نموذج شامل للفئران لتقييم مسارات نقل الكبد من خلال أخذ عينات لمفاوية وعوية دموية متزامنة

ملخص

يصف هذا البروتوكول التجريبي نموذج الجرذان الذي ينقل عبر قناة لمفاوية الكبد يتيح التقييم المباشر والكمي لتصريف الكبد اللمفاوي والأوعية. يتيح النموذج أخذ عينات متزامنة من الدم اللمفاوي الكبدي والدم الجهازي للتحقيق في نقل الكبد، والتمثيل الغذائي، والإشارات المناعية، مما يدعم دراسات الحراكية الدوائية وعلم الأحياء الخاص بالكبد.

الملخص

الكبد هو مركز أيضي ومنعوي مركزي يعالج المغذيات والزينوبيوتيك والوسائط المناعية المتداولة. تصل المواد إلى كريات الكبد وخلايا الكبد الأخرى عبر الشعيرات الدموية الجيبية التي تستقبل الدم من الأمعاء عبر الوريد البابي ومن الدورة الدموية الجهازية عبر الشريان الكبدي. تتدفق البلازما المفلولة من الشعيرات الدموية الجيبية إلى فضاء الديسي، حيث يمكن أن تخضع لتحول أيضي، أو تشارك في المراقبة المناعية، أو تتدفق إلى الأوعية اللمفاوية لتكوين لمفاوي كبدي. يمكن أن تساعد عينة اللمف والدم الكبدي في تمكين تحليل مفصل لنقل الكبد والعمليات الأيضية والنشاط المناعي. تم وصف نموذج جراحي للفئران يسمح بأخذ عينات متزامنة من تدفق اللمفاوي الكبدي والدم الجهازي عبر ثلاثة مواقع تدخين مميزة: القناة اللمفاوية الكبدية، الشريان السباتي، والوريد الوداجي. تسمح قنوات القنوات اللمفاوية والشريانية الكبدية بأخذ عينات مستمرة، بينما يمكن استخدام قنية الوريد الوداجي للترطيب المستمر ودعم السوائل أو لجمع الدم الوريدي، مما يسمح بالمقارنة بين الدم الشرياني والوريدي. يؤدي التقنيب الناجح إلى معدلات تدفق لمفاوية الكبد تقارب 0.1 مل/ساعة في الفئران المخدرة، مما يتيح أخذ عينات لمفاوية مستمرة تصل إلى 8 ساعات أثناء إجراء عينات دم شريان وأوريدي في نفس الوقت. يتيح هذا الترتيب مقارنة مباشرة بين الدم الشرياني الجهازي وتدفق الدم اللمفاوي الكبدي، مما يتيح فحصا شاملا لنقل الكبد وتطهيره، بالإضافة إلى عمليات الإشارات الأيضية والمناعية. لتوسيع النموذج أكثر، يمكن إجراء أخذ عينات نهائية من الشريان الكبدي والوريد البابي في نهاية العملية لتمكين المقارنة المباشرة بين تدفق الكبد الداخل، والخارج، والتصريف اللمفاوي. في النهاية، توفر هذه التقنيات منصة متعددة الاستخدامات لتقييم العمليات الكبدية، بما في ذلك الحراكية الدوائية، وتدفق العناصر الغذائية والتمثيل الغذائي، والاستجابات الخاصة بالكبد، تحت ظروف فسيولوجية مرضية مختلفة.

المقدمة

الكبد هو عضو أيضي ومنعوي مركزي مسؤول عن معالجة المغذيات، وإزالة السموم الغريبة، والمراقبة المناعية. الكبد هو أكبر عضو منتج لللمف في الجسم. تشير الدراسات على الثدييات الكبيرة إلى أنها تساهم بنسبة 25٪–50٪ من إجمالي تدفق اللمفاوف ^1,2. تشير دراسات القناة في القوارض إلى أن حوالي 10٪–20٪ من إجمالي تدفق اللمفاوي الصدري ينبع من الكبد ^3,4. ينشأ اللمف الكبدي من بلازما يتم ترشاؤها عبر بطانة الشعر الجيبي المحبطة داخل نسيج الكبد. يتجمع هذا الترشيح في فضاء Disse، وهو حجرة بين خلايا الكبد والخلايا البطانية الجيبية. ثم يمر المصفى عبر فضاء مال إلى الشعيرات الدموية اللمفاوية البابية التي تلتقي لتكوين أوعية تجمع نحو الهيلوم الكبدي وخزان الكهيلي ^5,6.

ينقسم الجهاز اللمفاوي الكبدي تشريحيا إلى شبكات بوابتية، وتحت كبسول، وتحت الفصيلة ^6,7. تظهر الدراسات الحديثة للتصوير الحجمي أن أمراض الجهاز اللمفاوي الكبدي تشكل شبكة متفرعة للغاية تعتمد على عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C)، وتقتصر بشكل كبير على المسارات البابية. تتكون هذه الشبكة بشكل رئيسي من الشعيرات الدموية اللمفاوية التي تصرف بشكل رجعي نحو الوريد الداخلي. من ناحية أخرى، فإن اللمفاوات تحت الكبسولية وتحت الفصوص موزعة على سطح الكبد وفي المناطق الوريدية المركزية على التوالي، هي مسارات تصريف إضافية. كشف تصوير ما بعد الوفاة البشرية أيضا عن شبكة أوعية لمفاوية كثيفة على طول الأوردة الكبدية، مما يشير إلى أن اللمفاوية الوريدية حول البوابات والكبدي تنظم بشكل مشترك تدفق اللمفاوف الكبدية⁸.

يمثل اللمفايا الكبدية مادة فائقة الترشيح المشتق من البلازما تعكس^{كل من} العمليات الأيضية والمناعية ^9,10. تظهر التحليلات الكيميائية الحيوية أن اللمف الكبدي يحتوي على الألبومين، وبروتينات دهنية، وسيتوكينات، ومستقلبات مشتقة من نشاط الجثه الكبدي ^3,4,6، متوافقا مع الملف البروتيومي العام للسائل اللمفاوي المبلغ عنه في أنسجة أخرى¹⁰. أظهرت الدراسات المبكرة أن اللمفاوف الكبدية تحتوي على فئات مختلفة من البروتينات الدهنية، حيث تمثل البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL) جزءا مهينا، مما يتوافق مع الدور المركزي للكبد في تخليق وإعادة تشكيل HDL¹¹. ومن الجدير بالذكر أن الدراسات الحديثة أظهرت أن اللمفاوف الكبدي غنية بإسترات HDL والكوليسترول مقارنة باللمف المساريقاري، مما يبرز مساهمته المميزة في تهريب الدهون ونقل الكوليسترول العكسي³. علاوة على ذلك، يعمل اللمف الكبدي كوسيط مناعي، يحمل وسطاء مناعيين، وخلايا مقدمة للمستضدات، وحويصلات خارج الخلية تربط البيئات الدقيقة الكبدية بالمناعة^{الجهازية.}

التغيرات في تكوين وتصريف اللمفاوف الكبدي هي من السمات الرئيسية لأمراض الكبد. في تليف الكبد وارتفاع ضغط الدم البابوي، يؤدي ارتفاع الضغط الجيب إلى زيادة عدة مرات في إنتاج اللمفاوية، مما يؤدي إلى تليف، والتليف، والاستسقاء بمجرد تجاوز قدرة التصريف. كما أن إصابة الكبد المزمنة تعزز تكوين اللانية اللمفاوية المعتمدة على VEGF-C/VEGFR-3، مع مساهمة إعادة تشكيل لمفاوية مفرطة أو شاذة في التهاب الكبد والوذمة وتراكم الدهون ^9,12. علاوة على ذلك، في مرض الكبد الدهني المرتبط بخلل الأيض (MASLD) وسرطان الخلايا الكبدية، أظهرت زيادة كثافة الكبد اللمفاوية ارتباطا بتقدم المرض ^{والانتشار.}

على الرغم من الدور الفسيولوجي والسريري المركزي للكبد، إلا أنه لا يزال غير مدرس بشكل كاف وغير مستكشف في الأبحاث التجريبية، ويرجع ذلك أساسا إلى التحديات التقنية في عزل اللمفاوف الكبدي النقي. تم وصف نماذج جمع اللمفاوف الصدرية والمضهروية بشكل أوسع، لكنها توفر فقط رؤى غير مباشرة حول آليات نقل الكبد. تم معالجة قيد في المجال من خلال تطوير نموذج قنعة اللمفاوي الكبدي للفئران، مما أتاح جمع اللمفاوف الكبدي بشكل^مباشر. باستخدام هذا النهج، أظهر أن معظم امتصاص البروتينات العلاجية الوريدي عبر الجهاز اللمفاوي يحدث في الكبد والمضاريارية. تسلط هذه النتائج الضوء على اللمف الكبدي كمسار رئيسي للتبادل الجزيئي الكبير بين الدم والجهازين اللمفاوي، مع تداعيات مهمة على الحراكية الدوائية وتوزيع العلاجات البيولوجية⁴.

لسد الفجوات المتبقية، تصف الدراسة الحالية نموذجا شاملا للفئران يتيح أخذ عينات متزامنة من الدم اللمفاوي الكبدي والدم الجهازي عبر قنعة القناة اللمفاوية الكبدية، الشريان السباتي، والوريد الوداجي. يتيح هذا النهج التقييم اللحظي لنقل المذاب عبر وتبادل الأجزاء البينية والجهازية في الكبد، مما يوفر منصة تجريبية قوية للتحقيق في نقل الكبد، والتمثيل الغذائي، والإشارات المناعية، وتصريف الأدوية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. يشمل النموذج أيضا أخذ عينات نهائية اختيارية من الشريان الكبدي والوريد البابي لتمكين المقارنة المباشرة بين تدفق الكبد الداخل، والخارج، والتصريف اللمفاوي.

الشكل 1. مخطط لنموذج القنات المتعددة لأخذ عينات لمفاوية ودم في نفس الوقت. نموذج شامل للقنية يوضح أخذ عينات متزامنة من الشريان السباتي، الوريد الوداجي، الشريان الكبدي، القناة اللمفاوية الكبدية، والوريد البوابتي. (أ) يتم تقطيب الشريان السباتي لأخذ عينات دم متقطعة. (ب) يتم قنية الوريد الوداجي الخارجي للحقن الملحي المستمر للحفاظ على الترطيب وتعويض فقدان السوائل أثناء أخذ العينات. (ج) الشريان الكبدي الشائع، الذي يمتد موازيا للقناة اللمفاوية الكبدية، يحقن لأخذ عينات دم نهائية. (د) يتم تقطيب القناة اللمفاوية الكبدية لجمع اللمفاوف المستمر. (ه) يتم الوصول إلى الوريد البابي عبر ثقب الإبرة لأخذ عينات دم نهائية. تجرى الإجراءات الموضحة في (أ)، (ب)، و(د) قبل أخذ العينة النهائية، تليها (ج) أخذ عينات من الشريان الكبدي ثم (ه) أخذ عينات من الوريد البوابتي. الاختصارات: EJV، الوريد الوداجي الخارجي؛ سرطان الدماغ، الشريان السباتي؛ SVC، الوريد الأجوف العلوي؛ IVC، الوريد الأجوف السفلي؛ Ao، الشريان الأبهر; CHA، الشريان الكبدي الشائع؛ HL، القناة اللمفاوية الكبدية؛ ML، القناة اللمفاوية المسرقيقية؛ SMA، الشريان المسرقي العلوي؛ PV، الوريد البوابتي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة بالحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات في معهد موناش للعلوم الصيدلانية (معرف الأخلاقيات #46283) وأجريت وفقا لإرشادات المجلس الأسترالي والنيوزيلندي لرعاية الحيوانات في البحث والتعليم (ANZCCART) والمدونة الأسترالية لرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية (المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية. أستراليا)¹⁵.

نماذج حيوانية: تم استخدام ذكور أو إناث فئران ألبينو من نوع Rattus norvegicus، أو جرذان سبريغ-داولي (SD) التي تزن 250–350 جراما. تم الحصول على الحيوانات من موردي الحيوانات المختبرية المرخصين (منصة أبحاث الحيوانات في موناش) ووضعت في أقفاص مهواة بشكل فردي تحت درجة حرارة محكمة (22 ± 2 درجة مئوية) ودورة ضوء وظلام لمدة 12 ساعة، مع إمكانية الوصول المجاني للطعام والماء قبل إجراء التجارب. تم تأقلم الحيوانات مع الحيوانات لمدة لا تقل عن أسبوع قبل الجراحة لتقليل التغيرات الفسيولوجية الناتجة عن التوتر.

تم وصف نموذج تقطيب القناة اللمفاوية الكبدية، والشريان السباتي، والوريد الوداجي الذي يتيح أخذ عينات متزامنة من الدم اللمفاوي والكبدي والجهازي. يمكن إجراء أخذ عينات نهائية اختيارية من الشريان الكبدي والوريد البابي تحت التخدير لإجراء تحليل مقارن لتدفق الكبد الداخلي والخارج اللمفاوي. المواد المستخدمة والمواد المدرجية مدرجة في جدول المواد.

1. التحضيرات في اليوم الذي يسبق الجراحة

1. صوم الفأر طوال الليل إذا لزم الأمر للبروتوكول التجريبي المحدد. تأكد من الوصول المجاني إلى الماء في جميع الأوقات.
2. جهز محلول ملحي معقم للتسريب الوريدي أثناء جمع اللمفاوية. تحديد الحجم المطلوب بناء على مدة الجمع (عادة من 3 إلى 5 ساعات) ومعدل تسريب مقترح بين 1.5 و3.0 مل/ساعة لتعويض فقدان السوائل الناتج عن جمع اللمفاوف والدم بالإضافة إلى الخسائر الفسيولوجية مثل إخراج البول.
3. جهز ثلاث قنوات بولي إيثيلين لقنوات القناة اللمفاوية الكبدية، والشريان السباتي، والأوردة الودادية كما يلي:
   1. القناة اللمفاوية الكبدية
      1. اقطع قناة خارجية بقطر 0.8 مم (O.D.)، و0.5 مم قطر داخلي (I.D.) إلى 30–35 سم. تأكد من أن الطول يسمح بالجمع دون شد.
      2. قم بإحرافة طرف الإدخال بزاوية تقارب 45° باستخدام شفرة جراحية معقمة لتسهيل الإدخال.
   2. الشريان السباتي
      1. اقطع قناة بقطر 0.8 مم O.D. و0.5 مم إلى 20–30 سم. حدد علامة على بعد حوالي 2–2.5 سم من الطرف الداخلي للدلالة على عمق الإدخال.
   3. الوريد الوداجي
      1. قص كانيولا بقطر 0.8 مم O.D.، 0.5 مم O.D. أو 0.96 مم O.D.، 0.58 مم I.D. إلى 50 سم أو أكثر. حدد من 1 إلى 1.5 سم من الطرف الداخلي لتحديد عمق الإدخال. تأكد من أن الطول يمكن أن يصل إلى مضخة التسريب دون شد.
4. حضر محلول مضاد للتخثر يتكون من 0.1٪ EDTA في ماء معقم أو 20 IU/mL هيبارين في محلول ملحي معقم.
5. املأ حقنة بحجم 1 مل بمحلول مضاد للتخثر واربط إبرة 25 جرام بقنية O.D. بقطر 0.8 مم أو إبرة 23G بقنوات O.D. بقطر 0.96 مم.
6. اغسل كل قنية بحوالي ثلاثة أضعاف حجمها الداخلي، لضمان عدم بقاء فقاعات هواء.
7. حافظ على القنوات المليئة بمضادات التخثر وسدها بالإبرة والحقنة المرفقة طوال الليل. النقع المسبق بمضاد تخثر يقلل من تكون الجلطات.
8. جهز أنابيب جمع الدم واللمفا. أضف محلول مضاد التخثر لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 ملغ/مل EDTA أو 10 وحدة دولية/مل هيبارين بعد جمع العينة.

2. التحضيرات مباشرة قبل الجراحة

1. غسل جميع القنية بمضاد تخثر للتأكد من الصدمة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
2. تحفز التخدير في الجرذ باستخدام 5٪ من الإيزوفلوران في الأكسجين بسرعة 1 لتر/دقيقة في غرفة التحفيز.
3. راقب التنفس وتأكد من أن المعدل قد تباطأ إلى حوالي 1.5 نفس في الثانية (حوالي 90 نفسا/دقيقة)، مما يشير إلى عمق مخدر كاف.
   تحذير: الإيزوفلوران هو مخدر متطاير ويجب استخدامه داخل نظام تخدير مهوى بشكل صحيح أو غطاء بخار لتقليل التعرض المهني.
4. انقل الفأر إلى وسادة جراحية مسخنة (37°م) وحافظ على التخدير مع 1–3٪ إيزوفلوران في الأكسجين يوصل بمعدل 0.4–0.6 لتر/دقيقة عبر مخروط أنف.
5. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال غياب ردود فعل القرنية وقرص الأصابع. حافظ على التخدير طوال فترة العملية وجمع اللمفاويات.
   ملاحظة: التخدير المستمر ضروري لمنع الألم أثناء الجراحة ومنع تساقط القنية بسبب الحركة.
6. احلق المناطق الجراحية، بما في ذلك الربع الأيمن من البطن (الخط الأوسط إلى الجانب الأيمن، على بعد حوالي 2 سم أسفل القفص الصدري) ومنطقة الترقوة اليمنى أو اليسرى.
7. قم بتعقيم جميع المناطق الجراحية باستخدام 0.5٪ كلورهيكسيدين متبوعا ب70٪ إيثانول.

3. قنية الشريان السباتي

ملاحظة: قد يتم إجراء التقنيب الشريان السباتي قبل أو بعد القناة في الوريد الوداجي.

1. حافظ على نفس الوضعية الظهرية والشق العنقي نفسه.
2. ضع دعامة صغيرة (مثل حقنة 3 مل) أسفل الرقبة لرفع منطقة السباتي.
   ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.
3. افصل عضلات الرقبة لكشف الشريان السباتي على بعد حوالي 1 سم تحت سطح الجلد.
4. عزل الشريان باستخدام ملقط القزحية المنحني. حدد العصب المبهم المجاور وافصله بلطف لمنع تلف العصب.
5. ضع ملقط جرايف مستقيم تحت الشريان لمنع تدفق الدم ومرر خياطتين حريرية 4-0 تحته. اربط الغرز القريب (الجمجمي) بإحكام.
6. قم بعمل شق صغير على سطح الشريان.
7. ارفع غطاء الوعاء بلطف باستخدام طرف ملقط العدسة لتثبيت تجويف الوعاء لإدخال القنية.
8. أدخل القنية إلى العمق المحدد مسبقا 2–2.5 سم. توقع تدفقا خفيفا؛ إذا كان العدد مفرطا، أعد إغلاق ونظفه قبل المتابعة.
   تحذير: الحفر الوعائي والقناة تتطلب أدوات حادة ويجب تنفيذها بعناية لمنع الإصابة العرضية.
9. تأكد من الموضع الصحيح عن طريق سحب كمية صغيرة من الدم بلطف وحقن محلول مضاد التخثر مرة أخرى في القنية دون الشعور بالمقاومة أو ملاحظة تورم تحت الجلد.
10. ثبت القنية بالخياط وأغلق الطرف الخارجي بسدادة.
11. قد يتوقف الإجراء لفترة وجيزة بعد القناة السباتي أثناء التخدير.
12. أغلق الجرح في الرقبة بغرز معقمة. يظهر الشكل 2 نظرة عامة على عزل الشريان السباتي ونجاح الكانولن.

الشكل 2: قنية الشريان السباتي. (أ) عضلات الرقبة المزدوجة التي تحيط بالشريان السباتي (سهام برتقالية). الغدة اللعابية (الأسهم الزرقاء) تكون مطوية من الجمجمة. (ب) الشريان السباتي المكشوف يقع على عمق حوالي 1 سم تحت سطح الجلد. الغدة اللعابية (الأسهم الزرقاء) تكون مطوية من الجمجمة. (ج) إعداد جراحي قبل إدخال القنية، يظهر انسداد تدفق الدم باستخدام ملقط جرايف مستقيم وغرزتين حريريتان تعزل الشريان، مع ربط نهايته العلوية. (د) يتم إدخال حوالي 2 سم من القنية بنجاح في الشريان السباتي (الأسهم الصفراء). تشير الأسهم الخضراء إلى قنية الشريان السباتي. (ه) تم تأكيد نجاح القنية للشريان السباتي عن طريق سحب الدم إلى القنية. (و) ثلاث غرز (الحجم 4-0) مربوطة حول الشريان السباتي والقناة للتثبيت (سهام بنفسجية). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. قنية الوريد الوداجي

1. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهرية مع تمديد الرقبة والرأس مائل قليلا إلى اليسار.
2. حدد الوريد الوداجي فوق الترقوة من خلال موقعه وتدفق الدم المرئي. قم بعمل شق مائل بطول 1–1.5 سم من الترقوة باتجاه القصبة الهوائية.
3. قم بتشريح الأنسجة تحت الجلد بشكل غير مباشر لكشف الوريد.
4. افصل الوريد عن النسيج الضام المحيط باستخدام ملقط القزحية المنحني. أكد العزل عن طريق تمرير الملقط تحت الوريد.
5. ضع غرزتين حريرية 4-0 تحت الوريد في كل طرف من القطعة المكشوفة. اربط الغرز القحفي (العلوي) بإحكام لمنع تدفق الدم.
6. لمنع تدفق الدم العكسي، ضع ملقط جرايف مستقيم تحت الوريد واستند المقابض على حقنة أو دعم.
7. قم بعمل شق صغير (~1 مم) في أعلى الوريد، ثلث القطعة المعزولة باستخدام مقص القزحية.
8. ارفع غطاء الوعاء بلطف باستخدام طرف ملقط العدسة لتثبيت تجويف الوعاء لإدخال القنية.
9. أدخل طرف القنية في الشق باستخدام ملقط القزحية وتقدمه إلى العمق المحدد مسبقا (1–1.5 سم).
10. أطلق الانسداد بمجرد استقرار القنية للسماح بتدفق الدم.
    ملاحظة: حافظ على قبضة ثابتة لمنع التدفق الوريدي العكسي. إذا حدث نزيف، أعد الإغلاق فورا ونظف الحقل قبل المتابعة.
11. تأكد من الموضع الصحيح عن طريق سحب كمية صغيرة من الدم بلطف وحقن محلول مضاد التخثر مرة أخرى في القنية دون الشعور بالمقاومة أو ملاحظة تورم تحت الجلد.
12. ثبت القنية بالغرز عند الطرفين القريب والبعيد.
13. أغلق الأنبوب الخارجي مؤقتا، وأزل المحقنة، وأغلق القنية بسدادة.
14. غط الشق بالشاش المبلل بمحلول ملحي دافئ حتى يكتمل الانتقال إلى الشريان السباتي. تظهر الصور التمثيلية لعزل الأوردة الوداجي والقنية في الشكل 3.

الشكل 3: تفريغ الوريد الوداجي. (أ) الوريد الوداجي (الإطار الأسود المنقط) يقع مباشرة تحت الجلد فوق الترقوة. يمكن ملاحظة قنوية الشريان السباتي المعروفة بالقرب من الوريد الوداجي (الأسهم الخضراء). (ب) الوريد الوداجي معزول بغرزتين حريريتين؛ يتم ربط الطرف العلوي. (ج) يتم إدخال حوالي 1 سم من القنية بنجاح في الوريد الوداجي (سهام صفراء). تشير الأسهم الزرقاء، إلى قناة الوريد الوداجي الودودية؛ تشير الأسهم الخضراء إلى قناة الشريان السباتي. (د) يتم ربط ثلاث غرز (الحجم 4-0) حول الوريد الوداجي والقناة للتثبيت (سهام بنفسجية). تم تأكيد نجاح القناة في الوريد الوداجي بحقن محلول ملحي ناعم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. تقطيب القناة اللمفاوية الكبدية

1. ضع الفأر في وضع الاستلقاء الظهري تحت المجهر الجراحي.
2. قم بعمل شق جلدي أفقي بطول 4–5 سم من الخط الأوسط إلى الجانب الأيمن، على بعد حوالي 1.5–2 سم أسفل القفص الصدري (الشكل 4A، B).
3. قم بسحب الجلد وعمل شقوق متطابقة في العضلات المائلة الخارجية والداخلية.
4. قم بكي أو ربط أي أوعية دموية كبيرة تواجهها لمنع فقدان الدم الزائد.
5. أعد وضع الأعضاء بلطف باستخدام مسحات قطنية مبللة بمحلول ملحي: حرك الكبد نحو الحجاب الحاجز، والمعدة إلى اليسار، والأمعاء الدقيقة إلى الأسفل.
6. حافظ على سحبها مع الشاش المبلل بالمحلول الملحي. يتم توضيح موقع الشق وموقع الأعضاء في الشكل 4C.
7. تحديد القناة اللمفاوية الكبدية (قطرها ~0.6 مم) باستخدام العلامات التشريحية المحددة. تمتد القناة بشكل مواز للشريان الكبدي وذيلية قليلا له، وتقع على الجانب الإنسي للكلية اليمنى وبجوار الوريد الأجوف السفلي.
8. راقب مظهر القناة اللمفاوية الكبدية. عادة ما تبدو شفافة وضيقة.
9. التمييز بين القناة اللمفاوية الكبدية والقناة اللمفاوية المسريقية، التي تكون أكبر وعادة ما تبدو معتمة أو بيضاء بسبب محتوى الكيلوميكرون. لذا يمكن أن تكون القناة اللمفاوية المسارقيوية معلما تشريحيا للمساعدة في تحديد القناة اللمفاوية الكبدية الموجودة في الجمجمة.
10. قم بإزالة النسيج الضام الذي يغطي القناة اللمفاوية والوريد الأجوف باستخدام ملقط جريف المستقيم.
11. قم بإنشاء ممر تحت الوريد الأجوف عن طريق إدخال ملقط جرايف مستقيم عبر الطبقة الدهنية تحت الكلية اليمنى. تقدم حتى تظهر الأطراف على الجانب المقابل تحت الوريد الأجوف، موازية للقناة اللمفاوية الكبدية.
12. أمسك الطرف الخارجي للقنية المحضرة بملقط جرايف المستقيم واسحبه عبر النفق الذي تم إنشاؤه تحت الوريد الأجوف حتى يخرج الطرف من الجانب المقابل.
13. باستخدام ملقط هالستد-موسكيتو الهيموستات، قم بثني طرف إبرة 25G إلى حوالي 90°. باستخدام الإبرة المثنية، قم بثقب القناة اللمفاوية الكبدية على الجانب الأيمن (الأقرب إلى المشغل).
    تحذير: كن حذرا عند التعامل مع الإبر الحادة أثناء ثقب القناة اللمفاوية لمنع الإصابة العرضية.
14. تأكد من أن القنية مليئة بمحلول مضاد للتخثر بدون فقاعات هواء. أدخل الطرف المشطوف بحوالي 2 مم داخل المجاري.
15. راقب الطرف الخارجي للقناة لتدفق اللمفاوف (~ 100 ميكرولتر/ساعة). إذا لم يلاحظ تدفق، قم بتعديل أو إعادة إدخال القنية.
16. بمجرد تأكيد تدفق اللمفاو، قم بسد القنية قبل وضع قطرة صغيرة من اللاصق البيطري لتثبيت موقع الإدخال. بعد التجفيف، تأكد من تدفق اللمف عبر الأنبوب.
17. أزل الشاش وأعد الأعضاء إلى مواقعها الأصلية.
18. ضع أنبوب الجمع الذي يحتوي على محلول مضاد للتخثر أسفل مخرج القنية. تأكد من أن الليمف يتدفق باتجاه القطرات داخل الأنبوب.
19. أغلق جدار البطن عن طريق خياطة الطبقات الداخلية المائلة الخارجية والجلد بشكل متسلسل. يظهر الشكل 5 تحديد القناة اللمفاوية الكبدية ونجاحها في القناة.
    ملاحظة: بعد نجاح عملية تدشين القناة اللمفاوية الكبدية، قد يتوقف الإجراء لفترة وجيزة أثناء الحفاظ على التخدير والترطيب قبل بدء جمع اللمفاويات.

الشكل 4: تعرض القناة اللمفاوية الكبدية. (أ) علامة تشريحية تشير إلى 1.5–2 سم تحت القفص الصدري الأيمن للشق. (ب) شق عبر الجلد وعضلات البطن، كاشفا الأعضاء الداخلية. (ج) الأعضاء التي أعيد تموضعها لكشف القناة اللمفاوية الكبدية. يتحرك الكبد نحو الحجاب الحاجز، والمعدة إلى يسار الحيوان، وتكون الأمعاء الدقيقة مطوية بشكل سفلي. تقع القناة اللمفاوية الكبدية بين الشريان الكبدي (السهم الأخضر) والشريان المسيقاطي (السهم الأزرق). L: كبد؛ SI: الأمعاء الدقيقة؛ IVC: الوريد الأجوف السفلي؛ RK: الكلية اليمنى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تحديد القناة اللمفاوية الكبدية وعملية التقنين. (أ) يمكن ملاحظة الهياكل اللمفاوية والشراينية بعد إعادة تموضع الأعضاء وقبل إزالة الأنسجة الضامة المحيطة. الشريان الكبدي (الأسهم الخضراء) يقع في الجمجمة بالنسبة للقناة اللمفاوية الكبدية المجاورة (الأسهم الصفراء). القناة اللمفاوية المسارقيوية (الأسهم البنفسجية) تقع فوق الشريان المسرقي (خط أسود منقط). تمتد هذه البنى بشكل عمودي على الوريد الأجوف السفلي. IVC: الوريد الأجوف السفلي؛ RK: الكلية اليمنى. (ب) يمكن رؤية القناة اللمفاوية الكبدية (الأسهم الصفراء) بوضوح بعد إزالة النسيج الضام المحيط. تمتد القناة اللمفاوية الكبدية موازية للشريان الكبدي (خط أخضر منقط) ومن حيث الجمجمة بالنسبة للقناة اللمفاوية المسارقيوية (الأسهم البنفسجية) والشريان المسارقي (خط أسود منقط). (ج) يتم إدخال القنية (الأسهم البيضاء) في القناة اللمفاوية الكبدية (الأسهم الصفراء) عبر الثقب الصغير الذي يحدث في القناة اللمفاوية (سهام برتقالية). يمكن رؤية القناة اللمفاوية المسرقيقة (الأسهم الزرقاء). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. فترة ما بعد الجراحة

1. مباشرة بعد نجاح التقنيب اللمفاوي للكبد، ابدأ إعادة الترطيب عن طريق حقن محلول ملحي معقم بسرعة 1.0–2.0 مل/ساعة عبر قناة الوريد الوداجي.
2. حافظ على التسريب طوال فترة جمع اللمفاويات. بدلا من ذلك، يمكن إجراء إعادة الترطيب عبر قنية معدية أو اثني عشر، مما يسمح بحجز قنية الوريد الوداجي لأخذ عينات الدم الوريدية إذا لزم الأمر.
3. أبق الحيوان تحت التخدير على وسادة جراحية مسخنة (37°م) طوال فترة التجمع.
4. راقب معدل التنفس وعمق التخدير طوال التجربة من خلال مراقبة أنماط التنفس والاستجابات الانعكاسية مع الحفاظ على تخدير إيزوفلوران عبر مخروط أنف.
5. تم الحفاظ على الترطيب من خلال التسريب الملحي المستمر (1.0–2.0 مل/ساعة) عبر قناة الوريد الوداجي.
6. لتقليل الاضطراب الفسيولوجي، تم تحديد إجمالي حجم الدم الذي تم جمعه قبل أخذ العينة النهائية إلى <10٪ من حجم الدم المنتشر المقدر وفقا لإرشادات أخلاقيات الحيوانات المؤسسية.
7. اجمع اللمفاوف الكبدية باستمرار في أنابيب تحتوي على مضادات التخثر. استبدل أنابيب الجمع كل ساعة أو حسب الحاجة.
8. اجمع عينات الدم الشريانية في النقاط الزمنية المحددة:
   1. أغلق الأنبوب الخارجي مؤقتا ووصل حقنة فارغة.
   2. اسحب الدم حتى يمتلئ الأنبوب.
   3. استبدل الحقنة بأخرى جديدة لجمع العينات واسحب حوالي 100–200 ميكرولتر من الدم الشرياني في كل نقطة زمنية محددة للعينات.
   4. اشطف القنية بمحلول مضاد للتخثر بعد كل جمع.
   5. أغلق القناة بسدادة.
9. بعد اكتمال جمع العينة، إما المضي قدما في أخذ عينات نهائية من الشريان الكبدي والوريد البوبوبي أو قتل الجرذ بطريقة إنسانية باستخدام بنتوباربيتون الصوديوم (>100 ملغ/كغ) عبر القنية السباتي أو الوداجي.

7. أخذ عينات نهائية من الشريان الكبدي والوريد المبوبي

1. عند الانتهاء من جمع الدم اللمفاوي والدمي، حافظ على تخدير عميق وضمان استقرار التنفس قبل المضي قدما في أخذ عينات الأوعية الوعائية النهائية.
2. أعد فتح الشق البطني بحذر لكشف التجويف العلوي للبطن.
3. اسحب الكبد بلطف نحو الحجاب الحاجز، والمعدة إلى اليسار، والأمعاء الدقيقة في الأسفل باستخدام شاش مبلل بالمحلول الملحي لكشف القناة اللمفاوية الكبدية الموجهة بالكانيلا.
4. حدد الشريان الكبدي الذي يمتد بشكل مواز وذيلي للقناة اللمفاوية الكبدية.
   ملاحظة: يبدو الشريان أصغر وأكثر فتحة من الوريد البابي ويظهر تدفقا أكثر نبضا.
5. حضر قنية بولي فينيل بقطر 0.61 مم، وقطرها 0.28 مم من مادة الهواء، ومملوءة مسبقا بمحلول مضاد للتخثر وخالية من فقاعات الهواء.
6. باستخدام ملقط القزحية المنحني، اعزل جزءا قصيرا من الشريان الكبدي وضع غرزة حريرية 4-0 تحته.
7. ارفع الشريان بلطف وضع غرزة ثانية في البعد إلى الأول. ربط الغرز البعيد للتحكم في التدفق العكسي مع ترك الغرز القريب غير مربوط للإغلاق لاحقا.
8. باستخدام مقص دقيق النقطة، قم بعمل شق عرضي صغير (حوالي 0.5 مم) في جدار الشريان بين الغرز.
9. ارفع غطاء الوعاء بلطف بطرف ملقط دومونت لتثبيت تجويف الوعاء لإدخال القنوية.
10. أدخل الطرف المشطوف من كانيولا البولي فينيل في الفتحة وتقدم حوالي 2–3 مم.
11. ثبت القنية عن طريق ربط الخيط القريب حول كل من الوعاء والقنوية.
12. تأكد من الموضع الصحيح بمراقبة تدفق الدم النابض إلى القنية أو عن طريق استنشاق كمية صغيرة من الدم الشرياني الأحمر الفاقع بلطف من خلال الانقراض.
13. اجمع الدم بحجم 0.5–1 مل في أنبوب محمل مسبقا يحتوي على مضاد تخثر.
14. بعد الجمع، اسحب القنية وتحقق التعقيم الدموي عن طريق شد كلا الغرزتين. يتم توضيح التعرض للشرايين الكبدي وإجراء القناة في الشكل 6.
15. حدد الوريد البابي الذي يمتد بشكل وسطي وعمودي على الشريان الكبدي. الوريد البابي له قطر أكبر ولونه أغمق مقارنة بالشريان الكبدي.
16. قم بتركيب إبرة 23 أو 25 جالون على حقنة بسعة 1 مل مسبقا مع محلول مضاد للتخثر.
17. أدخل حافة الإبرة للأعلى في وريد المدخل بزاوية ضحلة (حوالي 20°–30°) لتجنب انهيار أو تمزق الوعاء.
18. استنشق حجم الدم المطلوب بلطف.
19. نظرا لأن ثقب الأوردة البابية أمر نهائي، يجب قتل الحيوان بشكل إنساني فور جمع العينة بإعطاء >100 ملغ/كجم صوديوم بنتوباربيتون عبر القنية السباتية أو الوداجي بينما يبقى الحيوان تحت التخدير العميق. يتم عرض موقع وريد البوابة وطريقة أخذ عينات الطرف في الشكل 7.
    تحذير: الصوديوم بنتوباربيتون هو مادة خاضعة للرقابة ويجب التعامل معها وإعطاؤها وفقا للوائح المؤسسة وإجراءات السلامة المناسبة.
20. تأكيد الوفاة عن طريق توقف التنفس والنشاط القلبي قبل التخلص من الجثة، وفقا لقانون رعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية أسترالية (NHMRC)¹⁵ وإرشادات ANZCCART.

الشكل 6: تحديد الشرايين الكبدية والقنية. (أ) تعرض الشريان الكبدي (الأسهم الخضراء). يقع الشريان الكبدي بجوار القناة اللمفاوية المسارقيوية (مخطط أسود منقط) وعمودي على الوريد الأجوف السفلي. IVC: الوريد الأجوف السفلي؛ L: كبد. (ب) عزل الشريان الكبدي باستخدام ملقط منحني. (ج) إدخال ناجح (سهام بنفسجية) لكانيولا بولي فينيل بقطر 0.61 مم × 0.28 مم (سهام برتقالية) في الشريان الكبدي (سهام خضراء)، وتم تثبيتها بغرز حريرية 4-0 لأخذ عينات دم شريانية نهائية. يمكن رؤية القناة اللمفاوية المسروقية (الإطار الأسود المنقط). PV: الوريد البواب. (د) بعد تثبيت القنية، يتم تأكيد سلامة القنية عن طريق سحب الدم إلى القنية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: تحديد وريد البوابة وأخذ عينات من الطرف. (أ) الوريد البابي (المشار إليه بإبرة 25G) يقع بين الشريان الكبدي (خط أبيض منقط) والقناة الصفراوية (خط أسود منقط). يبدو الوريد البابي أكبر وأغمق من الشريان الكبدي ويتم الوصول إليه تحت التخدير العميق لجمع الدم النهائي. PV: وريد الباب؛ IVC: الوريد الأجوف السفلي؛ L: كبد؛ SI: الأمعاء الدقيقة؛ RK: الكلية اليمنى. (ب) إدخال إبرة 25G بنجاح في الوريد البابي (خط أسود منقط) لأخذ عينات دم وريدية نهائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

يسمح النهج الجراحي الموضح في قسم البروتوكول بتحديد القناة اللمفاوية الكبدية بوضوح، الواقعة في الوسط للكلية اليمنى وتمتد بالتوازي مع الشرايين السيلياكية والكبدية، كما تم الإبلاغ سابقا^{في 4}. التشريح التمثيلي والكانوليشن موضحان في الشكل 5. يتم تأكيد نجاح القناة من خلال ظهور سائل لمفاوي شفاف إلى عكر قليلا على الفور، خال من تلوث الكيلوميكرون الحليبي، مما يشير إلى خلط بسيط مع اللمفاوف المسريقية. تتوافق هذه الملاحظة مع الخصائص المبلغ عنها لللمفاوم^{الكبدي 3}. تم تحديد اللمفاوی الكبدي بناء على موقعه التشريحي بالنسبة للشريان الكبدي والوريد الأجوف السفلي، بالإضافة إلى مظهره الواضح المميز، على عكس المظهر الليفي المساريقي العادة المعتم أو الحليبي.

يجب أن يظل تدفق اللمفاوف الكبدي مستقرا طوال فترة التجميع، بمعدل متوسط يقارب 0.1 مل/س ^3,4,11. عادة ما يبقى تدفق اللمفاوف الكبدي أكثر استقرارا لمدة حوالي 2–3 ساعات بعد التقنية تحت ظروف تخدير، رغم أن فترات الجمع الأطول (حتى ~6–8 ساعات) قد تكون ممكنة في ظروف تجريبية مثالية. تم تلخيص قيم تدفق اللمفاوف التمثيلية التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات^{السابقة 4} في الجدول 1. عادة ما يكون تدفق اللمفاوف الكبدي أقل من المعدل المبلغ عنه لمعدلات تدفق القنوات اللمفاوية المجروية والصدرية في الفئران المخدرة.

المواقع اللمفاوية (الحالة الواعية)	معدل تدفق اللمفاوف المتوسط (mL/h)
اللمفاوی الصدرية (واعية)	1.74 ± 0.33
اللمفايا الصدرية (مخدرة)	0.65 ± 0.10
اللمفاوية السراعية (مخدرة)	0.45 ± 0.11
اللمفاوي الكبدي (مخدر)	0.12 ± 0.02

الجدول 1: متوسط معدلات تدفق اللمفاوف (mL/h) عبر قنوات القناة اللمفاوية الصدرية والمزاريقاية والكبدية في الفئران الواعية والمتخدرة. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM ل n = 3–5 فئران. مقتبس من الجدول 3 في ياداف وآخرون (2018)⁴.

تظهر النتائج التمثيلية التي توضح النقل اللمفاوي للجزيئات الكبيرة في الشكل 8. تظهر هذه الأمثلة كيف يمكن استخدام النموذج لتقييم التعافي اللمفاوي بعد إعطاء جزيئات علاجية كبيرة عن طريق الوريد، بما في ذلك حوالي 60 كيلو دالتون إنترفيرون مصاب α2a (IFN-PEG40)، وحوالي 31 كيلو دالتون إنترفيرون بيجيليت α2b (IFN-PEG12)، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة تراستوزوماب، مما يشير إلى أن الكبد موقع رئيسي للاستبعاد والوصول اللمفاوي للعلاجات الجزيئية الكبرى⁴.

الشكل 8: التعافي اللمفاوي للعلاجات الجزيئية الكبيرة التي تعطى عن طريق الوريد عبر الصدر واللمفاوي المسرقي والكبد. النسبة الكلية للجرعة التي تم استعادتها في اللمفاوم الصدرية والنسيقاوية والكبدية بعد إعطاء إنترفيرونات PEGylated بأحجام جزيئية مختلفة عن طريق الوريد (IFN-PEG12 و IFN-PEG40) وجسم مضاد وحيد النسيلة (تراستوزوماب). تمثل البيانات متوسط ± SEM لاسترداد الجرعة خلال 8 ساعات. مقتبس من ياداف وآخرون (2018)⁴. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

كما يتيح النموذج التحليل الدقيق للبروتين الدهني لللمفاوم^{الكبدي 3}. تعرض التحليل التمثيلي لتركيب الدهون اللمفاوية في الشكل 9. مقارنة باللمفاوف الصدرية والمضاريوية، يظهر اللمفاوي الكبدي محتوى دهني إجمالي أقل بشكل ملحوظ لكن تركيزات البروتين تقارن بتلك الموجودة في مصادر لمفاوية أخرى. يسلط تحليل البروتينات الدهنية لللمف الكبدي الضوء على الدور الفريد للكبد في تحركات الدهون ونقل الكوليسترول العكسي. يتم تلخيص بيانات تركيب الدهون الممثلة في الجدول 2. HDL اللمفاوي الكبدي غني بإسترات الكولوستيريل، وHDL اللمفاوي المسرقي غني بشكل رئيسي بالدهون الثلاثية، ويحتوي HDL اللمفاوي الصدري على محتوى فوسفوليبيد أعلى نسبيا. تشير هذه الاختلافات التركيبية إلى أدوار مميزة لكل مصدر لمفاوي في أيض الدهون ونقلها.

	٪wt/wt
الكسور	الفوسفوليبيد	الكوليسترول الحر	إستر كوليستريل	ثلاثي الجليسريد
اللمفاوف الميسيناريكية
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
اللمفاوف الكبدية
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
اللمفاوف الصدرية
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
البلازما
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

الجدول 2: تركيب الدهون في كسور البروتين الدهني عالي الكثافة (D-HDL) والضوء (L-HDL) المعزولة من اللمفاوات الميساريقية والكبدي والصدري، والبلازما. تمثل القيم نسبة الوزن (٪ وزن/وزن) من الفوسفوليبيد، والكوليسترول الحر، وكوليستريل إستر، وثلاثي الجليسريد بالنسبة لإجمالي نسبة الدهون الكلي. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM. مقتبسة من الجدول 1 في Gracia وآخرون (2020)³.

الشكل 9: تركيب البروتين والدهون في اللمفاوف الميساريقية والكبدية والصدرية. المحتوى النسبي للبروتين والدهون الكلية في اللمفاوف المسرقي، والكبدية، والصدرية. يشمل محتوى الدهون الفوسفوليبيدات (PL)، الدهون الثلاثية (TG)، إستر الكولوستريل (CE)، والكوليسترول الحر (FC)، ويعبر عنه كنسبة وزن الدهون نسبة إلى الوزن الكلي للبروتين والدهون. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM. مقتبس من غراسيا وآخرون (2020)³. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

قنية القناة اللمفاوية الكبدية هي إجراء تقني صعب، حتى بالنسبة لجراحي الميكرو ذوي الخبرة. يمكن لعدة خطوات حاسمة أن تحسن من احتمالية الحفاظ على سلامة القناة اللمفاوية وتحقيق تدفق لمفاوي مستقر. عند تحديد وعزل القناة اللمفاوية الكبدية (خطوات البروتوكول 5.7-5.10)، تكون الخطوة الأولى إزالة النسيج الضام والدهون التي تغطي القناة اللمفاوية المسارقيقة والوريد الأجوف بالقرب من القناة اللمفاوية الكبدية. القناة اللمفاوية الكبدية شفافة وهشة مقارنة بالقناة اللمفاوية المساريقية الأكثر سمكا وعتامة، ويمكن أن تتمزق بسهولة إذا تم التعامل معها مباشرة. تعد القناة اللمفاوية المساريخية علامة تشريحية مفيدة، حيث يكشف تنظيف الأنسجة العلوية عن القناة اللمفاوية الكبدية الموجودة في الأعلى. نظرا لأن القناة اللمفاوية الكبدية غالبا ما تظهر انحناءات أو انحناءات، يجب على المشغل اختيار نقطة قنية على طول مقطع مستقيم وتوجيه القنية بشكل مواز للمسار الطبيعي للقناة لتقليل خطر الانسداد أو التمزق (الخطوة 5.11-5.14).

الكانوليشن نفسه هو العامل الأهم في النجاح. بعد ثقب القناة (الخطوة 5.13)، يمكن تأكيد الوصول داخل الضوء بصريا عن طريق إدخال طرف الملقط في الفتحة والتأكد من أن جدار وعاء واحد فقط يغطي الأداة. ظهور جدارين متقابلين يشير إلى ثقب من الداخل والداخل. بمجرد تأكيد الوصول داخل المضيئة، يمكن تحريك القنية بسلاسة على طول القناة بنفس الزاوية. يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف الأوعية الدموية المجاورة، حيث يمكن أن يؤدي النزيف إلى الحقل إلى إدخال الدم إلى قنية جمع اللمفاو، مما يلوث العينة ويزيد بشكل كبير من خطر تكون الجلطات. بعد تثبيت تدفق اللمفاوف (الخطوة 5.15)، يجب تغطية طرف الجمع من القنية، ويجب تطبيق اللاصق البيطري بعناية لمنع دخوله إلى التلومين. يجب أيضا فحص القنية بحثا عن فقاعات هواء، حيث يزيد الهواء المحبوس من الضغط العكسي وقد يعيق تدفق اللمفاو. نظرا لأن اللمفاوي الكبدي يتكون تحت ضغط دفع منخفض، يجب دائما وضع طرف القناة المجمع تحت مستوى موقع الجراحة لتسهيل التصريف بالجاذبية.

يشير نجاح عملية القناة اللمفاوية الكبدية إلى بداية تدفق اللمفاوف فورا. بمجرد تأسيسها، يتدفق اللمفاوي الكبدي عادة بسرعة تقارب 0.1 مل/س، مع إخراج مستقر لعدة ساعات. قد يختلف معدل التدفق حسب تشريح الحيوان وفسيولوجيته وظروفه التجريبية. على سبيل المثال، تم جمع اللمف تحت تخدير إيزوفلوران في هذا البروتوكول. قد يؤثر تخدير الإيزوفلوران على المعايير الفسيولوجية ذات الصلة بوظيفة الجهاز اللمفاوي، ويجب مراعاة الظروف التجريبية التي تتضمن التخدير عند تفسير معدلات تكوين اللمف¹⁶. يتطلب تدخيم القناة اللمفاوية الكبدية استئصال البطن وجراحة دقيقة دقيقة للأوعية اللمفاوية البطنية، ولذلك فإن جمع اللمفاوف من الفئران الواعية غير ممكن في هذا النموذج. أظهرت دراسات سابقة قارنت نقل اللمفاوف تحت ظروف مخدرة وواعية أو باستخدام أنظمة تخدير مختلفة أن التخدير قد يؤثر بشكل معتدل على معدلات تدفق اللمفاوف المطلقة لكنه لا يغير بشكل كبير أنماط النقل اللمفاوي العامة⁴. لذلك، يجب تفسير قيم تدفق اللمفاوف التي تم الحصول عليها في هذا النموذج ضمن سياق الظروف التجريبية المخدرة.

غالبا ما يكون الانخفاض أو التوقف التدريجي في التدفق أثناء الجمع ناتجا عن تكون جلطات داخل القنية، نتيجة تلوث الدم أو ترسيب الفيبرين. يمكن أحيانا استعادة التدفق عن طريق تحديد موقع القنية والضغط عليها بلطف باستخدام ملقط دقيق لتفكيك الجلطة ميكانيكيا، أو عن طريق الشفط بلطف عبر طرف القنية المتجمع لإزالة الانسداد. إذا كان الانسداد محصورا في الجزء الخارجي، يمكن قطع القنية بالقرب من الجلطة وإعادة توصيلها بأنبوب جديد باستخدام موصل سيليكون معقم. إذا تكونت الجلطة في موقع القنية، عادة ما تكون إعادة القنية ضرورية. في مثل هذه الحالات، يمكن محاولة إزالة المادة اللاصقة بعناية كبيرة لتجنب تمزق القناة أو الأوعية الدموية المجاورة. يجب تحقيق التخثر الدموي قبل إعادة محاولة التقليل، لأن حتى تسرب الدم الطفيف إلى القنية يعزز بشكل ملحوظ التجلط داخل الجهاز اللمفاوي الكبدي منخفض الضغط.

تؤثر العوامل الفسيولوجية أيضا على تدفق اللمفاوف وسرعة الضرب. تدفق اللمفاوف الكبدي في الفئران بطبيعته أبطأ من تدفق القنوات الزرقاء أو الصدرية، حتى في الظروف القاعدية^17،18. علاوة على ذلك، يمكن للتخدير العام أن يقلل من تدفق اللمفاوف في الدوائر اللمفاوية الأخرى مقارنة بالفئران الواعية والحرة¹⁹. نظرا لأن القناة اللمفاوية الكبدية تتطلب تخديرا وبطنة، فمن المرجح أن تساهم هذه العوامل في انخفاض معدلات التدفق وزيادة الميل للجلطات التي لوحظت أثناء الجمعات الطويلة. الحفاظ على الترطيب عبر الوريد الوداجي أو القنية الهضمية أثناء الجمع يساعد في استقرار تدفق اللمفاوف وتقليل تكوين الجلطات. في هذا النموذج، عادة ما يكون تدفق الكبد المستقر للكبد ممكنا لمدة 2–3 ساعات، وبعدها قد يتدهور التدفق ويصبح احتمال حدوث التجلط. ومع ذلك، في ظل الظروف التجريبية المثلى، يمكن الحفاظ على جمع اللمفاوف لفترات أطول، مع حد أقصى لمدة تصل إلى ~8 ساعات تم الإبلاغ^{عنها 4}.

يشمل أخذ عينات من الشريان الكبدي والأوردة البابية (الشكل 6 والشكل 7) يوسع قابلية تطبيق النموذج من خلال السماح بالمقارنة المباشرة بين تدفق الكبد الداخل، والتدفق اللمفاوي، والدورة الدموية الجهازية. تتيح هذه الخطوة النهائية من أخذ العينة تقييما متزامنا لنقل الأوعية الدموية الدقيقة للكبد وإزالة الخلايا البينية داخل حيوان واحد. توفر هذه المقارنات رؤى قيمة حول توزيع المذابات بين أقسام الأوعية الدموية الكبدية واللمفاوية، خاصة للجزيئات الكبيرة أو المركبات المحبة للدهون التي تعتمد على الانتشار الخلالي.

رغم هذه التحديات، يظل نموذج القناة اللمفاوية الكبدية تقنية ذات قيمة ومعلوماتية. يساهم الكبد بنسبة كبيرة في تدفق اللمف الكبي الكلي، ويحتوي اللمف الكبدي على بروتينات ومكونات أخرى تنشأ من السائل الخلالي الكبدي. من خلال أخذ عينات من اللمفاوي المتصوبة مباشرة من الكبد، يمكن هذا النموذج من تحليل الجزيئات والخلايا التي تغادر الكبد قبل أن تخفف بواسطة اللمفاوف الميسرقي والجهازي في القناة الصدرية. يوفر التحليل الكيميائي الحيوي لللمفاوم الكبدي نظرة على عمليات الأيض الخلالي للكبد ونقل الدهون^12,20. وهذا يكمل المعلومات التي يتم الحصول عليها من البوابة أو الدم الجهازي، الذي يدمج تأثيرات الأيض الكبدي والتبادل خارج الكبد. ومن المهم أن هذا التكوين، الذي يجمع بين قنوات الوريد الوريدي اللمفاوي الكبدي، الشريان السباتي، والوريد الوداجي، يسمح بتقييم ديناميكي لتدرجات المذاب بين تدفق الكبد والتدفق الوعائي، مما يوفر رؤية أكثر شمولا لنقل الكبد وتطهيره.

تظهر الدراسات السابقة التي استخدمت هذا النموذج أن أخذ عينات اللمفاوف الكبدي يمكن تقييم التعافي اللمفاوي للعلاجات الجزيئية الكبيرة ومقارنة نقل المذاب بين اللمفاوف الكبدي والدورة الدموية الجهازية. معا، يوفر التنويه اللمفاوي الكبدي، وأخذ عينات وعائية متزامنة، والتحليل الكيميائي الحيوي منصة تجريبية قوية لدراسة ديناميكيات الأوعية الدموية الدقيقة والكبدي البينية. يتيح النموذج التقييم المتزامن لنقل الكبد، والأيض، ومعالجة الدهون، والإشارات المناعية، ويمكن تكييفه للتحقيق في التغيرات تحت الظروف الفسيولوجية المرضية مثل MASLD أو التهاب الكبد.

في الختام، يقدم هذا النموذج الجراحي المحسن الذي يدمج الوصول الوريدي اللمفاوي الكبدي والشرايين الكبدي والبوابة الوريدية، نهجا شاملا وقابلا للتكرار لفحص مسارات نقل الكبد. يسمح بمقارنة مباشرة بين تدفق الأوعية الدموية، والتدفق الخلالي، والتصريف اللمفاوي، مما يدعم الدراسات التي توفر رؤى ميكانيكية حول النقل والتمثيل الغذائي والعمليات الدوائية الخاصة بكبد. بالإضافة إلى ذلك، توفر القدرة على أخذ عينات من اللمفاوف الكبدي فرصة فريدة لدراسة تنقل الخلايا المناعية والمستضدات من الكبد، مما يوفر رؤى قيمة حول مراقبة المناعة الكبدية، والالتهابات، وآليات التحمل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Anticoagulant solution (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	Prevents clot formation in cannulas and collected samples
Anticoagulant solution (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	Prevents clot formation in cannulas and collected samples
Chlorhexidine (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Used for surgical site disinfection
Collection tubes (microcentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Used for lymph and blood collection
Cotton gauze	Winc Australia	18874125	Used for organ manipulation and moisture maintenance
Cotton swabs	Pacific Laboratory	1005199	Used for organ repositioning during surgery
Curved iris forceps	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Used for vessel isolation and tissue manipulation
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Used to open and stabilize the vessel lumen of the hepatic artery for cannula insertion
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Used for surgical site disinfection
Halsted-Mosquito hemostat forceps	Fine Science Tools	13009-12	Used to bend the 25G needle for hepatic lymph duct puncture
Heated surgical pad (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Maintains body temperature during surgery
Induction chamber	Darvall	1859	Used for initial anesthesia induction
Infusion pump	Adelab Scientific	NE-300	Provides controlled saline infusion via cannula
Iris scissors	Stark Medical	E-AC985-11	Used for skin and muscle incisions
Isoflurane	Provet Pty Ltd	ISOF07	Inhalation anesthetic used for induction and maintenance of anesthesia
Kelman-McPherson lens forceps	ProSciTech	TY-1301	Used to open and stabilize the vessel lumen of the jugular vein and carotid artery for cannula insertion
Needle (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Used for portal vein puncture and blood sampling
Needle (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Used for cannula flushing and hepatic lymph duct puncture
Nose cone anesthesia system	Darvall	7885	Maintains anesthesia during surgery
Oxygen supply with flowmeter	BOC	400NE	Carrier gas for isoflurane anesthesia
Polyethylene cannula (0.8 mm O.D., 0.5 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	Used for carotid artery, jugular vein, and hepatic lymph duct cannulation
Polyvinyl cannula (0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	Used for hepatic artery cannulation
Silk sutures (4-0)	SMI AG	SM8015	Used to secure vessels and cannulas
Sodium pentobarbitone	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Used for euthanasia (>100 mg/kg)
Sterile saline (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Used for rehydration and flushing
Straight Graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	Used for delicate vessel isolation
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000-CS	Used for visualization during hepatic lymph duct cannulation
Surgical sterile blades (for scalpel use)	Livingstone	SBLDCL15	Used for bevelling cannula tips during preparation
Syringe (1 mL)	Terumo	19032-TE	Used for flushing cannulas
Syringe (3 mL)	Terumo	19048-TE	Used for blood sampling
Syringe (30 mL)	Terumo	19034-TE	Used for saline infusion
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for vascular incisions
Veterinary tissue adhesive	3M	1469SB	Used to secure hepatic lymph duct cannula