وقائيا ضد موت الخلايا β في الجزر التي يسببها الحديد، مما قد يتضمن تعديل مسار NF-ĸB. قد تساهم هذه الآلية في خلل الجزر لدى مرضى β-TM الذين يعانون من زيادة الحديد.

المقدمة

الثلاسيميات بيتا (β)-هي مجموعة من الاضطرابات الدموية الوراثية التي تتميز بانخفاض أو غياب إنتاج سلسلة β غلوبين، مما يؤدي إلى فقر دم مزمن وعدم^{فعالية تقوية} الريثروبين. في المرضى الذين يعانون من β الثلاسيميا الكبرى المعتمدة على نقل الدم (β-TM)، غالبا ما تؤدي عمليات نقل الدم المتكررة وتحلل الدم إلى زيادة الحديد الجهازي، مما قد يضر بعدة أعضاء ويساهم في مجموعة من المضاعفات الصماء، بما في ذلك استقلاب الجلوكوز غير الطبيعي². بالإضافة إلى ذلك، يزيد فقر الدم المزمن من العبء على البنكرياس، والاختلالات الهرمونية التي تؤثر على تنظيم الجلوكوز، وخلل الكبد الذي يعيق أيض الجلوكوز، ومقاومة الأنسولين الناتجة عن العمليات الالتهابية قد تساهم جميعها في فرط سكر الدم لدى مرضى β-TM. لذلك، فإن اضطرابات أيض الجلوكوز في β-TM متعددة العوامل بطبيعتها ^2,3. أفاد تحليل تلوي حديث أن انتشار ضعف الجلوكوز الصائم، ضعف تحمل الجلوكوز (IGT)، والسكري (DM) لدى مرضى β-TM كان 17.21٪، 12.46٪، و6.54٪ على التوالي، مما يشير إلى زيادة عبء اضطرابات أيض الجلوكوز في هذه الفئة³.

على الرغم من أهميته السريرية المتزايدة، إلا أن الآليات الأساسية لاستقلاب الجلوكوز غير الطبيعي في مادة β-TM لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. أظهرت دراسات سابقة أن التحميل المزمن للحديد، خاصة من عمليات نقل الدم المتكررة وتحلل الدم، يمكن أن يؤدي إلى ترسب مفرط للحديد في البنكرياس، خاصة داخل خلايا β الجزر. هذا التراكم يعزز توليد أنواع الأكسجين التفاعلية ويزيد من الإجهاد التأكسدي، مما يؤدي إلى خلل في وظيفة الميتوكوندريا، ويعيق تخليق وتفرز الأنسولين، وفي النهاية يؤدي إلى استماتة الخلايا β ونقص الأنسولين ^4,6. بالإضافة إلى ذلك، قد يساهم فرط الحديد في مقاومة الأنسولين الطرفية من خلال الالتهاب الناتج عن الإجهاد التأكسدي والتداخل مع مسارات إشارات الأنسولين. ومع ذلك، فإن المسارات الجزيئية التي تربط فرط الحديد بإصابة الخلايا β واختلال تنظيم الجلوكوز الجهازي معقدة ولم يتم توضيحها بالكامل بعد. برزت الأحماض الريبونوكليتيكية الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) – وهي فئة من النسخ التي تزيد عن 200 نيوكليوتيد ولا ترمز البروتينات – كمنظمات مهمة في عمليات بيولوجية متنوعة، بما في ذلك توازن الجلوكوز، وإفراز الأنسولين، واستجابات الإجهاد التأكسدي ^7,8,9. تعرف خلايا β الجزر في البنكرياس بأنها تعبر عن أكثر من 1000 lncRNA، مما يشير إلى دورها التنظيمي المحتمل في الحفاظ على وظيفة الغدد الصماء¹⁰.

ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن ملفات تعبير lncRNA وأدوارها الوظيفية في سياق تلف خلايا β الجزر الناتجة عن حمل زائد الحديد، خاصة في β-TM. كشفت التطورات الحديثة أن LNCRNA MEG3 (MEG3) يعزز إفراز الأنسولين ويثبط موت الخلايا β في البنكرياس¹¹. ومع ذلك، لا يزال تأثيره على خلايا β البنكرياس في ظروف فرط الحديد بعيد المنال. في سياقات مرضية أخرى، أظهرت الريانا الريبية اللينكسية تفاعلا مع مسارات الإشارة الرئيسية مثل NF-kappa (ĸ)B، JNK، وNrf2، والتي تشارك أيضا في الإجهاد التأكسدي وإصابة الخلايا المرتبطة بحمل زائد الحديد 12,13,14. تحديدا، NF-ĸB هو عامل نسخ مركزي يتم تفعيله تحت الإجهاد التأكسدي وقد تورط في استماتة الخلايا β في حالات زيادة الحديد 15,16,17. لذلك، تحقق هذه الدراسة في أن انخفاض MEG3 قد يعزز الاستبرمج الخلوي β للجزر عبر إشارات NF-ĸB تحت ظروف حمل الحديد الزائد. قد يوفر هذا العمل رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء استقلاب الجلوكوز غير الطبيعي في β-TM.

البروتوكول

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى هاينان العام (البروتوكول رقم 2021-239). تم اتباع دليل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية وإعلان هلسنكي بدقة في جميع الإجراءات التجريبية. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. نموذج الحيوانات وتصميم التجارب

تم استخدام ستة وثلاثين فأرا ذكرا من نوع C57BL/6J (عمره 4 أسابيع، حوالي 20 جرام) في هذه الدراسة. تم إيواء جميع الفئران تحت ظروف مختبرية قياسية (20–25 درجة مئوية، رطوبة نسبية 50٪–65٪، دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة) مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بشكل مرضي. بعد فترة تأقلم استمرت 7 أيام، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى مجموعتين (n=18 لكل مجموعة): مجموعة زيادة الحديد (مجموعة النموذج)، التي تلقت حقن داخل الصفاق من الحديد دكستران (0.2 جم/كغ) مرتين في الأسبوع لمدة 4 أسابيع؛ ومجموعة التحكم، التي تلقت كميات مماثلة من المحلول الملحي الطبيعي عبر الحقن داخل الصفاق. بعد 4 أسابيع، تم قتل الفئران، وتم جمع أنسجة البنكرياس لتحليلها لاحقا.

2. قياس الحديد في المصل

تم جمع عينات دم من الجيب الرترو-حجابي تحت تخدير خماسي بنسبة 1٪ أثناء الديسترو. بعد أن ترك الدم واقفا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، تم طرد الدم عند 4 درجات مئوية، 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. تم فصل المصل وتخزينه عند -80 درجة مئوية. تم تحديد تركيزات الحديد في المصل باستخدام مجموعة اختبار لون الحديد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

3. التحليل النسيجي

تم غمر عينات أنسجة البنكرياس في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ للتثبيت، تلاها غرس البارافين قبل تحضير القطع. تم الحصول على مقاطع نسيج متسلسلة بسماكة تتراوح بين 4–5 ميكرومتر ومعالجتها من خلال إجراءات إزالة البارافين وإعادة الترطيب القياسية. تم إجراء الفحص النسيجي لاحقا باستخدام تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين، بينما تم تقييم ترسيب الحديد داخل أنسجة البنكرياس باستخدام التلوين الأزرق البروسي وفقا لبروتوكولات التلوين النسيجي التقليدية.

4. زراعة الخلايا ونقل حمض الريبونويكليك الصغير المتدخل

تم زراعة خلايا β البنكرياس الجرذية MIN6 في وسط Eagle المعدل عالي الجلوكوز من Dulbecco مع 15٪ من مصل البقر الجنيني، و100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين، و10 ملليمولار HEPES، و50 ملليمول بيروفات الصوديوم، و50 ميكرومول/لتر β-ميركابتوإيثانول. أجريت جميع التجارب عند التقاء الخلايا بنسبة 80٪. في كل مرة أثناء زراعة الخلية، يتم تناول 6–8 مل من وسط الزراعة. تم الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للدراسات الوظيفية، تم نقل خلايا MIN6 في مرحلة النمو اللوغاريتمي باستخدام RNA صغير متداخل (si)RNA خاص ب lncRNA (مستهدف lncRNA مختارة بناء على نتائج المصفوفة الدقيقة؛ مجموعة المثبط) أو مجموعة المثبط السلبي لأشعة الريبي الريبي (مجموعة مثبط NC) باستخدام ليبوفكتامين 2000، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد الزراعة لمدة 24 ساعة، تم تحليل الخلايا بواسطة تفاعل متسلسل بوليميراز كمي (qRT-PCR) أو ويسترن بلوت لتحديد كفاءة الإسقاط. كانت تسلسلات الأهداف لهذا ال siRNA كما يلي: siMEG3: GCGUCUUCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACGUGACGUUCGGAGAATT. تم إجراء كل تجربة ثلاث مرات وتكرر ثلاث مرات.

5. اختبار تفاعل بوليميراز بالنسخ العكسي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من عينات أنسجة البنكرياس وخلايا MIN6 باستخدام مادة عزل RNA متوفرة تجاريا تعتمد على الفينول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تصنيع الحمض النووي التكميلي باستخدام مجموعة نسخ عكسي بحجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر. بعد النسخ العكسي، كان تركيز cDNA لمعظم العينات حوالي 1 ميكروغرام/ميكرولتر بناء على تحليل كمية العينة. لاحقا، تم استخدام 1 ميكرولتر من قالب cDNA لتضخيم PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم تنفيذ qRT-PCR باستخدام مجموعة كشف PCR مدعومة ب SYBR Green تحت ظروف الدورة التالية: 95 °م لمدة 30 ثانية، 90 °م لمدة 15 ثانية، 60 °م لمدة 34 ثانية، و68 °م لمدة 30 ثانية. تم تحديد مستويات التعبير الجيني النسبية باستخدام طريقة دورة العتبة المقارنة (طريقة ^2-ΔCT ). تم استخدام GAPDH كجين مرجعي داخلي لتطبيع بيانات PCR اللحظية. تم تنفيذ جميع إجراءات التجارب وفقا لبروتوكولات الشركات المصنعة المعنية، وتم تكرار كل تجربة بشكل مستقل على الأقل ثلاث مرات. تم إدراج تسلسلات البادئات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 1 والجدول 2.

6. اختبار مجموعة عد الخلايا 8

تم تحديد قدرة تكاثر الخلايا باستخدام اختبار مجموعة عد الخلايا 8 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. باختصار، تم طلاء خلايا MIN6 في ألواح زراعة بسعة 96 بئرا بكثافة 5 × 10 خلايا³ في كل بئر بعد التحويل باستخدام si-MEG3 أو si-NC وحافظت عليها لمدة 24 ساعة. في النقاط الزمنية المحددة، تم إدخال 10 ميكرولتر من مادة الفعالية الخلوية في كل بئر، وتم حضن الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم قياس قيم الامتصاص لاحقا عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكروبليت (microplate). تم حساب قابلية البقاء للخلايا كنسبة مئوية بالنسبة لمجموعة الضابطة.

7. اكتشاف الاستماتة المبرمجة باستخدام قياس خلوية التدفق

تم فحص التغيرات الاستماتية في خلايا MIN6 باستخدام مجموعة كشف الاستماتة المبرمجة من نوع Annexin V-FITC/PI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد 48 ساعة من نقل siRNA، تم جمع الخلايا، وغسلها مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد، وأعيد تعليقها في حاجز الربط. بعد ذلك، تم حضن الخلايا ب 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و5 ميكرولتر يوديد بروبيديوم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتحت ظروف مظلمة. مباشرة بعد التلوين، تم تحليل العينات باستخدام قياس خلوي التدفق. تم قياس مجموعات الخلايا الموتمة المبكرة والمتأخرة باستخدام برنامج تحليل تدفق الخلايا الخلوي. تم حساب نسبة الخلايا الموتمة لاحقا للمقارنات بين المجموعات. تم إجراء كل تجربة بشكل مستقل ثلاث مرات.

8. تحليل البقعة الغربية

أجريت تجارب البقع الغربية وفقا للبروتوكولات السابقة¹⁸. تم هضم الخلايا أولا باستخدام التريبسين، وجمعها، وتحللها على الجليد باستخدام اختبار التحليل المناعي الإشعاعي لتحليل التفكيك (PARTITIONS). تم قياس تركيزات البروتين، وخضعت كميات مكافئة من البروتين إلى فصل على جل الرحلان الكهربائي 10٪ من هلام دوديسيل كبريت-بولي أكريلاميد الصوديوم قبل نقله إلى أغشية فلوريد بولي فينيليدين. بعد حجب الغشاء، تم حضنة العينات بأجسام مضادة أولية ضد NF-κB (1:1000)، Bcl-2 (1:1000)، باكس (1:1000)، كاسباز-3 (1:1000)، وجلسرا ألديهايد-3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH) (1:2000) عند نسب التخفيف المشار إليها، تلاها الحضانة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ببيروكسيداز الفجل الحار. تم اكتشاف إشارات البروتين باستخدام نظام تلألؤ كيميائي وقياسها باستخدام برنامج ImageJ. تم استخدام GAPDH كضابط تحكم داخلي، وتم التعبير عن مستويات تعبير البروتين كتغيرات في الطية بالنسبة لمجموعة الضابطة.

9. التحليل الإحصائي

تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم إجراء مقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار مان–ويتني U¹⁹ باستخدام التحليل الإحصائي. تم اعتبار قيمة p <0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تقييم نموذج فأر الحمولة الزائدة للحديد وقياس تعبير الجين 3 المعبر عنه الأم في أنسجة البنكرياس

لدراسة دور MEG3 في الجسم الحي، أنشأنا نموذج تحميل زائد الحديد في الفئران عبر حقن الحديد دكستران داخل الصفاق. مقارنة بمجموعة الضابطة، زادت مستويات الحديد في المصل في مجموعة النموذج بشكل ملحوظ (p<0.05) (الشكل 1A). كشفت الدراسة النسيجة عن ترسيب ملحوظ للحديد في أنسجة البنكرياس، كما يظهر من خلال تلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين والتلوين الأزرق البروسي. علاوة على...

المناقشة

يعد استقلاب الجلوكوز غير الطبيعي مضاعفة شائعة وخطيرة لدى مرضى β-TM، وغالبا ما تظهر على شكل IGT أو DM. في هذه الدراسة، وجدنا أن فرط الحديد أدى إلى إصابة البنكرياس وخفض بشكل كبير تعبير lncRNA MEG3 في أنسجة البنكرياس، مصحوبا بزيادة الاستماتة المبرمجة في خلايا β الجزر الصغيرة. علاوة على ذلك، أدى تعطيل MEG3 في خلايا MIN6 إلى تعزيز موت الخلايا β وكان مرتبطا بتنشيط NF-ĸB، مما يشير إلى وجود علاقة ميكانيكية محتملة بين MEG3 وخلل الخلايا β الناتج عن زيادة الحمل الحديدية. تشير هذه النتائج إلى أن MEG...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1M Tris-HCL (pH=6.8)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T1020
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
6×DNA Loading Buffer	TIANGEN	GH101-01
6×DNA Loading Buffer	TRANS	GH101-01
-80ºC refrigerator	BIOBASE	BDF-86V348
ABI 7500 real-time PCR system	Applied Biosystems, USA
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit	MULTI SCIENCES	AP101-100-kit
BCA Protein Assay Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.	E-BC-K318-M
Biopulverizer	biospec
BSA	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A8020
C57BL/6J male mice	Gempharmatech Co,Jiangsu,China
CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit	KeyGEN BioTECH	KGA317
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
DMEM	KeyGEN BioTECH
Flow cytometry	ACEA Biosciences, USA	NovoCyte 2060R
Fluorescence PCR instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai
Glycine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	G8200
High-capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Servicebio	GB23301	1/2000
HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Servicebio	GB23303	1/2000
Human LncRNA Array V5.0	Arraystar,Rockville, Maryland, USA
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
Microarray scanner	Agilent Technologies,California, USA
MIN6 cell	procell	KGM12800N
Mini-Bead-Beater-16	biospec
Mouse Anti-GAPDH	TransGen Biotech	HC301	1/2000
NanoDrop spectrophotometer	NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA	ND-2000
PAGE Pre-Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A1010
Primers	Generay Biotech,Anhui, China
PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	CWBIO,Jiangsu, China
PVDF	Millipore	IPVH00010
Rabbit Anti Bax	proteintech	50599-2-ig	1/5000
Rabbit Anti Bcl-2	abcam	ab194583	1/1000
Rabbit Anti Caspase3	abcam	ab184787	1/2000
Rabbit Anti P65	abcam	ab32536	1/8000
Rabbit Anti p-P65	Affinity	af2006	1/1000
TB Green Premix Ex Taq II	TaKaRa, Japan
TRIzol	Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA
TRIzol reagent	CWBIO,Jiangsu, China
Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai	Chemi DocTM XRS+
Ultraviolet spectrophotometer	NanoPhotometer	NP80