آليات تحضير شينغشيان تشيو في فشل القلب باستخدام نهج غير مستهدف في علم الأيض والصيدلة الشبكية لدى الفئران

ملخص

أكدت هذه الدراسة التأثير العلاجي لديكوكشن شينغشيان تشيو على فشل القلب من خلال تجارب على الحيوانات. حددت تحليلات الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء ومطياف الكتلة وعلم الأدوية الشبكي أهدافا وآليات علاجية محتملة.

الملخص

تم اقتراح محلول شنغشيان تشيو (SXQY) كاستراتيجية علاجية محتملة لفشل القلب (HF)، لكن آلياته العلاجية لا تزال غير واضحة. بحثت هذه الدراسة في التأثيرات العلاجية والآليات الأساسية ل SXQY في الهيدرولون الهومي. تم تحفيز نموذج الجرذان ل HF بواسطة تضيق الأبهر المستعرض (TAC) وعالج ب SXQY. تم تقييم وظيفة القلب بواسطة تخطيط صدى القلب عبر الصدر، وتم تقييم بنية عضلة القلب والتليف باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوزين وتلوين ماسون. تم تحليل عينات المصل بواسطة أيض غير مستهدف باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء – مطيافية الكتلة المتتالية. تم تعيين المكونات الداخلة للدم على الأهداف، وتم تحليل الأهداف المتقاطعة المرتبطة ب HF باستخدام تحليل شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)، تلاها تحليلات علم الجينات وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG). حسن SXQY بشكل ملحوظ وظيفة القلب لدى فئران TAC، كما يتضح من انخفاض القطر الداخلي للبطين الأيسر في الانبساط وسماكة جدار البطين الخلفي الأيسر في الانبساط وزيادة نسبة القذف البطيني الأيسر، كما خفف من تضخم عضلة القلب، والالتهاب، والتليف. تم تحديد ما مجموعه 563 مركبة دخول دم (367 نموذجا أوليا و196 مستقلبا)، مع 5 مركبات نشطة رئيسية تم تحديدها في قاعدة بيانات أنظمة الأدوية للطب الصيني التقليدي والتي تمثل 63 هدفا. كشف تحليل الشبكات عن 44 جينا متداخلا، مع فورمونيتين، تيموسابونين BII، وسينينستين كمكونات أساسية، وPTGS2 وPPARG و HSP90AA1 كأهداف مركزية. حدد تحليل مثبطات مضخة البروتون أيضا جينات رئيسية تشمل ESR1، PTGS2، PPARG، HSP90AA1، JUN، و15 جينا إضافيا. أشار تحليل KEGG إلى أن SXQY يعمل بشكل رئيسي عبر Ca²⁺، فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز بروتين كيناز B، مونوفوسفات الأدينوزين الحلقي، والمسارات المرتبطة بالالتهاب والهرمونات. في الختام، يمارس SXQY تأثيرات وقائية ضد HF من خلال تحسين وظيفة القلب وتخفيف إعادة تشكيل عضلة القلب من خلال آليات متعددة المكونات والأهداف والمسارات المتعددة.

المقدمة

فشل القلب (HF) هو متلازمة سريرية تتميز بضعف في ملء البطين والقدرة على القذف بسبب اضطرابات بنيوية أو وظيفية في القلب، مما يؤدي إلى مجموعة من العلامات والأعراض السريرية¹. باعتباره المرحلة النهائية لأمراض القلب المختلفة، يؤثر HF بشكل كبير على جودة حياة المرضى وينتج عنه معدلات وفيات مرتفعة وإعادة دخول متكررة إلى المستشفيات، مما يفرض عبئا مرضيا كبيرا على كل من العائلات والمجتمع ^2,3. في الإدارة السريرية، يشكل العلاج الدوائي ل HF الأساس والركيزة الأساسية للعلاج، ويضم بشكل أساسي فئات أدوية رئيسية مثل مدرات البول، مثبطات نظام الرينين-أنجيوتنسين، حاصرات بيتا، مضادات مستقبلات القشرة المعدنية (Mineralocorticoid)، ومثبطات ناقل الصوديوم-جلوكوز 2 3,4,5,6 . بينما حسنت هذه الأدوية جزئيا توقعات مرضى التهاب البول الهومي، إلا أن كل منها يحمل قيودا وآثارا جانبية معينة، مثل اضطرابات الإلكتروليت، بطء القلب، والتهابات المسالك^{البولية.} لذلك، لا تزال العلاجات الدوائية لالتهاب الهيمونيد تستحق المزيد من التحقيق.

اكتسب الطب الصيني التقليدي (TCM) خبرة سريرية واسعة في الإدارة طويلة الأمد لالتهاب الهيدرولون. مع التركيز على التنظيم الشامل والتدخل متعدد الأهداف، يقدم نهجا مميزا للعلاج⁸. في السنوات الأخيرة، أظهرت عدد من التجارب العشوائية المحكمة فعالية علاجية للصيغ العشبية الصينية لعلاج HF 9,10,11,12,13,14,15. بدأ محلول شنغشيان كيو (SXQY) بالفعل في الخضوع لتجارب عشوائية دقيقة لتأكيد فعاليته العلاجية، لكن آلياته العلاجية المحددة لا تزال تتطلب تحقيقا أعمق وأكثر شمولا¹⁶. علم الأدوية الشبكي، كعلم ناشئ يدمج علم الأحياء النظامي، وعلم الأدوية المتعددة، والتحليل الحاسوبي، يقدم أداة قوية لتوضيح الآليات الشاملة للعمل في الصيغ العشبية^{الصينية} 17,18,19. لذلك، تستخدم هذه الدراسة استراتيجية متكاملة تجمع بين الأيض غير المستهدف وعلم الأدوية الشبكي لتحديد المكونات الممتصة بالدم في SXQY وتوضيح آلياته العلاجية المحتملة. يهدف هذا العمل إلى توفير أساس للتطبيق السريري المستمر ل SXQY.

البروتوكول

تم فحص جميع الإجراءات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات ورفاهية الحيوان في مستشفى الصداقة الصين-الياباني (رقم الموافقة zryhyy21-23-01-09) وأجريت وفقا لمبادئ الاستبدال والتقليل والتنقيح لتقليل استخدام الحيوانات ومعاناتها. تم تعمية الباحثين الذين أجروا جمع البيانات وتحليلها (بما في ذلك قياسات تخطيط صدى القلب والتقييم النسيجي) عن تخصيص المجموعات.

تحضير عينة SXQY

يتكون SXQY من المكونات العشبية التالية: Astragalus membranaceus (هوانغتشي) (30 جم)، Codonopsis pilosula (دانغشين؛ 20 جم)، Cornus officinalis (شانيورو؛ 15 جم)، Sparganium stoloniferum (سانلينغ؛ 12 جم)، Curcuma zedoaria (إرزو؛ 15 جم)، Cimicifuga heracleifolia (شينغما؛ 10 جم)، Bupleurum chinense (تشايهو؛ 10 جم)، Platycodon grandiflorus (جيغنغ؛ 10 جم)، Anemarrhena asphodeloides (زيمو؛ 15 جم)، وليونوروس جابونيكوس (ييمو؛ 15 جم)، بوزن أعشاب خام إجمالي يبلغ 152 جراما لكل وصفة طبية. تم شراء جميع المواد العشبية من قسم الصيدلة في مستشفى الصداقة الصين-الياباني وتم التحقق منها من قبل كبير الصيادلة وفقا لطرق التعرف الدوائية القياسية. سريريا، يعطى SXQY بجرعة واحدة بوصفة طبية واحدة (152 جم) يوميا. بافتراض أن متوسط وزن جسم البالغين هو 70 كجم، فإن الجرعة البشرية المقابلة هي 2.17 جرام (عشبة خام)/كجم. استنادا إلى تطبيع مساحة سطح الجسم بين البشر والجرذان، تم حساب الجرعة المكافئة للجرذان لتكون 13.67 جرام (عشبة خام)/كجم. لتحضير الطعم الصناعي، تم نقع إحدى وصفات SXQY في ماء مقطر بنسبة 10 مل لكل جرام من الأعشاب الخام (w/v، بناء على حجم المذيب الأولي دون تعديل بعد النقع) لمدة ساعة واحدة، تليها الغليان باستخدام غطاء تسخين كهربائي والحفاظ عليها عند 100°C تحت الغليان المستمر لمدة ساعة. ثم تم ترشيح المستخلص عبر الشاش (بحجم مسام 200–300 ميكرومتر). ثم تم استخراج البقايا مرتين إضافيتين تحت ظروف متطابقة. تم تركيز الترشيحات المجمعة تحت ضغط منخفض باستخدام مبخر دوار عند 60°م حتى حجم نهائي يبلغ 111 مل، مما أدى إلى تركيز 1.37 جرام (دواء خام)/مل. تم ترشيح المحلول المركزة مرة أخرى عبر الشاش (حجم مسام 200–300 ميكرومتر) وتخزين عند 4°C واستخدم خلال 24–48 ساعة. للإعطاء، استخدم المحلول مباشرة، وتم حساب حجم الجافاج بناء على تركيز 1.37 جم/مل، مما أدى إلى حجم إعطاء يقارب 10 مل/كجم لتحقيق الجرعة المستهدفة 13.67 جرام/كغ.

نموذج الحيوانات

تم إيواء ثمانية عشر ذكرا من جرذ سبراج-داولي (SD) يبلغ من العمر 8 أسابيع في بيئة مهيئة (23°C ± 2°C، 50 ± 5٪ رطوبة نسبية، ودورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة) مع إمكانية الوصول المجاني للطعام والماء. تم توزيع الحيوانات عشوائيا إلى ثلاث مجموعات (n = 6 لكل مجموعة) باستخدام جدول أرقام عشوائي: مجموعة تعمل بالزائف (Sham)، ومجموعة تضيق الشريان الأبهر المستعرض (TAC)، ومجموعة معالجة ب SXQY (SXQY). تم تخدير الفئران في مجموعتي TAC وSXQY عن طريق استنشاق الإيزوفلوران (الحث 4٪، الصيانة 2٪)، ووضعها في وضع الاستلقاء على وسادة تسخين محكومة حراريا محفوظة عند 37°C. تم تأكيد التخدير الكافي من خلال غياب الاستجابات الانعكاسية لقرص الكف، إلى جانب معدل تنفس مستقر وغياب الحركة التلقائية. تم تطبيق مرهم العيون على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية. بعد التنبيب في القصبة الهوائية، تم توصيل الحيوانات بجهاز تنفس صناعي للحيوانات الصغيرة بحجم مد وجزر يتراوح بين 4–6 مل لكل 200 جرام من وزن الجسم، ومعدل تنفس 70 نفسا في الدقيقة، ونسبة التنفس إلى التنفس 1:1.

تم إجراء جميع الإجراءات الجراحية تحت ظروف معقمة. تم تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم الطبي (autoclaving)، وتم تجهيز منطقة العمليات بالحلاقة والتعقيم باستخدام بوفيدون-يودين تلاها إيثانول بنسبة 70٪. بعد تجهيز موقع الجراحة، تم إجراء شق في الجلد الصدري الأيسر، وتم تشريح عضلات الصدر الكبرى والصغيرة بشكل غير مباشر لكشف الأضلاع. تم إنشاء شق أفقي بعمق يقارب 1.0 سم في الفراغ بين الأضلاعية الثاني إلى الثالث المجاور للحافة اليسرى للعظمة القصية. تم فصل الأوعية الدموية واللفافة بشكل غير واضح، وتم سحب الغدة الدعترية بلطف لكشف قوس الأبهر بالكامل.

تم رفع قوس الشريان الأبهر بعناية بين الشريان الأيمن غير المحدد والشريان السباتي المشترك الأيسر باستخدام ملقط منحني معقم، وتم تمرير خياطة حريرية 2-0 تحته. تم تعديل إبرة 16 مقياس منحنية ذات طرف غير حاد (قطر خارجي 1.6 مم) يدويا عن طريق تخفيف الطرف وثنيه إلى انحناء مناسب قبل الاستخدام، تليها التعقيم باستخدام الأوتوكلاف. ثم تم وضع الإبرة المنحنية ذات الطرف غير العريض المحضرة موازية لقوس الشريان الأبهري، وبعدها تم ربط الغرز بإحكام حول الشريان الأبهر والإبرة. تمت إزالة الإبرة فورا لإنشاء تضيق موحد، وأعيد وضع الغدة الزعترية. بعد التأكد من عدم وجود نزيف نشط، تم إغلاق جدار الصدر والجلد في طبقات. بعد العملية، استمر التهوية الميكانيكية لمدة تقارب 10 دقائق حتى استعاد التنفس التلقائي، كما يتضح من معدل التنفس المستقر والمنتظم والقدرة على الحفاظ على التنفس التلقائي دون دعم التنفس. في هذه المرحلة، تمت إزالة أنبوب القصبة الهوائية. خضعت الحيوانات التي أجريت بعملية الشامية لنفس الإجراءات الجراحية باستثناء أن قوس الأبهر لم يكن مربوطا.

بعد الجراحة، تم تعقيم موقع الشق، ووضعت الحيوانات في أقفاص تعافي نظيفة لتقليل خطر العدوى. ثم أعيدت الفئران إلى منشأة الحيوانات للتعافي والإسكان الروتيني. تم إعطاء المسكنات باستخدام البوبرينورفين (0.05 ملغ/كجم، تحت الجلد). تمت ملاحظة الفئران كل 12 ساعة خلال أول 72 ساعة لعلامات الألم أو الضيق أو المضاعفات الجراحية، بما في ذلك انخفاض الحركة، الانتصاب، الوضعية غير الطبيعية، صعوبة التنفس، أو انفصال الجرح.

بعد ثلاثة أيام من الجراحة، تم تغطية الفئران في المجموعة التي عولجت ب SXQY عن طريق الفم بكمية 1 مل/100 جرام من محلول SXQY لمدة 9 أسابيع. وفي الوقت نفسه، تلقت الفئران في مجموعات التشغيل الصناعي وTAC حجم متساو (1 مل/100 جرام وزن جسم) من الماء المقطر بواسطة الجافاج.

تخطيط صدى القلب عبر الصدر

في نهاية فترة العلاج، تم إجراء تخطيط صدى القلب عبر الصدر في جميع الفئات. تم تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران ووضعها في وضعية الاستلقاء على الظهر على منصة تصوير مخصصة. تم حلق الصدر الأمامي بعناية ومغطى بطبقة سخية من جل الموجات فوق الصوتية. تم إجراء التصوير بالموجات فوق الصوتية باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالي الدقة للحيوانات الصغيرة مزود بمحول عالي التردد (18–40 ميجاهرتز) في وضع B وM. تم وضع المحول بلطف على المنطقة المغطاة بالهلام، مع ضبط عمق 12.29 مم وكسب 22 ديسيبل؛ تم ضبط التركيز لتحسين جودة الصورة. تم الحصول على صور وحلقات فيديو للتحليل الكمي اللاحق. تم قياس قطر القطر الداخلي الداخلي في نهاية الانبساط في البطين الأيسر (LVIDd) وسمك جدار البطين الأيسر الخلفي عند الانبساط النهائي (LVPWd)، وتم حساب نسبة القذف في البطين الأيسر (LVEF) باستخدام صيغة تيشولز بناء على قياسات وضع M. لكل معلم، تم قياس القياسات في المتوسط خلال 3–5 دورات قلبية متتالية. تم إجراء جميع عمليات الاقتناص والتحليلات من خلال تخطيط صدى القلب بواسطة مشغل معتمد لديه تدريب رسمي في تخطيط صدى القلب، وفقا لبروتوكولات تخطيط صدى القلب الموحدة.

جمع العينات ومعالجتها

بعد إجراء الموجات فوق الصوتية، تم تخدير الفئران بالإيزوفلوران. وضعت الحيوانات في وضعية الاستلقاء على الظهر، وفتح التجويف الصدري لكشف القلب. تم استئصال القلوب بسرعة، وشطفها بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات، وتقسيمها على طول مستوى السهمية. تم تثبيت الأنسجة القلبية فورا في 4٪ بارافورمالديهيد عند 4°C لمدة 24 ساعة، تلاها الجفاف عبر سلسلة إيثانول متدرجة (70٪، 80٪، 90٪، 95٪، و100٪) لمدة ساعة واحدة في كل خطوة، وخلالها أصبحت الأنسجة شفافة تدريجيا دون انكماش ملحوظ. تم تنظيف العينات في الزيلين، وترشبها بالبارافين المنصهر عند درجة حرارة 60°م لمدة 3 ساعات، وتركت لتتصلب عند درجة حرارة الغرفة (RT؛ 20°C–25°C). تم تقليم وتقسيم كتل أنسجة القلب المدمجة بالبارافين بسماكة 4–6 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. تم تعويم الأجزاء على حمام ماء يحافظ عليه عند 45°C، وتركب على شرائح زجاجية، وتجفيف عند 37°C–40°C طوال الليل. تم تخزين الشرائح في RT تحت ظروف منخفضة الرطوبة واستخدمت خلال أسبوع واحد للتلوين النسيجي.

صبغ الهيماتوكسيلين وإيوزين (HE)

تمت معالجة الأقسام المدمجة بالبارافين كما يلي. تم إزالة البارافين من القطع أولا بالغمر في الزيلين I وII وIII لمدة 5 دقائق لكل منها، تليها ترطيب من خلال سلسلة من الإيثانول اللامائي I وII ومحاليل الإيثانول المصنفة (95٪، 90٪، 80٪، 70٪، و50٪) لمدة 5 دقائق لكل منها، وأخيرا شطفها بماء مقطر دون بقايا شمعية ظاهرة. ثم تم تلطيخ الأقسام بمادة هاريس هيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق وشطفها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 1–2 دقيقة. تم إجراء التمايز في محلول الكحول الحمضي لمدة تقارب 1–2 ثانية، مع تحديد نقطة النهاية بالفحص البصري عندما بدا الخلفية شاحبة بينما بقيت التلوين النووي محددة بوضوح. تبع ذلك غسل الماء بالماء عند 37°C إلى 45°C ثم الشطف بالماء المقطر. بعد ذلك، تم صبغ الأقسام بالإيوزين القابل للذوبان في الكحول لمدة 40 ثانية، وغسلها بماء مقطر، وجففها عبر الإيثانول المتدرج، وتطهيرها في الزيلين، وأخيرا تركيبها على راتنج محايد.

ماسون ستينينغ

تم إزالة البارافينات من القطع المدمجة بالبارافين بشكل متسلسل في الزيلين I وII وIII لمدة 5 دقائق لكل منها، تليها الترطيب عبر الإيثانول اللامائي I وII ومحاليل الإيثانول المصنفة (95٪، 90٪، 80٪، 70٪، و50٪) لمدة 5 دقائق لكل منها، وأخيرا شطفت بماء مقطر. تم غمر الأقسام في حمض الأسيتيك بنسبة 0.5٪ (مبرد مسبقا إلى 4°C) لمدة ثانية، تليها صبغة بمحلول الفوشسين من مجموعة التلوين ثلاثية الألوان من شركة ماسون التجارية لمدة 10 دقائق، تلتها التمايز في حمض الفوسفوموليبيك لمدة 5 دقائق وصبغ مضاد باللون الأزرق الأنيليني لمدة 3 دقائق. كانت جميع المواد الكيميائية مكونات لنفس المجموعة التجارية واستخدمت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد التلوين، تم شطف المقاطع ثلاث مرات بحمض الخليك مبرد مسبقا إلى 4°C (حوالي 30 ثانية لكل شطف)، وجففها عبر الإيثانول المصنف، وإزالتها بالزيلين، وركبتها بالراتنج المحايد.

جمع عينات المصل لتحليل الأيض

تم إيواء ستة ذكور من فئران SD بعمر 8 أسابيع تحت نفس الظروف التي كانت في التجربة الحية أعلاه. تم توزيع الحيوانات عشوائيا إلى مجموعة معالجة ب SXQY ومجموعة ضابطة للمركبة (ماء مقطر؛ n = 3 لكل مجموعة) باستخدام طريقة عشوائية مولدة بالحاسوب. تم إعطاء الجرذان في مجموعة SXQY عن طريق الفم بجرعة 1 مل/100 جرام من وزن الجسم، بينما تلقت مجموعة التحكم في المركبات كمية مماثلة من الماء المقطر. بعد سبعة أيام من التشويش اليومي، تم مضاعفة الجرعة النهائية في اليوم السابع. بعد الإدارة الأخيرة، صمت الحيوانات لمدة 12 ساعة. تم تخدير الفئران بالإيزوفلوران حتى تم تأكيد فقدان رد فعل انسحاب الدواسة كمؤشر على التخدير الكافي. تم جمع عينات دم من الضفيرة الوريدية الرجعية باستخدام أنابيب شعيرات شعرية معقمة ونقلها فورا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 مل بدون مضاد للتخثر. ثم ترك الدم الكامل يقف في RT لمدة ساعة واحدة وتم طرد مركزه عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4°C للحصول على المصل. عندما ظهر فصل واضح بين طبقة المصل الشفافة العليا والجلطة، تم استنشاق المصل الفائق بعناية ونقله إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق النظيفة. تم تخزين عينات المصل عند −80°C حتى تحليل المكونات التي تدخل الدم.

المعالجة المبدئية العينة لتحليل الأيض

تم إذابة عينات المصل على الجليد بعد إزالتها من تخزين −80°C وخلطها لفترة وجيزة في دوامة (10 ثوان) لضمان التجانس. تم نقل كمية من مصل بحجم 100 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل، تلاه إضافة 500 ميكرولتر من مذيب الاستخلاص (20٪ أسيتونونتريل ميثانول يحتوي على 2-كلورو-لين-فينيل ألانين كمعيار داخلي بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل) لتحفيز ترسيب البروتين. تم تدوير الخليط بقوة لمدة 3 دقائق وتم طرد مركزه بحرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم نقل جزء بحجم 470 ميكرولتر من المادة الفائقة الناتجة إلى أنبوب جديد وتبخره حتى يصبح جافا باستخدام مبخر نيتروجين تحت تدفق منخفض ومنظم للنيتروجين. بعد إعادة التكوين في 200 ميكرولتر من 70٪ ميثانول–ماء ودوامة لمدة دقيقة واحدة، تم طرد المركزي للعينات بحرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4°C، وتم نقل 180 ميكرولتر من المادة الفائقة الموصحة إلى قوارير العينات الذاتية لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة–مطيافية الكتلة التاثنية (LC-MS/MS).

ثم تم نقل كمية 200 ميكرولتر من عينة SXQY إلى أنبوب طرد مركزي مسبقا بسعة 1.5 مل. تمت إضافة محلول الاستخلاص القياسي الداخلي إلى كل عينة بنسبة حجم 1:1 (v/v). تم خلط الخليط بالدوامة لمدة 15 دقيقة وتم تمركزه المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4°C. تم جمع المادة الفائقة الناتجة بعناية وترشيحها عبر غشاء ميكرومسامي بحجم 0.22 ميكرومتر، مما أدى إلى ترشيح شفاف بدون جزيئات مرئية. تم نقل الترشيح إلى قوارير العينات التلقائية وتخزينه عند 4°C قبل إجراء تحليل LC-MS/MS فائق الأداء (UPLC–MS/MS).

إعداد حلول المعايير الداخلية

تم إعداد محلول المخزون القياسي الداخلي (2-كلورو-إل-فينيل ألانين) عن طريق إذابة 1 ملغ من المعيار المرجعي في 1 مل من ماء الميثانول بنسبة 70٪ (v/v)، مما أدى إلى تركيز 1,000 ميكروغرام/مل. تم تخفيف هذا المحلول المخزن بنفس المذيب للحصول على محلول داخلي معياري يعمل بتركيز نهائي 1 جزء في المليون، تم تحضيره حديثا، وتخزينه عند 4°C، واستخدامه خلال 48–72 ساعة.

شروط UPLC–MS/MS

تم إجراء فصل كروماتوغرافي باستخدام نظام UPLC مرتبط بمطياف كتلة متتالية. تم تحقيق الفصل على عمود C18 حافظ على درجة حرارة 40°C، بمعدل تدفق 0.35 مل/دقيقة وحجم حقن 4 ميكرولتر. تكونت المرحلة المتنقلة من ماء فائق نقي يحتوي على 0.1٪ (v/v) وحمض الفورميك (A) والأسيتونيتريل الذي يحتوي على 0.1٪ (v/v) وحمض الفورميك (B). تم تطبيق إزالة التدرج كما يلي: 5٪ B عند 0.0 دقيقة؛ ارتفعت خطيا إلى 25٪ B عند 2.0 دقيقة، 35٪ B عند 3.0 دقيقة، 60٪ B عند 5.0 دقيقة، و99٪ B عند 6.0 دقيقة؛ تم الاحتفاظ به عند 99٪ B لمدة 1.5 دقيقة؛ عادت إلى 5٪ B عند 7.6 دقيقة؛ وكانت متوازنة عند 5٪ B حتى 10.0 دقيقة.

تم إجراء الكشف الطيفي الكتلي باستخدام مطياف كتلة عالي الدقة مزود بمصدر تأين بالرش الكهربائي يعمل في أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة. تم ضبط جهود الرش على 3500 فولت في الوضع الموجب و3200 فولت في الوضع السالب. تم ضبط غاز الغلاف والغاز المساعد على 30 و5 وحدات عشوائية (معرفة بالأداة) على التوالي. تم الحفاظ على درجة حرارة أنبوب نقل الأيونات ودرجة حرارة المبخر عند 320°C و300°C على التوالي. تم التقاط مسحات MS كاملة على نطاق m/z من 84–1250 بدقة 35,000 مع هدف للتحكم التلقائي في الكسب (AGC) من 1.0 × 10⁶، تليها اكتساب MS/MS المعتمد على البيانات (أفضل 10) بدقة 17,500 مع هدف AGC 2.0 × 10⁵ ونافذة عزل 1.0–1.5 m/z. تم تطبيق طاقات تصادم متدرجة موحدة بحجم 30 و40 و50. تم اختيار أفضل 10 أيونات أولية كثافة للتجزئة مع مدة استبعاد ديناميكية تبلغ 3 ثوان.

معالجة البيانات الخام

تم تحويل بيانات مطيافية الكتلة الخام إلى صيغة mzML باستخدام ProteoWizard. لضمان الموثوقية التحليلية، تم إعداد عينات مراقبة الجودة المجمعة عن طريق خلط أحجام متساوية من جميع عينات المصل. تم حقن عينات QC على فترات منتظمة (حقنة QC واحدة كل 5–10 عينات تحليلية) خلال تحليل UPLC–MS/MS لمراقبة استقرار الأداة، ووقت الاحتفاظ بالاتساق، وقابلية تكرار الإشارة. تم تقييم قابلية التكرار بناء على الانحراف المعياري النسبي لشدة الذروة في عينات مراقبة الجودة.

تم إجراء اكتشاف الذروة، وتصحيح وقت الاحتفاظ، ومحاذاة الذروة باستخدام حزمة XCMS. تم استبعاد الميزات التي كان فيها معدل النقص أكثر من 50٪ داخل أي مجموعة من التحليل الإضافي. تم تطبيق تصحيح انحراف الإشارة لاحقا على مناطق الذروة باستخدام طريقة تطبيع تعتمد على الانحدار المتجه الداعم (SVR) والتي تم تنفيذها في برنامج R الإحصائي باستخدام نمذجة قائمة على مراقبة الجودة لتصحيح انحراف الإشارة عبر المسار التحليلي.

تم تحديد المستقبات من خلال مطابقة الميزات المصححة مع مكتبة مرجعية داخلية (تحتوي على حوالي 5,000 مركب يحتوي على بيانات طيفية ل MS1 و MS2؛ وهي مملوكة وغير متاحة للجمهور)، بالإضافة إلى قواعد بيانات طيفية متاحة للجمهور مثل قاعدة بيانات استقلاب الإنسان (HMDB)، وقاعدة بيانات مطيافية الكتلة للمستقلبات والتانديم (METLIN)، وMassBank، وشبكة الجزيئات الاجتماعية للمنتجات الطبيعية العالمية (GNPS)، يعتمد على مطابقة الكتلة الدقيقة، ومحاذاة وقت الاحتفاظ، والتشابه الطيفي بين MS/MS. تم إجراء مطابقة الكتلة باستخدام تحمل ±25 جزء في المليون للأيونات السلفية (MS1) وأيونات الشظايا (MS2)، مع تحمل زمني احتفاظ يبلغ ±6 ثوان. في البحث في المكتبات، تم تطبيق تحمل ±25 جزء في المليون على الأيونات الأولية (Q1) و±50 جزء في المليون على شظايا MS/MS، مع درجة مطابقة لا تقل عن MS/MS تبلغ 0.3. تم الاحتفاظ فقط بالمواد المستقلبة التي حصلت على درجة تعريف شاملة تزيد عن 0.5 للتحديد غير المستهدف. تم حساب النتيجة النهائية كمجموع موزون من درجات مطابقة للجزء (0.1)، والتقدم (0.3)، والعكس (0.6). تم دمج البيانات التي تم الحصول عليها في أوضاع التأين الموجبة والسالبة على مستوى المركب. بالنسبة للتعليقات المكررة، تم اختيار المدخل الذي يحصل على أعلى ثقة في التعرف وأعلى درجة. تم تجميع التعليقات النهائية في ملف توضيح للمستقلب.

معايير تحديد المركبات الممتصة

تم تعريف المكونات النموذجية الممتصة بأنها مركبات تم اكتشافها في مستخلص SXQY والمجموعة المعالجة ب SXQY مع أوقات احتفاظ متطابقة ضمن تحمل ±0.1 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، كان من الضروري أن تظهر هذه المركبات منطقة ذروة في المجموعة المعالجة ب SXQY تكون أعلى بمرتين على الأقل من مجموعة التحكم في المركبة أو أن تكون غائبة عن عينات التحكم في المركبة.

تم تحديد المستقلبات الممتصة باستخدام مجموعة مختلفة من المعايير. لم يتم اكتشاف هذه المركبات في مستخلص SXQY لكنها كانت موجودة في المجموعة المعالجة ب SXQY. كانت ميزاتها المطيافية للكتلة مطلوبة لتكون متوافقة مع التحولات الأيضية المميزة، بما في ذلك الهيدروكسلة (Δm/z = +15.9949 Da) وإزالة المثيلة (Δm/z = −14.0157 Da). علاوة على ذلك، كان من الضروري أن تكون مساحة الذروة في مجموعة SXQY أعلى بمرتين على الأقل من تلك الموجودة في مجموعة التحكم في المركبة بناء على مناطق الذروة المقررة بعد تصحيح انحراف الإشارة، أو يجب أن تكون الإشارة المقابلة غير قابلة للكشف في عينات التحكم في المركبة.

استرجاع الجينات المرتبطة بالمركبات الممتصة

تم استجواب المكونات التي تدخل الدم في قاعدة بيانات وتحليل أنظمة الأدوية التقليدية للطب الصيني (TCMSP؛ https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph؛ تم الوصول إليها في يناير ²⁰²⁶). تم فحص المركبات الموثقة في TCMSP كمكونات نشطة حيويا مرشحة بناء على عتبات دوائية محددة للتوافر الحيوي الفموي ≥ 30٪ وشبه الدواء ≥ 0.18²¹. تم استرجاع الأهداف المفترضة المقابلة للمركبات المحتجزة لاحقا، وتم توحيد جميع معرفات الأهداف إلى رموز جينية رسمية باستخدام قاعدة بيانات UniProt²².

استرجاع الأهداف المرتبطة بالأمراض وجينات التقاطع

تم جمع جينات مرتبطة ب HF من قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/؛ تم الوصول إليها في يناير 2026) باستخدام مصطلح "فشل القلب" كمصطلح بحث، وتم اختيار الجينات ذات الدرجة ذات الصلة ≥ 10 لمزيد من التحليل. تم لاحقا تقاطع الأهداف المتعلقة بقوة التردد مع الأهداف المرتبطة بالمركبات التي تم تحديدها من TCMSP باستخدام منصة ويشينغشين (https://www.bioinformatics.com.cn؛ تم الوصول إليها في يناير 2026). تم تعريف الجينات المتداخلة كأهداف تقاطع واستخدمت في بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) اللاحقة وتحليلات الإثراء الوظيفي.

بناء الشبكات وتحليلات الإثراء الوظيفي

تم إجراء تحليل مثبط مضخة البروتون للأهداف المحددة باستخدام قاعدة بيانات STRING (http://cn.string-db.org/؛ تم الوصول إليها في يناير 2026)²³ مع تعيين النوع على الإنسان العاقل وعتبة درجة ثقة ≥0.7. تم استيراد بيانات التفاعل إلى أداة التصور Cytoscape لعرض الشبكة. تم إجراء تحليل طوبولوجي باستخدام إضافة NetworkAnalyzer في أداة التصور، وتم تحديد جينات المحور باستخدام إضافة CytoHubba^{رقم 24,25}. تم إجراء تحليل إثراء أنطولوجيا الجينات (GO) على أهداف التقاطع، بما في ذلك فئات العمليات البيولوجية (BP)، والمكون الخلوي (CC)، والوظيفة الجزيئية (MF). تم اعتبار مصطلحات GO ذات القيمة P < 0.05 ذات دلالة، وتم اختيار أفضل 10 مصطلحات مثرية من كل فئة للتصور²⁶. كما خضعت أهداف التقاطع لتحليل مسار إثراء مسار موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) باستخدام حزمة clusterProfiler في البرنامج الإحصائي. تم اعتبار المسارات ذات القيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية، وتم اختيار أفضل 20 مسارا غنية للتصور. تم استخدام هذه المسارات لاحقا لبناء شبكة تفاعل بين الهدف والمسار²⁷.

التحليل الإحصائي

تعرض البيانات كمتوسط ± SD. تم تقييم توزيع البيانات الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك، وتم تقييم تجانس التباين باستخدام اختبار ليفين أو اختبار براون-فورسايث قبل التحليل. تم إجراء المقارنات الإحصائية بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه تلاها اختبار توكي بعد الاختبار باستخدام منشور GraphPad. تم اعتبار P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تخطيط صدى القلب عبر الصدر

كشف تحليل تخطيط صدى القلب عن تجدد القلب وخلل واضح في فئران TAC (الشكل 1). مقارنة بمجموعة التحكم في شام، زاد TAC بشكل ملحوظ من LVIDd وLVPWd، بينما انخفض LVEF بشكل ملحوظ. ومن الجدير بالذكر أن إعطاء SXQY عكس جزئيا هذه التغيرات المرضية، كما يتضح من انخفاض كبير في LVIDd وLVPWd وتحسن مصاحب في LVEF مقارنة بمجموعة TAC.

المناقشة

تم استخدام SXQY على نطاق واسع في الممارسة السريرية لأكثر من عقدين، مما أظهر فعاليته في علاج مختلف الحالات القلبية الوعائية. مؤخرا، تم توسيع استخدامه ليشمل مرضى فشل القلب الذين يعانون من انخفاض نسبة القذف ونسبة القذف¹⁶ التي تقل قليلا. في هذه الدراسة، تم تأسيس نموذج للفئران بواسطة جراحة TAC لمحاكاة التغيرات المرضية في HF، وفي الوقت نفسه تم علاج بعض الفئران ب SXQY لفحص فعاليته. تم استخدام تخطيط صدى القلب عبر الصدر، وتلوين HE، وتلوين ماسون لتقييم ما إذا كانت النماذج ق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2-كلورو-إل-فينيل ألانين	علاء الدين	C105993-1 جرام	المعيار الداخلي؛ ≥ 98%
الأسيتونيتريل (درجة LC-MS)	علاء الدين	A120771-1L	مذيب الاستخلاص
حمض الخليك	سولاربيولوجيا	G1340	صبغة ماسون؛ مبرد مسبقا إلى 4 ودرجة؛ C
قوارير السامبلر الذاتية	أجيلينت	5190-9590	لتحميل العينات من LC-MS/MS
بوبرينورفين	سيريليانت	B-044S	مسكن الألم
عمود C18 (1.8 وما؛ m، 2.1 مم & أضعاف; 100 مم)	المياه	176001125	عمود ACQUITY Premier HSS T3
أنابيب شعرية، معقمة	فيشربراند	22-362-566	جمع الدم بالعكسية
الطرد المركزي (مبرد)	كوبوتا	N61196-F000	لمعالجة المصل والعينات
حزمة clusterProfiler	الموصل الحيوي	—	حزمة R لتحليل إثراء KEGG؛ v4.0.2
ملقط منحني، معقم	HL-SQX	HL-JP	التلاعب القوس الأبهر
برنامج سايتوسكيب	NHGRI	المعهد الوطني للصحة NHGRI تحت 24 سنة HG012107	الإصدار 6.4.1
منصة تصوير مخصصة	فوجي فيلم فيجوالسونيكس	نظام تصوير الموجات فوق الصوتية VisualSonics Vevo 1100	تموضع الحيوانات أثناء تخطيط صدى القلب
الماء المقطر	لا يوجد	لا يوجد	تحضير الديكوشن والتحكم في المركبة
وشاح التدفئة الكهربائية	ميديا	WK2102	غليان القطرات
أنبوب القصبة الهوائية	شركة CWE Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية	SAR-1000	التنبيب في القصبة الهوائية؛ تم دمج أنبوب القصبة الهوائية المستخدم في هذه الدراسة في تكوين جهاز التنفس ولم يكن جهازا منفصلا أو مستقلا
الإيثانول (المطلق)	شركة بكين ييلي فاين كيميكاليات المحدودة.	64-17-5	الجفاف والتعقيم
حمض الفورميك	علاء الدين	O930702	إضافة الطور المتنقل
الشاش	سولاربيولوجيا	YA0720	ترشيح القطر؛ 200– 300 μ حجم المسام
قاعدة بيانات GeneCards	بطاقات الجين	—	استرجاع الأهداف المرتبطة بالمرض؛ تم الوصول إليه في يناير 2026
قاعدة بيانات GNPS	جامعة كاليفورنيا سان دييغو	—	قاعدة بيانات طيفية؛ الإصدار 1.3.16، البيانات أرشفت في ديسمبر 2025
برنامج GraphPad Prism	برنامج جراف باد	—	الإصدار 10.1.2؛ SCR_002798
وسادة التدفئة (حرارية)	فيزيتمب	HP-4M	تتم الحفاظ عليها عند 37 ودرجة واحدة؛ C
الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&) ه) مجموعة التلوين	سولاربيولوجيا	G1120	التلوين النسيجي
محول عالي التردد	فيزوالسونيكس	فيفو F2	18– 40 ميجاهرتز
مطياف الكتلة عالي الدقة	ثيرمو فيشر العلمي	س: إكسكتيف	Q إكساكتيف HF-X
نظام الموجات فوق الصوتية عالي الدقة للحيوانات الصغيرة	فوجي فيلم فيجوالسونيكس	نظام تصوير الموجات فوق الصوتية VisualSonics Vevo 1100	Vevo 2100
قاعدة بيانات HMDB	مجموعة أبحاث ويشارت / مركز الابتكار في علم الأيض، جامعة ألبرتا	—	قاعدة بيانات طيفية؛ الإصدار الحالي 5.0 من HMDB؛ الإصدار 5.0؛ يناير 2022
مكتبة مرجعية داخلية	ميتروير	—	تركيب مكتبة المرجع القياسية الداخلية: تحتوي المكتبة على ما مجموعه 5,000 مركب وتشمل بيانات MS1 (المقدمة) وبيانات MS2 (التجزئة). بيان التوفر: تنسيق بيانات المكتبة هو .txt. حالة التخزين: يتم تخزين قاعدة البيانات على الخادم الداخلي للشركة. أذونات الوصول: هذه المكتبة القياسية التي تم بناؤها ذاتيا هي مكتبة طيفية داخلية خاصة بالشركة. يستخدم فقط لتحديد المستقلبات، والتحقق من النتائج، وتتبع الجودة ضمن سير العمل التحليلي المسيطر عليه للشركة. المكتبة غير متاحة للتحميل. يمكن للعملاء الحصول على نتائج التعليقات التوضيحية، ومعلومات الضربات، ووصف الحقول الضروري الذي يتم إنشاؤه بناء على هذه المكتبة.
إيزوفلوران	سيغما-ألدرتش	792632	مخدر استنشاق
نظام الكروماتوغرافيا السائل (UPLC)	SCIEX	إكسون إل سي AD	إكسون إل سي AD
قاعدة بيانات ماس بنك	اتحاد ماس بانك؛ جمعية الطيف الكتلي في اليابان / ماس بنك أوروبا	—	قاعدة بيانات طيفية؛ الإصدار 2024.06؛ البيانات مؤرشفة في ديسمبر 2025
ماسون مجموعة التلوين الثلاثية الألوان	سولاربيولوجيا	G1340	التلوين النسيجي
مرشح الغشاء (0.22 μ m)	بيوتايم	FF362	البولي إيثير سلفون (PES)
قاعدة بيانات METLIN	معهد سكريبس للأبحاث / مختبر سيوزداك	RRID: SCR_010500	قاعدة بيانات طيفية؛ هذه القاعدة لا توفر رقم إصدار سنوي ثابت؛ البيانات التي تم تحميلها في عام 2023
الميثانول (درجة LC-MS)	شركة بكين ييلي فاين كيميكاليات المحدودة.	67-56-1	مذيب الاستخلاص
أنابيب الطرد المركزي الدقيق (1.5 مل)	شركة كورنينج لايف ساينسز (ووجيانغ) المحدودة.	MCT-150-C	معالجة العينات
ميكروتوم	لايكا	DSC1	تقسيم الأنسجة
راتنج محايد	سولاربيولوجيا	G8590	تركيب الشريحة
مبخر النيتروجين/مصدر الغاز	الأورغونوميشن	N-EVAP	تجفيف العينات
مرهم العيون	علاء الدين	08-03-8009	حماية العين أثناء التخدير
البارافين	سولاربيولوجيا	YA0010	تضمين الأنسجة
بارافورمالديهايد (4٪)	سولاربيولوجيا	P1110	تثبيت الأنسجة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	دو يو يو	DYP1021	غسل المناديل
حمض الفوسفوموليبد	سولاربيولوجيا	G1340	صبغة ماسون
Povidone– اليود	سولاربيولوجيا	IP3800	التعقيم الجراحي
برنامج بروتيو ويزارد	مؤسسة بروتيو ويزارد	—	الإصدار 3.0.19254
برنامج R	مؤسسة R	—	الإصدار 4.2.2
المبخر الدوار	شركة تشينغداو جينغتشنغ للآلات المحدودة	JC-2LZF	تركيز القطران تحت ضغط منخفض
خياطة الحرير (2-0)	الفولان	NL30RH26A-76	انقباضات الشريان الأبهر
جهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة	شركة CWE Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية	SAR-1000	جهاز التنفس الصناعي الميكانيكي
Sprague– فئران داولي (ذكر، 8 أسابيع)	شركة SPF Bio المحدودة.	—	RGD_70508؛ رقم الرخصة. SCXK(jing)2024-0001
قاعدة بيانات السلاسل النصية	اتحاد STRING	—	تحليل تفاعل البروتينات؛ تم الوصول إليه في يناير 2026
حزمة أو سكريبت تلطيف الانحدار المتجه الداعم	ميت نورمالايزر	—	تصحيح انحراف الإشارة؛ v1.3.02
قاعدة بيانات TCMSP	TCMSP	—	الاسترجاع المركب والهدف؛ تم الوصول إليه في يناير 2026
قاعدة بيانات UniProt	اتحاد يوني بروت	—	توحيد رموز الجينات
جل الموجات فوق الصوتية	ماغنافلوكس	25-912	تخطيط صدى القلب
الماء فائق النقاء	محضر في المختبر	—	مذيب الطور المتنقل
خلاط الدوامة	يالين	VM-ST	خلط العينات
حمام مائي	جولابو	PURA22	القسم يطفو عند 45 ودرجة مئوية؛ C
منصة ويشينغشين	ويشينغشين	—	تحليل تقاطعات الأهداف؛ تم الوصول إليه في يناير 2026
برمجيات XCMS	مؤسسة R	—	الإصدار 3.16.1
زيلين	علاء الدين	X775162	إزالة البارافرافينية