طريقة متكاملة لنمذجة السكتة الضوئية وتسجيل الأوبترود البصري للنشاط العصبي والنجمي في الفئران السلوكية

ملخص

يوفر هذا البروتوكول طريقة متكاملة تشمل توصيل الفيروس، وزرع الأوبترود، والتحفيز الضوئي الخثري، وتسجيل النشاط النجمي والنشاط العصبي في نفس الوقت، والتحفيز البصري للخلايا النجمية. تهدف هذه الطريقة المتكاملة إلى تقديم دراسة متزامنة لعلاقة الخلايا النجمية والعصبون عبر المراحل الحادة إلى المزمنة للسكتة الدماغية الإقفاري.

الملخص

يعد التحقيق في ديناميكيات الخلايا النجمية والخلايا العصبية بعد السكتة الدماغية الإقفاري أمرا ضروريا لفهم آليات التعافي بعد السكتة الدماغية. ومع ذلك، غالبا ما تفشل المنهجيات الحالية في التقاط التفاعلات الفورية بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية في الحيوانات التي تنفذ مهام سلوكية محددة، مما يحد من قدرتنا على دراسة المرحلة الحادة من مرض السكتة الدماغية. يقدم هذا البروتوكول طريقة متكاملة تجمع بين نمذجة السكتة الضوئية مع تسجيل الفيزيولوجيا الكهربائية متعددة القنوات وفوتومترية الألياف في فئران مستيقظة وسلوكية باستخدام أوبترود مصمم خصيصا. يشمل البروتوكول تحفيز نقص الترويا البؤري عبر الجلطة الضوئية يليه تسجيل متزامن للارتفاعات العصبية وانتقالات الكالسيوم النجمية. يتيح الأوبترود توصيل الجلطة الضوئية، وتسجيل إشارات الكالسيوم، والتلاعب البصري المتزامن دون الحاجة إلى إجراءات جراحية منفصلة. النتائج الممثلة تؤكد النجاح في تسجيل إشارة الكالسيوم النجمية وارتفاع الخلايا العصبية في نفس الوقت. يؤدي التلاعب البصري بالخلايا النجمية إلى تغييرات قابلة للقياس في أنماط إطلاق الخلايا العصبية (انخفاض في تكرار إطلاق الخلايا العصبية الهرمية بمقدار 1.55 ± 0.45 هرتز، وانخفاض في العصبون البصرية بمقدار 3.64 ± 1.37 هرتز مقارنة بالتحفيز البصري قبل البصري، n = 2)، مما يؤكد أن النظام قادر على دراسة تفاعلات الخلايا النجمية والخلايا العصبية. يعالج هذا النهج المتكامل الفجوات الحرجة في منهجية البحث عن السكتة الدماغية من خلال توفير تسجيلات متعددة الوسائط في الوقت الحقيقي من المرحلة الحادة إلى المزمنة للسكتة الدماغية في الحيوانات السلوكية.

المقدمة

لا تزال السكتة الدماغية الحربية تحديا صحيا عالميا رئيسيا، وتمثل سببا رئيسيا لكل من الوفيات والإعاقة المكتسبة طويلة الأمد على مستوى العالم ^1,2,3. يرتبط معدل الإعاقة المرتفع المرتبط بالسكتة الدماغية الإقفاري بمجموعة متنوعة من الأعراض السريرية، تتراوح بين الشلل الحركي وفقدان الحواس إلى ضعف الإدراك ^4,5,6. هناك حاجة ملحة لفهم أعمق لآليات التعافي والمرضية للسكتة الدماغية الإقفاري خلال مرحلة الإصلاح. بعيدا عن الفشل العصبي، تم تسليط الضوء مؤخرا على الفشل الكارثي للخلايا النجمية ^7,8. الخلايا النجمية، وهي أكثر الخلايا الدبقية وفرة، هي مكون أساسي في الجهاز العصبي المركزي وكذلك في المشابك الثلاثي الأجزاء. في كل مرحلة من مراحل السلسلة الإقفارية، تلعب الخلايا النجمية دورا لا غنى عنه وتؤثر بعمق على التعافي العصبي والوظيفي ^9,10,11. في الدماغ السليم، ترتبط الخلايا النجمية والعصبونات وظيفيا عبر المشبك الثلاثي، حيث تغطي العمليات النجمية الأطراف قبل وبعد المشبك وتشارك بنشاط في النقل المشبكي ^7,8. تنظم الخلايا النجمية تركيزات الجلوتامات خارج الخلية عبر ناقلات الأحماض الأمينية المثيرة، وتحافظ على توازن البوتاسيوم عبر قنوات Kir4.1، وتعدل قوة المشبك العصبي من خلال إطلاق ناقل الدبق عبر الإخراج الخلوي المعتمد^على الكالسيوم ^7,8. في هذا السياق، تمثل العابرات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية نشاطا نجميا وترتبط ارتباطا وثيقا بإطلاق الخلايا العصبية⁷. خلال السكتة الدماغية الإقفارية، تتعطل هذه العلاقة الدقيقة بسرعة. يؤدي انهيار التدرجات الأيونية بعد فشل الطاقة إلى إطلاق الجلوتامات بشكل هائل وانتشار إزالة الاستقطاب، مما يؤدي إلى إصابة عصبية سامة وتكاثر الخلايا النجمية التفاعلية¹². تمر الخلايا النجمية داخل وحول نواة الاحتشاء بسلسلة من التغيرات المرضية، بما في ذلك فرط الكالسيوم، وضعف إعادة امتصاص الجلوتامات، وفقدان اقتران المشابك العصبية، وفشل إطلاق ناقل الدبقي¹³. في الوقت نفسه، يتم كبت نشاط الارتفاع العصبي بشكل كبير مع فقدان الخلايا العصبية للبقاء وسلامة جهد الغشية^14,15. في منطقة ما حول الاحتشاء، تشارك الخلايا العصبية الناجية والخلايا النجمية التفاعلية في تفاعلات ديناميكية يعتقد أنها حاسمة لتحديد نتيجة التعافي بعد السكتة الدماغية؛ ومع ذلك، فإن الترابطات الفيزيولوجية الكهربائية والكالسيوم في الوقت الحقيقي لهذا التفاعل لدى الحيوانات المستيقظة والمتصرفة لا تزال غير موصوفة بشكل جيد^13,16. وبالتالي، يعتبر فهم النشاط النجمي جنبا إلى جنب مع الإشارات العصبية حجر الزاوية في تعافي الوظائف العصبية بعد الإصابة الإقفارية.

الجلطة الضوئية هي نموذج إقفاري واسع الاستخدام؛ يستخدم صبغة حساسة للضوء والضوء الموضعي لتحفيز آفات إقفاري في مناطق محددة^{مستهدفة 17}. تعيق بروتوكولات نمذجة وتسجيل السكتة الدماغية الحالية دراسة تفاعل الخلايا النجمية مع الخلايا العصبية بعد السكتة الدماغية من خلال ثلاثة عنق زجاجة تقني^{رئيسي 17، 18، 19}. يعد فصل النمذجة والتسجيل عيبا شائعا في معظم البروتوكولات الحالية، مما يسبب فجوة زمنية بين إنشاء النموذج وتسجيل الإشارة في الوقت الحقيقي ^20,21. ومع ذلك، فإن دقائق إلى ساعات بعد السكتة الدماغية الإقفاري هي فترة أساسية تمر خلالها كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية بتقلبات حادة^12,22. بدون مراقبة متزامنة لتفاعل الخلايا النجمية والخلايا العصبية مباشرة بعد الحادثة الإقفاري، ستتعثر التحقيق في التدخل المبكر الفعال للسكتة الدماغية الإقفاري بشكل كبير. ويمثل القيود الإضافية للبروتوكولات الحالية في عزل أساليب التسجيل؛ معظم المنهجيات الحالية محسنة لنوع واحد من الإشارات. على سبيل المثال، تقدم الفيزيولوجيا الكهربائية متعددة القنوات اكتشاف إطلاق الخلايا العصبية والجهود الحقلية المحلية (LFPs) لكنها لا تتجاهل حالات الإشارة في الخلايا الدبقية^15,16. وعلى العكس، فإن مراقبة ديناميكيات الخلايا النجمية من خلال تصوير الكالسيوم في الجسم الحي تلتقط تقلبات الخلايا النجمية لكنها تفتقر إلى بيانات إطلاق الخلايا العصبية. يبدو أن آخر عنق زجاجة في البروتوكولات الحالية هو حالة تسجيل الحيوان؛ في معظم البروتوكولات، يتم تخدير الحيوان أو يتحرك بحرية. ومع ذلك، يعتبر خلل الحركة من أكثر آثار السكتة الدماغية إزعاجا؛ فهم العلاقة بين بعض السلوكيات وأحداث الخلايا النجمية والعصبون أمر ضروري. لذلك، هناك حاجة ملحة لطريقة متكاملة قادرة على إجراء نموذج السكتة الدماغية الضوئية مع التقاط إشارات الخلايا النجمية والعصبية في الفئران المستيقظة التي تجري اختبارات سلوكية معينة في الوقت نفسه. كل منهجية موجودة تعالج فقط جزءا من هذه المتطلبات. يوفر تصوير الكالسيوم بفوتونين دقة مكانية استثنائية لديناميكيات المجال الميكروسيتي النجمية في الدماغ السليم، لكنه يتطلب تثبيت الحيوانات على الرأس أو تخديرها، مما يمنع التقييم السلوكي الطبيعي، ولا يمكنه في الوقت نفسه التقاط بيانات الشوكة العصبية متعددة القنوات¹³. يتيح الفوتومتري المنفصل للألياف مراقبة الكالسيوم النجمي في الحيوانات التي تتصرف بحرية لكنه يظل غير متوقع عن أنماط إطلاق الخلايا العصبية، ولا يقدم أي قراءة كهربائية فيزيولوجية لوظيفة الدائرة¹⁶. تحل الفيزيولوجيا الكهربائية خارج الخلايا متعددة القنوات النشاط المتزايد لوحدات الخلايا العصبية وجهود المجال المحلية بدقة زمنية عالية لكنها لا تقدم معلومات عن حالة الإشارة للخلايا النجمية¹⁵. ومع ذلك، لا يمكن لأي من هذه الطرق أن تحفز سكتة ضوئية موضعية دقيقة في الوقت نفسه وإجراء تسجيل متعدد الوسائط من نفس الموقع التشريحي دون انقطاع.

لمعالجة القيود التقنية القائمة، نقترح هذا النظام المتكامل. يعالج هذا النظام القيود الثلاث ضمن جهاز مزروع مزمنا واحدا، مما يتيح تحفيز الجلطة الضوئية المتزامنة، وتسجيل الكالسيوم النجمي بواسطة الفوتومترية الليافية، وتخطيط كهربائي الخلايا العصبية متعددة القنوات في الفئران المستيقظة والمتحركة بحرية—من لحظة بداية السكتة الدماغية وحتى المراحل المزمنة للسكتة الدماغية. يتم التحقق من صحة جدوى هذه الطريقة من خلال زرع أوبترود مخصص في أدمغة الفئران يعبر عن مؤشر كالسيوم خاص بالخلايا النجمية وناقل فيروسي بصري. باستخدام هذه الطريقة، يتم تسجيل وتحليل الانتقالات النجمية للكالسيوم وأنشطة إطلاق الخلايا العصبية في الوقت نفسه أثناء المهام السلوكية وتحت التعديلات البصرية.

البروتوكول

حصل هذا البروتوكول على موافقة لجنة العناية بالحيوانات واستخدامها في جامعة قوانغتشو للطب الصيني (00379474)، وتم تنفيذه وفقا للإرشادات واللوائح التي صممها الدليل الوطني للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم تنفيذ جميع الإجراءات الممكنة لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة.

1. توصيل الفيروس عبر ناقل الفيروس

ملاحظة: يصف هذا القسم الحقن الفراغي لمتجهات AAV الخاصة بالخلايا النجمية في القشرة الحركية (M1FL). الهدف هو تحقيق تعبير مستقر وخاص بالخلايا النجمية لكل من مؤشر الكالسيوم GCaMP6s والبنية البصرية البصرية البصرية قبل زرع الأوبترود. المعدات الرئيسية المطلوبة: إطار ستيريوتاكسي، نظام فيرنييه رقمي، ميكروبيبت زجاجية، ومضخة حقن دقيقة.

1. ضع الفأر في غرفة الحث؛ ابدأ التخدير بإضافة إيزوفلوران بنسبة 3٪–4٪ ويمكن زيادة تركيز الإيزوفلوران إلى الحد الأقصى 5٪ في الدقيقة الأولى حتى يصبح الفأر غير مستجيب.
   تحذير: الإيزوفلوران هو عامل مخدر متطاير. قم بجميع الإجراءات تحت التهوية النشطة. تجنب التعرض الشخصي لفترة طويلة.
2. انقل الفأر إلى الإطار المجسم المزود بقناع تخدير، واستخدم 1–2٪ إيزوفلوران للحفاظ على مستوى تخدير عميق.
3. تحقق من عمق التخدير كل 10 دقائق عبر إيقاع التنفس، وردة فعل الخفف، وقرص إصبع القدم. حافظ على درجة حرارة جسم الفأر بين 36–37.5 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة تتحكم بها التغذية الراجعة.
4. ضع مرهم العيون على العينين لمنع تلف القرنية أثناء الجراحة.
5. ثبت الفأرة على إطار ستيريوتاكسي مع قضبان أذن وقضيب فم. اضبط قضبان الأذن لضمان تثبيت رأس الفأرة بشكل متماثل. تأكد من تثبيت الرأس باستخدام فحص لطيف.
6. قم بإزالة الشعر جيدا باستخدام كريم إزالة الشعر وقم بعمل شق منتصف الخط بالمقص الجراحي لكشف الجمجمة. نظف السباقات باستخدام المالحة ومسحات القطن لتعريض بريغما لامبدا.
7. خفض الميكروبايبت الزجاجية لتلامس بريغما لامبدا على التوالي؛ لاحظ إحداثيات Z على الفيرنييه الرقمي. اضبط قضيب الفم لضمان أن يكون الفرق <0.04 مم.
8. اخفض الميكروبايبت الزجاجية لتلامس بريغما وأعد ضبط الفيرنييه الرقمي إلى الصفر. حرك الماصغروبايبت بمقدار 2.3 مم إلى اليسار واليمين من بريغما على التوالي؛ لاحظ إحداثيات Z على الفيرنييه الرقمي. اضبط قضبان الأذن لضمان أن تكون الفروقات الثنائية <0.04 مم.
9. أعد ضبط الفيرنييه الرقمي إلى الصفر عند بريغما وحدد قشرة المحرك (M1FL؛ AP: +1.5 مم، ML: +0.74 مم). استخدم مثقاب دقيق مع رؤوس حفر بقطر 0.5 مم (طرف مستدير) لحفر ثقب صغير قطره حوالي 0.5 مم في الموقع المحدد. احفر بحذر لتجنب النزيف وتلف أنسجة الدماغ؛ قم بإسقاط محلول ملحي بارد مثلج لتعويض الحرارة الناتجة أثناء عملية الحفر.
10. خفض الميكروبايبت الزجاجية المتصلة بمضخة تسريب دقيقة إلى الموقع المستهدف (DV: -0.94 مم من سطح الدماغ). قبل التحميل، اخلط AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s وAAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP بكميات متساوية لتحضير خليط فيروسي. قم بحقن 400 نانولتر من الخليط (200 نانولتر من كل متجه) بمعدل 50 نانولتر/دقيقة.
    ملاحظة: يحتوي الكوكتيل الفيروسي على: 200 نانولتر من مؤشر الكالسيوم الخاص بالخلايا النجمية (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s، 1.0 ×^{10 13} vg/mL) و200 نانولتر من الناقل الفيروسي البصري الخاص بالخلايا النجمية (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap، 1 ×^{10 13}vg/mL). تم التحقق من نجاح النقل الخاص بالخلايا النجمية في مجموعة فرعية من الحيوانات من خلال التلوين المناعي الفلوري ل GFAP، مما أكد التزامين المشترك بين المبلغ الفلوري والخلايا الإيجابية ل GFAP وغياب التعبير في الخلايا السلبية ل GFAP.
    تحذير: ناقلات AAV هي عوامل بيولوجية مؤتلفة؛ التعامل مع جميع الناقلات الفيروسية والنفايات وفقا لإرشادات السلامة الحيوية للمؤسسة.
11. اترك الماصة في مكانها لمدة 10 دقائق بعد انتهاء التسريب للسماح بانتشار الفيروس بشكل أفضل ومنع التدفق العكسي. اسحب الماصة ببطء، وخيط فروة الرأس (4-0، 20 مم، دائري 3/8)، وضع الفأرة على وسادة تسخين حتى تتعافى تماما.
    ملاحظة: يتطلب الأمر فترة تتراوح بين 3 إلى 4 أسابيع للتعبير الأمثل عن الفيروس. الجدول الزمني التفصيلي للبروتوكول موضح في الشكل 1A.

2. فحص أوبترود والتحقق الوظيفي

ملاحظة: قبل الزرع، يجب فحص الأوبترود المصنوع خصيصا جسديا واختباره بصريا للتأكد من قدرته على توصيل الضوء في جميع الأوضاع الوظيفية الثلاثة (الجلطة الضوئية، التحفيز البصري، والفوتومترية الأليافية). المعدات الرئيسية المطلوبة: المجهر، مقياس القدرة البصري، ومصادر الليزر عند 532 نانومتر، 488 نانومتر، 470 نانومتر، و405 نانومتر.

1. الفحص الفيزيائي للعشاق البصري:
   1. ضع الأوبترود المصنع تحت المجهر لفحص ترتيب مواقع التسجيل.
   2. تأكد من أن الأسلاك الدقيقة الستة عشر التنجستن مجمعة بشكل متساو وتحيط بالألياف البصرية المركزية. افحص عدم وجود أي أسلاك منحنية أو متقاطعة قد تسبب أقصر كهربائي.
   3. تأكد من أن طرف الألياف البصرية أقصر من أسلاك التنجستن الدقيقة (الشكل 1B).
      ملاحظة: يجب أن يكون طرف الألياف البصرية متراجعا بمقدار 100-200 ميكرومتر عن أطراف القطب²³. هذا الإزاحة، التي تم اعتمادها من لي ^{وآخرين،} تضمن أن مخروط الضوء يغطي منطقة التسجيل بشكل كاف مع منع الضوضاء الكهروضوئية الزائدة. يشجع الباحثون على التحقق تجريبيا من الإزاحة المناسبة تحت أوبترودهم الخاص.
2. قم بتوصيل الألياف البصرية بمصدر نمذجة الليزر ومصدر التسجيل. استخدم مقياس القدرة الضوئية لقياس الخرج عند طرف الألياف للثلاثة أوضاع الوظيفية التالية (الشكل 1B):
   1. وضع النمذجة الضوئية: تحقق من أن النظام يمكنه تقديم ضوء الموجة المستمرة عالي الشدة (CW) (532 نانومتر).
      ملاحظة: تم استخدام ألياف ب NA 0.22 في هذه التجربة. القطر المقدر للبقعة المضيئة عند 100–200 ميكرومتر تحت طرف الألياف هو تقريبا 200–400 ميكرومتر. تأكد من وصول الطاقة عند الطرف إلى >20 ميلاواط لضمان تنشيط روز بنغال بنجاح وتكوين الجلطمات.
   2. وضع التلاعب البصري: اختبار خرج الليزر النبضي (مثلا، 488 نانومتر لتقنية opto-vTrap).
      ملاحظة: معايرة القدرة إلى 10 مللي واط عند الطرف؛ تم تحسين ذلك لتفعيل opto-vTRAP عند عمق تسجيل 0.94 مم في قشرة المحرك. بالنسبة لمناطق دماغية أخرى، يوصى بالتحقق السلوكي أو الفسيولوجي الكهربائي.
   3. وضع الفوتومترية الليفية (تسجيل الكالسيوم): اختبر ضوء الإثارة منخفض القدرة (مثل 470 نانومتر و405 نانومتر).
      ملاحظة: تأكد من أن الإخراج مستقر ويتم الحفاظ عليه عند مستوى منخفض جدا (<50 ميكروواط) لتقليل السمية الضوئية وتبييض مؤشر الكالسيوم (مثل GCaMP6s) أثناء التسجيل طويل الأمد.

3. زرع الأوبترود المزمن

ملاحظة: يغطي هذا القسم الإجراء الجراحي لزرع الطرف المقابل بشكل مزمن في موقع الحقن الفيروسي. الموقع الدقيق لإحداثيات الحقن ضروري لضمان أن الأقطاب الموسيقية المسجلة والألياف البصرية تأخذ عينات من منطقة GCaMP6s وتعبير opto-vTRAP. المعدات الرئيسية المطلوبة: إطار مجسم، مثقاب دقيق، ملقط، براغي تجميد الجمجمة، جل الأروز، وأسمنت الأسنان.

1. بالنسبة للتخدير، والتثبيت المجسم، وتحضير الجمجمة، والتوازن، اتبع نفس الإجراء الموضح في القسم 1، باستثناء أنه أثناء الشق في فروة الرأس، يتم إزالة 1.5 سم × 1.5 سم من فروة الرأس مع التأكد من بقاء جلد كاف حول العينين.
2. نظف الجمجمة ببيروكسيد الهيدروجين ومحلول ملحي بنسبة 0.9٪. حدد بريغما وأعد ضبط الفيرنييه الرقمي إلى الصفر.
3. استخدم المثقاب (0.8 مم، طرف دائري) لتخشن سطح الجمجمة بشكل خفيف للسماح بتثبيت أسمنت الأسنان بشكل أفضل.
4. حدد قشرة المحرك بعلامة (M1FL؛ AP: 1.5 مم، ML: 0.74 مم)، ثم استخدمه كنقطة مركزية لرسم مربع 5 مم × 5 مم (الشكل 1C).
   1. استخدم المثقاب الصغير بسرعة مناسبة (حوالي 10000 دورة في الدقيقة) وتتبع المربع. قم بإسقاط محلول ملحي بارد جدا باستمرار على مسار الحفر أثناء الحفر لتعويض الحرارة الناتجة عن الحفر عالي السرعة ومنع تلف أنسجة الدماغ. توقف فورا إذا ارتخى شريحة العظم (الشكل 1C).
5. احفر ثلاث ثقوب صغيرة (قطرها 0.5 مم) فوق نصف الكرة المخيخية المقابل المعاكس، وازرع براغي تجميل الجمجمة في الفتحات. تأكد من وصول كل برغي إلى الجافة الأم، مع تجنب أي اختراق إضافي أو ضرر إضافي لأنسجة الدماغ (الشكل 1C).
6. استخدم الملقط لإزالة شريحة العظم التي تم فكها سابقا. تجنب أي قوة إضافية للأسفل أثناء الإزالة لمنع تلف أنسجة الدماغ والحفاظ على سلامة الجافة المادية.
   ملاحظة: إذا حدث أي نزيف، يمكن استخدام إسفنجة دموية لإيقاف النزيف بسرعة.
7. استخدم ملقط بطرف فائق الدقة (<0.03 مم × 0.01 مم) لإزالة الدورا ماتر عند نافذة الجمجمة. امنع طرف الملقط من القرص مباشرة في أي نسيج دماغي خلال هذه العملية.
   ملاحظة: بعد إزالة العظم، من المهم جدا الحفاظ على رطوبة نسيج الدماغ. ينصح باستخدام كرات قطنية معقمة مغمورة بمحلول ملحي لتغطية النافذة عند عدم إجراء أي إجراء لتجنب التورم وتلف الخلايا العصبية الناتجة عن الجفاف.
8. ثبت البصرية على ذراع الميكرو مانبوليتور في إطار الستيريوتاكسي وانقله فوق نافذة الجمجمة. قم بتشابك الأرض الفضية والأسلاك المرجعية للجهاز البصري بثلاثة براغي تجميح الجمجمة (الشكل 1C).
9. نظف سطح نافذة الجمجمة بمحلول ملحي معقم للتأكد من عدم وجود نزيف أو جلطات دموية قد تعيق إدخال الأقطاب. خفض النقطة البصرية تدريجيا إلى العمق المطلوب (DV: -0.94 مم) بمعدل 1 ميكرومتر/ثانية.
   ملاحظة: يجب ترطيب الأنسجة القشرية المكشوفة بمحلول ملحي معقم أثناء الانغراس.
10. ضع طبقة من الأغاروز فوق نافذة الجمجمة بعد الزرع لحماية النسيج القشري من الأسمنت السني.
11. ضع 3–4 طبقات من الأسمنت السني لتغطية الجمجمة المكشوفة، مع التأكد من تثبيت الأوبترود بالكامل. قم بإزالة الفأرة من الإطار المجسم بمجرد أن يصبح الأسمنت السني صلبا (الشكل 1C).
12. قدم تسكين للألم لمدة 3–5 أيام ودع الفأر يتعافى لمدة أسبوع إلى أسبوعين قبل التسجيل والنمذجة.

4. النمذجة الضوئية والتسجيل المتزامن

ملاحظة: يصف هذا القسم التعود السلوكي، وتسجيل الخط الأساسي، وتحفيز السكتة الدماغية عن طريق الجلطة الضوئية، وإجراءات التسجيل الطولي بعد السكتة الدماغية. يتم توصيل الجلطة الضوئية عبر الأوبترود المزروعة بينما يتم الحفاظ على تسجيل الفيزيولوجيا الكهربائية وفوتومترية الألياف في نفس الوقت. المعدات الرئيسية المطلوبة: جهاز روتارود، مقياس قوة القبضة، نظام الفوتومترية الليافية، نظام التسجيل العصبي متعدد القنوات، صبغة روز بنغال، ومصدر ليزر عند 530 نانومتر.

1. اجعل الفأر يخضع لتدريب سلوكي قبل النمذجة.
   ملاحظة: تم إيواء جميع الحيوانات واختبارها في ظروف مختبرية موحدة. ظروف السكن: درجة حرارة الغرفة 20–25 درجة مئوية، رطوبة نسبية 50٪–60٪، على دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة (الأضواء مضاءة الساعة 07:00). كان لدى الحيوانات إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء طوال فترة الدراسة. تم إجراء جميع الفحوصات والإجراءات الجراحية خلال المرحلة الضوئية. أجريت جلسات تسجيل سلوكي خلال مرحلة الضوء في وقت ثابت يوميا لتقليل التفاوت اليومي في النشاط العصبي وديناميكيات الكالسيوم النجمية. كما تم الحفاظ على حاوية التسجيل عند درجة حرارة محيطة تتراوح بين 20–25 درجة مئوية.
   1. في اختبار الروتارود، اجعل الفأر يعمل باستمرار على القضيب الدوار لمدة 5 دقائق عبر 3 تجارب متتالية، مع تسارع الروتارود من 4 إلى 40 دورة في الدقيقة خلال 5 دقائق.
   2. لاختبار قوة القبضة، اجعل الفأر يتعلم سحب قضيب الاختبار بأقدامه الأمامية، وإكمال ثلاث تجارب متتالية مع تذبذب النتائج أقل من 10٪.
2. حدد معلمات جمع البيانات لقياس الألياف الضوئية.
   1. استخدم نظام قياس الألياف الضوئي ثنائي أو ثلاثي الأطوال الموجية لتحفيز مؤشر الكالسيوم (مثل GCaMP6s). بالنسبة لأقراص GCaMP6، قم بضبط قناة الإشارة على 470 نانومتر وقناة التحكم على 405 نانومتر لتصحيح التشوهات الحركية والتوهج الذاتي.
      ملاحظة: من المهم جدا اختبار قوة الليزر المسجل مرة أخرى لضمان أن يكون الخرج عند طرف الألياف بين 20–40 ميكروواط لتجنب التبييض الضوئي والسمية الضوئية.
   2. اضبط معدل أخذ عينات البيانات إلى 60–100 هرتز، وهو ما يكفي لالتقاط العابرات النجمية للكالسيوم.
3. حدد معلمات جمع البيانات لعلم الفيزيولوجيا الكهربائية متعدد القنوات.
   1. تأكد من أن جميع مكونات نظام التسجيل (بما في ذلك جهاز اختبار قوة القبضة والقفص) مؤرضة بشكل صحيح لتقليل الضوضاء. استخدم مرجعا وسطيا مشتركا (CMR) أثناء التسجيل للقضاء على التشوهات العالمية.
      ملاحظة: من المهم جدا فحص عرض طياف الإشارة في نظام التسجيل للتأكد من عدم وجود تداخل في خطوط الكهرباء وتقليل الضوضاء الناتجة عن تشوهات الحركة. قد تشير التشوهات الحركية الكبيرة إلى فشل البراغي وتثبيت الأسلاك الأرضية أثناء عملية الزرع.
   2. تأكد من اختيار إشارات النطاق العريض وإشارة LFP في برنامج التسجيل، وراقب أي ضوضاء تحدث طوال جلسة التسجيل.
4. قم بتسجيل القاعدة الأساسية.
   1. تخدير مؤقت بالإيزوفلوران (خلال 60 ثانية)؛ وصل ال optrode بخط التسجيل عبر محول.
   2. ضع الفأر في بيئة تشبه قفص المنزل للتسجيل، واترك التكيف لمدة 10 دقائق بعد الاستيقاظ.
   3. عند التسجيل بالتزامن مع اختبار قوة القبضة، يطلب من الفأرة سحب شريط الاختبار مرة كل دقيقة لمدة 5 دقائق.
   4. تأكد من أن اختبارات السلوك مختومة بدقة في أنظمة الفوتومترية متعددة القنوات والألياف للسماح بمحاذاة البيانات (الشكل 1D).
5. إنشاء نموذج فوتوترومبوتي.
   1. أعط محلول صبغة الوردة البنغالية بنسبة 1.5٪ داخل الصفاق (i.p.) بجرعة 10–20 ملغ/كجم، وانتظر 5 دقائق حتى تنتشر الصبغة عبر الأوعية الدموية القشرية.
      تحذير: روز بنغال صبغة حساسة للضوء. حماية المادة من الضوء المحيط الساطع. ارتد قفازات وواقيات للعين عند التعامل معه.
   2. تخدير الفأر بالإيزوفلوران باتباع نفس معايير الحث والصيانة التي وصفت سابقا.
   3. عندما يكون الفأر في مستوى تخدير عميق ويحافظ عليه بقناع تخدير، قم بتوصيل المجس البصري للأبترود بمصدر الليزر.
   4. تحفز نقص التروية البؤري عن طريق إرسال شعاع ليزر بقطر 530 نانومتر بقوة 15 مللي واط عبر الأوبترود المزروع لمدة 5–8 دقائق.
      تحذير: ليزر 530 نانومتر بقوة 15 ميلاواط خطير. يجب على جميع الباحثين ارتداء حماية للعين بأمان بالليزر. لا تنظر مباشرة إلى طرف الألياف أثناء الجلطة الضوئية.
6. قم بتسجيل ما بعد السكتة الدماغية.
   1. ضع الفأرة على وسادة ساخنة للاستعادة. بمجرد أن يستيقظ الفأر تماما (عادة خلال 10 دقائق)، ابدأ أول تسجيل حاد بعد السكتة الدماغية.
   2. كرر التسجيل يوميا لمتابعة تقدم المرض عن كثب.
7. قم بإجراء التلاعب البصري.
   1. بالإضافة إلى تسجيل إشارات الكالسيوم وانبعاث شعاع الليزر للتحفيز الإقفاري، فإن الأوبترود قادر أيضا على تقديم التحفيز البصري البصري، كما هو موضح في النتائج الممثلة (الشكل 4).
   2. توصيل الأوبترود بمحفز ليزر بصري بطول موجة وطاقة ليزرية مناسبين (في هذه الحالة، 488 نانومتر، 10 مللي واط، 5 دقائق للبصري-vTrap)، ثم شغل المنشط لإجراء التلاعب البصري.

5. خط أنابيب تحليل البيانات متعدد الوسائط

ملاحظة: يوضح هذا القسم سير العمل التحليلي لمعالجة بيانات الفيزيولوجيا الكهربائية متعددة القنوات (فرز الأشواك)، وإشارات الكالسيوم النجمية (حساب ΔF/F)، والمحاذاة متعددة الوسائط بين تياري البيانات. البرمجيات المطلوبة: برنامج فرز الأشواك غير المتصلة بالإنترنت (Plexon Sorter Offline Program)، NeuroExplorer (برنامج تحليل البيانات العصبية)، وبرنامج تحليل OFRs (القياس الضوئي للألياف).

1. فرز المسامير العصبية (نظام بليكسون):
   1. استيراد ملفات .pl2 الخام إلى برنامج فرز السنبلاء غير المتصل. تطبيق مرشح رقمي عالي النطاق (<300 هرتز) لعزل نشاط التردد العالي.
   2. حدد عتبة جهد (عادة -5 انحرافات معيارية للضوضاء) لاكتشاف الارتفاعات المحتملة.
   3. بعد الفحص اليدوي وإلغاء الموجات الضوضائية، استخدم وظيفة المسح في برنامج فرز الأشواك غير المتصلة لإجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتجميع أشكال الموجات ومسح مجموعات الخلايا العصبية المختلفة²⁴.
   4. افحص مخططات التكرار الفاصل بين الأشواك (ISI). تأكد من أن كل "وحدة منفردة" لديها معدل انتهاك في ISI بنسبة <1٪ (يعكس فترة المقاومة). معدل انتهاك ISI يظهر في الزاوية العلوية اليسرى لكل وحدة في برنامج فرز المسامير غير المتصل.
   5. تصدير الطوابع الزمنية المرتبة إلى برنامج تحليل البيانات العصبية. استخدم مخطط التكرار المعدل ودالة المخطط المحيطي بالأحداث مقابل الزمن في برنامج تحليل البيانات العصبية لإنشاء مخططات المعدل ومخطط الزمن حول التحفيز (PSTH).
   6. أخرج متوسط طول الموجة ومتوسط معدل الإطلاق لكل وحدة من قسم الإحصاء في برنامج تحليل البيانات العصبية لمزيد من التحليل.
2. معالجة إشارات الكالسيوم النجمية (برنامج تحليل الفوتومترية للألياف)
   1. افتح بيانات الفلورة الخام (قناة 470 نانومتر للإشارة وقناة 410 نانومتر للتحكم في الحركة) في برنامج التحليل.
   2. في قسم المعالجة المسبقة في نظام الفوتومترية الليافية، قم بإجراء 410 نانومتر كتحكم لتصحيح الحركة، وضبط معامل التنعيم إلى 8، واختيار PLS Fit كتصحيح أساسي.
   3. احسب تغير التألق (ΔF/F) باستخدام الصيغة²⁵:
      
   4. إجراء تحليل إشارة الكالسيوم في الخلايا النجمية بناء على طوابع زمنية للأحداث، واستخراج بيانات حول الحدث لرؤية (مثل خرائط الحرارة والمسارات المتوسطة)، وحساب المساحة تحت المنحنى (AUC).
3. الارتباط المتزامن بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية
   1. محاذاة الارتفاعات العصبية وإشارات الكالسيوم في الخلايا النجمية باستخدام ختم الحدث السلوكي المشترك كزمن صفر.
   2. بعد استخراج بيانات الحدث المحيط، قم بمحاذاة تدفقي البيانات مع هذا الصفر الزمني المشترك وتصور الارتباط بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية (الشكل 3).

النتائج

الجدول الزمني التجريبي

يلخص الشكل 1 الجدول الزمني التجريبي والمعالم الجراحية الرئيسية. تعد فترة ثلاثة أسابيع بين حقن الفيروس وزرع الأوبترود أمرا بالغ الأهمية لتحقيق تعبير كاف عن GCaMP6، ويجب تأكيد إشارات الكالسيوم النجمية القوية من خلال فحص آثار الفوتومترية الليفية خلال فترة التسجيل الأساسية قبل تحفيز السكتة الدماغية.

التحقق متعدد الأبعاد للنمذجة الضوئية الثروبوتية

...

المناقشة

يقدم البروتوكول المتكامل الموضح هنا تقدما كبيرا في دراسة تفاعلات الخلايا النجمية والخلايا العصبية أثناء تقدم السكتة الدماغية الإقفاري. من خلال الجمع بين التحفيز الضوئي مع المراقبة البصرية الفيزيولوجية الكهربائية في الوقت الحقيقي والتلاعب البصري، فإن هذه المنهجية تجسر الفجوة بين بداية السكتة الدماغية وملاحظة إعادة تنظيم الخلايا العصبية والخلايا النجمية على مستوى الدوائر الكهربائية. أظهرت أعمال حديثة من بويز وآخرين إمكانية دمج الفوتومترية الليفية وتسجيل الفيزيولوجيا الكهربائية أثناء السكتة...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0.005 mm ´ 0.025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Customized with 16 tungsten electrode surrounding 1 optical fiber
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specific calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specific optogenetic viral vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Photosensitive dye for thrombus induction/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesia machine for controllable inhalation anesthesia for mice