يسبب الأكونيتين ضررا عضليا في القلب لدى الفئران مرتبطا بتنشيط مسار الإشارات JNK1/2

ملخص

بحثت هذه الدراسة في الدور المحتمل لإشارات JNK1/2 في تلف عضلة القلب الناتج عن الأكونيتين في الفئران. ارتبط زيادة فسفرة JNK1/2 بتلف عضلة القلب، بينما خفف التثبيط الدوائي لمسار JNK جزئيا من تلف عضلة القلب، مما يشير إلى أن إشارات JNK قد تشارك في سمية القلب الناتجة عن الأكونيتين.

الملخص

يمكن أن يسبب التسمم الحاد بالأكونيتين (Acon) اضطراب نظم القلب وتلف عضلة القلب؛ ومع ذلك، لا تزال الآليات الأساسية غير واضحة. بحثت هذه الدراسة في آلية إصابة عضلة القلب الناتجة عن تسمم الأكون الحاد. تم إنشاء نموذج فئران (n = 51) للتسمم الحاد بالأيكون عن طريق الإعطاء داخل المعدة. تم استخدام التتبع الكهربائي للقلب لتسجيل التغيرات في إيقاع القلب. تم إجراء صبغة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (HE) وصبغة ماسون لتقييم إصابات عضلة القلب المرضية وترسيب الكولاجين. تم اكتشاف مستويات تعبير إنزيمات القلب والبروتينات في الدم الوريدي باستخدام مجموعات اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA). تم دراسة علاقة الهيكل بالنشاط بين Acon ومسار JNK من خلال الالتحام الجزيئي. تم اكتشاف مستويات التعبير لبروتينات كيناز C-Jun N-terminal 1/2 (JNK1/2) المفسفرة بواسطة البلويت الغربي. في هذه الدراسة، لوحظت اضطرابات نظم البطين في الفئران بعد إعطاء أكون داخل المعدة. أظهر نسيج عضلة القلب ترتيبا غير منتظم لألياف وخلايا عضلة القلب، مصحوبا بترسب غير طبيعي للكولاجين. أشارت نتائج الالتحام الجزيئي إلى تفاعلات محتملة بين Acon وJNK1/2. وفي الوقت نفسه، زادت مستويات تعبير الإنزيمات والبروتينات القلبية، بالإضافة إلى JNK1/2 المفسفر، بشكل ملحوظ. أظهرت دراسات إضافية أن العلاج بمثبط JNK SP600125 عكس جزئيا إصابة عضلة القلب الناتجة عن Acon في الفئران. تشير هذه النتائج إلى أن فسفرة JNK1/2 تشارك في تطور إصابات عضلة القلب الناتجة عن تسمم الأكونيتين الحاد. تشير النتائج إلى أن تنشيط مسار الإشارة JNK1/2 يساهم في تلف عضلة القلب الناتج عن الأكونيتين، وأن تثبيط مسار JNK1/2 قد يخفف من إصابة عضلة القلب الناتجة عن تسمم الأكونيتين الحاد.

المقدمة

الأكون هو مستخلص طبيعي من قلويد الديتربين من نبات الأكونيتوم من عائلة رانونكولاسيا. له ^{تأثيرات} مضادة للالتهابات ^1,2، مسكنة، مضادة للأورام، مضادة للروماتيزم، أيض المناعة، وتعزيز الدورة ^{الدموية}. ومع ذلك، فإن الاستخدام غير المناسب أو المفرط للمستحضرات التي تحتوي على أكون قد يؤدي إلى حالات تسمم شديدة. تشمل الأعراض الناتجة عن تسمم الأكونيتين أعراض القلب⁶، والأعراض العصبية⁷، والأعراض الهضمية⁸. في السنوات الأخيرة، وردت تقارير متكررة حول العالم عن حالات تتعلق بتسمم الأكونيت أو الوفاة ^9,10,11. يظهر تسمم الأكون بشكل رئيسي في الجهاز القلبي الوعائي، والجهاز العصبي، والجهاز الهضمي. من بينها، السبب الرئيسي للوفاة بسبب التسمم هو السمية القلبية. الضرر القلبي الذي سببه آكون خطير جدا؛ على وجه الخصوص، فإن بداية متلازمة المرض القصيرة تجعل من الصعب إجراء العلاج السريري في الوقت المناسب. عادة ما يسبب التسمم الحاد بالأكون الغثيان، والإسهال، والدوار، وألم الصدر، وضيق التنفس، وأعراض أولية أخرى^{خلال بضع} ساعات. في الوقت الحالي، لا تزال الآلية التفصيلية لتلف عضلة القلب الناتجة عن تسمم الأيكون الحاد غير واضحة، ولا توجد أدوية فعالة سريريا يمكنها تخفيف تلف عضلة القلب الناتجة عن تسمم الأكون^12,13.

الضرر الناتج عن تسمم الأيكون الحاد الذي قد يسمح باستكشاف آلية تلف عضلة القلب قد يوفر وسيلة مهمة لتحقيق يعتمد على الزمن. قد يكون لهذا النموذج إمكانية علاج مستقبلي للمرضى المصابين بتسمم الأكون الحاد، وقد يمنع تطور المتلازمة مبكرا. تكهنت الدراسات بدور مسار الإشارة من كيناز الطرف n-c-Jun (JNK) في الاستجابة المناعية للسموم. مسار إشارة JNK هو أحد مسارات إشارة كيناز البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK). تمتلك عائلة JNK ثلاثة جينات (JNK1/MAPK8، JNK2/MAPK9، و JNK3/MAPK10). يمكن التعبير عن JNK1 وJNK2 في معظم الأنسجة، بما في ذلك القلب، بينما يوجد JNK3 بشكل رئيسي^{في الدماغ}، ويرتبط بشكل رئيسي بالإجهاد التأكسدي والاستجابة الالتهابية للخلايا¹⁵. وجدت الدراسات أن مسار الإشارات الذي يعبر عنه JNK يلعب دورا مهما في إصابة نقص التروية/إعادة تروية الدماغ وعضلة القلب^16,17. إعطاء C66 يخفف التهاب عضلة القلب الناتج عن النظام الغذائي عالي الدهون عن طريق تثبيط تنشيط JNK في قلوب الفئران¹⁸. يخفف حمض الكلوروجينيك من إصابة خلايا عضلة القلب الناتجة عن TNF-α عن طريق تثبيط إشارة JNK¹⁹. يخفف بينوسيمبرين من تلف عضلة القلب الناتج عن LPS والاستجابة الالتهابية عن طريق تثبيط مسار الإشارة p38/JNK MAPK، ويخفف من اضطرابات القلب^{واضطراب} نظم القلب. تشير هذه الدراسات إلى أن التغيرات في إشارات JNK، وخاصة JNK1/2، مرتبطة ارتباطا وثيقا بتلف عضلة القلب. وفي الوقت نفسه، تعد JNK أيضا هدفا لاحقا لشركة Acon لسلسلة من الأنشطة. وجدت إحدى الدراسات أن الجرعات العالية من التعرض لأكون يمكن أن تتوسط مسار تنشيط إنزيم JNK، مما يسبب سمية تطورية في أجنة سمك الزرد (اليافع) مثل قصر طول الجسم، وشكل الجسم المنحني، وعيوب تطور الدماغ²¹. تشير هذه الدراسة إلى أن Acon قد ينشط مسار إشارة JNK. ومع ذلك، فإن دور مسار إشارات JNK في تلف عضلة القلب الناتج عن تسمم الأكونيتين الحاد غير واضح.

أسست هذه الدراسة نموذجا للفئران لتسمم الأيكون الحاد لتلف عضلة القلب من خلال تحديد جرعات وفترات زمنية داخل المعدة. علاوة على ذلك، استكشفنا تأثير الأيكون على مستوى فسفرة JNK1/2 في عضلة القلب وتنشيط مسار الإشارة JNK في هذا النموذج. استكشاف دور فسفرة JNK1/2 في إصابات عضلة القلب في الفئران الناتجة عن تسمم الأكون الحاد يوفر أساسا نظريا لدراسة تلف عضلة القلب الناتج عن التسمم الحاد بالأكون.

البروتوكول

تمت الموافقة على تصميم التجارب التجريبية وخطة التنفيذ من قبل لجنة التجارب الحيوانية في جامعة كونمينغ الطبية للموافقة عليها (رقم الموافقة: Kmmu20220652) في 06/2022. تم تنفيذ جميع الخطط التجريبية وفقا ل "إرشادات التجارب الحيوانية لجامعة كونمينغ الطبية". قائمة جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

تحذير: بسبب السمية العالية لجهاز Acon، تم إجراء جميع إجراءات التحضير والإدارة وفقا للوائح السلامة المختبرية المؤسسية. كان الأفراد الذين يتعاملون مع أكون يرتدون معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعاطف المختبر والأقنعة، وتم تنفيذ إجراءات التحضير لأكون مع الاحتياطات المناسبة لتقليل خطر التعرض. تمت مراقبة الحيوانات عن كثب أثناء وبعد إعطاء Acon للكشف عن علامات السمية الشديدة والمعاناة، وتم تطبيق نقاط إنسانية عند الضرورة لتقليل المعاناة. تم التخلص من النفايات البيولوجية والمواد الملوثة بأكون وفقا للوائح السلامة الحيوية المؤسسية.

علاج الحيوانات

تم تربية ذكور البالغين من فئران سبراج-داولي (SD) (عمرها شهران، وزنه 230 جرام) في مبنى تجارب الحيوانات SPF، مركز الحيوانات التجريبية، جامعة كونمينغ الطبية. تم التعامل مع ظروف تغذية جميع فئران SD وفقا لمتطلبات التغذية لفئران SPF. تم تربيتهم تكيفا لمدة أسبوع وصوم لمدة 12 ساعة قبل التجربة. تم إذابة الأكون في محلول مؤقت أسيتات بحجم 0.05 متر (Acet)، وتم تقسيم فئران SD إلى 4 مجموعات وفقا لمبدأ التحكم العشوائي: المجموعة 1 (Acon-1 mg) أعطيت 1mg/kgAcon بواسطة الجافاج؛ المجموعة 2 (Acon-2 ملغ) أعطيت 2 ملغ/كجم أكون عن طريق المعدة؛ المجموعة 3 (أسيت)، تم إعطاؤها 2 مل من الأسيتات 0.05 M مع التخزين داخل المعدة؛ والمجموعة 4 (ضابطة، دون تطبيق علاج). تم جمع العينات بعد 1 و3 و6 ساعات بعد الإعطاء داخل المعدة. تمت دراسة ما مجموعه 36 فأرا، حيث 3 فأر لكل مجموعة بمعدل ساعة واحدة، و3 ساعات، و6 ساعات. في كل نقطة زمنية محددة، كانت تنفذ تسجيلات تخطيط القلب لأول مرة. بعد ذلك، تم تخدير الفئران، وجمعت عينات دم لتحليلها الكيميائي الحيوي في المصل. بعد جمع الدم، تم التضحية بالفئران، وتم استئصال نسيج القلب بسرعة. تم تثبيت أجزاء من نسيج عضلة القلب للتحليل النسيجي (تلوين HE وماسون)، بينما تم تخزين الأنسجة المتبقية لتحليل تعبير البروتين بواسطة Western blotting. في التجارب التي اختبرت منشطات ومثبطات JNK1/2، سيتم تقسيم فئران SD إلى 5 مجموعات وفقا لمبدأ التحكم العشوائي: تلقت مجموعة النموذج إعطاء 2 ملغ/كغ من الأكون داخل المعدة، وتلقت مجموعة المثبط حقنة داخل الصفاق بجرعة 6 ملغ/كغ SP600125²² في البداية، تليها 2 ملغ/كغ أكون بمقدار الغافي بعد ساعتين. تلقت مجموعة المنشآت في البداية حقنة داخل الصفاق بجرعة 0.1 ملغ/كغ من أنيسوميسين (أنيس)^23،24، تلتها 2 ملغ/كغ أكون بمقدار الغافاج بعد ساعتين. تلقت مجموعة DMSO حقنا داخل الصفاق بمقدار 2 مل من محلول DMSO المذيب المختلط بنسبة 0.8٪. لم تلق مجموعة الضابط أي علاج. تمت دراسة ما مجموعه 15 فأرا. تم تحليل جميع نتائج التلوين بطريقة عمياء لتقليل التحيز الرصدي. خلال فترة التجارب، تم مراقبة الفئران باستمرار للتأكد من حالة البقاء وعلامات السمية الشديدة بعد إعطاء الأكونيتين. تم تسجيل الوفاة في كل نقطة مراقبة محددة (ساعة واحدة، 3 ساعات، و6 ساعات). كان يعرف الموت بأنه توقف كامل للتنفس ونبضات القلب. الحيوانات التي تظهر ضائقة شديدة، بما في ذلك ضيق التنفس المستمر، فقدان رد فعل الاستقامة، عدم القدرة على المشي أو حالة ميتة، اعتبرت قد وصلت إلى نقاط إنسانية وتم إعدامها فورا تحت التخدير العميق لتقليل المعاناة. عدد الوفيات لكل مجموعة من الفئران (الجدول 1–4).

تتبع تخطيط القلب الكهربائي للفئران (ECG)

تم تعريض الفئران في كل مجموعة لتتبع تخطيط القلب (ECG). كانت الطريقة المحددة كما يلي: بعد التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق لبنتوباربيتال الصوديوم بجرعة 30 ملغ/كغ. كانت الفئران مثبتة في وضعية الاستلقاء على لوحة التجارب الحيوانية. تم توصيل الحاسوب بنظام استحواذ وتحليل الإشارات البيولوجية BL-420N، وتم إدخال سلك ECG في منفذ الإدخال ثلاثي القنوات لنظام BL-420N. تم إدخال الدبابيس تحت الجلد في الجانب الداخلي من الطرف الأمامي الأيمن، والطرف الخلفي الأيمن، والطرف الخلفي الأيسر للفئران. تم نقع الدبابيس وتعقيمها بنسبة 75٪ كحول قبل العملية، وتم التأكد من إدخال الدبابيس في العضلات. ثم تم توصيل مشابك أقطاب سلك الرصاص ECG بدبابيس كل طرف. تم تفعيل مفتاح الطاقة وبرمجيات النظام لنظام اكتساب وتحليل الإشارات البيولوجية BL-420N. تم اختيار القناة 3 لاكتساب الإشارة، وتم تعيين نوع الإشارة كجهاز تخطيط قلب الفئران. تم تعيين المعايير كما يلي: معدل أخذ العينات، 1 كيلوهرتز؛ المدى، 2.0 ميلي فولت؛ ثابت الزمن (ترشيح عالي التمرير)، 200 مللي ثانية (0.80 هرتز)؛ ترشيح منخفض المرور، 100 هرتز؛ سرعة المسح الضوئي، 200.0 مللي ثانية/ديف؛ وتم إيقاف فلتر الشقوق 50 هرتز. تم تسجيل تخطيط القلب في الرصاص الثاني، ولوحظت تغييرات في تخطيط القلب. بعد أن أصبح تخطيط القلب مستقرا، تم إجراء المراقبة والتسجيل لمدة 3 دقائق، وتم حفظ البيانات من قبل مجموعات للتحليل لاحقا. بعد تسجيل تخطيط القلب الكهربائي، تمت إزالة مشابك الأقطاب والدبابيس، وأعيدت الفئران إلى أقفاصها. تم تدفئة الفئران، ومراقبة تنفسها حتى التعافي الكامل من التخدير لمنع الموت المرتبط بالاختناق. تم إجراء تسجيلات تخطيط القلب الأساسية في اليوم الأول قبل أي علاج. في اليوم الثاني، تم إعطاء الفئران دواء Acon عن طريق التشويش داخل المعدة، وأجريت تسجيلات تخطيط القلب بعد ساعة و3 ساعات و6 ساعات بعد الإعطاء باستخدام نفس الإجراء.

صبغة الهيماتوكسيلين وإيوزين (HE) وتلوين ماسون

تم قطع القلوب عند مستوى المحور الأفقي القصير، وتم جمع أنسجة القلب من قمة القلب لفئران SD وتثبيتها في 4٪ بولي فورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. تم تجفيف الأنسجة المثبتة، وتنظيف الزيلين، وغرس في شمع البارافين. ثم تم صبغ الأقسام (بسماكة 4 ميكرومتر) بصبغ HE وماسون وفقا للإجراءات القياسية. في التلوين ب HE، تم إجراء صبغ الهيماتوكسيلين لمدة دقيقتين، ثم نقع العينات في ماء دافئ لمدة دقيقة واحدة، ثم تم تلوين الإيوسين لمدة 30 ثانية. في تلوين ماسون، تصبغ بمحلول هيماتوكسيلين الحديد من ويغرت لمدة 5 دقائق، ثم بمحلول ماسون الأزرق لمدة 3–5 دقائق، وأخيرا بمحلول أزرق أنيلين لمدة 1–2 دقيقة. تمت ملاحظة الشرائح تحت مجهر بصري عادي. لكل قسم، تم اختيار خمسة حقول مجهرية غير متداخلة عشوائيا بنفس التكبير، متجنبا الأوعية الكبيرة والشوائب الواضحة. تم حساب نسبة حجم الكولاجين (CVF) باستخدام ImageJ، وفقا للمعادلة (1):

(1)

اختبار التغذية المناعية المرتبطة بالإنزيمات (ELISA)

بعد تسجيل تخطيط القلب الكهربائي، تم تخدير الفئران باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم، ثم أجري عملية فتح البطن في منتصف المسار لجمع الدم الوريدي. تم جمع عينات الدم عن طريق ثقب الوريد الأجوف السفلي باستخدام إبرة جمع دم وريدي ذات مرة واحدة. تم حضن الدم عند 4 درجات مئوية خلال الليل، وجمع المادة الفائقة بعد الطرد المركزي بحرارة 1000 × جرام لمدة 20 دقيقة. تم تحديد تركيزات CK-MB، AST، LDH، cTn-1، وh-FABP باستخدام مجموعة اختبار ELISA. تم إجراء اختبار ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحديد قيم الكثافة البصرية (OD) لكل بئر عند 450 نانومتر، باستخدام قارئ ميكرولوب.

تحليل البلوتينغ الغربي

تم استخراج البروتين الكلي من أنسجة القلب باستخدام مجموعة استخراج البروتين. تم استخدام مجموعة اختبار بروتين BCA لتحديد تركيز البروتين. تم فصل البروتين الكلي (حجم عينة البروتين المراد اختباره 10 ميكرولتر) باستخدام رحلان كهربائي هلام دوديسيل كبريت-بولي أكريلاميد 10٪ ونقله إلى غشاء PVDF، محجوبا في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة. لاحقا، تم حضانة الغشاء خلال الليل بجسم مضاد أولي JNK1/2 (1:500)، p-JNK1/2 (1:1000)، وGAPDH (1:4000). في اليوم التالي، تم غسل جميع الأغشية ب PBST ثلاث مرات، ثم حضنتها بالجسم المضاد الثانوي المناسب (1:5000) لمدة ساعة واحدة. وأخيرا، تم استخدام كواشف التلميض الكيميائي المعززة لاكتشاف الإشارات؛ تم تطبيق المحلول المتطور بشكل متساو باتجاه القطرات على شرائط غشاء PVDF وترك للحضانة لمدة 10 ثوان، تلاها التعريض والتطوير والتصوير. تم قياس شدة نطاق البقع الغربية باستخدام برنامج ImageJ.

التحقق من صحة الالتحام الجزيئي

تم تحميل البنية الجزيئية ثلاثية الأبعاد ل SDF لأكونيتين من قاعدة بيانات PubChem، وتم تحويل بنية SDF إلى بنية mol2 باستخدام برنامج OpenBabel. تم تنزيل أعلى دقة وأطول هياكل بروتينية PDB ل JNK1 وJNK2 من قاعدة بيانات Uniprot وProtein Data Bank. تم إجراء عمليات الهموجة، وإزالة الرابطات، وإضافة الهيدروجين الكاملة على البروتينات الجزيئية الكبيرة، بينما أجريت إضافة هيدروجين كاملة وتحميل إلكترون على مركبات جزيئية صغيرة، وتم تثبيت روابط التواء. أجريت تجارب الالتحام الجزيئي عبر أوتودوك فينا، حيث تم تعريف الارتباط ≤-7.0 كيلو كالوري/مول كدليل على تفاعلات قوية بين الليغاند والبروتين. تم استخدام PyMol لتصوير البنية ثلاثية الأبعاد لمجمع الإرساء، بينما استخدم Discovery Studio لتصوير البنية ثنائية الأبعاد لمجمع الإرساء.

التحليل الإحصائي

تم تكرار جميع التجارب ثلاث مرات بشكل مستقل. تم استخدام GraphPad Prism 8 لتحليل ورسم جميع البيانات إحصائيا. تم عرض جميع البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم استخدام اختبار t للطالب للمقارنات بين مجموعتين. للمقارنات بين مجموعات متعددة في نفس النقطة الزمنية أو تحليلات المسار الزمني داخل نفس المجموعة، تم استخدام تحليل ANOVA أحادي الاتجاه. تم اعتبار النسبة اللي < 0.05 تشير إلى²⁵ ذات دلالة إحصائية.

النتائج

نتائج تخطيط القلب للفئران بعد تراجع Acon Gavage

أظهرت الدراسات السابقة أن التأثيرات السامة للأكونيتين تحدث في المرحلة المبكرة، عادة خلال ساعات بعد الإعطاء^26,27. لذلك، من أجل التقاط الحدوث المبكر وتطور السمية القلبية الحادة خلال هذه الفترة الزمنية، اخترنا ثلاث نقاط زمنية: 1 ساعة، 3 ساعات، و6 ساعات للتجارب. أظهرت نتائج تخطيط القلب أنه بعد ساعة و3 ساعات و6 ساعات من عمل الأكون، لم تحدث اضطرابات نظم في المجموعة الضابطة ومجموعة الآسيت، ولم تكن تغييرات تخطيط القلب واضحة. أصيبت الفئران في مجموعة Acon-1mg بتقلصات مبكرة في البطين وتكبير بطيني مبكر على التوالي، وثلاثية بطينية مبكرة، وتسرع البطين القصير الانفجار، وتسرع البطين أحادي الشكل، وتسرع البطين ثنائي الاتجاه، واضطراب نظم بطيني واحد أو أكثر. أصيبت الفئران في مجموعة Acon-2 mg بتقلصات مبكرة في البطين، واضطراب نظم البطين أو أكثر، بما في ذلك تضخم البطين المبكر، وتسرع البطين القصير الانفجار، وتسرع البطين ثنائي الاتجاه (الشكل 1، الأشكال 1–2 الإضافية). يعزز الأيكون الضرر المرضي لعضلة القلب ويزيد من تلوين الكولاجين في نسيج عضلة قلب الفئران.

تم تقييم نسيج عضلة القلب عن طريق صبغة HE. أظهرت النتائج أنه مقارنة بمجموعة التحكم ومجموعة الآسيت، بعد ساعة و3 ساعات و6 ساعات من علاج الأكون، أظهر نسيج عضلة القلب في فئران SD في مجموعة Acon-1 mg تمزقا جزئيا في ألياف عضلة القلب، وترتيب خلل لخلايا عضلة القلب، واتساع العضلة القلبية، وتحدث الوذمة في العضلة القلبية. معظم خلايا عضلة القلب متورمة، والنوى ملونة بعمق ومكثفة، وعدد كبير من خلايا عضلة القلب تتعرض للتنكس، وتتكون الفقاعات المستديرة في السيتوبلازم الليفي العضلي القلبي (المشار إليها بالسهام). كانت الخطوط العضلية في نسيج عضلة القلب لدى فئران SD في مجموعة Acon-2 mg غير واضحة أو اختفت؛ كان ترتيب حزم العضلات مرتخيا وغير منظم، وتوسع المساحات العضلية، وكانت عدد كبير من نوى الخلايا ملطخة بعمق، وتكس البكنويات النووية، والوذمة بين الخلايا، وخلايا عضلة القلب متورمة ومتدهورة. أظهر السيتوبلازم لألياف عضلة القلب فجوات دائرية (موضحة بالسهام) (الشكل 2A، الشكل التكميلي 3A، الشكل 4A الإضافي).

تم إجراء تلوين ماسون لتقييم ترسيب الكولاجين في نسيج عضلة القلب. في مجموعتي التحكم والآسيت، أظهرت خلايا عضلة القلب شكلا طبيعيا، مع لوحظ أقل من ترسيب الكولاجين في منطقة عضلة القلب. في مجموعة Acon-1 ملغ، لوحظت زيادات طفيفة في الكولاجين الملون باللون الأزرق في بعض المناطق البينية. في مجموعة Acon-2 ملغ، توزعت مناطق أكثر تطورا باللون الأزرق في جميع أنحاء نسيج عضلة القلب، مصحوبة بترتيب غير منظم في خيوط عضلة القلب واضطراب في البنية الطبيعية لعضلة القلب. كان مدى تلوين الكولاجين في مجموعة Acon-2 mg أكبر من مجموعة Acon-1 ملغ. أظهر التحليل الكمي أن نسبة حجم الكولاجين (CVF) زادت بشكل ملحوظ في كل من مجموعتي Acon-1 ملغ وAcon-2 ملغ مقارنة بمجموعتي التحكم والأسيت (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05). ومن الجدير بالذكر أن قيمة CVF وصلت إلى أعلى مستوى لها في مجموعة Acon-2 ملغ بعد 6 ساعات من الإعطاء داخل المعدة (الشكل 2B، الشكل 3B الإضافي، الشكل 4B الإضافي). وبالنظر إلى فترة الملاحظة القصيرة (1–6 ساعات)، فمن المرجح أن تعكس هذه النتائج تغيرات حادة في النسيج الخلالي، مثل الوذمة أو تغيرات في أنماط صبغ الكولاجين، بدلا من تليف عضلة القلب المعروف. بالإضافة إلى ذلك، لم يكن هناك فرق ذو دلالة إحصائية في وزن القلب بين المجموعات عند ساعة واحدة، 3 ساعات، و6 ساعات بعد علاج Acon-1 ملغ أو Acon-2 ملغ (الجدول 5).

يعزز الأيكون إنزيمات القلب ومستويات البروتين القلبي في دم الفئران الوريدي

لتقييم تلف عضلة القلب الناتج عن Acon، قمنا بقياس مستويات مؤشرات إصابة القلب في المصل، بما في ذلك CK-MB، AST، LDH، cTn-I، وh-FABP. مقارنة بمجموعتي الضابطة وACET، أظهرت مجموعتا Acon-1 mg و Acon-2 mg زيادة ملحوظة في مستويات CK-MB، AST، LDH، cTn-I، وh-FABP عند 1 ساعة و3 ساعات و6 ساعات (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05). علاوة على ذلك، في نفس الوقت، كانت الزيادات في هذه العلامات أكثر وضوحا في مجموعة Acon-2 mg مقارنة بمجموعة Acon-1 mg (p < 0.05) (الشكل 3).

نتائج الالتحام الجزيئي

ولدراسة تأثير الأكون بشكل أعمق على مسار الإشارة الناتج عن تلف عضلة القلب في الفئران، استخدمنا الالتحام الجزيئي لتحديد بروتينات المسارات المرتبطة بالأكون. أظهرت نتائج الالتحام أن Acon يمكنه الارتباط بشكل مستقر بالجيوب النشطة لكل من JNK1 وJNK2 من خلال تفاعلات غير تساهمية متعددة. في JNK1، شكل الأكونيتين رابطتين هيدروجينيتين تقليديتين مع ALA267 وSER299، بمسافات روابط 2.0 أونغرومية و2.1 أونغروميت على التوالي، مما يشير إلى تفاعلات اتجاهية قوية تساهم في تثبيت الليجند. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت تفاعلات واسعة بين الأكونيتين وبقايا الرواتب المحيطة، مما سهل التكامل المكاني الوثيق داخل جيب الربط. التفاعلات الكارهة للماء، بما في ذلك تفاعلات الألكيل/π-ألكيل مع ILE304، زادت من استقرار الليجند داخل البيئة الدقيقة الكارهة للماء. كما تم تحديد روابط الكربون-الهيدروجين، مما شكل شبكة تفاعل تعاونية تدعم ارتباط الروابط (الشكل 4A–C). في JNK2، شكل الأكونيتين رابطة هيدروجينية تقليدية واحدة مع LEU302 (2.1 Å)، وكانت تعمل كتفاعل تثبيت رئيسي. مماثل ل JNK1، ساهمت تفاعلات فان دير فالس، والتفاعلات الكارهة للماء، وروابط الكربون-الهيدروجين مجتمعة في استقرار مركب الليغاند-البروتين (الشكل 4D–F). يتم الإبلاغ عن نتائج الإرساء للمركبات المختبرة كدرجات ربط (كيلو كالوري/مول) وتعرض في الجدول 6. بشكل عام، وفرت الروابط الهيدروجينية خصوصية وتثبيت المواد، وزادت التفاعلات الكارهة للماء من تضمين الروابط والارتباط في الرابط، وساهمت تفاعلات فان دير فالس في الاستقرار المعقد بشكل عام. تشير هذه النتائج إلى أن الأكونيتين يمكنه تكوين مركبات مستقرة مع كل من JNK1 وJNK2، مما يدعم إمكانياته كعامل استهداف.

Acon يرفع مستوى فسفرة JNK

ولدراسة تأثير الأكون على مسار إشارات JNK في أنسجة عضلة القلب، تم تقييم تعبير فسفرة JNK1/2 بواسطة الطلاء الغربي. مقارنة بمجموعتي التحكم وACET، أظهرت مجموعتا Acon-1 mg و Acon-2 mg زيادة ملحوظة في مستويات p-JNK1/2 (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05). علاوة على ذلك، كان مستوى الفسفرة في JNK1/2 أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة Acon-2 ملغ مقارنة بمجموعة Acon-1 mg (p < 0.05) (الشكل 5A). داخل مجموعة Acon-2 ملغ، أظهرت المقارنات بين نقاط زمنية مختلفة أن مستويات p-JNK1/2 ارتفعت بشكل ملحوظ عند ساعة واحدة، و3 ساعات، و6 ساعات، مع لوحظة أعلى مستوى عند 6 ساعات (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05) (الشكل 5B). استنادا إلى هذه النتائج، تم اختيار مجموعة Acon-2 mg في 6 ساعات للتجارب اللاحقة.

مثبط JNK يخفف من التلف المرضي لعضلة القلب وتلوين الكولاجين في أنسجة عضلة قلب الفئران

ولتقييم الدور التنظيمي لمسار إشارات JNK بشكل أعمق، تم تقييم مستويات التعبير ل p-JNK1 و p-JNK2 في نسيج عضلة القلب بواسطة Western blotting. مقارنة بمجموعتي التحكم وDMSO، أظهرت مجموعة Acon زيادة ملحوظة في مستويات التعبير ل p-JNK1 و p-JNK2 (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANO أحادي الاتجاه، p < 0.05). مقارنة بمجموعة Acon، أظهرت مجموعة Acon+SP600125 انخفاضا ملحوظا في مستويات p-JNK1 و p-JNK2 (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANO أحادي الاتجاه، p < 0.05). وعلى النقيض من ذلك، مقارنة بمجموعة Acon+SP600125، أظهرت مجموعة Acon + Anis زيادة ملحوظة في مستويات التعبير ل p-JNK1 و p-JNK2 (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05) (الشكل 6).

تم التحقيق بشكل أعمق في تأثيرات أنيس SP600125 على تلف عضلة القلب. أظهرت نتائج تلوين HE أنه مقارنة بمجموعة Acon، انخفضت وذمة نسيج عضلة القلب في مجموعة Acon+SP600125، واختفى تورم بعض خلايا عضلة القلب، وأصبح السيتوبلازم الخلوي موحدا. مساحة العضلات ممتلئة، وتصبح المساحة بين العضلات أرق، وبعض ألياف عضلة القلب مرتبة بإحكام ومنظمة، وعدد قليل من أنوية الخلايا ملطخة بعمق، وتظهر السيتوبلازم في ألياف عضلة القلب فجوات دائرية صغيرة، ويتم تخفيف الضرر المرضي لعضلة القلب. مقارنة بمجموعة Acon+SP600125، كانت مجموعة Acon + Anis تعاني من كسور ألياف عضلة القلب، واتساع الفجوات العضلية، وترتيب ألياف عضلة القلب بشكل غير مرتبط، وخلايا عضلة القلب متورمة ومتدهورة، وكان الكروماتين النووي ملطخا بعمق، وحدثت وذمة بين الخلايا (الشكل 7A).

تم إجراء صبغة ماسون لتقييم صبغة الكولاجين في نسيج عضلة القلب. في مجموعة Acon+SP600125، لوحظت مناطق متلوخة باللون الأزرق المعتدل في منطقة عضلة القلب. مقارنة بمجموعة الأكون، كان نسبة حجم الكولاجين (CVF) في مجموعة Acon+SP600125 أقل بشكل ملحوظ، مما يشير إلى تخفيف التغيرات البينية الناتجة عن الأكونيتين. على النقيض من ذلك، في مجموعة Acon + Anis، لوحظت مناطق كولاجينية مصبوغة باللون الأزرق أكثر اتساعا في منطقة الوسط القلبي مقارنة بمجموعة Acon+SP600125، مصحوبة بزيادة كبيرة في CVF (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANVA أحادي الاتجاه، p < 0.05) (الشكل 7B). بالإضافة إلى ذلك، لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في وزن القلب بين المجموعات (الجدول 5). وبالنظر إلى فترة الملاحظة القصيرة (1–6 ساعات)، فإن هذه التغيرات غالبا ما تعكس تغيرات حادة في الوضع، مثل الوذمة أو تغيرات في أنماط صبغ الكولاجين، بدلا من تليف عضلة القلب المعروف. تشير هذه النتائج إلى أن SP600125 يخفف من إصابة عضلة القلب الناتجة عن الأكونيتين، في حين أن الأنيزوميسين يزيد من تفاقم تلف عضلة القلب في هذه الظروف التجريبية.

يخفف مثبط JNK تعبير إنزيمات القلب وبروتينات القلب في مصل الفئران

أظهرت نتائج ELISA أنه مقارنة بمجموعة Acon، انخفضت تعبيرات CK-MB وAST وLDH بشكل ملحوظ في مجموعة Acon + SP600125، بينما زادت تعبيرات CK-MB وAST وLDH بعد تأثير Anis (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05). بالإضافة إلى ذلك، مقارنة بمجموعة الأكون، انخفض تعبير cTn-I و h-FABP بشكل ملحوظ في مجموعة Acon + SP600125 (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05). مقارنة بمجموعة Acon + SP600125، زاد تعبير cTn-I و h-FABP بشكل ملحوظ في مجموعة Acon + Anis (n = 3 فئران لكل مجموعة، ANOVA أحادي الاتجاه، p < 0.05) (الشكل 8A–8B).

توفر البيانات:

جميع البيانات الخام المستخدمة في هذه الدراسة متوفرة في الملفات الإضافية المرفقة بالمخطوطة.

الشكل 1: رسم تخطيط كهربائي القلب لاضطراب نظم القلب في الفئران (بعد 6 ساعات من تأثير الأكون). من الأعلى إلى الأسفل، مجموعة التحكم، مجموعة Acet، مجموعة Acon-1 mg، ومجموعة Acon-2 mg. أنواع اضطرابات نظم القلب في Acon-1mg-A-gavage و Acon-2 mg-A-gavage (حسب ترتيب حدوث اضطراب النظم من الأعلى إلى الأسفل): Acon-1mg-A-gavage: انقباضات بطينية مبكرة؛ تضخم البطين المبكر؛ تسرع البطين ثنائي الاتجاه. Acon-2 mg-A-gavage: انقباضات بطينية مبكرة؛ تضخم البطين المبكر؛ انفجار قصير من تسرع البطين. الاختصارات؛ B-gavage = قبل أكون جافاج؛ A-gavage = بعد Acon gavage. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تلف عضلة القلب وتلوين الكولاجين في نسيج عضلة القلب لدى الفئران يشير إلى تلوين HE وماسون. (أ) تم اكتشاف التغيرات المرضية في نسيج عضلة القلب لدى الفئران بواسطة تلوين HE (السهم الأصفر يشير إلى الفجوات المستديرة التي تشكلت بواسطة خلايا عضلة القلب التالفة); شريط القياس = 100 ميكرومتر. (B) تم اكتشاف صبغة الكولاجين في نسيج عضلة قلب الفئران بواسطة تلوين ماسون؛ المقياس = 50 ميكرومتر. المتوسط ± SD، n = 3. تم حساب جميع قيم P باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. *p < 0.05، **p < 0.01. 40x و400x. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: مستويات CK-MB، AST، LDH، cTn-I، وh-FABP في مصل الفئران أشارت إلى تلف عضلة القلب. (من ال إلى الوراء). تم قياس مستويات CK-MB، AST، LDH، cTn-I، وh-FABP باستخدام مجموعات ELISA. المتوسط±SD، n = 3. تم حساب جميع قيم p باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. *p < 0.05، **p < 0.01. الاختصارات؛ CK-MB = الكرياتين كيناز-MB; AST = إنزيم الأسبارات أمينوترانسفيراز؛ LDH = إناز اللاكتاتات ديهيدروجيناز؛ cTn-I = تروبونين القلب I; h-FABP = بروتين مرتبط بالأحماض الدهنية من نوع القلب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: نتائج الالتحام الجزيئي لأكون مع مسار JNK. (A–B) و (D–E) مخططات التفاعل ثنائية الأبعاد لأكون مع بروتين JNK1/2. (C) و (F) مخططات التفاعل ثلاثية الأبعاد لأكون مع بروتين JNK1/2. الاختصارات؛ JNK = c-Jun-الطرف الشمالي كيناس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: الأكون يرفع مستوى فسفرة JNK. (أ–ب) تم اكتشاف مستويات تعبير p-JNK1/2 و JNK1/2 في أنسجة عضلة قلب الفئران بواسطة الطلاء الغربي. المتوسط ± SD، n = 3. تم حساب جميع قيم p باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. *p < 0.05، *p < 0.01. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: مثبط JNK يثبط فسفر JNK الناتج عن Acon. تم اكتشاف مستويات تعبير p-JNK1/2 و JNK1/2 في أنسجة عضلة قلب الفئران بواسطة الطلاء الغربي. المتوسط ± SD، n = 3. تم حساب جميع قيم p باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. *p < 0.05، **p < 0.01. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: مثبط JNK يخفف من تلف عضلة القلب المرضي وتلوين الكولاجين في الفئران. (أ) تم اكتشاف التغيرات المرضية في أنسجة عضلة قلب الفئران بواسطة تلوين HE (السهم الأصفر يظهر الفجوات المستديرة التي تشكلت بواسطة خلايا عضلة القلب التالفة); المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تم اكتشاف صبغة الكولاجين في نسيج عضلة قلب الفئران بواسطة تلوين ماسون؛ المقياس = 50 ميكرومتر. المتوسط±SD، n = 3. تم حساب جميع قيم p باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. *p < 0.05، **p < 0.01. 40 و400x. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: يخفض مثبط JNK مستويات CK-MB، AST، LDH، cTn-I، وh-FABP في مصل الفئران. (أ–ب) تم اكتشاف مستويات تعبير CK-MB، AST، LDH، cTn-I، وh-FABP بواسطة مجموعات اختبار ELISA. تم حساب جميع قيم p باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. المتوسط±SD، n = 3. *p < 0.05، **p < 0.01. الاختصارات؛ CK-MB = كيناز الكرياتين-MB; AST = إنزيم أمينوترانسفيراز؛ LDH = لاكتات ديهيدروجيناز؛ cTn-I = تروبونين القلب I; h-FABP = بروتين مرتبط بالأحماض الدهنية من نوع القلب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

	التحكم	الأسيت	Acon-1 ملغ	Acon-2 ملغ
فئران	9	9	9	9
عدد وفيات الفئران	0	0	0	0

الجدول 1: عدد وفاة الفئران بعد ساعة واحدة من عمل الأكون. بعد ساعة من إعطاء Acon، لم يمت أي فئران في مجموعة الضابطة، ومجموعة Acet، ومجموعة Acon-1 ملغ، ومجموعة Acon-2 ملغ. (عدد الحيوانات التي تم تضمينها في التحليل النهائي لكل مجموعة كان 3، ولم يتم استبدال الفئران الميتة).

	التحكم	الأسيت	Acon-1 ملغ	Acon-2 ملغ
فئران	9	9	9	9
عدد وفيات الفئران	0	0	0	0

الجدول 2: عدد حالات وفاة الفئران بعد 3 ساعات من عمل الأكون. بعد 3 ساعات من إعطاء الأكون، لم يمت أي فئران في مجموعة الضابطة، ومجموعة الآسيت، ومجموعة أكون-1 ملغ، ومجموعة أكون-2 ملغ. (عدد الحيوانات التي تم تضمينها في التحليل النهائي لكل مجموعة كان 3، ولم يتم استبدال الفئران الميتة).

	التحكم	الأسيت	Acon-1 ملغ	Acon-2 ملغ
فئران	9	9	9	9
عدد وفيات الفئران	0	0	4	4

الجدول 3: عدد حالات وفاة الفئران بعد 6 ساعات من عمل الأكون. بعد 6 ساعات من إعطاء Acon، مات 4 من كل 9 فئران في مجموعة Acon-1 ملغ، و4 من 9 فئران في مجموعة Acon-2 ملغ. (عدد الحيوانات التي تم تضمينها في التحليل النهائي لكل مجموعة كان 3، ولم يتم استبدال الفئران الميتة).

	التحكم	DMSO	أكون	Acon + SP600125	أكون + أنيس
فئران	9	9	9	9	9
عدد وفيات الفئران	0	0	3	1	3

الجدول 4: عدد وفيات الفئران بعد عمل أنيس و SP600125. اختلفت أعداد وفيات الفئران بين مجموعات العلاج المختلفة: في مجموعة Acon-2 ملغ، توفي 3 من كل 9 فئران؛ في مجموعة Acon+SP600125، مات 1 من كل 9 فئران؛ وفي مجموعة Acon + Anis، مات 3 من أصل 9 فئران. (عدد الحيوانات التي تم تضمينها في التحليل النهائي لكل مجموعة كان 3، ولم يتم استبدال الفئران الميتة).

المجموعة	وزن القلب (ج)
التحكم	0.71 ± 0.03
الأسيت	0.73 ± 0.02
Acon-1mg (ساعة واحدة)	0.73 ± 0.06
Acon-2mg (ساعة واحدة)	0.75 ± 0.02
Acon-1mg (3 ساعات)	0.71 ± 0.04
Acon-2mg (3 ساعات)	0.77 ± 0.03
Acon-1mg (6 ساعات)	0.72 ± 0.03
Acon-2mg (6 ساعات)	0.77 ± 0.02
DMSO	0.70 ± 0.03
Acon + SP600125	0.74 ± 0.03
أكون + أنيس	0.75 ± 0.04

الجدول 5: وزن قلب الفئران. لم يكن هناك فرق كبير في وزن القلب بين المجموعات.

الليغاند	JNK1	JNK2
أكون	-7.8 كيلو كالوري/مول	-8.41 كيلو كالوري/مول

الجدول 6: نتائج دراسات الالتحام الجزيئي. درجات الالتحام بين Acon وJNK1 هي -7.8 كيلوكالوري/مول، ودرجات الالتحام بين Acon وJNK2 هي -8.41 كيلوكالوري/مول.

الشكل الإضافي 1: رسم تخطيط كهربائي القلب لاضطراب نظم القلب في الفئران (بعد ساعة واحدة من تأثير الأكون). من الأعلى إلى الأسفل، مجموعة التحكم، مجموعة Acet، مجموعة Acon-1 mg، ومجموعة Acon-2 mg. أنواع اضطرابات نظم النظم في Acon-1mg-A-gavage وAcon-2 mg-A-gavage (حسب ترتيب حدوث اضطراب النظم من الأعلى إلى الأسفل): انقباضات البطين المبكرة؛ تضخم البطين المبكر؛ ثلاثية بطينية خديقة؛ تسارع البطين القصير الانفجاري؛ نبض القلب البطيني أحادي الشكل تسرع القلب; تسرع البطين ثنائي الاتجاه. Acon-2 mg-A-gavage: تسرع البطين ثنائي الاتجاه. الاختصارات؛ B-gavage = قبل أكون جافاج؛ A-gavage = بعد Acon gavage. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: رسم تخطيط كهربائي القلب لاضطراب نظم القلب في الفئران (بعد 3 ساعات من تأثير الأكون). من الأعلى إلى الأسفل، مجموعة التحكم، مجموعة Acet، مجموعة Acon-1 mg، ومجموعة Acon-2 mg. أنواع اضطرابات نظم القلب في Acon-1mg-A-gavage و Acon-2 mg-A-gavage (حسب ترتيب حدوث اضطراب النظم من الأعلى إلى الأسفل): انقباضات البطين المبكرة؛ نوبات قصيرة من تسرع القلب البطيني؛ تسرع البطين ثنائي الاتجاه. Acon-2 mg-A-gavage: انقباضات بطينية مبكرة؛ تسرع البطين ثنائي الاتجاه. الاختصارات؛ B-gavage = قبل أكون جافاج؛ A-gavage = بعد Acon gavage. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: الأيكون يعزز تلف عضلة القلب وتلوين الكولاجين بعد ساعة واحدة من تأثير الأكون. (أ) تم اكتشاف التغيرات المرضية في أنسجة عضلة قلب الفئران بواسطة صبغ HE (ملاحظة: السهم الأصفر يظهر الفجوات المستديرة التي تشكلت بواسطة خلايا عضلة القلب التالفة); المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تم اكتشاف التليف في نسيج عضلة قلب الفئران بواسطة تلوين ماسون؛ المقياس = 50 ميكرومتر. المتوسط ± SD، n = 3. تم حساب جميع قيم p باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. *p < 0.05، **p < 0.01، 40x و400x. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4: الأيكون يعزز تلف عضلة القلب وتلوين الكولاجين بعد 3 ساعات من تأثير الأكون. (أ) تم اكتشاف التغيرات المرضية في أنسجة عضلة قلب الفئران بواسطة صبغ HE (السهم الأصفر يظهر الفجوات المستديرة التي تشكلت بواسطة خلايا عضلة القلب التالفة); المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تم اكتشاف صبغة الكولاجين في نسيج عضلة قلب الفئران بواسطة تلوين ماسون؛ المقياس = 50 ميكرومتر. المتوسط ± SD، n = 3. تم حساب جميع قيم p باستخدام تحليل مستقل أحادي الاتجاه للتباين. *p < 0.05، **p < 0.01. 40x و400x. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يمكن للأكون أن يسبب اضطرابات نظم القلب وتلف عضلة القلب؛ ومع ذلك، لا تزال الآليات الأساسية لتلف عضلة القلب الناتج عن أكون غير واضحة. في هذه الدراسة، تم تأسيس نموذج للفئران لتسمم الأيكون الحاد مع إصابة عضلة القلب بنجاح. أظهرت هذه النتائج أن تنشيط مسار إشارة JNK قد يمثل آلية رئيسية في الضرر العضلي القلبي الناتج عن تسمم الأكون الحاد. على وجه التحديد، كانت مستويات الفسفرة في JNK1/2 مرتفعة بشكل ملحوظ في الفئران التي تعاني من اضطرابات نظم القلب الناتجة عن أكون وتلف عضلة القلب. علاوة على ذلك، فإن تثبيط مسار JNK عكس جزئيا الضرر العضلي القلبي الناتج عن تسمم الأكون الحاد. تشير هذه النتائج إلى أن تنشيط مسار JNK يلعب دورا مهما في نشوء تلف عضلة القلب الناتج عن الأكونيتين.

السبب الرئيسي للوفاة بسبب تسمم الأيكون الحاد هو السمية القلبية. أظهرت دراسات سابقة أنه بعد علاج الأكون، أصبحت ألياف عضلة القلب في الفئران متدهورة وغير منظمة، وتعمق التلوين النووي، وحدث تسرب للعدلات، وظهرت الفجوات الدائرية²⁸. وهذا يتوافق مع نتائج الأبحاث. كشف تلوين HE أن نسيج عضلة القلب في المجموعة التي تم علاجها ب Acon أظهر تغيرات مرضية، بما في ذلك اضطراب ترتيب حزم العضلات، واتساع الفجوات العضلية، وتمزق ألياف العضلات. بالإضافة إلى ذلك، في الظروف الطبيعية، توجد إنزيمات القلب CK-MB، AST، LDH، وبروتينات القلب cTn-I و h-FABP بكميات صغيرة جدا في المصل²⁹. عندما تتضرر خلايا عضلة القلب، تطلق هذه العلامات في الدم بكميات كبيرة^{30، 31، 32، 33.}

تظهر نتائج هذه الدراسة أن CK-MB، AST، LDH، cTn-I، وh-FABP في المصل الوريدي للفئران ضمن مجموعة Acon gavage زادت بدرجات متفاوتة في كل نقطة زمنية للملاحظة. يكون مستوى التعبير أعلى بعد 6 ساعات في الإعطاء داخل المعدة. هذا الاكتشاف يتوافق مع الدراسات^{السابقة 34}. وجدوا أن Acon تسبب في تلف خلايا القلب H9C2 في الفئران ورفع مستويات AST. وفي الوقت نفسه، استخدمت دراسات سابقة Acon لتحفيز تلف عضلة القلب في الفئران لدراسة تأثيرات الترياق على تلف عضلة القلب³⁵. وجدوا أن مستويات LDH وCK-MB في مصل الفئران المعرضة لتلف عضلة القلب كانت مرتفعة. باختصار، تظهر النتائج التجريبية لاكتشاف علامات تلف عضلة القلب في المفاصل أن نموذج الجرذان لتلف عضلة القلب الناتج عن تسمم الأكون الحاد يمكن تأسيسه بنجاح بعد 1 و3 و6 ساعات من إعطاء 1–2 ملغ/كغ من أكون داخل المعدة. تأثير النمذجة ل 2 ملغ/كجم من الأكون بعد الإعطاء داخل المعدة لمدة 6 ساعات هو الأفضل، وهو ما يلبي متطلبات التجارب اللاحقة.

وجدت الدراسات أن تأثير الأكون على قنوات أيونات Na⁺ و Ca²⁺ يؤدي إلى زيادة تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلية، مما ينشط مسار الإشارة P38-MAPK وبالتالي يثير تفاعل سلسلة JNK 36,37,38. تفعيل JNK سيؤدي إلى زيادة تلف عضلة القلب^39,40. وهذا يتوافق مع نتائج هذه التجربة. في هذه الدراسة، وجدنا أن Acon يعزز فسفرة JNK1/2 في خلايا عضلة القلب ويفعل مسار إشارة JNK. يشير هذا إلى أن تنشيط JNK قد يمثل استجابة إشارة لاحقة تساهم في تلف عضلة القلب الناتج عن الأكونيتين. ومع ذلك، تتطلب الآليات الجزيئية والحركية الدوائية التي تقوم عليها تحفيز أكون لفسفرة JNK1/2 مزيدا من البحث.

أظهرت الدراسات أنه عندما يتم فسفرة كمية كبيرة من JNK1/2، يتم تنشيط مسار الإشارة الخاص ب JNK، والذي بدوره يتوسط التعبير غير المسيطر عليه للجينات في نواة خلايا عضلة القلب ويعطل دورة الخلية. يمكن لتثبيط مسار الإشارة في JNK أن يخفف من تلف عضلة القلب^41,42. في نتائج HE، يمكن SP600125 مثبط مسار JNK أن يقلل بشكل كبير من التغيرات المرضية في نسيج عضلة القلب التي يسببها Acon. وفي الوقت نفسه، أظهرت دراسات سابقة أنه في نموذج الفئران لاحتشاء عضلة القلب الحاد الناتج عن ربط الشريان التاجي، زادت بشكل ملحوظ ألياف الكولاجين الملوثة بالزرقاء وترسيب الكولاجين في نسيج عضلة القلب، مصحوبة بتنشيط مسار إشارة JNK. أدى العلاج بالحبيبات التقليدية الصينية إلى تقليل ترسيب الكولاجين في عضلة القلب من خلال تثبيط مسار إشارة JNK^43,44.

في الفئران المصابة بإصابة عضلة القلب السكري، زاد محتوى ألياف الكولاجين (التصبغ الأزرق) ونسبة حجم الكولاجين (CVF) بشكل ملحوظ. وفي الوقت نفسه، تم تفعيل مسار الإشارات الخاص ب JNK. تم الإبلاغ عن أن الإيثانول بجرعة منخفضة يثبط تنشيط مسار JNK، مما يقلل من زيادة ترسيب ألياف الكولاجين وCVF في نسيج عضلة قلب الفئران⁴⁵. في هذه الدراسة، أظهر تحليل الالتحام الجزيئي أن الأكونيتين قد يتفاعل مع JNK1 وJNK2 من خلال تفاعلات غير تساهمية متعددة؛ ومع ذلك، يجب اعتبار هذه النتائج دليلا داعما ولا تشكل دليلا مباشرا على الارتباط الفسيولوجي. علاوة على ذلك، أظهرت التجارب في الجسم أن Acon، كعامل ضغط، رفع من تنظيم فسفرة JNK1/2، مما أدى إلى تنشيط مسار إشارة JNK. ارتبط هذا التنشيط بزيادة ترسيب الكولاجين (التصبغ الأزرق) وارتفاع ارتفاع CVF في نسيج عضلة قلب الفئران، مما أدى في النهاية إلى تلف عضلة القلب. ومع ذلك، فإن إضافة مثبط JNK SP600125 قلل بشكل كبير من التأثيرات السامة ل Acon، مما قلل من زيادة قيمة CVF في أنسجة عضلة القلب. يؤدي تلف عضلة القلب إلى تعطيل سلامة غشاء عضلة القلب الطبيعي وفقدان المحتوى داخل الخلية إلى الفضاء خارج الخلية، مما يظهر بزيادة مستويات إنزيمات عضلة القلب في الدم^46,47. أظهرت هذه النتائج أن زيادة مستويات إنزيمات عضلة القلب في دم الفئران أشارت أيضا إلى أن الأيكون تسبب في تلف عضلة القلب. وفي الوقت نفسه، كانت مثبطات JNK تثبط إفراز إنزيمات عضلة القلب، مما يشير إلى أن مثبطات JNK يمكن أن تخفف جزئيا من تلف عضلة القلب الناتج عن Acon.

يجب الاعتراف بعدة قيود لهذه الدراسة. أولا، كان حجم العينة في كل نقطة زمنية صغيرا نسبيا (n = 3 لكل مجموعة)، مما قد يحد من القوة الإحصائية للتحليلات، ولم يتم إجراء تحليل رسمي للقدرة قبل تحديد حجم العينة. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم نطاق جرعة واحد فقط من الأكونيتين وفترات مراقبة قصيرة نسبيا (1–6 ساعات)، مما حد من تقييم التغيرات المرضية طويلة الأمد وعلاقات استجابة الجرعة. ثانيا، رغم أن زيادة فسفرة JNK1/2 والتدخل الدوائي أشارت إلى تورط مسار إشارة JNK في إصابة عضلة القلب الناتجة عن الأكونيتين، إلا أن الآليات العليا التي تربط تعرض الأكونيتين بتنشيط JNK لم تدرس بالكامل. من المعروف أن الأكونيتين يؤثر بشكل أساسي على قنوات Na⁺ المقيدة بالجهد وتوازن Ca²⁺ داخل الخلية، مما قد يساهم في تنشيط JNK في الأسفل في النهاية. ومع ذلك، لم يتم فحص أحداث الإشارة ذات الصلة، بما في ذلك الإجهاد التأكسدي ومسارات فرط الكالسيوم، بشكل مباشر في الدراسة الحالية. ثالثا، قدم تحليل الالتحام الجزيئي أدلة داعمة فقط على التفاعلات المحتملة بين الأكونيتين وJNK1/2 ولم يمثل ارتباطا فسيولوجيا مباشرا. لم يتم إجراء أي تحقق تجريبي إضافي، مثل رنين البلازمون السطحي أو اختبارات السحب للأسفل. علاوة على ذلك، تم دراسة JNK1/2 فقط، بينما لا يزال الدور المحتمل ل JNK3 في السمية القلبية الناتجة عن الأكونيتين غير واضح. وأخيرا، لم يتم إجراء تقييم تخطيط القلب بعد SP600125 أو تدخل اليانسين. لذلك، ما إذا كان تنظيم مسار JNK يؤثر مباشرة على اضطرابات نظم البطين الناتجة عن الأكونيتين يحتاج إلى مزيد من البحث.

باختصار، ينشط Acon مسار إشارات JNK، كما يتضح من زيادة فسفر JNK1/2، مما قد يساهم في تلف عضلة القلب، كما يتضح من زيادة ترسيب الكولاجين وارتفاع إطلاق إنزيمات القلب في نسيج عضلة قلب الفئران. وبالنظر إلى أن السمية القلبية الناتجة عن الأكونيتين تتضمن عدة أحداث في الأعلى، بما في ذلك تنشيط قناة Na⁺، وزيادة الحمل في Ca²⁺، والإجهاد التأكسدي، فقد يمثل تنشيط مسار JNK حدثا رئيسيا في الإشارة في المراحل النهائية يساهم في تلف عضلة القلب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
4٪ بارافورمالديهيد	شركة ووهان سيرفيس-بيو المحدودة.	HJ203501	تثبيت الأنسجة
أكونيتين (Acon)	شركة تشنغدو ديسيتي للتكنولوجيا البيولوجية المحدودة.	DRK-0335-960330	المركب السام لنموذج الجافاج
محلول أزرق أنيلين	شركة بكين سولاربيو المحدودة	G1350	صبغة ماسون
الأنيسوميسين (أنيس)	شركة ميدكيم إكسبريس المحدودة	153154	مفعل/التحكم في مسار JNK
مجموعة AST إليسا	شركة ووهان هوامي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.	CSB-E13023r	اكتشاف إنزيمات القلب
أوتودوك فينا	مفتوح المصدر	لا يوجد	الالتحام الجزيئي
مجموعة اختبار بروتين BCA	سانغون بيوتيك (شنغهاي، الصين)	غير محدد	قياس البروتين
الطرد المركزي	شركة دونغقوان cnzcn المحدودة.	TD5M-WS	1000 مرة ومرة؛ الطرد المركزي G
برمجيات Chem3D	بيركينإلمر	لا يوجد	تقليل طاقة الليغاند
كيك-إم بي إليسا كيت	شركة ووهان هوامي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.	CSB-E14403r	اكتشاف إنزيمات القلب
مجموعة cTn-I ELISA	شركة ووهان هوامي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.	CSB-E08594r	اكتشاف البروتينات القلبية
إبرة جمع الدم الوريدي ذات الاستخدام الواحد	شركة كايندلي المحدودة.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	جمع الدم
كاشف التوألؤ الكيميائي المعزز (ECL)	شركة ميليبور المحدودة.	21302A4	تصور البقعة الغربية
إيوسين	شركة بكين سولاربيو المحدودة	20200905	H& التلوين الإلكتروني
جراف باد بريزم 8	شركة جراف باد سوفتوير	لا يوجد	التحليل الإحصائي
الهيماتوكسيلين	شركة ووهان سيرفيس-بيو المحدودة.	CR2203066	H& التلوين الإلكتروني
مجموعة إلسا h-FABP	شركة ووهان هوامي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.	CSB-E16184r	اكتشاف البروتينات القلبية
برنامج إيمج جي	المعاهد الوطنية للصحة (NIH)	لا يوجد	كمية البقعة الغربية
الأجسام المضادة الأولية JNK1/2	هواآن بيوتكنولوجي (هانغتشو، الصين)	ET1609-42	الأجسام المضادة للنقطة الغربية
مجموعة LDH ELISA	تكنولوجيا شنغهاي الحيوية المرتبطة بالإنزيمات	ml003416	اكتشاف إنزيمات القلب
حل ماسون الأزرق	شركة بكين سولاربيو المحدودة	20220303	صبغة ماسون
قارئ اللوحة الدقيقة	ثيرمو فيشر العلمي	ME001000C	قياس ELISA OD (450 نانومتر)
المجهر البصري (أوليمبوس C33)	أوليمبوس (طوكيو، اليابان)	C33	التصوير الأنسجي
شمع البارافين	Leica  شركة المحدودة.	2110068	تضمين الأنسجة
مخزن PBST	شركة ميلونبيو المحدودة.	MA0015-أبريل-27G2	مخزن الغسيل
p-JNK1/2 الأجسام المضادة الأساسية	هواآن بيوتكنولوجي (هانغتشو، الصين)	ET1601-28	الأجسام المضادة JNK المفسفرة
بنك بيانات البروتين (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	مصدر بنية البروتين
مجموعة استخراج البروتين	سانغون بيوتيك (شنغهاي، الصين)	C510003-0050	استخراج بروتين الأنسجة
قاعدة بيانات PubChem	المعاهد الوطنية للصحة	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	مصدر بنية الليغاند
غشاء PVDF	شركة ميليبور المحدودة.	R1PB81493	غشاء نقل البقعة الغربية
باي مول	شرö دينجر، إنك.	https://pymol.org/	تصور الإرساء
جل SDS-PAGE (10٪)	شركة بكين سولاربيو المحدودة	817X031	الرحلان الكهربائي البروتيني
مسحوق الحليب الخالي من الدسم	شركة بكين سولاربيو المحدودة	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	كاشف حجب (5٪)
الصوديوم بنتوباربيتال	شركة ثيرمو فيشر العلمية	57-33-0	التخدير لإجراءات الحيوانات
SP600125 (مثبط JNK)	شركة ميدكيم إكسبريس المحدودة	112518	مثبط مسار JNK
منشأة إسكان الحيوانات SPF	جامعة كونمينغ الطبية	لا يوجد	ظروف إسكان الحيوانات
جرذان سبراج-داولي (ذكر، شهران، ~230 جم)	شركة بكين هوافوكانغ للتكنولوجيا البيولوجية المحدودة.	http://www.hfkbio.com/	الحيوانات التجريبية (n = 51)
ويغرت آيرون هيماتوكسيلين	شركة قوانغتشو ويكسيس المحدودة.	18092001	صبغة ماسون
زيلين	شركة تيانجين تيجكسج المحدودة	20220208	تنظيف الأنسجة