عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية في لب الأسنان عبر ممرات الخلايا

ملخص

يحدد هذا البروتوكول سير عمل موحد لعزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSC) عبر الممراح، مما يمكن من تقييم جودة الإكسوسوم والنشاط الوظيفي القابل للتكرار في التطبيقات التجديدية.

الملخص

تمثل الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSCs) مصدرا متاحا وذو صلة سريريا للخلايا الجذعية الميزنشيمية، وقد برزت الإكسوسومات المشتقة منها كحويصلات نشطة حيويا واعدة لتطبيقات خالية من الخلايا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي. ومع ذلك، لا تزال الطرق القابلة للتكرار والموحدة لعزل والتحقق الوظيفي من الإكسوسومات المشتقة من DPSC محدودة، خاصة فيما يتعلق بالتباين الذي يدخل أثناء توسع الخلايا عبر الممرات. هنا، نصف سير عمل شامل وموحى قائم على المجموعات لعزل وتنقية الإكسوسومات من وسط مكيف ب DPSC، متوافقا مع الممارسات المخبرية الروتينية. تمكن هذه الطريقة من استعادة الحصيلات السليمة بشكل متسق المناسبة للتوصيف الشكلي والجزيئي والوظيفي باستخدام تقنيات شائعة. يتم تقييم هوية الإكسوسومات بناء على الشكل الشكلي وتوزيع الحجم وتعبير العلامات، بينما يتم تقييم النشاط البيولوجي باستخدام اختبار مضاد للالتهاب محدد في المختبر. لفحص التأثيرات المتعلقة بالمقطع، تتم مقارنة الإكسوسومات المستخرجة من مقاطع DPSC المختلفة باستخدام هذا القراءة الوظيفية، مما يوفر إطارا عمليا لتقييم الاتساق أثناء توسع الخلية. من خلال دمج العزل والتنقية والتوصيف والتحقق الوظيفي في سير عمل واحد، يقدم هذا البروتوكول نهجا قابلا للتكرار والتوسع لتوليد إكسوسومات مشتقة من DPSC مثبتة وظيفيا لأبحاث المواد الحيوية والتطبيقات التجديدية.

المقدمة

تعد الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية الميزنشيمية وسطاء أساسيين في التواصل بين الخلايا وتظهر إمكانات علاجية كبيرة في مجالات هندسة الأنسجة والطب التجديدي. الإكسوسومات هي حويصلات يبلغ قطرها بين 30 و150 نانومتر، قادرة على توصيل جزيئات نشطة حيويا وتنظيم وظائف مختلفة في الخلايا المستقبلة، مثل التكاثر، والتمايز، والاستجابة المناعية ^1,2. من بين مصادر الخلايا الجذعية المتوسطة الكيميائية المختلفة (MSC)، تحظى الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSCs) باهتمام خاص بسبب سهولة وصولها، وقدرتها القوية على التكاثر، وانخفاض خطر الإصابة بالأورام، وأقل المخاوف الأخلاقية^3،4،5. تحتوي الإكسوسومات المشتقة من DPSCs (DPSC-Exos) على مجموعة متنوعة من الحمولة الوظيفية، بما في ذلك البروتينات، والmRNAs، والميكروRNAs، مما يمكنها من الاحتفاظ بالعديد من الخصائص البيولوجية لخلاياها الأبوية. أظهرت دراسات سابقة أن DPSC-Exos يمكن أن يعزز تكوين الأوعية، وإصلاح الأعصاب، وتجديد العظام، والاستجابات المضادة للالتهابات. بعيدا عن أدوارها في هندسة الأنسجة، تعتبر الإكسوسومات بشكل متزايد منظمات مهمة في تكوين الأورام وعلاج السرطان، حيث تساهم في إعادة تشكيل بيئة الأورام الدقيقة، ومقاومة الأدوية، والتهرب المناعي⁶. الإكسوسومات المشتقة من MSC، بما في ذلك تلك المستخرجة من DPSCs، تمتلك قدرات فطرية في توجيه الأورام وخصائص مناعية، مما يضعها كوسائل واعدة للجيل القادم لتوصيل أدوية مضادة للسرطان بشكل مستهدف أو كعوامل مناعية علاجية خالية من الخلايا. من خلال تجاوز عدة قيود مرتبطة بالعلاجات المعتمدة على الخلايا، برز DPSC-Exos كمكون حيوي واعد غير خلوي للتطبيقات التجديدية ^{7,8,9,10,11,12}.

على الرغم من هذه المزايا، لا يزال تحويل أبحاث DPSC-Exo إلى الاستخدام التجريبي أو السريري القابل للتكرار أمرا صعبا. أحد القيود الرئيسية هو غياب البروتوكولات الموحدة والموحدة لعزل وتنقية الإكسوسومات. تشمل الطرق المستخدمة حاليا الطرد المركزي^{الفائق 13}، والترشيح الفائق، والترسيب، والكروماتوغرافيا بتحديد الحجم، والتقاط الموابين المناعي^14,15. من بين هذه الطرق، يوفر الترسيبيات القائمة على البوليمر مزايا عملية، بما في ذلك إنتاجية عالية، وتوافق مع مجموعة واسعة من أحجام العينات، وبساطة تشغيلية، مما يجعله مناسبا للدراسات التي تتضمن أعدادا كبيرة من العينات أو متطلبات التوسع 16,17,18. وقد تم توثيق تحليلات مقارنة لطرق العزل المختلفة، خاصة فيما يتعلق بإنتاج البروتين ونسبة الجسيمات إلى البروتين، على نطاق واسع في الأدبيات¹⁹. ومع ذلك، لم يتم معالجة تأثير رقم مرور DPSC على خصائص ونشاط الإكسوسومات المستخلصة بشكل كاف، مما يمثل فجوة مهمة في توحيد ومراقبة جودة إنتاج DPSC-Exo.

لمعالجة هذه القيود التقنية، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا موحدا قائما على المجموعات لعزل وتنقية الإكسوسومات من وسط مشروط ب DPSC. بالإضافة إلى التوصيف الفيزيائي والجزيئي، يتضمن البروتوكول اختبارا وظيفيا لتقييم النشاط المضاد للالتهابات في الإكسوسومات المستمدة من مقاطع DPSC المختلفة، مما يمكن من تقييم مقارن لثبات الممرات المعتمدة في جودة ووظيفة الإكسوسومات. تم تصميم سير العمل ليكون سهل التنفيذ في مختبرات مجهزة بمرافق قياسية لزراعة الخلايا وعلم الأحياء الجزيئي. يعتمد على مجموعات تجارية متاحة لتقليل التنوع بين التجارب، ويمكن بسهولة توزيعه لتلبية احتياجات تجريبية مختلفة. لتقليل التباين بين المتبرعين، يتم عزل DPSCs من الأسنان الفردية وتوسيعها بشكل مستقل بدلا من تجميعها من عدة متبرعين. يعد هذا البروتوكول مفيدا بشكل خاص للباحثين الذين يسعون لتوليد إكسوسومات مشتقة من DPSC تم التحقق منها وظيفيا للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك شفاء الجروح، وهندسة أنسجة العظام، ودراسات التضمين المناعي، حيث يكون الاتساق من دفعة إلى دفعة أمرا ضروريا. بشكل عام، يوفر إطارا عمليا وموحدا لإنتاج الإكسوسومات المشتقة من DPSC لاستخدامها في هندسة الأنسجة وأبحاث الطب التجديدي.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل لجان الأخلاقيات المؤسسية. تم الحصول على أنسجة لب الأسنان البشرية من أضراس ثالثة مهملة أو ضواصك تقويمية تقويمية تم جمعها في مستشفى نينغبو لطب الأسنان وفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية (البروتوكول رقم NBKQYY2025LS-04؛ تاريخ الموافقة: 30 مايو 2025). تم الحصول على أنسجة جلدية بشرية من عينات قلفة تم جمعها خلال إجراءات الختان الروتينية في قسم المسالك البولية بمستشفى الشعب التابع بجامعة نينغبو، وفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية (البروتوكول رقم 2024104؛ تاريخ الموافقة: 30 أكتوبر 2024). تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المتبرعين أو أوصيائهم القانونيين قبل جمع العينات.

1. عزل الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية للب السن

1. العزلة، والثقافة، والتعرف على مراكز التصوير الدائم
   1. جمع العينات ونقلها
      1. جمع الأضراس الثالثة البشرية السليمة من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 18 و25 سنة أو من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 12 و16 عاما بعد خلع التقويم.
      2. ضع الأسنان المختزعة فورا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات مبرد مسبقا (PBS) مع 100 U/ml بنسلين-G و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين.
      3. نقل العينات إلى المختبر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ومعالجة خلال 6 ساعات من الاستخلاص.
   2. تعرض لب الأسنان وتفكك الأنسجة
      1. اغمر في 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية؛ اغسله ثلاث مرات باستخدام 1× PBS يحتوي على 3٪ P/S (30 ثانية لكل منها). قم بإزالة الأنسجة اللثية واللثوية المتبقية من سطح السن بعناية باستخدام مقص معقم أو مشرط.
      2. لف السن بشاش معقم، ثم كسر التاج بحذر باستخدام مطرقة معقمة لكشف غرفة اللب.
      3. افصل نسيج اللب عن العاج بلطف وقم بتقطيعه إلى شظايا صغيرة (<1 مم³) باستخدام شفرات جراحية معقمة.
      4. انقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل يحتوي على محلول هضم بسعة 2.5 ملغ/مل ديسباز II و2.5 ملغ/مل كولاجناز النوع الأول.
      5. حضن الخليط عند الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30–45 دقيقة مع تحريك لطيف.
         ملاحظة: تم تحديد مدة الهضم الإنزيمي بناء على حجم ودرجة تجانس نسيج لب السن.
   3. إنهاء الهضم وزراعة الخلايا الأولية
      1. أوقف الهضم الإنزيمي بإضافة حجم مماثل من وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS).
      2. قم بعمل جهاز الطرد المركزي في تعليق الخلية عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا وقطع الأنسجة.
      3. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من وسط الزراعة الكامل (α-MEM مع 20٪ FBS، 100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين).
      4. قم بزرع الخلايا المعلقة والبصيلات الخارجية في طبق زراعة بحجم 60 مم وإضافة وسط زراعة كامل إلى حجم نهائي يبلغ 5 مل.
      5. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂.
   4. صيانة الخلايا والزراعة الفرعية
      1. قم بتحديث وسيط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة.
      2. راقب الخلايا يوميا.
         ملاحظة: عادة ما تهاجر DPSCs الأولية من إزالة الأنسجة وتصل إلى التقاء بنسبة 80–90٪ خلال 7–14 يوما.
      3. في الزراعة الفرعية، يتم فصل الخلايا باستخدام حمض التربسين-إيثيلين إيثيلين أمين تترا أسيتيك بنسبة 0.05٪ (EDTA) عند وصولها إلى 80–90٪ التقاء البعض.
         تحذير: التربسين مهيج. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة.
      4. الخلايا الممررة بنسبة 1:3 باستخدام وسط الزراعة الكامل (مع 20٪ FBS).
      5. استخدم أجهزة DPSC في المقاطع 2 و4 و6 لجميع العزل اللاحق للأجهزة الخارجية والاختبارات الوظيفية.
   5. توصيف DPSCs بواسطة قياس خلوي التدفق
      1. فصل DPSCs عند الممر المطلوب باستخدام 0.05٪ تريبسين-EDTA، وتم تحييده باستخدام وسط زراعة كامل، وجمع تعليق الخلية.
      2. الطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في PBS وعد الخلايا. اضبط كثافة الخلايا إلى حوالي 1 ×^{10 6} خلايا/مل.
      3. أليكوت 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل أنبوب قياس خلوي تدفق. حضن الخلايا بالأجسام المضادة المتقاربة بالفلوروكروم ضد CD44، CD90، CD105، CD45، CD19، وCD14 بتخفيفة 1:100 في PBS لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      4. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من PBS لكل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي بحرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق. تخلص بعناية من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة الخلوية في 300–500 ميكرولتر من PBS للتحليل.
      5. تضمين الأجسام المضادة المناسبة للتحكم في النظائر بتركيزات مطابقة لكل فلوروكروم لتمكين تصحيح الخلفية والتجيد.
      6. تحليل العينات باستخدام مقياس تدفق وتركيب مجهول بالليزر والمرشحات المناسبة للفلوروكروم المختارة. احصل على ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة.
      7. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج قياس تدفق الخلوية. أولا، بوابات الخلايا الصالحة للحياة بناء على التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) لاستبعاد الحطام. ثم ضع بوابات مفردة لإزالة الدوبلت.
      8. تحديد تعبير العلامة من خلال مقارنة شدة الفلورة مع ضوابط النظير المقابلة لتحديد مجموعات موجبة وسالبة.
2. عزل وتنقية DPSC-Exos
   1. تحضير الوسط المكيف
      1. تزرع DPSC في طبق زراعة بحجم 10 سم حتى تصل إلى التقاء بنسبة 70–80٪.
      2. أزل الوسط المستهلك ثم اغسل طبقة الخلية الأحادية بلطف مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا.
      3. أضف 10 مل من الوسط الكامل مع 10٪ من FBS الخالي من الإكسوسومات.
      4. حضن الزراعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يصل التقاء الخلايا إلى 90–100٪ (وهي عملية عادة ما تتجاوز 24 ساعة).
   2. مجموعة الوسط المشروط
      ملاحظة: حافظ على جميع الخطوات التالية على التجميد أو عند 4 درجات مئوية.
      1. انقل الوسط المكيف إلى أنبوب طرد مركزي.
      2. قم بعمل الطرد المركزي على حرارة 4 درجات مئوية و3000 × جرام لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا والحطام الكبير.
      3. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد دون إزعاج الحبيبة.
      4. قم بجهاز الطرد المركزي للمادة الفائقة عند 4 درجات مئوية و10,000 × جرام لمدة 10 دقائق لإزالة الجسيمات الصغيرة والأجسام الموتية.
      5. قم بترشيح المادة الفائقة عبر فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي نظيف بسعة 50 مل.
      6. قم بمعالجة الوسط المصفى فورا لعزل الإكسوسوم، أو الأكوت وخزنها عند -80 درجة مئوية.
         ملاحظة: يمكن تخزين الوسط المصحى عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
   3. عزل الإكسوسومات بواسطة الترسيبات القائمة على البوليمرات
      1. قم بإذابة الوسط المصحى على الثلج إذا كان مجمدا.
      2. في أنبوب معقم على الجليد، ادمج الوسط مع محلول تركيز الإكسوسوم بنسبة حجم 4:1 (مثلا، وسط 20 مل: محلول 5 مل). قم بتدوير الخليط لمدة دقيقة واحدة لضمان التجانس.
      3. اترك الخليط دون اضطراب عند 4 درجات مئوية لمدة 16–18 ساعة للسماح بترسيب الإكسوسومات.
         ملاحظة: يمكن تمديد وقت الحضانة بشكل مناسب لزيادة الإنتاجية المحتملة، ولكن يجب ألا يتجاوز 24 ساعة.
      4. قم بعمل الطرد المركزي للخليط عند 4 درجات مئوية و10,000 × جرام لمدة 75–80 دقيقة لإزالة الحبيبات الإكسوسومية. استنشق السوبرنت بعناية وتخلص منها دون إزعاج الحبيبة.
      5. قم بالطرد المركزي في الأنبوب مرة أخرى عند 4 درجات مئوية و10,000 × جرام لمدة دقيقتين. قم بإزالة أي فائض متبقي باستخدام ماصة.
      6. أعد تعليق حبيبات الإكسوسوم في 1x PBS (استخدم 200 ميكرولتر من PBS لكل وسط مكيف 20 مل).
      7. نقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و12,000 × جرام لمدة دقيقتين، مع الاحتفاظ بالسوبرناتينت الذي يغني بجسيمات الإكسوسومات (كرر إذا لزم الأمر).
   4. تنقية الإكسوسومات
      1. قم بتطبيق تعليق الإكسوسوم على عمود مرشح لتنقية الإكسوسوم الموضوع في أنبوب تجميع.
      2. قم بطرد المركزي على العمود عند 4 درجات مئوية و3000 × جرام لمدة 10 دقائق.
      3. اجمع السائل الذي يمر عبر التيار من أسفل أنبوب التجميع. يحتوي هذا السائل على الإكسوسومات المنقاة.
   5. تخزين الإكسوسومات المنقاء
      1. أليكوت تعليق الإكسوسوم المنقى إلى أحجام ذات استخدام واحد مناسبة للتجارب اللاحقة.
      2. خزن الأليكوات عند -80 درجة مئوية.
         ملاحظة: الأليكوتينج ضروري لتجنب تكرار دورات التجمد والذوبان، التي قد تضعف سلامة الإكسوسومات والنشاط البيولوجي.
   6. توصيف وتحديد DPSCs-Exo
      1. إجراء التحليل الشفي باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) كما هو موضح في الخطوات 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. استخدم معصية، اسحب 10 ميكرولتر من عينة تعليق الإكسوسوم المحضرة، ثم أسقطها على بارافيلم جاهز مسبقا. ضع شبكة النحاس المطلية بالفورمفار/الكربون، جانب الفيلم مواجها للأسفل، على القطرة، ودعها تمتص بشكل طبيعي لمدة 10–15 دقيقة.
      3. استخدم شريط ورق فلتر لامتصاص أي سائل زائد واتركه ليجف في الهواء لفترة وجيزة.
      4. استخدم ماصة، اسحب 10 ميكرولتر من محلول حمض الفوسفوتونغستيك بنسبة 2٪، ثم أسقطه على البارافيلم. اقلب الشبكة التي أكملت خطوة الامتصاص بحيث يواجه جانب الفيلم محلول التلوين، واتركها لمدة 3–5 دقائق.
      5. استخدم شريط ورق فلتر لامتصاص السائل الزائد واترك الشبكة تجف تحت مصباح متوهج.
      6. راقب والتقاط الصور باستخدام مجهر إلكتروني ناقل.
      7. إجراء تحليل توزيع الحجم والتركيز باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) كما هو موضح في الخطوات 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. اشطف غرفة العينة ثلاث مرات بماء فائق النقي.
      9. قم بمعايرة الجهاز باستخدام خرزات البوليسترين القياسية بقياس 100 نانومتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تابع القياسات بعد معايرة ناجحة.
      10. اشطف غرفة العينة ب 1× PBS.
      11. قم بتخفيف عينة الإكسوسوم بمقدار 1× PBS (تخفيف 1:500) وحملها في غرفة العينة. راقب حركة الجسيمات في الوقت الحقيقي باستخدام برنامج الآلة.
      12. احصل على البيانات وأنشئ تقرير التحليل المقابل.
      13. حدد علامات البروتين من خلال تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في الخطوات 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. عينات إكسوسومات ليز باستخدام محلول تحلل بروتين خاص بالإكسوسومات وقياس تركيز البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينشونينيك (BCA).
      15. جهز جل المحلول وتكديس. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين لكل مسار وأضف 5 ميكرولتر من مؤشر البروتين لكل جل.
      16. قم بالرحلان الكهربائي بجهد ثابت 80 فولت حتى تصل جبهة الصبغة إلى هلام المعالج، ثم زد إلى 120 فولت واستمر حتى تصل جبهة الصبغة إلى أسفل الهلام.
      17. قم بقص غشاء بولي فينيليدين فلورايد (PVDF) إلى الحجم المناسب وتفعيله بنقعه في الميثانول لمدة 5 دقائق.
      18. تحضير مخزن نقل يتكون من 25 مللي مولار قاعدة تريس، 192 ملليمولار جليسين، و20٪ (v/v) ميثانول (pH = 8.3). توازن جميع مكونات النقل في مخزن النقل.
      19. قم بتجميع ساندويتش النقل بالترتيب التالي من الكاثود إلى الأنود: إسفنجة – ورق مرشح – جل – غشاء PVDF – ورق فلتر – إسفنجة. قم بإزالة أي فقاعات هوائية وإجراء نقل البروتين بتيار ثابت قدره 300 مللي أمبير.
      20. بعد النقل، اشطف غشاء PVDF لفترة وجيزة بمحلول ملحي مخزن ب Tris مع 0.1٪ Tween20 (TBST) وكتلة بحليب خالي من الدهون 5٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف.
      21. حضن الغشاء بالأجسام المضادة الأولية (مثل مضاد CD63 ومضاد TSG101) مخفف في حليب خالي من الدهون 5٪ طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع هز لطيف. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل مرة.
      22. حضن الجسم المضاد الثانوي المناسب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، تليها ثلاث غسلات باستخدام TBST (5 دقائق لكل منها).
      23. تحضير محلول عمل جديد للتلميض الكيميائي الكهربائي (ECL) (خلط المحاليل A و B بنسبة 1:1)، وتطبيقه على الغشاء، واكتشاف الإشارات باستخدام نظام تصوير كيميائي للتلميع.

2. عزل وزراعة خلايا الكيراتينية الجلدية الأولية لدى الإنسان

1. جمع العينات ونقلها
   1. احصل على عينات من نسيج القلفة من متبرعين ذكور أصحاء في مستشفى الشعب التابع بجامعة نينغبو.
   2. ضع نسيج القلفة المستخرج فورا في PBS بدرجة 4 درجات مئوية مع 100 U/mL بنسلين-G و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين.
   3. نقل العينات إلى المختبر عند 4 درجات مئوية ومعالجة خلال 6 ساعات.
2. تحضير الحوض المعقم وتجزئة الأنسجة
   1. اغمر النسيج في إيثانول بنسبة 70٪ لمدة تتراوح بين 30 ثانية إلى 3 دقائق.
      ملاحظة: قم بضبط وقت الغمر بناء على حجم الأنسجة عند التعقيم الأولي.
   2. باستخدام مقص معقم أو مشرط، قم بتشريح وإزالة الدهون تحت الجلد والأنسجة الضامة من عينة النسيج المغسولة.
   3. قم بتقطيعه إلى شظايا صغيرة (حجم الشظية <1 مم³) باستخدام شفرات جراحية معقمة.
      ملاحظة: عادة ما يستغرق تقطيع 3–4 عينات من الأنسجة أقل من 15 دقيقة. أضف كمية صغيرة من PBS أثناء التقطيع إذا بدا أن النسيج جاف.
   4. انقل العجينة المفروم إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل يحتوي على محلول هضم من 2.5 ملغ/مل من كولاجنازي النوع الأول و2.5 ملغ/مل ديسباز II. أضف 10–20 مل من محلول الهضم لكل قطعة من النسيج المفروم.
   5. حضن الخليط في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. حافظ على التحريك الخفيف عند 80 × جرام، أو حرك الأنبوب بقوة يدويا كل 20 دقيقة.
3. الهضم الثانوي وعلاج DNase
   1. أضف 0.25٪ من تريبسين-إيدتا إلى خليط الهضم بنسبة حجم 1:5. حضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة مع تحريك لطيف.
      تحذير: التربسين مهيج. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة.
   2. أضف محلول DNase I (10 ملغ/مل) إلى الخليط بنسبة 10 ميكرولتر لكل مل من إجمالي حجم الهضم. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف.
4. إنهاء الهضم وزراعة الخلايا الأولية
   1. أوقف الهضم الإنزيمي بإضافة كمية متساوية من DMEM مع 10٪ FBS.
   2. قم بتفكيك الخليط جيدا عن طريق استخدام النبوبات للأعلى والأسفل حوالي 20 مرة لتفكيك شظايا الأنسجة. قم بترشيح تعليق الخلية عبر مصفاة خلية بطول 100 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 مل.
   3. قم بعمل جهاز التعليق المركزي للخلية عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا وقطع الأنسجة.
   4. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من وسط الزراعة الكامل (α-MEM مع 20٪ FBS، 100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين).
   5. قم بزرع الخلايا المعلقة والبذر في طبق زراعة بحجم 10 سم وأضف وسط الزراعة الكامل إلى حجم نهائي يبلغ 6 مل.
   6. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_.
      ملاحظة: قم بإضافة زراعة الخلايا الكيراتينية ب Y-27632 بتركيز نهائي يبلغ 5 ميكرومولار أثناء الزراعة.
5. صيانة الخلايا والزراعة الفرعية
   1. قم بتحديث وسيط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة.
   2. راقب الخلايا يوميا.
      ملاحظة: عادة ما تهاجر خلايا الكيراتينية الجلدية الأولية من القطع النسيجية وتصل إلى 80-90٪ من التقاء الأشجار خلال 10-14 يوما.
   3. في الزراعة الفرعية، يتم فصل الخلايا باستخدام 0.05٪ تريبسين-EDTA عند وصولها إلى 80–90٪ التقاء القوام.
      تحذير: التربسين مهيج. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة.

3. التحقق الوظيفي لوظيفة الإكسوسومات المضادة للالتهاب من ممرات مختلفة

1. زرع الخلايا وتحضيرها
   1. تزرع خلايا الكيراتينية الجلدية للبذور بكثافة 1.5 × 10^{إلى 5} خلايا لكل بئر في صفيحة مكونة من 12 بئرا. أضف 1 مل من الوسط الكامل إلى كل بئر وزرع الخلايا لمدة 24 ساعة.
   2. عندما يصل التقاء الخلايا إلى حوالي 70٪، استنشق الوسط بعناية، واغسل طبقة الخلية الأحادية بلطف مرتين باستخدام 1× PBS المسخن مسبقا.
2. التحفيز الالتهابي وعلاج الإكسوسومات
   1. تحفز نموذج خلوي صدفي الشكل، وتحفيز الخلايا بخليط السيتوكين الالتهابي "M5" (يحتوي على IL-1α، IL-17A، IL-22، Oncostatin M، وTNF-α، كل منها بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل).
   2. بالنسبة لمجموعات العلاج، يتم حضن الخلايا المحفزة معا باستخدام DPSC-Exos (50 ميكروغرام لكل بئر).
   3. بالنسبة لمجموعة التحكم السالبة (NC)، أضف حجما مكاويا ل PBS بدلا من الإكسوسومات.
      ملاحظة: قم بإجراء جميع التحفيز والعلاجات في وسط خال من Y-27632 لتجنب تداخله المحتمل مع مسارات الإشارات الالتهابية.
3. جمع العينات وتحليل qRT-PCR (مقارنة وظيفية عبر المقاطع)
   1. احصد الخلايا واستخرج الحمض النووي الريبي بعد 24 ساعة من العلاج.
   2. حلل تعبير المؤشر الالتهابي الرئيسي IL-23A.
      1. قارن التأثيرات المثبطة على تعبير IL-23A بين مجموعات علاج الإكسوسومات المشتقة من ممرات مختلفة (P2، P4، وP6) باستخدام qRT-PCR لتقييم التغيرات المعتمدة على الممرات في وظيفة الإكسوسومات.
      2. قم بإجراء qRT-PCR باستخدام ظروف الدورة التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 40 دورة إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، والتلدين/التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      3. إجراء تحليل منحنى الصهر من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لتأكيد خصوصية التضخيم.
         ملاحظة: تسلسلات التمهيد: Human-IL-23A (للأمام: 5'-GAAGAGGGAGATGAGAGAGAC-3'، الخلف: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTC-3'); Human-H36B4 (الأمامي: 5'-GCAATGTGGCCAGTGTGTGTGT-3'، الخلف: 5'-GCCTTGACCTTCAGCAAG-3')

النتائج

تحديد وتوصيف خلايا اللب الجذعية السنية
أظهرت الخلايا الجذعية الأولية للب الأسنان (DPSCs) المعزولة باستخدام البروتوكول الموصوف نموا مستقرا وشكلا ميزانيا نموذجيا للميزانشيمي أثناء التوسع الصناعي. كما هو موضح في الشكل 1، أظهرت الخلايا المضغوطة في الممرات 2 و4 و6 مجموعة متجانسة من خلايا تشبه الخلايا الليفية على شكل المغزل، دون وجود اختلافات شكلية واضحة أو علامات تمايز تلقائي عبر المقاطع. تم زراعة جميع ممرات DPSCs ...

المناقشة

يوفر البروتوكول الموحد الموضح في هذه الدراسة إطارا قابلا للتكرار لعزل الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSCs)، وإنتاج الإكسوسومات المشتقة من DPSC (DPSC-Exos)، والتحقق الوظيفي لهذه الحويصلات عبر ممرات خلايا متعددة. تسلط المناقشة أدناه الضوء على الاعتبارات الإجرائية الحيوية، واستراتيجيات التحسين، والقيود المنهجية، والأهمية الأوسع لهذا سير العمل في أبحاث الطب التجديدي.

تعتمد موثوقية هذا البروتوكول على مراقبة جودة صارمة في المراحل الأولى، بدءا من مصدر الأنسجة والتعامل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.05٪ حل تريبسين-إيدتا	جيبكو	25300054	وبفضل قوته الهضمية، يستخدم التربسين على نطاق واسع في تفكك الخلايا، ومرور الزراعة الخلوية بشكل روتيني، وتفكك الأنسجة الأولية.
طبق زراعة الخلايا والأنسجة بحجم 100 مم	بيوفيل	TCD010100	معالج/غير معالج على السطح معقم غير البيروجينيك خالي من DNase/RNase
خرز 100 نانومتر PS	ثيرمو فيشر	3100A	قبل إجراء تجارب تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، يجب معايرة الجهاز باستخدام معيار بحجم جسيمات معروف بدقة (100 نانومتر).
أنبوب طرد مركزي مخروطي سائب بسعة 15 مل	كيرغن	KG2611	معقم، RNase/Dnase وخالي من البيروجينية
شبكة نحاسية مطلية بالكربون من فورمفار مكونة من 200 شبكة	تشونغجينغ   Scientific  الآلات الموسيقية	AZH200	يدعم عينات الإكسوسوم لتصوير TEM (TEM). يعزز طلاء فورمفار-كربون التصاق العينة وموصليتها، بينما توفر شبكة 200 شبكة مساحة مفتوحة كافية لتوزيع الجسيمات بشكل متساو والتصوير المستقر.
37 & درجة؛ حاضنة C	ثيرمو ساينتفيك	51032877	توفر حاضنة ثاني أكسيد الكربون بزاوية 37 درجة بيئة مثالية في المختبر.
أنبوب طرد مركزي مخروطي سائب بسعة 50 مل	كيرغن	KG2811	معقم، RNase/Dnase وخالي من البيروجينية
الأجسام المضادة المضادة ل CD63 [MX-49.129.5]	أبكام	ab193349	الجسم المضاد المضاد ل CD63 [MX-49.129.5] (ab193349) هو جسم مضاد وحيد النسيلة للفأر يكشف عن CD63 in ؛ البقعة الغربية، قياس خلوية التدفق (داخليا)، قياس خلية التدفق، IHC-P، ICC/IF. مناسب ل  إنسان.
الأجسام المضادة المضادة ل-TSG101 [EPR7130(B)]	أبكام	ab125011	الأجسام المضادة المضادة TSG101 [EPR7130(B)] (ab125011) هو جسم مضاد وحيد النسيلة للأرنب يكشف عن TSG101 في  البقعة الغربية، قياس خلوية التدفق (داخليا)، قياس خلية التدفق، IHC-P، ICC/IF. مناسب ل  إنسان، فأر، فأر.
عداد الخلايا الآلي	كونتستار	IC1000	عداد خلوي آلي للعد السريع والدقيق للخلايا
مجموعة اختبار بروتين BCA	بيوتايم	P0012	لدي علاقة خطية جيدة ضمن نطاق التركيز من 50 إلى 2000 & mu; G/ML.
الطرد المركزي على سطح الطاولة	بيوريدج	TD5	جهاز الطرد المركزي على سطح الطاولة لفصل العينات بسرعة وكفاءة في بيئات المختبر
خزانة السلامة البيولوجية	ثيرمو ساينتفيك	1379	خزانة السلامة البيولوجية هي جهاز احتواء معقم يحمي المشغلين والعينات والبيئات من المخاطر البيولوجية عن طريق تصفية مسببات الأمراض المحمولة جوا ومنع التلوث المتبادل أثناء العمل الميكروبيولوجي.
لوحة زراعة الخلايا، 12-بئر	إبندورف	0030721110	تمت معالجة مزرعة الأنسجة، مع غطاء، قاع مسطح معقم، خال من البيروجينات والريبوز والريبوز القابل للكشف DNase، الإنسان والإنسان. باكت. DNA غير سام
صفيحة زراعة الخلايا، 96-بئر	NEST	701001 0714B	معالجة مزرعة الأنسجة، البوليسترين، غير البيروجينيك، معقم
حفظ الخلايا	NCM	C40100	خلو من المصل والبروتين الحيواني لتجميد الخلايا
كولاجيناز، النوع الأول، مسحوق	جيبكو	17100017	الكولاجيناز هو بروتياز يقطع الرابط بين حمض أميني محايد (X) وجليسين في تسلسل Pro-X-Gly-Pro، والذي يوجد بتردد عال في الكولاجين.
ديسباسي II، مسحوق	جيبكو	17105041	ديسباز II (بروتيز محايد) هو ببتيداز أمينو-إندو يقوم بتحليل الروابط الببتيدية N-الطرفية لبقايا الأحماض الأمينية غير القطبية.
دولبيكو ميديف إيجل	Gibco	C11995500BT	[+]4.5g/L D-جلوكوز [+]L-جلوتامين [+]110mg/L بيروفات الصوديوم
مجموعة النسخ العكسي Evo M-MLV	المدعي العام	AG11707	كاشف نسخ عكسي مخصص ل RT-PCR في الوقت الحقيقي. يستخدم هذا النموذج نسخ Evo M-MLV العكسي مع قدرة تمديد قوية، مما يتيح تخليقا فعالا للحمض النووي النووي خلال فترة زمنية قصيرة.
محلول تركيز الإكسوسوم	أوميبيو	UR52111	استخرج الإكسوسومات من المادة الفائقة للخلية
مصل البقر الجيني المستنفد من الإكسوسوم	أوميبيو	UR50202	تم الحصول على مصل الأبقار الجنيني الخالي من الإكسوسومات عن طريق ترشيح المصل الأبقاري الجنيني السليم الذي تم جمعه بشكل معقم، و &ge؛ تمت إزالة 99٪ من الإكسوسومات الداخلية في مصل البقر الجنيني. كان له نفس معدل نمو الخلية والشكل مثل مصل الأبقار الجنيني قبل المعالجة.
مصل البقر الجنني، مؤهل، أستراليا	جيبكو	10099141	مستوى الهيموغلوبين:  ≤ 30 ملغ/ديسيلتر (المستويات بشكل روتيني وأقل وزن؛ 25 ملغ/ديسيلتر)
هيومان-H36B4	سانغون بيوتيك	SB002	الأمامي: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTGTGTGT-3'; الخلف: 5'-GCCTTGACCTTCAGCAAG-3'
هيومان-IL-23A	سانغون بيوتيك	SB002	الهجوم: 5'-جاجاجاغاغاغاغاغاجاجاك-3'; الخلف: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTC-3'
المجهر البيولوجي المقلوب	لايكا	DMI1	راقب الخلايا أو الأنسجة الحية التي تلتصق بجدران الحاويات مثل قوارير الزراعة وأطباق البتري.
الحد الأدنى من الوسط الأساسي	Gibco	C12571500BT	[+]L-جلوتامين [+]ريبونوكليوسيديات [+]ديوكسي ريبونوكليوسيدات
مجموعة استخراج RNA سريعة من نوع NcmSpin	NCM	M5106	يمكن لهذه المجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الكلي بسرعة من ما يصل إلى 3,000,000 خلية وما يصل إلى 10 ملغ من الأنسجة.
البنسلين-ستريبتوميسين	NCM	C100C5	يحتوي على 10,000 وحدة/مل من البنسلين و10,000 ميكروغرام/مل من الستربتوميسين. تم تصفيتها لإزالة البكتيريا ويمكن استخدامها مباشرة في زراعة الخلايا. يمنع بشكل فعال التلوث البكتيري للخلايا.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	ترانس جين	AQ601-02-V2	صبغة فلورية ترتبط بالأخدود الصغير لكل الحمض النووي مزدوج السلسلة وتصدر ضوءا أخضر عند الإثارة. أثناء تضخيم PCR، يتم دمجه في الحمض النووي المضخم حديثا، مما يؤدي إلى زيادة التألق. خلال خطوة إزالة الطبع، تنفصل خيوط الحمض النووي، مما يطلق الصبغة ويسبب انخفاضا كبيرا في إشارة الفلورة.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	فيفا سيل بايوساينسز	C3582-0500	وظيفته هي الحفاظ على درجة الحموضة في الوسط ضمن النطاق الفسيولوجي والحفاظ على توازن الضغط الأسموزي داخل وخارج الخلية.
حمض الفوسفوتونغستيك	سولاربيولوجيا	G1870	يستخدم كصبغة سلبية لتحضير عينات TEM.
حمامات المياه الاهتزازية في جنوب غرب	جولابو	(DIN 12876-1)I	تتراوح درجات حرارة العمل من +20 إلى +99.9 ° C
فلتر الحقنة,0.22 μ ذكور/33 مم، PES	بيوتايم	FF362	DNase/RNase خالي من البروتين منخفض البروتين غير البيروجينيك ملفوف بشكل فردي
المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)	هيتاشي	HT7700	يستخدم للتصوير عالي الدقة لشكل الجسيمات النانوية، بما في ذلك الإكسوسومات. تعمل بجهد متسارع 80– 100 كيلوفولت لرؤية عينات مصبوغة سلبا وتأكيد حجم الجسيمات وشكلها وسلامة الهيكل.
ZetaView_Particle متريكس	مقياس الجسيمات	PMX-120	يستخدم لقياس حجم الجسيمات وتركيزها وإمكانات زيتا وخصائص الفلورة للجسيمات النانوية.