طريقة محسنة لعزل الظهارة الإحليل في إناث الفأر لتحليل الخلايا الأحادية والتحليل المناعي الفلوري

ملخص

يقدم هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل بطانة الظهارة في إحليل الإناث البالغة من أجل التحليلات اللاحقة، بما في ذلك قياس تدفق الخلية، وصبغ المناعة، وزراعة العضويات. أسفرت الطرق عن خلايا ظهارية إحليل غنية وقابلة للحياة، كما يتضح من تحليل قياس التدفق الخلوي، والتصوير الكامل، وتكوين الأعضاء الفعال.

الملخص

الإحليل، المبطن بخلايا ظهارية، يعمل كقناة لخروج البول من الجسم. تتكون بطانة الإحليل الظهارية من أنواع خلايا مميزة مع توقيعات جينية تدل على أدوار في الدفاع المضاد للميكروبات والمناعة. تمثل البلاعم المقيمة المدمجة في طبقة الظهارة الإحليل نوعا فرعيا مميزا من حيث النسخ يفترض أنه يحمل دورا في مراقبة المناعة وعرض المستضدات. تصعد مسببات الأمراض البولية عبر الإحليل لتصل إلى المثانة. دراسة على بطانة الإحليل الظهارية والخلايا المناعية المرتبطة بها ستسلط الضوء على آليات الدفاع عن العائل في الجهاز البولي السفلي. الهدف المركزي لهذا البروتوكول هو توفير طرق محسنة لتشريح إحليل الفأر الأنثوي وعزل بطانة الظهارة للتحليلات اللاحقة. يصف البروتوكول طريقة محسنة لعزل الأنسجة الظهارية عن إحليل الفأر الأنثوي عن طريق الفصل الإنزيمي والميكانيكي اللطيف. بعد عزل الظهارة، تم وصف طرق الهضم الإنزيمي اللطيف لظهارة الإحليل المعزولة والخلايا المناعية المرتبطة بها للحصول على تعليق خلية واحدة عالية الصلاحية. كما يوضح البروتوكول طرق تحليل التدفق الخلوي لخلايا الظهارة المعزولة في الإحليل والخلايا المناعية المرتبطة بالظهارة. بالإضافة إلى ذلك، تعرض هنا طرق لتوليد عضويات ظهارية ثلاثية الأبعاد طبقية من خلايا ظهارية معزولة. كما يوضح البروتوكول طريقة محسنة لصبغ الصفائح الظهارية في الإحليل بشكل كامل على جهاز المناعة، والتي يمكن استخدامها لملاحظة شكل وتركيب الظهارة الإحليل في الفأر وخلايا المناعة المرتبطة بها. بشكل عام، تتيح الطرق الموضحة هنا لعزل وهضم الخلايا الظهارية في مجرى البول في الخلية الواحدة إجراء تحليلات لاحقة، بما في ذلك التلوين المناعي، وقياس تدفق الخلية، وتوليد العضويات، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

المقدمة

يتكون الجهاز البولي السفلي للفأر (LUT) من جزأين: المثانة والإحليل. خلال المراحل الجنينية، تتطور هياكل LUT من الكلواكا، وهي بنية عابرة مشتقة من الأديم الداخلي تقع في الأمعاء الخلفية الذيلية. الجزء البطني من الحصانة، وهو الجيب التناسلي، يشكل المثانة من الأمام والإحليل من الخلف¹. بطانة المثانة مدروسة بشكل جيد. يشكل حاجزا محكما ضد مكونات البول من خلال لويحات بلورية قمية مكونة من بروتينات اليوروبلاكين^2،3،4. بينما بطانة المثانة هي ظهارة انتقالية، يظهر الإحليل اختلافات في بنية الظهارة من عنق المثانة إلى فتحة الإحليل البعيدة. بالإضافة إلى ذلك، يظهر الإحليل تباينا جنسيا في الهياكل الظهارية والبنية الخلوية. يتكون إحليل الفأر الذكري من ظهارة انتقالية عند عنق المثانة، تليها ظهارة عمودية وطبقية. يحيط مجرى الإحليل الأنثوي بظهارة انتقالية عند عنق المثانة وظهارة متعددة الطبقات غير حرشفية متناثرة بقنوات صغيرة تنتهي بغدد إفرازية نحو الطرف البعيد⁵.

الإناث أكثر عرضة لعدوى المسالك البولية (UTIs)، والتي تسببها البكتيريا الممرضة في المسالك البولية التي تصعد من الأمعاء عبر الإحليل لتصيب المثانة^. الإحليل هو أول سطح في LUT يلامس مسببات الأمراض البولية الصاعدة. وظيفة خلايا الظهارة الإحلالية، وخاصة دورها كحاجز مناعي نشط، لم تدرس بشكل كاف. قدمت أعمال حديثة من نفس المجموعة خريطة مكانية بدقة خلية واحدة للإحليل 5 لأنثى الفأر^{البالغة.} حدد التحليل بطانة إحليل ثلاثية الطبقات مع خلايا قاعدية ومتوسطة وقمة. متداخلة في بطانة الظهارة توجد خلايا عصبية صماء نادرة ^5,7. نحو منتصف الإحليل، تتفرع قنوات صغيرة من الجذع الرئيسي للإحليل، وتنتهي بمجموعات من الغدد الإفرازية، المدمجة في الحجرة البمثيرة للمجرى الشعري. كشفت بيانات النسخ النصي أن الخلايا الطهارية في الإحليل تعبر عن جينات مناعية ومضادة للميكروبات قد تشكل دفاع المضيف⁵. دراسة خصائص وخصائص خلايا الظهارة الإحليل المتعلقة بقدراتها الدفاعية ووظائفها المعدلة مناعيا قد توفر استراتيجيات جديدة لمكافحة التهابات المسالك البولية.

استخدام الفأر لدراسة ظهارة الإحليل يسمح بالدراسات الزمنية والتحقيق في التباين الجنسي. نظرا لتشابه الفأر مع الإنسان من حيث البنية الخلوية للمثانة والإحليل¹، فقد تم استخدام الفأر على نطاق واسع لدراسة التطور الجنيني للمجرى البولي السفلي ^1,8,9. كما تم استخدام الفئران في نماذج الحقن عبر الإحليل لدراسة التهاب المسالك البولية الناتج عن مسببات الأمراض البولية 10,11,12. يصعب الوصول إلى نسيج المسالك البولية السفلية لدى المرضى إلا إذا كانوا يخضعون للاستئصال بسبب السرطان أو اضطرابات أخرى. مصدر نسيج بشري سليم ومتسق يصعب الوصول إليه، ويوفر الفأر نموذجا مفيدا لدراسة الأنسجة في المسالك البولية السفلية لدراسات حول توازن الأنسجة، وإصلاحها، والاستجابة للالتهابات. تتكون بطانة الإحليل الأنثى والإنسان من ظهارة انتقالية عند عنق المثانة وظهارة غير حرشفية وغير مقرحة في الطرف البعيد. يلاحظ الظهارة الحرشفية في الطرف البعيد لإحليل الإناث البشري، رغم أن هناك تباين ملحوظ في بطانة الإحليل الأنثوية البشرية مع عمر ^5,13. على الرغم من أن مقارنات بطانة الإحليل على مستوى الإحليل النسبي لم تجر بين الإحليل البشري والفأر، إلا أن الفأر يمثل نموذجا مفيدا لالتقاط أنماط الظهارة، والتفاعلات الظهارية-المناعية، والاستجابة للعدوى في الإحليل.

في هذه الدراسة، يصف المؤلفون طرق تشريح الإحليل الأنثوي البالغ الكامل، وعزل ظهارة الإحليل، والهضم الإنزيمي اللطيف لتحضير تعليق خلية واحدة. هذا هو أول بروتوكول مفصل لعزل وهضم نسيج الظهارة في مجرى البول لدى أنثى الفأر. ينتج البروتوكول المحسن مجموعة غنية من الخلايا الظهارية ذات الخلية الواحدة التي يمكن استخدامها في تحليلات لاحقة مختلفة. كما هو موضح في الدراسة، أجرى المؤلفون قياس تدفق الخلايا على تعليق خلية واحدة لعزلات خلايا ظهارية الإحليل، مما يثبت وجود خلايا منفردة حية، خاصة ذات طبيعة ظهارية. علاوة على ذلك، تستطيع هذه الخلايا الظهارية إنتاج عضويات في الزراعة ثلاثية الأبعاد، والتي تشبه بطانة الإحليل الطبقية للفأر. كما يثبت المؤلفون تلوينا كاملا لصفائح ظهارية الإحليل لدراسة ارتباط الخلايا المناعية المرتبطة بالظهارة، وخاصة البلعم، مع خلايا ظهارة الإحلال. الطرق الموضحة في هذه الورقة ستساعد في البحث حول بطانة الإحليل ودورها في الدفاع المناعي.

البروتوكول

أجريت جميع الدراسات على الفئران بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوانات المؤسسية (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) ولجنة السلامة الحيوية المؤسسية (inStem/G-141(3)-22/DBJ) في معهد BRIC لعلوم الخلايا الجذعية والطب التجديدي في بنغالور. تم استخدام إناث فئران CD-1 أو C57BL6/J تتراوح أعمارها بين 6-12 أسبوعا، وكانت تقيم في مركز رعاية وموارد الحيوان (ACRC) في المركز الوطني للعلوم البيولوجية (NCBS)، مجموعة علوم الحياة في بنغالور (BLiSC) في هذه الدراسة. تم إيواء الفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ضمن دورة من 12 ساعة مع طعام وماء بالإجازة.

جميع المواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تشريح وجمع إحليل الإناث البالغة في الفأر

1. قم بقتل الفأر باستخدام ثاني أكسيد الكربون_حتى يتوقف الفأر عن التنفس. إجراء خلع عنق الرحم كنوع من القتل الرحيم الثانوي.
2. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء ورش 70٪ إيثانول لترطيب الشعر على البطن (الشكل 1A).
3. ارفع الجلد على البطن باستخدام ملقط وقم بعمل شق عمودي نحو الجزء السفلي من الجسم ينتهي عند فتحة الإحليل الخارجية (الشكلان 1B و 1C).
4. حدد المثانة ورفعها برفق باستخدام الملقط. في بعض الحالات، قد يكون مليئا بالبول. اضغط المثانة بلطف بين الملقط لتفريغها.
   ملاحظة: ستظهر المثانة على شكل بنية منتفخة.
5. قم بقص الدهون والأنسجة الضامة حول المثانة باستخدام مقص نابض صغير لكشف البنية على شكل فراشة حيث تلتقي عظمتا العانة عند التكافل العانة (الشكل 1D). يمر الإحليل تحت التعايش العاني.
6. اقطع عند التكافل العانة عن طريق رفعه بالملاقط وفتحه باستخدام مقص زنبركي صغير (الشكل 1E). قم بإزالة شظايا عظم العانة بحيث يمكن رؤية الإحليل يمتد إلى الأسفل من المثانة (الشكل 1F).
   ملاحظة: سيظهر الإحليل كأنبوب أحمر رفيع يقع على السطح البطني لجدار المهبل (الشكل 1G).
7. اسحب المثانة بلطف للأعلى من تجويف الجسم باستخدام ملقط دقيق وامرر مقصا نابضيا صغيرا بين الإحليل وجدار المهبل لفصل المسالك البولية عن الجهاز التناسلي.
8. حافظ على توتر خفيف على المثانة أثناء القطع على طول الجزء الخلفي من الإحليل لفصله عن جدار المهبل (الشكل 1H–J). اقطع حتى فتحة الإحليل البعيدة للحصول على إحليل الفأر الكامل (1.2–1.5 سم طولا) (الشكل 1K و1L).
9. افصل الإحليل عن المثانة عن طريق عمل قطع واحد في عنق المثانة.

2. عزل النسيج الظهاري الإحليلي

ملاحظة: تم تعديل وتحسين بروتوكول عزل الصفائح الظهارية عن الإحليل من بروتوكول لعزل ظهارة بطانة الرحم¹⁴. يوضح الشكل 2 خطوات لعزل صفائح الظهارة الإحليل عن الحجرة الخصية المحيطة (الشكل 2A).

1. انقل الإحليل المفصول إلى طبق بتريل معقم يحتوي على محلول ملح هانكس المتوازن الطازج (خالي من HBSS، Ca وMg، التفاصيل في الجدول التكميلي 1).
   ملاحظة: يوصى بتجميع 4–5 إحليل في هذه المرحلة لفصل الظهارة وهضم الخلايا الواحدة.
2. تحت مجهر تشريح، قم بقص الدهون والأنسجة الضامة المحيطة بالإحليل باستخدام ملقط دقيق ومقص زنبركي صغير (الشكل 2B).
3. اقطع كل إحليل إلى قطعتين متساويتين الحجم عرضيا وضعه على قمة مصفاة نايلون بحجم 100 ميكرون (الشكل 2C–G).
4. اغسل الأنسجة بتمرير 1 مل من 1x HBSS (خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم) فوق الأنسجة.
5. نقل قطع الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل (MCT) (الشكل 2H) يحتوي على 1 مل من 1٪ تريبسين (1٪ تريبسين، مع 1x sHBSSa، التفاصيل المذكورة في الجدول التكميلي 2).
6. هضم النسيج عن طريق الحضانة لمدة 15–30 دقيقة على جهاز تدوير العينة (30 دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية.
7. بعد الحضانة، قم بإزالة الأنابيب من درجة حرارة 4 درجات مئوية. أضف MgCl₂ (1 M MgCl₂، مخزون معد في 1x HBSS) إلى تركيز نهائي 10 ملليمولار وDNase I (10 ملغ/ملليتر DNase I، مخزون معد في 1x PBS) إلى تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل في نفس الأنبوب مع قطع الأنسجة.
8. انقل الأنبوب إلى فرن هجين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية على مدور عينة ليحتضن لمدة 15–30 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن تعديل أوقات الحضانة للتريبسين عند 4 درجات مئوية و37 درجة مئوية بناء على التطبيق في مرحلة ما بعد التيار. من الأفضل استخدام أوقات حضانة 15 دقيقة للتلوين الكامل والحضانة 30 دقيقة للهضم الخلوي الواحد.
9. انقل الأنسجة إلى MCT بحجم 1.5 مل يحتوي على 10٪ مصل أغنام في 1x HBSS (خالي من الكالسيوم والملغيزيوم) لإخماد نشاط التربسين.
10. نقل أنسجة الإحليل إلى أنبوب جديد يحتوي على 1x HBSS بارد مثلج (خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم). ثم ينتقل إلى طبق بتري معقم يحتوي على 1x HBSS بارد جدا.
11. باستخدام ملقطين دقيقين الرأس، اعصر الظهارة من الإحليل. امسك أحد طرفي قطعة الإحليل باستخدام زوج واحد من الملقط.
12. باليد الأخرى، اضغط على قطعة الإحليل بين شوكات الملقط، وتمرير طول القطعة بالكامل لعصر الظهارة. كرر ذلك لشظايا الإحليل المتبقية في الطبق لعزل الظهارة (الشكل 2I–J).
    ملاحظة: عند الانفصال الميكانيكي، يتم إخراج طبقة رقيقة من النسيج الظهاري الشفاف من تجويف الإحليل. يمكن التعرف على ظهارة الإحليل كشظايا نسيج رقيقة تشبه الصفائح تبدو أفتح لونها (شفافة) من نسيج البمثول. يجب أن تكون العزلات الظهارية قطع نسيج شفافة ورفيعة يمكن نقلها إلى طبق بتري للفروم. يجب ألا تتحلل معزولات الأنسجة بالكامل. إذا تم تفكيك أجزاء الأنسجة بالكامل، يمكن تقليل وقت حضانة التريبسين.

3. الهضم إلى تعليق خلية واحدة

1. انقل قطعا معزولة من الظهارة إلى صحن بتري معقم باستخدام ماصة نقل بلاستيكية صغيرة أو رأس ماصة بسعة 200 ميكرولتر. قم بتقطيع الظهارة إلى شظايا صغيرة باستخدام مقص زنبركي صغير في قطرة 1x HBSS مضافة مباشرة إلى الشظايا (الشكل 2K).
   ملاحظة: يمكن هضم قطع نسيج البثمر المتبقية بعد فصل الظهارة بنفس طريقة الظهارة المعزولة.
2. نقل القطع المفروم باستخدام ماصة إلى محلول MCT بسعة 2 مل يحتوي على 1.5 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) من أكيوتاز. يحتوي محلول الهضم الخاص بأكوتاز على ما يلي: أكيوتاز، 10 ميكرومولار روكي Y-27632، و100 ميكروغرام/مل DNase I.
3. انقل الأنبوب الذي يحتوي على النسيج ومحلول الهضم إلى مدور عينة في فرن تهجين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. حضانه لمدة ساعة.
   ملاحظة: يمكن فحص محتويات الأنبوب للتأكد من نجاح الهضم قبل المضي قدما. الهضم الناجح: ينتشر النسيج المفروم جيدا في محلول الأكوتاز مع وجود قطع قليلة مرئية بعد الحضانة. فشل الهضم: لا تزال قطع الأنسجة الكبيرة موجودة بعد الحضانة في محلول أكيوتاز. يجب تفريم المناديل بأدق درجة ممكنة للهضم الناجح.
4. بعد ساعة واحدة، انقل محتويات 2 مل MCT بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 5 مل وأضف 2 مل من محلول الغسيل (1x PBS بدون كالسيوم والملغيزيوم، مع ألبومين مصل 1٪ البقري).
5. قم بتدوير نظام التعليق عند 600 × g لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية مع دوار دلو متأرجح.
6. استنشق الفائق باستخدام فراغ لطيف وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من محلول الغسيل باستخدام ماصة 1 مل مع طرف فلتر.
7. باستخدام رأس الماصة، قم بتقسيم الحبيبات عن طريق الرش صعودا وهبوطا حتى تصبح الكتل أصغر. مرر نظام التعليق بأربع أشواط عبر إبرة قياس 23 1/2 متصلة بحقنة 1 مل، تليها 4–6 أشواط عبر إبرة قياس 26 1/2 متصلة بحقنة 1 مل.
   ملاحظة: يتطلب الأمر المرور عبر إبرة صغيرة للحصول على تعليق خلية واحدة موحد ومنع تكتل الخلايا. بينما يمكن أن تسبب هذه الخطوة إجهاد القص وموت الخلايا، فقد قام المؤلفون بتحسين عدد الضربات باستخدام الإبرة والحقنة لتوفير تعليق واحد دون موت الخلايا بشكل مفرط. تخطي هذه الخطوة يؤدي إلى ظهور نسبة كبيرة من الخلايا المتجمعة، مما يربك التحليل اللاحق مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وقياس تدفق السيل.
8. أضف 1 مل من مخزن الغسيل لترطيب سطح فلتر ما قبل الفصل بحجم 30 ميكرون موضوع فوق أنبوب بحجم 5 مل. استخدم الحقنة المتصلة بإبرة قياس 26 1/2 لنقل 1 مل من محلول الخلية عبر المصفاة.
9. أضف 1 مل من محلول الغسيل الإضافي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا، ثم خذ هذا المحلول مع الحقنة ومرره عبر الفلتر. الخلايا الحبيبية عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.
10. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل، وأضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC). حضن التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق بالضبط، ثم أضف 4 مل من حاجز الغسيل وأعد تعليق الحبيبة.
    ملاحظة: يوصى بتحلل الدم الحمراء لإزالة خلايا الدم من تعليق خلايا الظهارة في الإحليل. على الرغم من أن هذه الخطوة قد يكون لها تأثير طفيف على بقاء الخلايا الظهارية، إلا أن البروتوكول استخدم محلول تحلل خلايا الدم الحمراء مخفف بمقدار 0.5x وحضانة لمدة 3 دقائق لتقليل فقدان الخلايا والحفاظ على حيوية الخلية.
11. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.
12. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 50–200 ميكرولتر من حاجز الغسيل حسب حجم الكريات.
    ملاحظة: حجم الحبيبات من الأنسجة المأخوذة من 4–5 عينات ظهارية من إحليل الفئران مجتمعة سيكون صغيرا لكنه لا يزال مرئيا بالعين. من الضروري أن تقوم الخلايا بالطرد المركزي باستخدام دوار دلو متأرجح بحيث تتجمع الحبيبات في قاع الأنبوب بدلا من أن تلطخ على الجانب. سجل الباحثون إنتاجية خلايا تتراوح بين 28,000 إلى 34,000 خلية حية لكل ظهارة إحليل للفأر.
13. انقل 5 ميكرولتر من الخلايا إلى MCT بحجم 0.5 مل وأضف 5 ميكرولتر من الأزرق التريباني. قم بمزج وتحميل جهاز قياس الدم لفحص العائد وصلاحية الخلية.

4. تحليل تدفق الخلايا الخلوية لعزلات الخلايا الأحادية في الظهارة الإحليل

1. أليكوت 100,000 خلية في أنبوب طرد مركزي بقطر 5 مل لإجراء صبغ مناعي فلوري لخلايا فردية من الحجرة الظهارية الإحليلي أو الحجرة البثمية لقياس تدفق الخلايا الخلوي. قم بزيادة حجم الأنبوب إلى 4 مل مع 1x PBS.
   ملاحظة: للحصول على نتائج موثوقة باستخدام قياس تدفق الخلية، يوصى بوجود ما لا يقل عن 50,000 خلية لكل عينة.
2. قم بتدوير تعليق الخلية عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.
3. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 50 ميكرولتر من 1x PBS.
4. أضف 50 ميكرولتر من صبغة Ghost 2x بنفسجي 450 (1 ميكرولتر صبغة Ghost في 500 ميكرولتر من 1x PBS) إلى تعليق الخلية للحصول على 100 ميكرولتر من محلول صبغة Ghost 1x.
   ملاحظة: صبغة الشبح V450 هي صبغة تفاعلية مع الأمين يمكن استخدامها للتمييز بين الخلايا الحية وغير الحية في تطبيقات قياس تدفق السيامات.
5. أضف 5 ميكرولتر من محلول حجب مستقبلات Fc (مضاد للفأر CD16/32) لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لمنع ارتباط الغلوبولين المناعي بمستقبلات Fc.
6. حضن تعليق الخلية على الثلج لمدة 25 دقيقة إضافية.
7. قم بتخفيف تعليق الخلية إلى 5 مل باستخدام مخزن تلوين الخلية (1x PBS، 0.02٪ (مع أزيد الصوديوم)، و1٪ (مع الصوديوم/الوزن) BSA، انظر الجدول التكميلي 3). قم بتدوير القرص عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في 100 ميكرولتر من مخزن تلوين الخلية.
   ملاحظة: أزيد الصوديوم سام للغاية. تجنب ملامسة الجلد والعينين والملابس. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل معها.
8. في 100 ميكرولتر من تعليق الخلية، أضف 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المترافقة: مضاد CD326/EPCAM (يصنف الخلايا الظهارية)، مضاد F4/80 (يسميها البلعم في الفئران)، ومضاد CD45 (مؤشر شامل المناعة) عند تخفيف 1:20. حضن تعليق الخلية على الثلج لمدة 30 دقيقة.
9. قم بتخفيف تعليق الخلية إلى 5 مل باستخدام مخزن تلوين الخلايا، ثم قم بالدوران بقوة 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من حاجز تلوين الخلية.
10. انقل تعليق الخلية عبر مصفاة شبكية نايلون بسعة 35 ميكرون على أنابيب فرز غطاء الفلتر. ضع الأنابيب على الثلج حتى تحليل إضافي.
11. قم بإجراء الإعداد الأولي وفحص الأداء على جهاز قياس السيتومتر.
12. اضبط الفولتية باستخدام عينات غير مصبوغة وملونة بالكامل. قم بالتعويض باستخدام ضوابط الخرزات ثم تابع عملية الاستحواذ.
    ملاحظة: تتطلب التجارب على أكثر من فلوروفور واحد إجراء تعويض. جهز ضوابط التعويض اللازمة. ستحتاج إلى ضوابط ملونة واحدة (أي خرزات تعويضية) لكل فلوروفور مستخدم في التجربة. يمكن إجراء التعويض تلقائيا وفقا لإعدادات برنامج مقياس التدفق الخلوي. يوصى باستخدام ضوابط FMO (الفلورية ناقص واحد) للتمييز بين مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية لفلوروفور معين. جهز FMO بإدراج جميع الفلوروفورات في العينة باستثناء الفلوروفورات التي يتم التحكم بها.
13. ضبط البوابات باستخدام ضوابط FMO (فلورية ناقص واحدة) واكتساب 50,000 حدث لكل عينة.

5. زراعة الأعضاء الظهارية الإحليل

ملاحظة: بالنسبة للعضويات الظهارية في مجرى الإحليل في الفأر، اتبع البروتوكولات، القسم 3، الهضم إلى تعليق الخلية الواحدة، الخطوات 3.1 إلى 3.11. للحصول على تعليق خلية واحدة.

1. أعد تعليق حبيبات الخلايا الظهارية الإحليلي في وسط توسع عضوي بسعة 50–100 ميكرولتر (التفاصيل الواردة في الجدول التكميلي 4). احصل على قابلية البقاء وعدد الخلايا عن طريق العد على جهاز قياس الدم.
2. جهز خليطا بنسبة 1:4 من تعليق الخلية (جزء واحد) وCultrex (4 أجزاء)، مع تركيز نهائي 5000 خلية في 25 ميكرولتر. أضف 3 قطرات من تعليق الخلية 25 ميكرولتر (5000 خلية/قطرة) إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئر.
   ملاحظة: استخدم دائما ماصة Cultrex بلطف مع طرف مقطوع لتجنب الفقاعات.
3. انقل اللوح إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية (5٪ ثاني أكسيد الكربون₂₎ لمدة 15 دقيقة لتصلب القطرات.
4. ضع القطرات على القطرات 800 ميكرولتر من وسائط التمدد العضوية بلطف من جوانب البئر، وانقل اللوح مرة أخرى إلى الحاضنة.
   ملاحظة: يطلب تغيير الوسائط كل يومين. استبدل الوسائط المستهلكة بوسائط تمدد عضوية جديدة بسعة 800 ميكرولتر.
5. التقط صورا للعضويات في كل يوم من اليوم 0 إلى 6 أيام باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 4 إلى 20 مرة.

6. علم نسيج وصبغة المناعة في عضويات الإحليل

تحذير: زيلين مذيب شديد الاشتعال. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة للتعامل مع المادة الكيميائية. اجمع الزيلين المستخدم كنفايات عضوية للمذيبات. التخلص من خلال برامج النفايات الكيميائية الخطرة المعتمدة. الفورمالين سام ويسبب تهيج الجلد والعين والتنفس. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة للتعامل مع المادة الكيميائية. التخلص من خلال أنظمة التخلص من النفايات الكيميائية الخطرة المؤسسية. تم تعديل وتحسين بروتوكول تضمين عضويات الإحليل في كتل البارافين من بروتوكول لدمج عضويات بطانة الرحم¹⁴.

1. في اليوم السادس من زراعة العضويات، تخلص من الوسائط المستهلكة واغسل الأعضاء ب 1x HBSS في درجة حرارة الغرفة. أضف 1.5 مل من الفورمالين المحايد المخزن (10٪) إلى الآبار لمدة 15 دقيقة.
2. تخلص من المثبت وأضف 1.5 مل من الهيماتوكسيلين إلى الآبار لمدة 10 دقائق. تخلص من البقعة واغسل مرتين باستخدام 1x HBSS.
3. أضف 1 مل من الأجاروز الفائق 2٪ منخفض الانصهار المصنوع في 1x HBSS في كل بئر يحتوي على 3 قطرات، واترك الأجاروز ليتصلب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. أزل الأغاروز بلطف من البئر باستخدام طرف مسطح لملعقة رقيقة، مع التأكد من أن قطرات كولتريكس تسقط معه.
5. انقل قرص الأغاروز إلى شريط نسيج وجفف في 70٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك مستمر.
6. تجفيف إضافي بتركيزات مختلفة من الإيثانول ومدة مختلفة: 90٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة، 100٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة، 100٪ إيثانول لمدة 60 دقيقة، 100٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
7. أزل الإيثانول الزائد ونظف بالزيلين لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك مستمر. كرر خطوة إزالة الزيلين لمدة 60 دقيقة.
8. أزيل الزائدة من الزيلين وانقلت إلى شمع البارافين المتسرب (65 درجة مئوية) خلال الليل.
9. أضف طبقة رقيقة من شمع التضمين إلى قاعدة قالب معدني ووضع قرص الأغاروز فوقه. أزل القالب من مدفأة الشريحة وقم بتغطية شمع مدمج بسرعة عبر الشرائح في أسفل الكاسيت. اتركه ليتصلب في درجة حرارة الغرفة.
10. قطع كتل البارافين العضوية على ميكروتوم للحصول على مقاطع بحجم 5 ميكرومتر. ضع مقاطع على شرائح ذات شحنة موجبة.
11. صبغ الهيماتوكسيلين-إيوزين
    1. اخبز شرائح الخبز عند حرارة 60 درجة مئوية وأزيل البارافين بالزيلين ثم أعد ترطيبه عبر سلسلة من غسولات الإيثانول (زيلين 1 دقيقة، 100٪ إيثانول 1 دقيقة، 95٪ إيثانول 1 دقيقة، 75٪ إيثانول دقيقة واحدة)
    2. اغسل الزلاجات بماء الصنبور وحضن الشرائح باستخدام جيلز هيماتوكسيلين رقم 2 لمدة 3 دقائق. ضع الزلاجات تحت تيار من ماء الصنبور لتكتل لونا أزرق.
    3. حضن شرائح في 95٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة، تليها محلول إيوزين 0.25٪ لمدة دقيقة واحدة. اغسل الزلاجات في ماء الصنبور حتى يصبح الماء صافيا.
    4. جفف الشرائح (95٪ إيثانول دقيقة واحدة، 100٪ إيثانول دقيقة واحدة) ونظف الشرائح بالزيلين (دقيقة واحدة) قبل تركيبها باستخدام وسائط تثبيت سريعة التقسية.
12. تلطيخ مقطع البارافين المناعي
    1. اخبز شرائح البرافين بحجم 5 ميكرومتر في فرن تهجين على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1–2 ساعة.
    2. إزالة الشمع تنزلق عن طريق الغمر في الإكسيلين لمدة 6 دقائق داخل جرة تلوين منزلق.
    3. أعد ترطيب شرائح 100٪، 95٪، 75٪ إيثانول في ماء مقطر لمدة 6 دقائق لكل منها. ثم اغسل السلايد بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
    4. أضف شرائح في طبق بايركس مربع يحتوي على محلول استرجاع مستضدات بحمض الستريك 0.01 ملونة (في ماء مقطر)، وغط الطبق بلفافة اللصق. قم باسترجاع المستضدات عن طريق تسخين الميكروويف على طاقة عالية لمدة 20 دقيقة.
    5. يبرد إلى فاتر لمدة 20 دقيقة ثم يشطف السلايدات في PBS لمدة 5 دقائق. ارسم حاجزا كاره للماء حول أقسام الأنسجة وأضف 100 ميكرولتر لكل مقطع من حاجز الحصان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تأرجح لطيف (انظر الجدول التكميلي 5 لتحضير حاجز منع الحصان).
    6. تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية في حاجز حصان الحصان عن طريق إضافة الأجسام المضادة الأولية بدرجة تخفيف مناسبة (1:100–1:200). أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى كل قسم. الحضانة تنزلق طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تأرجح لطيف.
       ملاحظة: تم تعزيز العضويات مناعة بأجسام مضادة لكيراتين 5/KRT5 (علامة ظهارية قاعدية)، P63 (علامة ظهارية قاعدية)، KRT4 (علامة ظهارية متوسطة/فوق قاعدية)، وKRT13 (علامة ظهارية متوسطة/فوق قاعدية).
    7. بعد الحضانة طوال الليل، أغسل الشرائح في PBS 4 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تأرجح لطيف.
       ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية في صندوق محمي من الضوء في درجة حرارة الغرفة.
    8. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوي في حاجز حصانة الحصان، مع إضافة الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلورية عند تخفيف 1:500. حضانة الانزلاق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف.
    9. اغسل السلايدات في PBS 4 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هزة لطيفة.
       ملاحظة: خطوة اختيارية: استخدم مجموعات التوهج التلقائي لإخماد إشارة التألق التلقائي.
    10. حضن محلول DAPI بحجم 300 نانومتر لمدة 5 دقائق مع تأرجح لطيف. اغسله في PBS لمدة 2 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف.
    11. تم تركيبه بمحلول مضاد للتلاشي (90٪ جليسرول، 0.2٪ n-بروبيل جالات في 1x PBS). صور أقسام على مجهر فلوري واسع المجال.
        ملاحظة: يجب ضبط إعدادات تعريض الكاميرا لكل فلوروفور لتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع تجنب تشبع البكسلات. استخدم نفس إعدادات التعريض أثناء تصوير العضويات الملونة في جلسة معينة.

7. التلوين المناعي الكامل لصفائح الظهارة المعزولة في الإحليل

ملاحظة: لصبغ المناعة على الشكل الكامل، اتبع البروتوكول القسم 2، عزل نسيج ظهارة الإحلال، الخطوات من 2.1 إلى 2.12. للحصول على صفائح ظهارية الإحليل.

1. انقل النسيج الظهاري بعناية باستخدام ماصة نقل أو طرف ماصة بسعة 200 ميكرولتر إلى بئر في طبق زراعة أنسجة يحتوي على 500 ميكرولتر من الفورمالين المحايد 10٪. أغلق غطاء اللوحة بالبارافين وحضنه على هزاز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: قم بجميع الخطوات في نفس البئر لتجنب فقدان الأنسجة الظهارية.
2. استنشق الفورمالين بحذر من البئر. قم بغسل 500 ميكرولتر من 1x PBS وحضن على هزاز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر نفس خطوة الغسل مرة أخرى.
3. أضف 500 ميكرولتر من محلول النفاذية يحتوي على 1x PBS + 1٪ ترايتون X-100 إلى البئر. أغلق غطاء اللوح باستخدام بارافيلم، ثم احتضن لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف.
4. استنشق محلول النفاذية بعناية من البئر.
5. قم بإجراء الحجب عن طريق حضنة الأنسجة في 500 ميكرولتر من حاجز حصان يحتوي على 1٪ إضافية من ترايتون X-100 (وصفة لحاجز حصان الخيول مرفقة في الجدول التكميلي 5). أغلق غطاء الطبق بطبقة بارا فيلم واحتضن الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع هز لطيف.
6. تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية في محلول حاجز حصان يحتوي على 1٪ إضافية من ترايتون X-100 عن طريق إضافة الأجسام المضادة الأولية بدرجة تخفيف مناسبة (1:100–1:200). استنشق محلول حاجز وأضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية: مضاد CDH1 (علامة خلايا ظهارية) ومضاد F4/80 (علامة بلاعم الفئران). أغلق الغطاء بطبقة بارا فيلم واحتضن لمدة 48–72 ساعة عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف.
7. استنشق محلول الجسم المضاد الأساسي بحذر واغسل 3 مرات مع 1x PBS لمدة 30 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف.
8. تحضير محاليل الأجسام المضادة الثانوية في حاجز حجب الخيول مع إضافة 1٪ تريتون X-100 عن طريق إضافة أجسام مضادة ثانوية بتخفيف مناسب (1:500).
9. أضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى البئر وغط اللوحة بورق الألمنيوم، وحضن اللوحة لمدة 4–6 ساعات في درجة حرارة الغرفة على هزاز.
10. استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوية بعناية واغسله ثلاث مرات مع قرص PBS مرة واحدة لمدة 30 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن إجراء تلوين DAPI عن طريق حضان الأنسجة باستخدام محلول مخفف من مخزون DAPI (تركيز نهائي 300 نانومتر) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل المناديل ب 1x PBS (مرتين في 5 دقائق) في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.
11. انقل الأنسجة الظهارية بعناية إلى شريحة زجاجية أو طبق تصوير وأضف محلول تركيب مضاد للتلاشي (90٪ جليسرول، 0.2٪ n-بروبيل غالات في 1x PBS).
12. صور الأنسجة على المجهر الفلوري.
    ملاحظة: نظرا لسماكة العينة، يوصي المؤلفون بالتصوير باستخدام مجهر فلوري قادر على التقسيم البصري. في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون مجهر فلوري واسع المجال مع مقطع بصري من أبوتوم لإزالة الضوء خارج البؤرة والحصول على مراكز z. تم الحصول على مجموعات z من الصور لتصوير الإسقاطات التغصنية للبلاعم المرتبطة بالظهارة.

النتائج

تشريح وجمع إحليل أنثى الفأر البالغة

في الجزء الأول من هذه الدراسة، يقدم المؤلفون بروتوكولا مفصلا لتشريح إحليل الإناث في الفأر. نظرا لارتباطه بجدار المهبل البطني وموقعه تحت التعاقد العاني، تسمح الطريقة المقدمة هنا بتشريح نظيف للإحليل الأنثوي الكامل (الشكل 1).

عزل الأنسجة الظهارية الإحليلي وتحليل قياس تدفق الخلايا للعزلات أحادية الخلية

يؤدي هضم التربسين إلى فصل سهل للبطانة الظهارية للإحليل عن السدى المحيط. يمكن ملاحظة صفائح ظهارية ذات شفافية أعلى من نسيج البسكوما بعد الانفصال (الشكل 2). أدت صفائح الظهارة المنفصلة إلى إنتاج تعليق خلية واحدة عند الهضم الإنزيمي. تظهر الخلايا المفردة المعزولة من ظهارة الإحليل قابلية عالية للحياة باستمرار (>80٪) عن طريق استبعاد الصبغة الزرقاء على جهاز قياس الدم (الشكل 2L) وقياس التدفق الخلوي باستخدام أصباغ البقاء لتحديد الخلايا الحية (الشكل 3، الملف التكميلي 1).

أجرى المؤلفون قياس تدفق الخلايا لتقييم تثريب الخلايا الظهارية من معلقات الخلايا الأحادية لظهارة الإحليل. للتحقق من بقاء الخلية، تم صبغ تعليق الخلية بعلامة حية/ميتة، وهي صبغة الشبح التفاعلية مع الأمينات V450. لاحظ المؤلفون باستمرار قدرة خلايا على البقاء بنسبة >80٪ حسب مؤشر الأحياء أو الأموات. مكن العلامة الحية/الميتة من إخراج الحطام والخلايا الميتة أثناء تحليل التدفق. قاموا بصبغ عينات بعلامة خلايا ظهارية (CD326/EPCAM)، وعلامة بلاعمية (F4/80)، وعلامة خلايا مناعية (CD45) لتسجيل تركيب الخلايا المعزولة بهذه الطريقة. أظهرت نتائج قياس تدفق الخلايا الخلوية أن المؤلفين عزلوا مجموعة من خلايا الظهارة الغنية من ظهارة الإحليل الأنثوية في الفأر. في كلا التجربتين المستقلتين اللتين أجريتين، حققت المجموعة 80–90٪ من الخلايا الظهارية الإيجابية ل EPCAM بعد الانتقال إلى الخلايا الحية. لاحظ المؤلفون أيضا ~1.30٪ من خلايا CD45+ المناعية في تحضير الظهارة. شكلت البلاعم المرتبطة بالبطانة الظهارية ~1.18٪ من الخلايا الحية من الحجرة الظهارية. أظهر تحليل التدفق الخلوي لتعليقات الخلايا المفردة من صفائح الظهارة تلوثا طفيفا في البضاعة (5–6٪)، ويرجع ذلك غالبا إلى بطانة الأوعية الدموية وفقا لدراستهم السابقة⁵. يظهر الملف التكميلي 1 نتائج قياس تدفق الخلايا لتحضيرات خلية واحدة من حجرات الظهارة والسترومال. مقارنة بزيادة 80–90٪ من الخلايا الظهارية المعزولة من الحجرة الظهارية، أظهرت الحجرة البثارية أيضا 40–50٪ من الخلايا الطهارية، وهي من القنوات القصيرة والظهارة الغدية الممتدة من تجويف الإحليل إلى الجرومة المحيطة (الشكل 3، الملف التكميلي 1).

زراعة الأعضاء الظهارية الإحليلية، علم النسيجة، وتلوين المناعة

كما أظهر المؤلفون كيف أن الخلايا الظهارية المفردة المعزولة من الإحليل قابلة للحياة ويمكن أن تشكل عضويات في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، ولاحظوا نمو عضوي من خلايا ظهارية إحليل واحدة حتى اليوم السادس في الزراعة (الشكل 4B–G). أجروا تلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين (H&E) لمراقبة نسيج العضويات (الشكل 4H–J). لاحظ المؤلفون شكلين مميزين للعضويات الظهارية الإحليلية، أحدهما كبير وجوف، بينما النوع الآخر أصغر وصلبا. في كلتا الحالتين، تم تصنيف العضويات وإعادة تجميع العلامات المعبر عنها في بطانة الإحليل الأنثوي، بما في ذلك KRT5 وP63 التي تحدد الطبقة القاعدية، وKRT4 وKRT13 التي تضع علامات على طبقات الخلايا فوق القاعدية/المتوسطة (الشكل 4K–N)، الشكل 1 الإضافي). تم دراسة الفروق في قدرة تكوين الأعضاء بين الإحليل القريب والبعيد. العضويات الناتجة من الإحليل القريب كانت تحتوي على نسبة أعلى من الأعضاء المجوفة، بينما كانت الأعضاء الناتجة من الإحليل البعيد تشكل كرات صلبة (الشكل 4O–P). بالإضافة إلى ذلك، لاحظوا اختلافات في كفاءة تكوين الأعضاء في الخلايا الظهارية المعزولة من الأجزاء القريبة والبعيدة من الإحليل. تشكل ظهارة الإحليل البعيدة عضويات بكفاءة أعلى من ظهارة الإحليل القريبة ذات نفس كثافة البذر الأولية (5000 خلية/قطرة) (الشكل 4Q–S).

التلوين المناعي الكامل لصفائح الظهارة المعزولة في الإحليل

كما قدم الباحثون طريقة محسنة لتلوين كامل لألواح الظهارة في إحليل الفأر الأنثى. هنا، قاموا بصبغ صفائح الظهارة بعلامتين: F4/80 للبلاعم وE-cadherin/CDH1 لتحديد وصلات الخلايا الظهارية (الشكل 5). تم تصوير الأنسجة باستخدام مجهر Zeiss Axio Observer 7 مع تقسيم بصري من Apotome 3. تظهر صفائح الظهارة علامات قوية مع الجسم المضاد CDH1. أظهرت التحضيرات الكاملة لظهارة الإحليل الموسومة بأجسام مضادة ل F4/80 أن البلاعم تشكل دائرة من التغصنات في بطانة الظهارة. يمكن ملاحظة البلاعم وهي ترسل عمليات شجرية بين خلايا الظهارة في الإحليل. بشكل عام، تظهر النتائج فائدة البروتوكولات الموضحة هنا لدراسة بطانة الظهارة في إحليل الجرار الأنثى.

الشكل 1: تشريح الفأر لمجموعة الإحليل الإناثية. (أ) وضع الفأر في وضعية الاستلقاء ورش البطن بنسبة 70٪ من EtOH. (B–C) افتح البطن عن طريق رفع الجلد وعمل شق عمودي. (د) تقليم الدهون والأنسجة الضامة لكشف عظام العانة على شكل فراشة المتصلة عند (السهم الأسود) التكافل العاني. (ه) قطع التعايش العاني. (و) بمجرد إزالة عظام العانة، يمكن رؤية الإحليل يمتد للأسفل (محدد بخط أسود منقط) من المثانة. (G) اسحب المثانة بلطف باستخدام الملقط. الإحليل واضح على شكل أنبوب أحمر رفيع. (H–I) اسحب المثانة للأعلى من تجويف الجسم. استخدم شد المثانة لفصل الإحليل عن جدار المهبل البطني. مرري المقص بين الإحليل وجدار المهبل لفصل المسالك البولية عن الجهاز التناسلي. (J–K) افصل الطرف البعيد من الإحليل المتصل بالجلد. (L) صورة لأنثى فأرة مقطعة في المسالك البولية السفلية (FLUT)، تظهر المثانة والإحليل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: عزل ظهارة الإحليل وتحضير تعليق خلية واحدة. (أ) مخطط يصور الهضم الإنزيمي والفصل الميكانيكي بين القسمين الظهارية والسترومية في الإحليل يليه هضم خلية واحدة. (ب) إزالة الدهون الزائدة من الجهاز البولي السفلي للأنثى. (C–F) اقطع الإحليل من منطقة رقبة المثانة لفصل الإحليل عن المثانة. ثم اقطع الإحليل إلى نصفين باستخدام مقص دقيق. (G) غسل قطع الإحليل بمحلول HBSS 1x عن طريق تمرير فلتر بحجم 100 ميكرون. (ح) نقل شظايا نسيج الإحليل إلى محلول تريبسين بنسبة 1٪. حضن على عينة دوار في الغرفة الباردة. أضف MgCl₂ وDNase I إلى نفس الأنبوب. حضن عند 37 درجة مئوية في فرن هجين على مدور عينة. (I–J) عزل الظهارة عن طريق الضغط اللطيف بملقط ناعم على طول جزء الإحليل. (ك) تقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام مقص ناعم. انقل النسيج الظهاري المفروم إلى محلول هضم أكوتاز وحضنه عند 37 درجة مئوية في فرن تهجين على مدور العينة. (L) عد خلايا الظهارة وتقييم قابلية البقاء باستخدام جهاز قياس الدم الصبغي (Trypan Blue). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: قياس تدفق الخلايا لتقييم التعليق الأحادي الخلية من حجرات ظهارة الإحليل والستروم. تم إجراء قياس تدفق الخلايا على تحضيرات خلية واحدة من أقسام الإحليل (A) والخلية (B) في الإحليل المجمع. تم إغلاق الخلايا الحية لاستبعاد الخلايا الميتة الملونة بصبغة الشبح V450. تم تقييم الخلايا الحية للتعبير عن CD45 (مؤشر المناعي الشامل)، CD326/EPCAM (علامة الظهارة الشاملة)، وF4/80 (علامة البلعم في الفئران). تمثل البيانات تجربتين مستقلتين أجريتهما على مجموعة من 5–6 فئران في كل تجربة لتوليد عينات ظهارية وسميضية. الاختصارات؛ SSC-A = منطقة الذروة الجانبية المتفرقة؛ FITC = فلوريسين إيزوثيوسيانات; APC = ألوفيكوسيانين; PE = فيكوإيريثرين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: علم النسيجة والتلوين المناعي للعضويات الظهارية الإحليلية. (أ) يوضح تخطيطيا سير العمل لتوليد الأعضاء الظهارية الإحليلية. (B–G) صور مجهرية ممثلة للمجال الساطع لعضويات الظهارة في الإحليل (UEOs) التي تم توليدها من خلايا مفردة في أيام مختلفة من التوسع الصناعي. صور ممثلة للمجال الساطع لعضويات ظهارية الإحليل المجوفة (H) و(I) الصلبة (UEOs) الملونة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E). (ج) قياس أنواع العضويات الناتجة عبر ثلاث تجارب مستقلة. شريط الخطأ يمثل الخطأ القياسي للمتوسط. صور تمثيلية لعضويات ظهارية الإحليل المجوفة (K) و(L) الصلبة (UEOs) محملة بعلامات ظهارية KRT13 (علامة ظهارية فوق قاعدية)، KRT5 (علامة ظهارية قاعدية) وP63 (علامة ظهارية قاعدية). تظهر صور لقنوات فلورسنت مفردة بألوان K'، K''، K'''، L'، L'' وL'''. صور تمثيلية لعضويات ظهارية الإحليل الصلبة (M) و(N) الصلبة (UEOs) مدعمة بعلامات ظهارية KRT4 (علامة ظهارية فوق قاعدية) وKRT5 (علامة ظهارية قاعدية). الصور التي تصور قنوات فلورية واحدة تظهر بألوان M'، M''، N' وN". (س) مخطط لتشريح الإحليل القريب والبعيد. (P) قياس أنواع العضويات الناتجة عن الإحليل القريب والبعيد عبر تجربتين مستقلتين. صور مجهرية ممثلة للحقل الساطع لعضويات الظهارة في الإحليل في اليوم السادس (UEOs) الناتجة عن ظهارة معزولة من الإحليل (Q) القريب و(R) البعيد. تمثل بيانات الأعضاء الناتجة عن الإحليل الكامل 3 تجارب مستقلة أجريت مع مجموعة من 3–5 فئران في كل تجربة. (S) بيانات العضويات الناتجة عن الإحليل القريب والبعيد تمثل تجربتين مستقلتين أجريتهما مع مجموعة من 3–4 فئران في كل تجربة. نوى موسومة ب DAPI (أزرق). (أشرطة مقياس، 100 ميكرومتر). تم إعداد المخططات باستخدام BioRender وAdobe Illustrator. تم إنشاؤه في BioRender. بينوي جوزيف، د. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: صبغ مناعي كامل لألواح الظهارة في الإحليل. (أ) مقطع مجمد بوزن 10 ميكرون من إحليل أنثى الفأر البالغة في وسط قطع مثالي، يظهر صبغة مناعة لعلامة البلعم في الفأر F4/80 (باللون الأحمر) وبروتين الظهارة E-cadherin/CDH1 (باللون الأخضر). (A') تمثل الصورة المكبرة للإدخال في (A). (ب) مخطط تخطيطي يوضح خطوات التلوين الكامل لصفائح ظهارية الإحليل المعزولة. تم إجراء صبغ مناعي شامل لبطانة الظهارة المعزولة لأنثى الفأر باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة البلعم في الفأر F4/80 (باللون الأحمر) وبروتين الظهارة E-cadherin/CDH1 (باللون الأخضر). (ج) صورة تمثيلية للعرض المدمج. (د) إسقاط شدة قصوى متعامد للقناة الحمراء التي تظهر تنظيم البلاعمية. (E–F) تم تكبير رؤية الظهارة والبلاعم المرتبطة بها. شريط مقياس أبيض، 50 ميكرومولار. شريط مقياس رمادي، 500 ميكرومولار. البيانات تمثل تجربتين مستقلتين أجريتهما على مجموعة من 4–5 فئران. المخططات المعدة في BioRender وAdobe Illustrator. تم إنشاؤه في BioRender. بينوي جوزيف، د. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: تحضير 1x HBSS (بدون كالسيوم، المغنيسيوم).يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: تحضير محلول 1x sHBSSa و1٪ تريبسين.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: تحضير حاجز تلوين الخلية/التدفق.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: تحضير وسط توسع العضوية للعضويات الظهارية الإحلالية.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 5: تحضير حاجز الحصان.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: عد الخلايا لتجربة قياس تدفق الخلايا التي أجريت على خلايا منفردة من الظهارة الإحليلي وحجرات البثوم من تجربتين مستقلتين.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 1: مقارنة بين ظهارة الإحليل الأنثوية البالغة للفأر مع الأعضاء الظهارية في الإحليل. صور تمثيلية ل (أ) ظهارة الظهارة البالغة في الفأر، (ب) عضويات ظهارية الإحليل المجوفة، و(ج) عضويات ظهارية الإحليل الصلبة (UEOs) ملطخة بعلامات ظهارية KRT13 (علامة ظهارية فوق قاعدية)، KRT5 (علامة ظهارية قاعدية)، وP63 (علامة ظهارية قاعدية). تظهر الصور التي تصور قنوات فلورية مفردة بألوان A'، A''، A''، B'، B''، B''، C'' و C''. صور تمثيلية ل (D) ظهارة الظهارة البالغة في مجرى الإحليل من الفئران، (E) عضويات ظهارية مجرى في الإحليل المجوفة، و(F) عضويات ظهارية إحليل صلبة (UEOs) مدعمة بعلامات ظهارية KRT4 (علامة ظهارية فوق قاعدية) وKRT5 (علامة ظهارية قاعدية). الصور التي تصور قنوات فلورية مفردة تظهر بألوان D'، D''، E'، E''، F' وF". بيانات تمثل 3 تجارب مستقلة أجريت مع مجموعة من 3–4 فئران في كل تجربة. نوى موسومة ب DAPI (أزرق). (أشرطة مقياس، 100 ميكرومتر). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تعد الحواجز الظهارية في الجسم مهمة جدا للدفاع عن المضيف. هذه أقسام متخصصة تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا الظهارية وخلايا مناعة مقيمة مرتبطة. تتغير الحواجز الظهارية مع مرور الوقت التطوري، حيث تكتسب تعبير جيني دفاعي للمضيف غالبا استجابة للميكروبيوتا أو التعرض البيئي. قد تؤثر عيوب في سلامة الظهارة أو التعبير الجيني على دفاع المضيف¹⁵. من الضروري دراسة نسيج الظهارة بشكل منفرد لفهم التوقيعات النصية وكذلك لدراسة تلامس الخلايا وسلامة الظهارة. حتى الآن، لم يتم وصف أي طرق بالتفصيل مصممة لعزل نسيج الظهارة الإحليلي عن الأنثى الفأرة. بينما يمكن عزل ظهارة المثانة فقط عن طريق الفصل الميكانيكي¹⁶، فإن ظهارة الإحليل موجودة داخل أنبوب الفحم في الإحليل وتتطلب مزيجا من الانفصال الإنزيمي والميكانيكي لعزل الأنسجة الظهارية.

هنا، يقدم المؤلفون طريقة محسنة لعزل صفائح الظهارة عن تجويف الإحليل لدى إناث الفئران. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد تعليق خلية واحدة عالية القدرة على الحياة لخلايا الظهارة الإحليل لتطبيقات لاحقة مثل قياس خلوية التدفق، وزراعة العضويات، والتلوين المناعي. تم إثبات توافق هذه الطريقة مع سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية سابقا من قبل نفس المجموعة⁵. مع التعديلات وتحسين إضافي، يمكن تكييف البروتوكول المعروض هنا لاستخراج الأنسجة الظهارية من أعضاء أنبوبية أخرى للتطبيقات اللاحقة.

تشمل الخطوات الرئيسية في البروتوكول التشريح الدقيق لإحليل الإحليل الكامل لأنثى الفأر البالغة، مما يمكن من دراسة الفروقات الإقليمية على طول المحور القريب إلى البعيد. بعد ذلك، يستخدم البروتوكول الهضم الإنزيمي اللطيف لتخفيف بطانة الإحليل من الجدة المحيطة. يقوم الهضم الإنزيمي بترخي الظهارة للسماح بالفصل الميكانيكي عن طريق الضغط اللطيف على أنبوب الإحليل بين الملقط لتحرير النسيج الطلائي. قام الباحثون بتحسين توقيت هضم التربسين بعناية لتمكين عزل ظهارة الإحليل ذات القدرة العالية على البقاء (> 80٪) كصفائح لصبغ المناعة أو لعزل خلية واحدة لاحقا (الشكل 3، الملف التكميلي 1). كشف الهضم الخلوي الواحد لظهارة الإحليل عن 80–90٪ من الخلايا الظهارية في عزلات ظهارية الإحلال. من خلال دراسة سابقة، حدد المؤلفون أن الخلايا غير الظهارية في هذا التحضير تتكون في الغالب من خلايا مناعية مرتبطة بالظهارة وبطانة الأوعية الدموية⁵. الطريقة الحالية لعزل الخلية الواحدة توفر تعليقات عالية الجودة لخلية واحدة للتطبيقات اللاحقة مثل قياس خلية التدفق وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عن طريق القضاء على تجمعات الخلايا من خلال التعطيل الميكانيكي عبر شفط الإبر الصغيرة وإزالة خلايا الدم الأحمر عن طريق التحلل اللطيف.

تظهر النتائج أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لإثراء خلايا المناعة الخاصة بأقسام معينة (الشكل 3). يمكن أيضا دراسة الظلام المعزول من الإحليل القريب والبعيد بشكل منفصل. بالإضافة إلى ذلك، أظهر المؤلفون أن الخلايا الطهارية المعزولة يمكن استخدامها لتوليد عضويات الإحليل التي لم يتم وصفها سابقا (الشكل 4). تظهر هذه النتائج أيضا تباينا إقليميا في قدرة توليد الأعضاء في الإحليل الأنثوي. بينما أظهرت دراسات المؤلف الحديثة فروقا في التعبير الجيني الظهاري وتنظيم الخلايا المناعية في الإحليل الأنثوي⁵، تظهر الدراسة الحالية أن خلايا الظهارة في الإحليل القريب تشكل عضويات أقل من الظهارة المعزولة من الإحليل البعيد (الشكل 4). أحد قيود هذا التقسيم المكاني إلى الإحليل القريب والبعيد هو أنه لا يوجد علامة تشريحية يمكن استخدامها عند التشريح لتمييز هذين المنطقتين. في هذه الدراسة، قام المؤلفون بتقسيم طول الإحليل إلى النصف للحصول على أقسام قريبة وبعيدة. يمكن استخدام طريقة عزل الظهارة الموصوفة هنا لتوصيف الفروق في التعبير الجيني وتركيب الخلايا بين الظهارة الإحليل القريبة والبعيدة.

بينما البروتوكول المحسن المعروض هنا متاح وقابل للتكرار، تتطلب بعض الخطوات ممارسة ومعايرة دقيقة. على وجه الخصوص، تتطلب طريقة التشريح المعروضة هنا استخراجا دقيقا لأنبوب الإحليل من أسفل التعامل العاني مع الحفاظ على طول الإحليل بالكامل. بالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر لإزالة أي نسيج مهبلي متصل بجدار الإحليل الظهري بعد التشريح. يجب إزالة الدهون الموجودة حول عنق المثانة بعناية لتقليل تلوث الخلايا الدهنية أثناء التطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. علاوة على ذلك، يجب تحسين هضم التربسين بعناية مع كل دفعة من الإنزيم لضمان هضم متسق. قد يؤدي فرط هضم الأنسجة إلى فقدان صلاحية الخلايا. قام المؤلفون بتحسين الوقت المناسب لهضم التربسين، مشيرين إلى نافذة زمنية تتراوح بين 15–30 دقيقة لخطوات الحضانة عند 4 درجات مئوية و37 درجة مئوية. يمكن تحسين ذلك بناء على دفعة الإنزيم المستخدمة. كما أنه من الضروري تقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة لهضم خلية واحدة فعالة. استخدم المؤلفون أكوتاز لمزيد من الهضم الأحادي الخلية لأنه يؤدي إلى تفكك لطيف من الواقع. في حالة انخفاض صلاحية الخلايا، يمكن تقليل وقت حضانة الأكوتاز. بالإضافة إلى ذلك، أدرج المؤلفون مثبط الصخور في خليط هضم أكوتاز لتعزيز بقاء الخلايا. يوصى بهضم إنزيمات DNase لتقليل تكتل الخلايا عن طريق هضم الحمض النووي خارج الخلوي المنبعث من الخلايا الميتة والمتمردة. كما يوصي المؤلفون باستخدام مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء لتقليل تلوث خلايا الدم الحمراء الذي قد يربك النتائج اللاحقة مثل قياس تدفق الخلايا وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

أحد القيود في طريقة عزل الظهارة المعروضة هنا هو أنها تم تحسينها لإحليل الإناث في الفأر. الإحليل الذكري للفأر أكثر تعقيدا تشريحيا، مع تغير في بنية الظهارة من الإحليل القريب إلى الإحليل البعيد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للطريقة فقط عزل الخلايا الظهارية التي تبطن تجويف الإحليل. الغدد الإفرازية في الإحليل المتصلة بتجويف الإحليل عبر قنوات ظهارية قصيرة لا يمكن عزلها لأنها مدمجة في نسيج البظلة. بدلا من ذلك، يتم إثراء هذه البنى الظهارية في الحجرة البثمية المتبقية بعد عزل بطانة الظهارة الإحليل (الشكل 3).

على الرغم من هذه القيود، أتاحت هذه الطريقة رؤى مهمة حول بنية الظهارة في الإحليل وستسمح بمزيد من التحقيق في الخلايا المناعية المرتبطة بالظهارة من خلال تصور البلعم المرتبطة بالظهارة في الموقع. لقد ثبت بالفعل أن الطريقة متوافقة مع سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد التغاير الخلوي في ظهارة الإحليل والخلايا المناعية المرتبطة^{بها 5}. بالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على عزل الظهارة عن الإحليل القريب والبعيد ستمكن الدراسات من فهم الفروق المكانية في الإحليل. ومن اللافت أن طريقة هضم الخلايا الظهارية تنتج خلايا منفردة قابلة للحياة يمكنها توليد عضويات ظهارية في الإحليل ستكون مفيدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض وبيولوجيا الظهارة في الإحليل. بشكل عام، تضيف هذه الطرق إلى مجموعة الأدوات لتمكين تحقيقات أعمق في بيولوجيا الظهارة الإحليلية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		لصنع لوحات الأرقام
Adobe Photoshop	Adobe		لصنع لوحات الأرقام
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	تخفيف 1:20، لقياس التدفق الخلوي
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	تخفيف 1:20، لقياس التدفق الخلوي
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	تخفيف 1:200
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	تخفيف 1:20، لقياس التدفق الخلوي
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	تخفيف 1:200
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	تخفيف 1:200
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	تخفيف 1:200
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	تخفيف 1:800
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	تخفيف 1:200
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	تخفيف 1:200
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	تخفيف 1:500
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	تخفيف 1:500
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	تخفيف 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	تخفيف 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	تخفيف 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	تخفيف 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	تخفيف 1:500
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1	PeproTech	315-32
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002