اكتشاف هرمونات الجنس في فيلم الدموع البشري باستخدام اختبارات المقاومة المناعية المرتبطة بالإنزيمات

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) المحسنة للكشف وقياس 17β-إستراديول والتستوستيرون في سائل الدموع البشري الذي يجمع عبر أنابيب الشعيرات الدموية الدقيقة. يتيح هذا النهج قياسا طفيفا للتوغل لمستويات هرمون الدموع.

الملخص

طبقة الدموع هي سائل معقد متعدد الطبقات ضروري للحفاظ على صحة سطح العين، ووضوح البصر، والحماية من مسببات الأمراض والضغوط البيئية. يتكون بشكل أساسي من الدهون والسائل المائي والبروتينات الذائبة والمخاطات، ولا يعمل فقط على تشحيم وحماية العين، بل كوسيلة تشخيصية قيمة لاضطرابات سطح العين مثل مرض جفاف العين. تعرف هرمونات الجنس، بما في ذلك الأندروجينات والإستروجينات، بتأثيرها على تركيب أفلام الدموع، لكن قياس هذه الهرمونات في سائل الدموع محدود بسبب انخفاض حجم العينات والتحديات التقنية. يصف هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتكييف مجموعات اختبار المناعة المرتبطة بالإنزيمات (ELISA) المتاحة تجاريا للكشف عن 17β-إستراديول والتستوستيرون في الدموع القاعدية التي تم جمعها باستخدام أنابيب الشعيرات الدموية الدقيقة. يتضمن سير العمل استراتيجيات مثالية لجمع العينات، والتخفيف، وتحضير الاختبارات لتمكين تحليل عينات الدموع منخفضة الحجم. يثبت البروتوكول إمكانية وتكرار اكتشاف الهرمونات في سائل الدموع باستخدام طرق ELISA المعدلة. تستمد النتائج التمثيلية من عينات تجريبية مجمعة وتهدف إلى توضيح أداء الاختبارات بدلا من الفروق البيولوجية. قد يدعم هذا النهج الدراسات المستقبلية التي تحقق في سائل الدموع كمصفوفة لقياس الهرمونات في أبحاث سطح العين.

المقدمة

يلعب فيلم الدموع أدوارا حيوية في حماية وتغذية وتزييت سطح العين¹. سمكه تقريبا بين 2–5.5 ميكرومتر وحجمه 3–10 ميكرولتر، مع معدل دوران يبلغ 1–2 ميكرولتر في الدقيقة على عين سليمة ^2,3. تفرز الغدد الدمعية المكون المائي من الدموع، الغني بالماء والإلكتروليتات والبروتينات والعوامل المضادة للميكروبات، بينما تنتج غدد ميبوميان دهونا تبطئ تبخر طبقة الدموع، وتطلق خلايا الكأس الملتحمة المخاط الذي يدعم تزييت سطح العين⁴. يحدث إنتاج الدموع بطريقتين رئيسيتين: 1) الإفراز القاعدي، الذي يحافظ على طبقة دمعة مستقرة على سطح عين سليم، و2) الإفراز الانعكاسي، الذي يتم تحفيزه بواسطة محفزات مثل التهيج أو المشاعر أو الأضواء الساطعة. التركيب الكيميائي الحيوي يختلف بين الاثنين، مما يمكن أن يؤثر في النهاية على الطريقة المستخدمة لجمع الدموع للتحليل ^5,6. عادة ما تحتوي التمزقات القاعدية على تركيزات أعلى من البروتينات والدهون التي تدعم استقرار طبقة الدموع وصحة القرنية، بينما تميل الدموع الانعكاسية إلى أن تكون ذات حجم مائي أعلى وأكثر تخفيفا لطرد المهيجات وحماية سطح العين ^7,8,9.

نظرا لأن الدموع تعمل على تنظيم الالتهاب، والدفاع ضد مسببات الأمراض، وتزويد القرنية الوعائية بالعناصر^{الغذائية،} فقد أصبحت نقطة محورية لأبحاث المؤشرات الحيوية¹⁰. توفر الدموع بديلا طفيف التوغل وفعالا نسبيا من حيث التكلفة لأخذ عينات الدم لمراقبة التغيرات الفسيولوجية، خاصة تلك التي تحدث بالقرب من موقع المرض⁸. لجمع هذه البيانات بدقة، من الضروري جمع البيانات بشكل صحيح¹⁰. تستخدم أنابيب الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية على نطاق واسع لأخذ عينات من التمزقات القاعدية لأنها تسمح بجمعها مع تهيج قليل وتخفيف الدموع⁵. تقلل هذه الطريقة من خطر تحفيز التمزق الانعكاسي، الذي يمكن أن يغير تركيب التمزق ^9,11، من خلال وضع الأنبوب بعناية لتجنب ملامسة الملتحمة البلبرية وحافة الجفن. باستخدام هذا النهج، يمكن للباحثين الحصول على تمزقات قاعدية غير مخففة تعكس الحالة الفسيولوجية لسطح العين. هذا يضمن بقاء العينة وسطا موثوقا لقياس التحليلات الحساسة، مثل هرمونات الجنس^10،12. ومع ذلك، فإن الحجم المحدود الذي تم الحصول عليه يشكل تحديات تحليلية للاختبارات الكيميائية الحيوية في المراحل النهائية. عادة ما ينتج جمع التمزق القاعدي باستخدام أنابيب الشعيرات الدقيقة عدة ميكرولترات لكل عينة، مما يحد من التوافق مع الاختبارات القياسية.

السطح العيني البشري يعرف بشكل متزايد كنسيج مستهدف للهرمونات الجنسية^13،14. تشمل الأدلة الداعمة ذلك الكشف عن نسخ mRNA لمستقبلات الأندروجين (AR)، ومستقبلات الإستروجين (ER)، ومستقبلات البروجستيرون (PR) في الخلايا الحارة في الغدد الدمعية والميبومية، وكذلك في خلايا الظهارة في القرنية والملتحمة وكأس الملتحمة¹⁵. علاوة على ذلك، تم تحديد mRNA التي تشفر الإنزيمات الستيرويدية في هذه الأنسجة، مما يشير إلى القدرة على تحويل السلف الستيرويد إلى هرمونات جنسية نشطة بيولوجيا محليا¹⁶. يشير هذا إلى إمكانية تصنيع هرمونات في الموقع على سطح العين ويثير سؤالا حاسما حول ما إذا كانت هذه الهرمونات تفرز في طبقة الدموع بمستويات يمكن اكتشافها.

تشير الأدلة الحالية إلى أن هرمونات الجنس جزء لا يتجزأ من الحفاظ على توازن سطح العين، رغم أن الآليات الجزيئية الدقيقة لا تزال قيد التحقيق^13,14. يبدو أن الأندروجينات، مثل التستوستيرون، تحفز إفراز الدهون وتثبط الالتهاب؛ وبالتالي، يعتبر نقص الأندروجين على نطاق واسع سببا لجفاف العين التبخري 13,14,17. على النقيض من ذلك، دور الإستروجينات أكثر تعقيدا ويعتمد على السياق 13,14,18. وأثناء مشاركتها في تعديل تركيب وحجم الدموع، غالبا ما ترتبط تقلبات الإستروجين، مثل تلك التي تحدث أثناء سن اليأس أو الحمل أو استخدام وسائل منع الحمل الفموية، بضعف الإفراز المائي، وانخفاض استقرار طبقة الدموع، والتهاب سطح العين^19,20. وبالتالي، يمثل الأفراد الذين يعانون من هذه الاختلالات الهرمونية فئة معرضة لخطر مرتفع للإصابة بمرض جفاف العين (DED)13,14,20.

على الرغم من هذه الأدلة، لا تزال مراقبة الحالة الهرمونية لدى مرضى DED تحديا. على وجه التحديد، لم يتم تحديد ما إذا كانت مستويات هرمونات المصل الجهازي تعكس بدقة مستويات الهرمونات المحلية^{في العين}. هذا التمييز مهم جدا لأن أنسجة سطح العين ثبت أنها تمتلك مستقبلات هرمونات جنسية وتعبير إنزيمات ستيرويدية تدعم التخليق المحلي والتمثيل الغذائي للستيرويدات الجنسية¹⁶. تشير هذه القدرة داخل الكريك إلى أن تركيزات الهرمونات المحلية في طبقة الدموع قد تختلف بشكل كبير عن مستويات المصل المتداولة¹³. لذلك، فإن القياس المباشر لتركيز الهرمونات في سائل الدموع ضروري لفهم التأثيرات الهرمونية المحلية على سطح العين. ومع ذلك، فإن هذه الإجراءات تشكل تحديا تقنيا بسبب قلة حجم عينات الدموع المتاحة للتحليل. تم استخدام تقنيات تحليلية متقدمة مثل الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة (LC-MS) لقياس الهرمونات في الدم وسوائل الدموع ذات الحساسية العالية، لكن هذه الطريقة تتطلب أجهزة متخصصة وخبرة تقنية قد لا تكون متاحة بسهولة لجميع الباحثين^21,22.

اختبار العضلات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) هو تقنية معروفة على نطاق واسع للكشف عن البروتينات والأجسام المضادة والهرمونات وقياسها. لتحليل الجزيئات الصغيرة مثل المنشطات الجنسية، يستخدم هذا البروتوكول تنسيق ارتباط تنافسي. في هذه الطريقة، يتنافس الهرمون غير الموسوم الموجود في عينة الدمعة مع نظير هرموني موسوم بالإنزيم على عدد محدود من مواقع ارتباط الأجسام المضادة. بسبب هذا التنافس، فإن شدة الإشارة، التي تقاس ككثافة بصرية، تتناسب عكسيا مع تركيز الهرمون في العينة؛ فعليا، تشير الإشارة المنخفضة إلى تركيز أعلى من الهرمون المستهدف ^23,24.

تقدم ELISA عدة مزايا عملية للقياس الموجه. إنه فعال من حيث التكلفة وسهل الوصول تقنيا، مما يسمح بتطبيقه في بيئات مختبرية قياسية دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة. علاوة على ذلك، تسهل ELISA الفحص عالي الإنتاجية في صيغ ألواح 96 بئر مع تحضير عينات قليل، مما يوفر كفاءة زمنية وقابلية تكرار عالية²³. ومع ذلك، عادة ما تكون مجموعات ELISA المتوفرة تجاريا محسنة للعينات البيولوجية ذات الحجم الأكبر مثل المصل أو البلازما، وأدائها في عينات التمزق منخفضة الحجم غير محدد بشكل جيد. لمعالجة هذا القيد، يدمج البروتوكول استراتيجيات مخففة ومناولة للعينات لتحسين الكشف عن الهرمونات ضمن نطاق حساسية الاختبار.

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا مرئيا يكيف مجموعات ELISA المتوفرة تجاريا للكشف وقياس 17β-إستراديول والتستوستيرون في عينات دمعة بشرية منخفضة الحجم تم جمعها باستخدام أنابيب شعيرات دقيقة زجاجية. يركز هذا البروتوكول على التعديلات العملية في جمع العينات، والمعالجة، وتحضير الاختبارات لتمكين قياس هرموني قابل للتكرار من خلال أحجام دمعة محدودة. يركز هذا العمل على إنشاء سير عمل عملي لتطبيق منهجية ELISA الحالية على تحليل سائل التمزق. قد يكون هذا النهج أساسا للدراسات المستقبلية التي تبحث في مستويات الهرمونات المحلية على سطح العين.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس مراجعة المؤسسات بجامعة إنديانا (IRB#1908362633)، وتم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المشاركين قبل جمع العينات.

1. مجموعة أفلام الدموع

1. التحضير
   1. حدد حجم التمزق الذي سيتم جمعه، مع الأخذ في الاعتبار أن هناك حاجة إلى نسختين مكررتين للموثوقية الإحصائية لنتائج ELISA.
   2. جهز أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل لتخزين فيلم الدموع.
   3. اختر الأنابيب الدقيقة الشعرية المناسبة لجمع التمزقات. أنصح بالبدء ب 3.33 ميكرولتر أو 5 ميكرولتر وتغيير الحجم إلى حجم أصغر إذا جمعت من حجم أقل من التمزقات على سطح العين.
   4. جهز لمبة ضغط مطاطية مزودة بمجموعة أنابيب الشعيرات الدقيقة، لتسهيل نقل سائل الدموع إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
2. مجموعة الدموع
   1. اطلب من المشارك أن ينظر للأمام مباشرة أو قليلا للأعلى قليلا.
   2. ضع فتحة أنبوب الشعيرات الدموية الدقيقة بلطف في الغضروف الهلالي الممزق بالقرب من الكانثوس الجانبي لجمع التمزقات القاعدية.
   3. قلل من ملامسة بلبرة وحافة الغطاء لتجنب التمزق الانعكاسي قدر الإمكان.
   4. املأ الأنبوب بالتمزقات حتى يمتلئ الجسم.
   5. إذا كانت هناك حاجة لجلسات جمع عدة مرات، حدد جدولة جلسات ضمن 24 ساعة من بعضها البعض وفي أوقات متقاربة خلال اليوم لتقليل تباين مستويات الهرمونات.
3. تخزين الدموع
   1. قم بإغلاق الفتحة في أعلى مصباح الضغط المطاطي ثم إدخال أنبوب الشعيرات الدقيقة داخل المصباح مع وضع الطرف المفتوح داخل أنبوب الطرد المركزي الدقيق للسماح للتمزق بالخروج من أنبوب الشعيرات الدقيقة. قد يكون هناك حاجة إلى ضغط إضافي على المصباح لإخراج أكبر قدر ممكن من عينة الدمعة من أنبوب الشعيرات الدموية الدقيقة.
   2. أغلق غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق لمنع التبخر.
   3. قم بتدوير الأنبوب باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة بقوة 2000 × جرام لمدة 3–5 ثوان لتكون العينة في أسفل الأنبوب قبل التخزين.
   4. خزن في -80 درجة مئوية للحفاظ على استقرار التحليل قبل التحليل.

2. اختبار التستوستيرون

1. جهز معايير التستوستيرون، واتبع البروتوكول
   1. اتبع بروتوكول المجموعة، وتأكد من توفر كواشف ومعدات لإعداد معايير التستوستيرون، والضوابط والعينات.
   2. أعد تشكيل معيار التستوستيرون باستخدام ماء منزوع الأيونات أو مقطر للحصول على محلول مخزوني بمقدار 100 نانوغرام/مل. تأكد من إعادة هيكلة كاملة ودعه يبقى لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
   3. جهز مستوى التستوستيرون في يوم التجربة.
   4. جهز 6 أنابيب طرد مركزي دقيق للمعيار، مع 900 ميكرولتر من مخفف المعايرة في أنبوب 10 نانوغرام/مل و400 ميكرولتر في الأنابيب المتبقية.
   5. تأخذ 100 ميكرولتر من محلول المخزن في الأنبوب الأول (أنبوب 10 نانوغرام/مل)، ثم اخلط جيدا وغير طرف الماصة للنقل التالي.
   6. مقطوبة 200 ميكرولتر من الأنبوب الأول (أنبوب 10 نانوغرام/مل) إلى الأنبوب التالي (3.33 نانوغرام/مل)، اخلط جيدا، ثم غير طرف الماصة للنقل التالي وكرر الخطوة حتى الأنبوب الأخير (0.041 نانوغرام/مل).
   7. ملاحظة: بعد إكمال جميع الخطوات، يجب أن يكون هناك 7 تركيزات من المعايير. يخفف المعايرة كمعيار الصفر (0 نانوغرام/مل). كل معيار معد يكفي لتكرارين فقط.
2. جهز ضوابط التستوستيرون: منخفض، متوسط، وعالي التركيز
   1. أعد تشكيل كل قارورة باستخدام حجم الماء منزوع الأيونات أو المقطر المشار إليه في شهادة التحليل (COA) لمجموعة التحكم
   2. قم بتخفيف كل عنصر تحكم في شكل ثنائي في مخفف المعايرة قبل استخدامه في الفحص
3. جهز عينات
   1. أزل عينات الدموع من -80 درجة مئوية وضعها على الثلج لتذوبت.
   2. بمجرد إذابة العينات بالكامل، قم بعمل طرد مركزي مؤقت لعينات الدموع لضمان وجود جميع العينات في قاع الأنابيب بدرجة حرارة الغرفة لمدة 3–5 ثوان.
   3. اخلط 20 ميكرولتر من العينة مع 80 ميكرولتر من مخفف المعايرة للحصول على حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر لكل نسخة.
   4. خطط لنسختين مكررتين للتجربة من أجل الموثوقية وآبار الربط غير المحددة (NSB) للتحكم الخلفي.
   5. ملاحظة: يتم تحليل كل عينة في آبار مكررة. لذلك، يتطلب الأمر 40 ميكرولتر من عينة الدموع لكل مشارك لإجراء الاختبار، مع خلط 160 ميكرولتر من مخفف المعايرة للحصول على حجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر.
4. إجراء الفحص
   1. جهز جميع المواد الكيميائية، ومعايير العمل، وعينات الدموع، وأدوات التحكم.
   2. قم بإزالة الآبار الزائدة من إطار الميكروبلويت وأعيدها إلى علبة المجففات بدرجة حرارة 4 درجات مئوية.
   3. أضف 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولي (بلون أزرق) إلى كل بئر باستثناء الآبار المخصصة لآبار NSB. غط اللوحة بورق الألمنيوم.
   4. حضن الصفيحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على هزاز ميكرولوح أفقي مداري (مدار 0.12" مضبوط على 500 ± 50 دورة في الدقيقة أو على أقرب إعداد متاح.
   5. جهز كمية كافية من محلول الغسيل ليصل إجمالي 8 غسلات، 400 ميكرولتر لكل بئر/غسيل (4 غسولات قبل و4 غسولات بعد مرحلة الحضانة التي تستغرق 3 ساعات).
   6. استنشق محتويات كل بئر واغسل الطبق 4 مرات باستخدام مخزن الغسيل.
   7. أضف 100 ميكرولتر من مخفف المعايرة إلى آبار NSB ولا يوجد أي آبار قياسية.
   8. أضف 100 ميكرولتر من عينات الدموع القياسية والضابطة والجاهزة إلى الآبار المخصصة.
   9. أضف 50 ميكرولتر من ترافق التستوستيرون إلى كل بئر وامزجه جيدا عن طريق استخدام الماصات.
   10. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على جهاز هزاز ميكرولوح أفقي مداري (مدار 0.12" مضبوط على 500 ± 50 دورة في الدقيقة أو عند أقرب إعداد متاح.
   11. استنشق كل بئر واغسله 4 مرات باستخدام مخزن الغسيل.
   12. جهز محلول الركيزة مباشرة قبل الاستخدام عن طريق خلط كاشف اللون A وكاشف اللون B بنسبة 1:1. خصص 200 ميكرولتر لكل بئر. استنشاق كامل لمخزن الغسل المتبقي قبل إضافة الركيزة.
   13. أضف 200 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر خلال 15 دقيقة بعد التحضير. حضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على سطح الطاولة. احم من الضوء بتغطيته بورق الألمنيوم.
   14. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر بنفس ترتيب محلول الركيزة. اخلط جيدا في كل بئر وسيتغير اللون من الأزرق إلى الأصفر.
   15. قس الكثافة البصرية عند 450 نانومتر و560 نانومتر خلال 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف باستخدام قارئ الميكروبلوت.
   16. ملاحظة: تعليمات الشركة المصنعة توصي بطول موجي مرجعي يبلغ 540 نانومتر أو 570 نانومتر. في هذا البروتوكول، تم استخدام طول موجة 560 نانومتر كأقرب خيار متاح على قارئ الميكرولوتين، لتصحيح الإشارة الخلفية والعيوب البصرية.
5. الحساب
   1. اطرح الكثافة البصرية المقاسة عند 560 نانومتر (الطول الموجي المرجعي) من الكثافة البصرية المقاسة عند 450 نانومتر.
   2. اطرح متوسط الكثافة البصرية ل NSB من كل قراءة فردية للمعايير والعينات وأدوات التحكم، ثم احسب متوسط القياسات المكررة.
   3. توليد منحنى معياري عن طريق ملاءمة البيانات باستخدام نموذج اللوجستيات ذات الأربعة معلمات (4PL).
   4. تحديد تركيزات التستوستيرون عن طريق استيفاء قيم العينة من المنحنى القياسي.
   5. قم بضبط التركيزات المحسوبة بتطبيق عامل تخفيف 5 لأخذ التخفيف بنسبة 1:5 في العينة.
   6. تحقق من القياس بحساب معامل التغير (CV) بين النسخ يجب ألا يتجاوز 20٪.
      1. ملاحظة: ٪CV = (SD/متوسط) × 100

3. اختبار الإستراديول

1. تحضير معايير الإستراديول، وأدوات التحكم، والعينات
   1. اتبع بروتوكول المجموعة، وتأكد من توفر المواد الكيميائية والمعدات لإعداد المعايير والضوابط والعينات.
   2. اترك جميع المواد والكواشف تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
   3. حضر مادة جديدة في يوم التجربة.
   4. المعايير والرقابة جاهزة للاستخدام. أليكوت فقط الكمية المطلوبة للاختبار الحالي لتقليل التلوث والحد من التغيرات المتكررة في درجة الحرارة أثناء التعامل.
   5. تأكد من إعداد ستة معايير (رقم 0–5)، حيث يمثل المعيار 0 بيجا/مل، ويشمل عينة تحكم واحدة مقدمة مع المجموعة.
   6. قم بإذابة العينات المجمدة من درجة حرارة -80 درجة مئوية عن طريق وضعها على الثلج.
   7. قم بتدوير عينات الدموع للأسفل للتأكد من أن جميع العينات في أسفل الأنبوب.
2. إجراء الفحص
   1. قم بإزالة الآبار الزائدة من الميكروبلوح وأعيدها إلى عبوة المجفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. أضف 20 ميكرولتر من المعايير وضوابط والعينات إلى الآبار.
   3. ملاحظة: يجب اختبار كل معيار وعينة باستخدام نسختين مكررات.
   4. لضمان توزيع متجانس، قم بخلط جميع المعايير وأدوات التحكم والعينات جيدا قبل التوصيل مباشرة إلى الآبار.
   5. أضف 160 ميكرولتر من 17 بيتا من إستراديول-HRP مترافقة في آبار الاختبار.
   6. اترك بئر فراغ للركيزة فارغة.
   7. غط البئر بورق الألمنيوم قبل وضعه في الحاضنة. يمكن أن يتبخر المحلول في الآبار إلى ورق الألمنيوم.
   8. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
   9. جهز محلول الغسيل من محلول غسيل 10X خلال فترة الحضانة.
   10. عند الانتهاء من الحضانة، قم بإزالة ورق الألمنيوم واسحب السائل من الآبار.
   11. اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام مخزن الغسيل. انقع > 5 ثوان في كل دورة غسيل.
   12. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة TMB إلى جميع الآبار.
   13. غط الطبق بالكامل بورق الألمنيوم واحتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بالضبط.
   14. أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى جميع الآبار بنفس الترتيب وبنفس المعدل الذي أضيف سابقا محلول الركيزة TMB.
   15. هز الصفيحة الدقيقة بلطف وستتغير المادة من الأزرق إلى الأصفر.
   16. قس الامتصاص عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف.
3. الحساب
   1. اطرح امتصاص البئر الفارغ من قراءات جميع المعايير والعينات وأدوات التحكم لتصحيح العيوب في الإشارة الخلفية والبصرية.
   2. احسب متوسط القياسات المكررة.
   3. توليد منحنى قياسي متوافق باستخدام لوجستي من أربعة معاملات (4PL).
   4. تحديد تركيز الإستراديول عن طريق استيفاء قيم العينات من المنحنى القياسي..
   5. تحقق من القياس بحساب معامل التغير (CV) بين النسخ يجب ألا يتجاوز 20٪.
      1. ملاحظة: ٪CV = (SD/متوسط) × 100.

4. تحليل البيانات باستخدام R و RStudio

1. قم بتثبيت R و RStudio، وتثبيت الحزم المطلوبة المدرجة في جدول المواد قبل إجراء تحليل البيانات.
2. استيراد قياسات الكثافة البصرية للمعايير وأدوات التحكم والعينات إلى برنامج التحليل.
3. قم بمعالجة البيانات مسبقا عن طريق تطبيق تصحيح الطول الموجي كما هو محدد في الاختبار. ثم طرح القيم الفارغة أو القيم غير المكتبية وحساب متوسط القياسات المكررة.
4. ملاءمة منحنى قياسي باستخدام نموذج انحدار لوجستي من أربعة معاملات (4PL) مع التركيز كمتغير مستقل والكثافة البصرية كمتغير استجابة.
5. قم بملاءمة المنحنى في R باستخدام دالة drm() من حزمة drc، مع تحديد النموذج ك fct = LL.4() لانحدار 4PL، مع بيانات التركيز والكثافة البصرية كمدخل.
6. تحقق من جودة ملاءمة المنحنى (مثلا، R² > 0.99 أو جودة الملاءمة المقبولة) قبل تفسير تركيزات العينة.
7. حساب تركيزات الهرمونات بالتنبؤ العكسي باستخدام دالة ED() بناء على منحنى المعيار الملاءم، مع تحديد الجرعة الفعالة المقابلة لقيم كثافة العينة البصرية بناء على النموذج المعدل.
8. قم بضبط التركيزات المحسوبة بتطبيق عامل التخفيف المناسب (مثلا، ×5 لتخفيف بنسبة 1:5).
9. أبلغ عن تركيزات الهرمونات النهائية بالوحدات المناسبة (مثل ng/mL أو pg/mL)، مع التأكد من الاتساق مع المنحنى المعياري، وتصدير البيانات المعالجة لمزيد من التحليل أو التصور.

النتائج

دراسة فيلم دمر التيارين

تم تضمين ما مجموعه 20 امرأة (45–63 سنة) في هذه الدراسة. تصنيف DED كان يعتمد على الأعراض وعلى الأقل علامة سريرية واحدة لدي. على وجه التحديد، كان لدى جميع المشاركين في DED درجة مؤشر أمراض سطح العين (OSDI) > 12 وعين واحدة على الأقل مع وقت تفكك دموع الفلورسين (TBUT) < 5 ثوان أو درجة تلوين فلوريساين القرنية (CFSS) > 3 (مقياس NEI²⁵). كان لدى المشاركين المصنفين كغير ممرضين لمرض نقص المناعة العصبية (DED)...

المناقشة

يتيح جمع الدموع والتحليل وصولا سهلا للتقييم العلمي لصحة سطح العين وتحديد العلامات الحيوية المحتملة^10،22. يصف بروتوكولنا التكيف الناجح لطرق ELISA الشائعة لتحليل عينات أفلام الدموع بحثا عن هرمونات الجنس. طورنا هذه الطريقة لمعالجة القيد الأساسي لتحليل التمزق، وهو الحجم الصغير نسبيا من التمزقات المتاحة. من خلال تحسين سير العمل لاستيعاب هذه القيود على الحجم الصغير، نضمن الكشف الموثوق دون التأثير على الحساسية المطلوبة لقياس دقيق للهرمو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
17 بيتا استراديول كيت ELISA	Abcam	ab108667
رقائق الألمنيوم	Reynolds Wrap	10900000154	أي رقائق ألومنيوم متاحة للمطبخ لحماية المواد الكيميائية من الضوء
أنبوب دقيق 3.33 ميكرولتر	Drummond	1-000-0033	يتضمن لمبة ضغط لنقل السوائل
أنبوب دقيق 5 ميكرولتر	Drummond	1-000-0050	يتضمن لمبة ضغط لنقل السوائل
جهاز الطرد المركزي الصغير	Benchmark Scientific	C1012
أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل	Fisher	05-408-129
قارئ الألواح الدقيقة	Promega	GM3000
هزاز الألواح الدقيقة المداري	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
لغة الكمبيوتر R	Posit Software, PBC (المعروفة سابقًا باسم RStudio Inc.)	R الإصدار 4.5.1	قم بتنزيل لغة R قبل Rstudio من خلال https://cran.r-project.org/
برنامج RStudio	Posit Software, PBC (المعروفة سابقًا باسم RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
حزم R "drc" و "ggplot2" و "patchwork" و "ggpp" و "dplyr" و "readr" و "tidyr" و "writexl"	Posit Software, PBC (المعروفة سابقًا باسم RStudio Inc.)		قم بتثبيت الحزمة في Rstudio
مجموعة التحكم في هرمون التستوستيرون	R&D Parameter	QC165	يباع بشكل منفصل عن كيت ELISA (KGE010)
كيت ELISA لهرمون التستوستيرون	R&D Parameter	KGE010