عزل قوي وتحديد الخلايا النادرة المتداولة عبر الميكروفلويديات الطرد المركزي المستمر والكيمياء المناعية للهيدروجيل

ملخص

تقدم هذه الدراسة سير عمل مستمر للميكروفلويد الطرد المركزي لعزل وتحديد الخلايا النادرة المتداولة بكفاءة. يتيح النظام التحكم الدقيق في السائل ويقلل من فقدان الخلايا، مما يسمح بتحليل متزامن لأنواع فرعية متعددة من CRC، بما في ذلك CTCs وcCAFs، لتحسين دقة التشخيص.

الملخص

تعد الخلايا النادرة المنتشرة (CRCs)، بما في ذلك الخلايا الورمية المتداولة (CTCs) والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان (cCAFs) المنتشرة، مؤشرات حيوية واعدة لتشخيص السرطان وتوقعه. ومع ذلك، فإن وفرة الوفرة المنخفضة جدا وعدم التجانس الظاهري يجعلان العزل الفعال والتحليل متعدد المعلمات تحديا تقنيا. هنا، نقدم سير عمل مستمر للميكروفلويد الطرد المركزي للعزل والتعرف المتسلسل على CRCs من الدم الكامل. تتكون الخرطوشة من خمس غرف مترابطة مع صمامات قابلة للتحكم تتيح التعامل بدقة مع وسط تدرج الكثافة وطبقات الدم أثناء الطرد المركزي. استنادا إلى منصة إثراء تم التحقق منها سابقا، يدمج سير العمل الحالي تثبيت الخلايا المعتمد على الهيدروجيل مع الكيمياء المناعية متعددة الإرسال لدعم تحديد وتوصيف عدة أنواع فرعية من CRC، بما في ذلك CTCs وcCAFs. بعد العزل، يتم تثبيت الخلايا داخل مصفوفة الهيدروجيل لدعم احتفاظ الخلايا أثناء التلوين المناعي المتكرر والتحليل المعتمد على التصوير. باستخدام هذا السير العملي، تم تحديد كل من CTCs وcCAFs من نفس العينة، مما يثبت جدوى التحليل المتكامل لمجموعات الخلايا النادرة المتداولة المتعددة ضمن سير عمل واحد لأخذ خزعة سائلة. توفر هذه المنصة نهجا عمليا وقابلا للتكرار لتوصيف الخلايا النادرة في تطبيقات الخزعة السائلة.

المقدمة

تعرف الخلايا النادرة المنتشرة (CRCs) بأنها خلايا توجد في مجرى الدم بترددات منخفضة جدا مقارنة بالمكونات الطبيعية مثل خلايا الدم الحمراء، وخلايا الدم البيضاء، والصفائح الدموية. تنشأ خلايا CRC من مصادر متنوعة، مثل المنتجات الثانوية للعمليات البيولوجية، أو إعادة تشكيل الأنسجة، أو شفاء الجروح، أو إصابات الأوعية الدموية. تشمل الأمثلة الممثلة خلايا البطانة الدورية، خلايا الجنين المتداولة، الخلايا الميغاكاريوكريوية، الريثروبلاست، ومختلف الخلايا السلفية أو الخلايا الجذعية ^1,2. بينما لا يعكس وجود خلايا CRC وحده حالة مرضية بالضرورة، فإن المستويات المرتفعة غالبا ما تشير إلى حالات فسيولوجية أو مرضية غير طبيعية ^3,4. وبناء عليه، يوفر الكشف الحساس وتوصيف خلايا CRC رؤى قيمة حول العمليات الفسيولوجية والمرضية الديناميكية التي تحدث داخل الجسم.

من بين الأنواع الفرعية لسرطان الكرون، تعد الخلايا الورمية الدورية (CTCs) والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان المنتشرة (cCAFs) علامات حيوية رئيسية للسرطان. توفر CTCs دليلا مباشرا على انتشار خلايا الورم وتدرس على نطاق واسع⁵. غالبا ما ترتبط التغيرات في تعداد CTC بالكشف المبكر، والتشخيص، ومراقبة الاستجابة العلاجية⁶. بالتوازي، تمثل cCAFs مكونات البثوية التي تسقط في مجرى الدم، مما يعكس تفاعلات البيئة الدقيقة مع الورم وتكوين المجوز قبل الانتقال⁷. ومع ذلك، مقارنة بCTCs، لا تزال الأبحاث حول cCAFs محدودة، وفائدتها السريرية بدأت للتو في الاستكشاف^.

قد توفر CTCs وcCAFs معلومات بيولوجية تكميلية في الخزعة السائلة، حيث تعكس CTCs انتشار الخلايا الورمية والصفات النقائلية، بينما قد تمثل cCAFs إشارات إعادة تشكيل العضلات النسبية وإشارات التقدم المرتبطة بالبيئة الدقيقة للورم. لذا قد يدعم التحليل المتزامن لهذين المجموعتين النادرتين المتداولتين فهما أكثر تكاملا لتطور السرطان مقارنة بتحليل أي من المجموعتين فقط. ومع ذلك، فإن فائدتها السريرية والترجمية محدودة بشكل كبير بسبب ندرها الشديد في الدم الطرفي، وغياب العلامات المقبولة عالميا لمتلازمة cCAFs، والتباين الكبير في تعبير العلامات عبر مجموعات الخلايا الفرعية، مما يعيق معا التعرف الموثوق. لذا، فإن تقليل فقدان الخلايا أثناء الإثراء والتعرف أمر بالغ الأهمية لضمان تحليل قوي وموثوق. علاوة على ذلك، فإن التوصيف الشامل للتنوع الوظيفي والمؤشر في CTCs وcCAFs ضروري لتوضيح أدوارها في انتشار الانتشار ولتطوير مؤشرات حيوية ذات معنى سريري ^8,9.

هنا، نقدم طريقة لعزل cCAFs^{وCTCs 10,11} في نفس الوقت، مع التعرف على العلامات المتعددة باستخدام تغليف الهيدروجيل للخلايا النادرة في الكيمياء المناعية (ICC)¹². غالبا ما تواجه طرق عزل CRC الحالية قيودا تقنية، بما في ذلك فقدان الخلايا أثناء المعالجة متعددة الخطوات، وتقييد التقاط الخلايا غير المتجانسة بشكل ظاهري، وتحيز الاختيار المرتبط باستراتيجيات الإثراء المعتمدة على المؤشر. على النقيض من ذلك، تعتمد منصة الميكروفلويدية الطردية المستمرة المستخدمة في هذه الدراسة على إطار إثراء شامل، مما يقلل الاعتماد على مؤشرات الانتقاء الإيجابي التقليدية. تم وصف الأداء التحليلي وسير العمل لمنصة الإثراء الأساسية في دراساتنا السابقة⁹.

استنادا إلى هذه المنصة المثبتة، تركز الدراسة الحالية على دمج تثبيت الخلايا المعتمد على الهيدروجيل والكيمياء المناعية متعددة الخلايا لتمكين العزل والتعرف الشامل على عدة مجموعات خلايا نادرة متداولة، بما في ذلك CTCs وcCAFs، ضمن سير عمل موحد. من خلال الجمع بين التخصيب، واستقرار احتفاظ الخلايا، والتحليل المتكرر المتوافق مع التلوين، يوفر هذا البروتوكول إطارا عمليا لتحليل الخلايا النادرة المتكاملة من عينات الخزعة السائلة.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات التي تشمل عينات دم بشري من المرضى والمتبرعين الأصحاء وفقا لإرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في مستشفى سيفيرانس. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى سيفيرانس (رقم IRB 4-2013-0059). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الجهاز

1. اضغط على مفتاح الطاقة لتشغيل الآلة.
2. شغل مفتاح قفل الليزر ، ثم شغل مفتاح الطاقة بالليزر .
3. شغل برنامج التشغيل وتأكد من أن النظام يهيئ بشكل طبيعي.
4. من الواجهة البرمجية الرئيسية، اختر تشغيل الجهاز واختر البروتوكول المحدد مسبقا لعينات الدم الكاملة القياسية من EDTA.

2. تشغيل الجهاز^{- الخطوة الأولى}

ملاحظة: تفاصيل مواقع المداخل وبنية الخرطوشة موضحة في الشكل 1A.

1. من المدخل 6، أضف 2 مل من المادة A (وسط تدرج الكثافة) إلى الحجرة الأولية.
2. من المدخل 8، أضف 875 ميكرولتر من المادة A إلى غرفة الاستنزاف.
3. ثبت الخرطوشة على رف القرص، لضمان التوازن الصحيح للطرد المركزي.
4. اضغط على زر الباب في CTCeptor لفتح الحامل، ثم ثبت رف القرص على CTCeptor وتثبيته باستخدام براغي التثبيت.
5. اضغط على زر الباب لإغلاق الحامل، ونفذ خطوة Spin Down باستخدام برنامج CTCeptor (حوالي 30 ثانية).
6. بعد التأكد من نقل المادة A إلى الجزء السفلي من الحجرة الأولية، أطلق براغي التثبيت وأخرج رف القرص من الجهاز مع الحفاظ على تركيب الخرطوشة.

3. تشغيل الجهاز^{- الخطوة الثانية}

1. قبل التعامل مع عينات الدم، قم بجميع الإجراءات في خزانة سلامة بيولوجية معتمدة وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، وحماية العين، وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.
2. بعد إزالة الخرطوشة من الآلة، قم بحقن 3 مل من الدم في الحجرة الأولية عبر المدخل 6.
3. قم بتركيب رف الأقراص على CTCeptor وتثبيته باستخدام براغي التثبيت.
4. شغل خطوة إزالة الحمراء الدموية باستخدام برنامج CTCeptor (حوالي 40 دقيقة). خلال هذه الخطوة، يقوم الطرد المركزي بفصل البلازما، وخلايا الدم الأحادية المحيطية، وخلايا الدم الأحادية المحيطية (PBMCs) داخل الخرطوشة، وينقل الجزء الذي يحتوي على PBMC إلى الحجرة التالية لاستنزاف كريات الدم البيضاء لاحقا.
5. بعد الانتهاء من خطوة إزالة RBCs، قم بإزالة رف القرص من الآلة.

4. تشغيل الجهاز^{- الخطوة الثالثة}

1. قم بتعقيم منطقة العمل بعناية للحفاظ على التعقيم.
2. دوامة الكواشف B (خرزات عزل الكريات البيضاء للكرية) لضمان تعليق متجانس.
3. جهز مخزن الغسيل عن طريق خلط DPBS خالية من Ca²⁺^{/Mg مع} 0.1٪ BSA و2 mM EDTA (pH 7.4).
4. نقل الحجم المطلوب من مادة الكاشف B إلى أنبوب بسعة 1.5 مل (على سبيل المثال، 50 ميكرولتر لكل خرطوشة).
5. أضف حاجز الغسيل بحجم خمسة أضعاف حجم المادة B، وامزج بلطف عن طريق التنبيت.
6. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة للسماح للخرزات في المادة B بالتجمع، ثم تخلص من السوبرناتانت بعناية.
7. أعد تعليق الخرزات في مخزن الغسيل بحجم يساوي حجم الخرزة الأولي.
8. خزن الخرزات عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
9. قبل الاستخدام مباشرة، اخلط 50 ميكرولتر من الخرزات المحضرة مع 50 ميكرولتر من DPBS، وحمل 100 ميكرولتر من الخليط في المدخل 7.
10. قم بتركيب رف الأقراص على CTCeptor وتثبيته باستخدام براغي التثبيت.
11. شغل خطوة إزالة ال WBCs باستخدام برنامج CTCeptor (حوالي 50 دقيقة). في هذه الخطوة المبرمجة، يتم خلط خربات عزل الكريات البيضاء المحملة مع الجزء الذي يحتوي على PBMC عن طريق الاهتزاز لتعزيز ارتباط الخرزة بخلايا الدم البيضاء (WBC)، تليها إزالة جزء الكتلة البيضاء المرتبط بالخرزات عن طريق الطرد المركزي.
12. بعد الانتهاء من خطوة إزالة القرص الكبير، قم بإزالة رف الأقراص من الآلة.

5. استعادة العينة

1. أدخل رأس الماصة في المخرج رقم 9 من الحجرة النهائية وأعد تعليق المحتويات، ثم نقل العينة المجمعة إلى أنبوب بسعة 15 مل.
2. حقن 2 مل من DPBS في المخرج 9، شطف الحجرة جيدا عن طريق التنبيه، وانقل الغسيل إلى نفس أنبوب 15 مل.
3. كرر خطوة الغسيل مرتين.
4. اضبط حجم السائل المجمع في أنبوب 15 مل إلى 14 مل باستخدام DPBS، وأغلق الأنبوب، وامزج بلطف عن طريق العكس.
5. قم بطرد مركزي الأنبوب على حرارة 380 × جرام لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. قم بإزالة السوبرناتانت بعناية، تاركا حوالي 1 مل، واستخدم التعليق المتبقي للتحليل في المراحل النهائية.

6. تحديد مراكز CRC

1. لتحضير بوليمر ما قبل الهيدروجيل، اخلط محلول DPBS خالي من Ca^2⁺/Mg^2⁺، ومحلول الكيمياء المناعية للحلقات الهيدرجيلية A (قبل البوليمر)، وبرنامج التصوير الضوئي بنسبة 80:20:1.
2. اخلط 870 ميكرولتر من تعليق CRC مع بوليمر ما قبل الهيدروجيل بسعة 270 ميكرولتر.
3. انقل الخليط إلى غرفة HypICC وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالاستقرار في المنصة.
4. أدخل وحدة التحكم في السماكة في غرفة HypICC لضبط سمك الهيدروجيل.
5. قم بإشعاع العينة بضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) لمدة 20–30 ثانية من الأسفل لربط طبقة الهيدروجيل.
6. قم بإزالة وحدة التحكم في السماكة وغسل الخلايا المغلفة بالهيدروجيل ثلاث مرات باستخدام DPBS.
7. ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام DPBS، كل منها 10 دقائق.
8. قم بنفاذ الخلايا بنسبة 0.05٪ من ترايتون X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام DPBS، كل مرة 10 دقائق.
9. قم بحظر العينات ب 2٪ من BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
10. حضن العينات بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
11. اغسل العينات خمس مرات باستخدام DPBS، كل غسلة لمدة 20 دقيقة.
12. صبغ النوى ب Hoechst لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام DPBS، كل منها 10 دقائق.
13. إذا لزم الأمر، يمكن إجراء حضانة الأجسام المضادة الثانوية في نفس ظروف الليل التي تتم فيها حضانة الأجسام المضادة الأولية.
14. قم بإجراء تصوير مجهر فلوري وتحديد خلايا CRCs.

7. صبغ المناعة متعدد القنوات لمراكز CRC

1. بعد التلوين المناعي والتصوير، يمكن لخلايا CRC أن تخضع لجولة إضافية من تلوين الأجسام المضادة بعد التبريد.
2. جهز محلول تبريد يتكون من 4.5٪ H₂O₂ و24 mM NaOH في PBS.
3. قم بإزالة DPBS من غرفة HypICC وإضافة محلول التبريد.
4. حضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تحت ضوء أبيض مع هز.
5. استبدل محلول التبريد واحتضن لمدة ساعة إضافية تحت نفس الظروف.
6. اغسل العينات أربع مرات باستخدام DPBS لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
7. أعد بدء عملية التلوين المناعي من مرحلة الحجب باستخدام 2٪ BSA.

النتائج

يظهر الشكل 1A صورة لخرطوشة واحدة تستخدم لعزل الخلايا النادرة. تتكون الخرطوشة من خمس غرف منفصلة متصلة بقنوات دقيقة وصمامات قابلة للتحكم تنظم تدفق السائل. هيكل الخرطوشة كالتالي: (1) غرفة بلازما تجمع البلازما المنفصلة عن الدم الكامل؛ (2) حجرة أولية يفصل فيها الدم الكامل إلى طبقات البلازما، وخلايا الدم الحمراء، وطبقات PBMC؛ (3) غرفة خلط حيث يتم دمج PBMCs المعزولة مع خرز عزل الكريات البيضاء (LBC)؛ (4) غرفة استنزاف تزيل الكريات البيضاء (الكريات الميتة)؛ (5) غرفة ن...

المناقشة

تعد CRCs مؤشرات حيوية مهمة ذات قيمة محتملة لكل من تشخيص السرطان وتشخيصه. ومع ذلك، لتحسين الفائدة السريرية لتحليل CRC، من المهم جمع مجموعة أوسع من مجموعات CRC المتنوعة ظاهريا، ودعم التوصيف متعدد المعلمات المتوازي¹³. بالإضافة إلى ذلك، تشير الأدلة المتزايدة في علم المناعة الأورامية إلى أن المكونات المناعية والبيئة الدقيقة للورم تلعب أدوارا حاسمة في تشكيل الاستجابة العلاجية، مما يبرز الحاجة إلى تجاوز المعلومات المرتكزة على الخلايا الورمية وحدها¹⁴

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disc cartridge
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disc rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	density gradient media
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	leukocyte isolation beads
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC chamber
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			Fabricated in-house using a 3D printer
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA
β actin antibody	abcam	ab8226