يصف هذا البروتوكول نهجا لضبط الفيبرين الغني بالصفائح الدموية بيولوجيا من خلال التخصيب بالكوبالامين وألفا-توكوفيرول قبل الطرد المركزي، مما يمكن من تعديل عامل النمو وإطلاق السيتوكين تحت ظروف المختبر .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
يصف هذا البروتوكول نهجا لضبط الفيبرين الغني بالصفائح الدموية بيولوجيا من خلال التخصيب بالكوبالامين وألفا-توكوفيرول قبل الطرد المركزي، مما يمكن من تعديل عامل النمو وإطلاق السيتوكين تحت ظروف المختبر .
الفيبرين الغني بالصفائح الدموية (PRF) هو مادة حيوية ذاتية الاستخدام تستخدم على نطاق واسع في طب الأسنان التجديدي بسبب توافقه الحيوي وإفراره المستمر لعوامل النمو. تحولت الأبحاث الحديثة نحو تعديل PRF بيولوجيا لتعزيز أدائه التجددي دون تغيير مبادئ التحضير الأساسية. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لضبط PRF بيولوجيا بدقة من خلال إثراء الكوبالامين والألفا-توكوفيرول قبل الطرد المركزي، وتقيم تأثيراتها على عامل النمو وإفراز السيتوكين الالتهابي تحت ظروف المختبر . تمت معالجة عينات الدم الطرفية التي تم الحصول عليها من متطوعين أصحاء باستخدام بروتوكول طرد مركزي ثابت. تمت إضافة الكوبالامين أو ألفا-توكوفيرول إلى الدم الكامل قبل الطرد المركزي للحصول على مصفوفات PRF المعدلة بيولوجيا. تم قياس ملفات إفراز عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF)، عامل النمو المحول-β1 (TGF-β1)، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)، عامل النمو الشبيه بالأنسولين-1 (IGF-1)، عامل نمو الأرومات الليفية-2 (FGF-2)، الإنترلوكين-1β (IL-1β)، وعامل نخر الورم-α (TNF-α) عند 24 ساعة و72 ساعة باستخدام اختبار منشط مناعي مرتبط بالإنزيم. ارتبط PRF الغني بالكوبالامين بفروق كبيرة بين المجموعات في مستويات TGF-β1 وانخفاض إطلاق السيتوكينات المضادة للالتهابات، مما يشير إلى تحول نحو بيئة ميكروية تجديدية أكثر ملاءمة. على النقيض من ذلك، كانت الزيادات التي لوحظت في FGF-2 وIGF-1 تعتمد على الزمن وتم اكتشافها عبر جميع المجموعات، دون إظهار تأثير خاص بالكوبالامين. أظهر PRF الغني بألفا توكوفيرول زيادة انتقائية في إفراز VEGF، مما يشير إلى تأثير مبكر محتمل. تظهر هذه النتائج أن التخصيب المستهدف للفيتامينات يمكن من التحكم في ضبط النشاط الحيوي ل PRF مع الحفاظ على طبيعته الذاتية والخالية من مضادات التخثر. يوفر هذا البروتوكول إطارا عمليا لضبط PRF بيولوجيا ويدعم استخدامه كمنصة تجديدية قابلة للتعديل للتطبيقات الانتقالية والسريرية المستقبلية.
الفيبرين الغني بالصفائح الدموية (PRF) هو مركز من الجيل الثاني من الصفائح الدموية الذاتية، وقد تم اعتماده على نطاق واسع في أمراض اللثة، وطب أسنان الزرعات، وجراحة الفم بسبب توافقه الحيوي، وسهولة تحضيره، وقدرته علىإطلاق عوامل النمو بشكل مستمر 1,2. يتم الحصول على PRF عن طريق الطرد المركزي للدم الكامل دون استخدام مضادات التجلط أو المنشطات الخارجية، مما ينتج عنه مصفوفة فيبرين ثلاثية الأبعاد تحبس الصفائح الدموية وكريات الدم البيضاء (الكريات البيضاء الدقيقة). تعمل هذه المكونات الخلوية كمستودعات داخلية لعوامل النمو، بما في ذلك عامل النمو المستخرج من الصفائح الدموية (PDGF)، وعامل النمو المحول-β1 (TGF-β1)، وعامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)، وعامل النمو الشبيه بالأنسولين-1 (IGF-1)، وعامل نمو الأرومات الليفية-2 (FGF-2)، والتي تنظم معا تكوين الأوعية، وهجرة الخلايا، والتكاثر، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية أثناء تجديد الأنسجة 3,4.
بعيدا عن تركيبه البيولوجي، يتأثر الأداء التجديدي ل PRF بشكل كبير ببنية شبكة الفيبرين والنشاط البيولوجي لمكوناته الخلوية. لهذا السبب، تجاوزت التحقيقات الحديثة بروتوكولات التحضير التقليدية وبدأت تصور PRF كنظام ناقل قابل للتعديل بيولوجيا بدلا من هيكل سلبي 5,6. أظهرت استراتيجيات التعديل الهيكلي، مثل دمج المواد الحيوية مثل حمض الهيالورونيك والكولاجين، أن الخصائص الفيزيائية والميكانيكية ل PRF يمكن تغييرها، مما يؤدي إلى تغييرات في تنظيم الفيبرين، والاستقرار الميكانيكي، وحركية إفراز عوامل النمو7. ساهمت هذه النتائج في تزايد الأدلة التي تدعم قدرة PRF على التكيف مع متطلبات التجدد المحددة.
بالتوازي مع الأساليب القائمة على المواد الحيوية، ظهر التخصيب القائم على الفيتامينات كاستراتيجية ذات صلة بيولوجية لتنظيم النشاط البيولوجي لPRF. تعرف الفيتامينات بتنظيم العمليات الخلوية الأساسية مثل الأيض، وتوازن الأكسدة والاختزال، وتخليق الكولاجين، وتكوين الأوعية، والإشارات الالتهابية. على وجه الخصوص، أثبتت الفيتامينات مثل حمض الأسكوربيك، والكوليكالسيفيرول، والكوبالامين، والألفا-توكوفيرول تأثيرها على سلوك الخلايا وشفاء الأنسجة من خلال مسارات جزيئية مميزة8. أظهرت الدراسات المختبرية السابقة أن تركيبات PRF الغنية بالفيتامينات يمكن أن تعدل ملفات إفراز عامل النمو، وتعبير السيتوكين الالتهابي، والخصائص البيوميكانيكية لمصفوفة الفيبرين، مما يشير إلى أن مكملات الفيتامينات تمثل وسيلة فعالة لتعديل PRF بيولوجيا دون تغيير طبيعته الذاتية9.
الكوبالامين (فيتامين B12) والألفا-توكوفيرول (فيتامين E) هما من المغذيات الدقيقة الأساسية المشاركة في العمليات البيولوجية الرئيسية المتعلقة بتوازن وإصلاح الأنسجة. يلعب فيتامين B12 دورا حيويا في تخليق الأحماض النووية، والأيض الخلوي، وتكوين الريثروبويز، وقد ارتبط نقصه بتغيرات في الغشاء المخاطي الفموي وتحلل أنسجة اللثة10,11. يعمل فيتامين E كمضاد أكسدة قوي يحد من تأكسد الدهون، ويقلل من الإجهاد التأكسدي، ويساهم في استقرار الكولاجين وتنظيم الاستجابات الالتهابية12,13. ومن المهم أنه، على الرغم من أن العمل الحالي يبني على التحقيقات السابقة التي تستكشف معدلات بيولوجية وفسيولوجية مختلفة ل PRF، إلا أن الدراسة الحالية تقدم بروتوكولا مميزا مخصصا للإثراء بالكوبالامين والألفا-توكوفيرول قبل الطرد المركزي. وبناء عليه، فإن هدف هذه الدراسة هو وصف بروتوكول قابل للتكرار لتحضير PRF غني بالكوبالامين والألفا-توكوفيرول وتقييم تأثيرات هذا النهج النشط بيولوجيا على عامل النمو وإفراز السيتوكين الالتهابي تحت ظروف المختبر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
أجريت هذه الدراسة التجريبية وفقا للمبادئ الأخلاقية المنصوص عليها في إعلان هلسنكي وحصلت على موافقة لجنة أخلاقيات البحث السريري في جامعة تشوكوروفا (رقم الموافقة: 139/25؛ التاريخ:8 ديسمبر 2023). قبل المشاركة، تم إبلاغ جميع الأفراد بإجراءات الدراسة، وتم الحصول على موافقة مستنيرة كتابية من كل مشارك. تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بعينات دم بشرية وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية. تم استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك القفازات والكمامات ومعاطف المختبر، طوال عملية التجربة. تم التعامل مع المواد البيولوجية باستخدام تقنيات المطهر، وتم التخلص من جميع النفايات وفقا لبروتوكولات إدارة المخاطر البيولوجية المعتمدة. جميع المواد الكيميائية والمواد الاستهلاكية والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد، بما في ذلك تفاصيل الشركة المصنعة والمواصفات ذات الصلة لضمان قابلية التكرار.
1. اختيار المشاركين
تم اختيار المشاركين من بالغين أصحاء جهازيا تتراوح أعمارهم بين 20 و30 عاما وأظهروا التزاما كافيا بإجراءات الدراسة. الأفراد الذين لديهم تاريخ من الأمراض الجهازية أو اضطرابات الدم أو الحالات المعروفة بتأثيرها على وظيفة الصفائح الدموية أو شفاء الجروح لم يعتبروا مؤهلين. شملت معايير الاستبعاد الإضافية الحمل أو الرضاعة، التدخين الحالي، العدوى الحديثة، فرط الحساسية المعروف للكوبالامين أو ألفا-توكوفيرول، واستخدام مكملات الفيتامينات أو الأدوية التي قد تتداخل مع نشاط الصفائح خلال الأشهر الستة السابقة. لتقليل التباين البيولوجي، تم تسجيل المتطوعين فقط الذين لديهم نتائج دموية أساسية طبيعية، وتم تقييم جميع المشاركين قبل الإدراج لضمان ملاءمتهم للتحضير ل PRF. كإجراء استكشافي أولي للتحقيق، استخدمت هذه الدراسة حجم عينة بناء على الجدوى وتوفر المشاركين المؤهلين خلال فترة الدراسة، وتم تحليل عينات من اثني عشر مشاركا.
2. جمع الدم وتوزيع المجموعات
تم جمع دم وريدي محيطي من كل مشارك باستخدام أنابيب زجاجية خالية من الإضافات بحجم 10 مل في ظروف معقمة. تم الحصول على خمسة أنابيب لكل مشارك. تم تخصيص أنبوب واحد لتحليل كامل لعدد الدم، واستخدم أنبوب آخر لتحديد مستويات الكوبالامين في المصل الأساسي ومستويات ألفا-توكوفيرول. تم تخصيص الأنابيب الثلاثة المتبقية لتحضير الفيبرين الغني بالصفائح الدموية (PRF). من بين هذه المواد، خدم أنبوب واحد كمجموعة PRF الضابطة دون أي إضافات، وتلقى أنبوب واحد كوبالامين (1 مل) قبل الطرد المركزي للحصول على PRF الغني بالكوبالامين، وتلقى أنبوب واحد ألفا-توكوفيرول (0.5 مل) قبل الطرد المركزي للحصول على PRF غني بألفا توكوفيرول. تم إعطاء الكوبالامين كمحلول حقن معقم (1000 ميكروغرام/مل)، واستخدم ألفا-توكوفيرول في شكل أمبول (2 مل). تمت معالجة جميع العينات فور جمع الدم لتجنب التخثر المبكر.
3. PRF التحضير
تم جمع عينات دم وريدي محيطي من كل مشارك باستخدام أنابيب زجاجية معقمة خالية من مضادات التخثر. مباشرة بعد الجمع، وضعت الأنابيب في جهاز طرد مركزي ومعالجتها دون تأخير لمنع التخثر المبكر. تم إجراء الطرد المركزي عند 2700 دورة في الدقيقة (708 × جم) لمدة 12 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة) باستخدام نظام دوار بزاوية ثابتة. عند الانتهاء من الطرد المركزي، لوحظت ثلاث طبقات مميزة: جزء سفلي لخلايا الدم الحمراء، طبقة بلازما علوية فقيرة بالصفائح الدموية، وجلطة فيبرين وسيطة تمثل الفيبرين الغني بالصفائح الدموية (PRF). تم فصل جلطة PRF بعناية عن طبقة خلايا الدم الحمراء باستخدام أدوات معقمة وعزلها لمزيد من المعالجة. لتحضير مجموعات PRF المخصبة، تم إدخال الإضافات المخصصة إلى عينات الدم مباشرة قبل الطرد المركزي في ظروف موحدة. مكن هذا النهج من دمج المركبات النشطة الحيوية في مصفوفة الفيبرين النامية أثناء تكوين الجلطات (الشكل 1).

الشكل 1: مخطط تدفق يوضح البروتوكول المنهجي لأخذ عينات PRF. تمت إضافة 1 مل من الكوبالامين (A) و0.5 مل من ألفا-توكوفيرول (B) إلى عينات الدم قبل الطرد المركزي. عينات PRF الناتجة في الأنابيب (C) وبعد فصلها عن طبقة خلايا الدم الحمراء (D). النتيجة النهائية PRF المغنية بالكوبالامين (E) وPRF المغنية بألفا-توكوفيرول (F). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
4. الحضانة المخبرية لعينات PRF
تم نقل كل جلطة PRF إلى أنبوب معقم، وأضيف وسط زراعة الخلايا بنسبة موحدة 1 مل لكل 1 جرام من الجلطة (1:1، ضض/بض) لضمان بيئة انتشار متسقة عبر جميع العينات. وضعت الأنابيب على جهاز هزاز مداري وحضنتها عند 37 درجة مئوية لمدة إجمالية تبلغ 72 ساعة لتسهيل إطلاق عوامل النمو والسيتوكينات تدريجيا من مصفوفة PRF. تم جمع المواد الفائقة عند 24 ساعة و72 ساعة، ثم نقلت إلى أنابيب دقيقة معقمة، وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى إجراء تحليلات إضافية. تم استخدام وسط زراعة الخلايا دون مكملات مصل لتجنب التداخل من عوامل النمو الخارجية ولضمان أن جميع الجزيئات الحيوية المقاسة نشأت فقط من مصفوفة PRF.
5. تحليل ELISA لعامل النمو
تم قياس تركيزات عامل النمو المستخرج من الصفائح الدموية (PDGF)، عامل النمو المتحول β1 (TGF-β1)، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)، عامل النمو الشبيه بالأنسولين-1 (IGF-1)، عامل نمو الأرومات الليفية-2 (FGF-2)، الإنترلوكين-1β (IL-1β)، وعامل نخر الورم-α (TNF-α) في المواد المجمعة باستخدام مجموعات اختبار منشطات مناعية مرتبطة بالإنزيمات وفقا لتعليمات المصنعين. تم قياس قيم الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوح، وتم حساب تركيزات التحليل بناء على منحنيات المعايرة القياسية.
6. التحليل الإحصائي
تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام إحصائيات IBM SPSS لنظام ويندوز (الإصدار 20.0). تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± انحراف معياري ومتوسط (أدنى–أعظم)، حسب الاقتضاء. تم تقييم معدل توزيع البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. أجريت مقارنات داخل المجموعات بين النقاط الزمنية باستخدام اختبار t المزدوج أو اختبار ويلكوكسون لتصنيف الموقع، بينما أجريت المقارنات بين المجموعات باستخدام تحليل التباين بمقاييس متكررة أو اختبار فريدمان، حسب الاقتضاء. تم اعتبار قيمة p <0.05 ذات دلالة إحصائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم تحقيق تحضير ناجح للفيبرين الغني بالصفيحات الدموية (PRF) الغني بالكوبالامين، والمغني بالألفا توكوفيرول، لدى جميع المشاركين. أكد الفحص الماكروسكوبي تكوين جلطات PRF منظمة جيدا مع سلامة الفيبرين المحفوظة واستقرار ميكانيكي كاف، مما سمح بالتعامل المعياري، والحضانة، والتحليلات الكيميائية الحيوية اللاحقة (الجدول 1).
| المتغيرات |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تظهر الدراسة الحالية أن الفيبرين الغني بالصفائح الدموية (PRF) يمكن ضبطه بيولوجيا بدقة من خلال تخصيب مستهدف بالكوبالامين وألفا توكوفيرول قبل الطرد المركزي، مما يؤدي إلى تعديل مميز وقابل للتكرار لعوامل النمو وملفات إطلاق السيتوكينات. تعزز هذه النتائج المفهوم المتطور بأن PRF ليس مجرد هيكل سلبي ذاتي بل هو مصفوفة متجاوبة بيولوجيا يمكن تعديل سلوكها التجديدي من خلال تدخلات نشطة بيولوجية مختارة بعناية دون تغيير مبادئ تحضيرها الأساسية.
يمارس PRF إمكاناته التجديدية بشكل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ألفا-توكوفيروس (فيتامين E) | أكسو فارما، إسطنبول، تركيا | A11HA03 | أمبولة EVIGEN 2 مل |
| الطرد المركزي (40 درجة؛ دوار بزاوية ثابتة) | عملية PRF، نيس، فرنسا | 913023410238 | جهاز الطرد المركزي الثنائي |
| كوبالامين (فيتامين ب12) | ديفا هولدينغ، إسطنبول، تركيا | B03BA01 | أمبول DODEX 1000 ميكروغرام/مل��سبورد; |
| أنابيب إيبندورف | أكسجين | PCR-02-C | 200 قطعة |
| أنابيب جمع الدم الزجاجي | هيما & تيوب (إسطنبول، تركيا) | HNM8080 | (10 مل) لا يوجد مضاد تخثر |
| حل الموارد البشرية | مشمولة في مجموعة ELISA | ||
| مجموعة ELISA البشرية - FGF | ووهان فاين بيوتيك | EH0541 | اختبار جيد |
| مجموعة إليسا البشرية - IGF-1 | ووهان فاين بيوتيك | ER0030 | اختبار ممتاز |
| مجموعة إليسا البشرية - PDGF | ووهان فاين بيوتيك | ER1240 | اختبار ممتاز |
| مجموعة ELISA البشرية - TGFβ-1 | ووهان فاين بيوتيك | EH0287 | اختبار جيد |
| مجموعة ELISA البشرية - VEGF | ووهان فاين بيوتيك | EH0327 | اختبار جيد |
| إنسان: IL-1&beta؛ مجموعة إليسا | ووهان فاين بيوتيك | EH0185 | اختبار جيد |
| بشري TNF-&; مجموعة إليسا | ووهان فاين بيوتيك | EH0302 | اختبار جيد |
| الميكروبايتات والميكروبايتات نصائح | إبندورف | 3123000063 | مجموعة واحدة |
| قارئ اللوحة الدقيقة | البيوكروم | EZ Read 400 | 450 نانومتر |
| هزز المدارات | ستيوارت | SSM3 | ميني جيرو-روك |
| مقياس الدقة | سارتوريوس | H51-D | قطعة واحدة |
| وسط زراعة الخلايا RPMI-1640 | هايكلون، سايتيفا، الولايات المتحدة الأمريكية | SH30027.01 | 500 مل |
| مقص معقم | ASA لطب الأسنان (إسطنبول، تركيا) | 0305-1 | قطعة واحدة |
| حل الإيقاف | مشمولة في مجموعة ELISA | ||
| محلول الركيزة | مشمولة في مجموعة ELISA | ||
| مخزن الغسيل | مشمولة في مجموعة ELISA |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.