يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير داخل القيد الحيوي لمرض الفطرية المضافة للسلال المخفف في رئة الفأر خلال العدوى الوعائية المبكرة

96 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71019

⸱

يونيو 30, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 2Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 6Cancer Dormancy Institute, Albert Einstein College of Medicine, 7Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا للتصوير داخل الحيوية لمرض متفطرة السل المعتمد من BSL-2 المخفف. إجهاد في رئة الفأر باستخدام نافذة رئوية دائمة. يتيح هذا النهج التحليل الطولي وحل الخلية الأحادية للتفاعلات المبكرة بين المضيف والممرض، بما في ذلك تحديد موقع البكتيريا، وديناميكيات الأوعية الدموية، وامتصاص البلعم داخل نفس البيئة الدقيقة للرئة.

الملخص

المجهر داخل الحيوية يتيح التصور المباشر للعمليات الخلوية الديناميكية داخل الأنسجة السليمة. ومع ذلك، فإن تطبيقه على متفطرات السل (Mtb) كان محدودا بسبب متطلبات احتواء مستوى السلامة البيولوجية 3 (BSL-3) والتحديات التقنية في تثبيت الرئة للتصوير عالي الدقة. هنا، نقدم بروتوكولا يجمع بين نافذة الصدر للتصوير عالي الدقة لرئة الفأر (WHRIL) مع mc27902، وهو سلالة ثلاثية مضافة للتغذية الوراثية معتمدة للاستخدام في ظروف BSL-2. كما نصف توليد mc28471، وهو مشتق يعبر عن الطماطم من mc27902، وتحضيره للعدوى الوريدية، وتطبيقه للتصوير داخل الحيوية في الفئران المراسلة. يتيح هذا النظام التصور الفوري لديناميكيات العدوى المبكرة، بما في ذلك الدخول السريع للبكتيريا إلى الأوعية الدموية الرئوية، والتجمع، والانتشار في نسيج الرئة، وامتصاص البلاعم في نفس البيئة الدقيقة للرئة خلال أول 3 أيام بعد العدوى. من خلال تمكين التصوير الطولي للعصيات وتفاعلات المضيف والممرض بدقة خلية واحدة، يتغلب هذا النهج على القيود الرئيسية المرتبطة بالتصوير التقليدي والنماذج عالية الاحتواء. يوفر هذا البروتوكول منصة عملية متوافقة مع BSL-2 للتصوير الحيوي داخل الحياة لبكتيريا الفطرية المخففة في الرئة، ويؤسس أساسا للدراسات الميكانيكية لفسيولوجيا البكتيريا، والتعرف على العائل، والتطهير المناعي.

المقدمة

لقد حول المجهر داخل الحيوية عالي الدقة دراسة السلوك الخلوي الديناميكي داخل الأنسجة السليمة من خلال تمكين التصور المباشر لهجرة الخلايا، والتفاعلات الوعائية، والمراقبة المناعية بدقة خلية واحدة 1,2,3,4. بينما تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع في أبحاث السرطان 3,5، فإن تطبيقها على العدوى الرئوية كان محدودا بسبب حركة الجهاز التنفسي، وهشاشة الأنسجة، وقيود السلامة البيولوجية. لقد عالجت التطورات الحديثة في منصات التصوير الصدري، بما في ذلك النوافذ البصرية المثبتة بالفراغ والمزروعة بشكل دائم، العديد من هذه التحديات التقنية من خلال توفير تصوير مستقر وخالي من الحركة للبيئة الدقيقة الرئوية على مدى فترات طويلة 6,7,8,9,10. النوافذ القابلة للزرع بشكل دائم، على وجه الخصوص، هي أدوات قوية لأنها تتيح التصور المتكرر لتدفق الأوعية الدموية، وديناميكيات الخلايا المناعية، وسلوك الخلية المفردة على مدى ساعات إلى أسابيع، وكانت حاسمة في تحديد آليات انتشار السرطان، ونفاذية الأوعية الدموية، والمراقبة المناعية11,12.

على الرغم من هذه التطورات، لم يتم تطبيق التصوير داخل الحيوية من قبل على عدوى الفطريات السلية (Mtb) في رئة الثدييات في الجسم الحي بدقة خلية واحدة. أقرب السوابق تأتي من التصوير الحيوي للعدوى الفطرية في بيئات أخرى. كشفت التصوير اللحظي لعدوى Mycobacterium marinum في أجنة سمك الزرد13 عن تفاعلات مبكرة بين البلاعم وبدء الورم الحبيبي، بينما كشفت التصوير بفوتونين لأحبيات BCG في كبد الفئران14,15 عن ديناميكيات البلاعم والخلايا التائية أثناء تطور الورم الحبيبي، وأظهرت عرضا محدودا للمستضد ووظيفة مؤثر الخلايا التائية داخل الآفات الحبيبية. وقد أسست هذه الدراسات رؤى أساسية حول تفاعلات المضيف بين المضيف والممرض لكنها لم تصل إلى الرئة الثديية السليمة 8,16.

كما تم تطبيق أساليب التصوير داخل الحيوية على الرئة في سياقات معدية وبيولوجية أخرى، بما في ذلك التصوير الرئوي العام8، حيث كشفت الدراسات أن البلعم الحويخية الدورية يمكن أن تخفي البكتيريا عن الجهاز المناعي17 وتصف الاستجابة الفورية للنخاع لعدوى SARS-CoV-2 في الرئة البشرية16. تم تطبيق التصوير داخل الحيوية بالمثل على الرئتين المصابتين بالإنفلونزا، مما أتاح التصور المباشر لسلوك الخلايا المناعية الديناميكي داخل نسيج الرئة المصاب18,19.

مكنت أساليب التصوير البصري للجسم بالكامل باستخدام الإثارة الدقيقة20 بالألياف الضوئية وتقنية الفلورة الإنزيمية21,22 من الكشف الحساس لMtB في رئتي الفئران، لكنها لا تستطيع اكتشاف مجموعات فردية أو صغيرة من العصيات، أو تتبع ديناميكيات تجمع البكتيريا، أو تصور التفاعلات المباشرة بين البكتيريا الفطرية وخلايا المضيف داخل نسيج الرئة السليم. تم تنفيذ أساليب تصوير داخل الحيوية عالية الاحتواء للرئتين المصابتين في بيئات BSL-3، بما في ذلك منصات التصويرمتعددة الفوتونات المتخصصة في SARS-CoV-223 وMtb. تظهر هذه الدراسات إمكانية تصوير الرئتين المصابتين تحت الاحتواء، لكن مثل هذه الترتيبات لا تزال تتطلب تقنية وليست متاحة على نطاق واسع. يتطلب العمل مع المونترينغ الشديد احتواء BSL-3، مما يشكل تحديات هندسية وسلامة حيوية كبيرة للتصوير داخل القيدالحيوي 23,24. نتيجة لذلك، تعتمد معظم الدراسات حول عدوى البكتيريا المبكرة على اختبارات نهاية ثابتة لا يمكنها التقاط الديناميكيات المكانية والزمانية لسلوك البكتيريا داخل الرئة.

يوفر تطوير سلالات MtB ثلاثية الأكستروفية المعرفة وراثيا ومعتمدة من BSL-2 فرصة فريدة لتجاوز هذه القيود. سلالة mc27902، وهي مشتقة من Mtb auxotroph من H37Rv، هي مخففة بالكامل، وتفشل في التكاثر في الفئران المصابة بضعف المناعة، وتحافظ على التلوين السريع للحمض الكلاسيكي، وتظهر قابلية طبيعية للفاج، ويمكن التعامل معها بأمان خارج مرافق BSL-325. تجعل هذه الخصائص MC27902 بديلا مثاليا لتأسيس طرق التصوير داخل القيد الحيوي واستكشاف التفاعلات المبكرة بين المضيف والممرض تحت احتواء منخفض للسلامة البيولوجية.

هنا، نطبق نافذة التصوير عالي الدقة للرئة (WHRIL) مع mc28471، وهو مشتق فلوري يعبر عن الطماطم من سلالة Mtb ثلاثية التغذية mc27902، لرؤية العدوى المبكرة للرئة الجبلية في رئة الفأر السليمة. أجريت تجارب على فئران Rag2-/- 26 المتضادة مناعة مع فئران ماكبلو27، حيث يحرك محفز Csf1r التعبير عن البروتين الفلوري السماوي المحسز (ECFP) في الخلايا الأحادية والدبقية الصغيرة ومجموعات الخلايا التغصنية والبلاعميات. يتيح الجين الناقل ماكبلو رؤية واضحة لمجموعات الخلايا البلعمية أحادية النواة خلال العدوى المبكرة من ال MTB. اخترنا استخدام فئران تفتقر إلى Rag2 لتركيز النظام على أقدم التفاعلات الفطرية بين المضيف والممرض ولتجنب تعقيد الاستجابات المناعية التكيفية خلال نافذة التصوير القصيرة التي تم فحصها هنا. ومن المهم أن هذه التقنية ليست مقتصرة على الفئران التي تفتقر إلى Rag2 ويمكن تنفيذها أيضا في الحيوانات المناعية الكافية.

من خلال دمج نافذة رئوية دائمة مع سلالة MtB مخففة متوافقة مع BSL-2، تتيح هذه المنصة التصوير التسلسلي داخل الحيوية لتفاعلات الخلايا العصيرية والمضيفة في نفس البيئة الدقيقة للرئة بدقة خلية واحدة على مدى عدة أيام. على الرغم من أن المنصة نفسها ليست مقيدة بالضرورة بنقاط زمنية مبكرة ومبدأ، ومن حيث المبدأ، تطبيقها على المراحل اللاحقة حسب النموذج التجريبي وتصميم الدراسة. نظرا لأن تطبيق هذه المنصة التصويرية بنجاح يعتمد على استخدام التحضير البكتيريا الفلورية المحددة الموضح هنا، فقد أدرجنا الخطوات الأساسية اللازمة لتوليد وتحضير هذا الكواشف كجزء من البروتوكول الكامل. توفر هذه المنصة تصويرا مباشرا وفي الوقت الحقيقي لسلوك الحشرات الجزيرية في الجسم الحي، وتؤسس أساسا للدراسات الميكانيكية المستقبلية حول فسيولوجيا البكتيريا، والتعرف على المضيف، والتنظيف المناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإرشادات السلامة الحيوية ورعاية الحيوانات المؤسسية، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في كلية ألبرت أينشتاين للطب (IACUC). السلالة mc28471 هي محول pYUB1169 من mc27902، وهو سلالة ثلاثية التغذية الثلاثية معتمدة للاستخدام في BSL-2. تم تنفيذ جميع الأعمال المتعلقة بالبكتيريا الحية باستخدام الاحتياطات القياسية للتعامل مع الميكروبكتيريا.

1. بناء سلالة Mtb المعتمدة من BSL-2 m.d.

  1. توليد جهاز BSL-2-safe MC28471 الذي يعبر عن tdTomato-Safe بواسطة تحويل البلازميدات
    1. تحويل السلالة الثلاثية المعتمدة من BSL-2 mc27902 إلى البلازميد الفطري البتكيري pYUB1169 الذي يحتوي على جين tdTomato المعبر عنه من محفز G13، لتوليد المشتقة الفلورية mc28471.
    2. تلقيح 100 ميكرولتر من mc27902 (كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD600 نانومتر) بمقدار 0.7-1.0) في 10 مل من ميدلبروك 7H9 المعقم مع إضافة إثراء OADC (10٪ (v/v))، الجلسرول (0.2٪ (v/v))، D-بانتوثينات (24 ملغ/لتر)، L-ليوسين (50 ملغ/لتر)، L-أرجينين (200 ملغ/لتر)، بروبيونات الصوديوم (0.1 ملليمو)، وتايلوكسابول (0.05٪ (v/v)) في زجاجة حبر بحجم 30 مل.
    3. حضن الزرعة، مع هز ببطء (100 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى OD600 نانومتر بين 0.7-1.0.
    4. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 15 مل وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 3000 × جرام في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من الجلسرول المعقم بنسبة 10٪ يحتوي على 0.05٪ (v/v) تايلوكسابول (غسل #1). كرر الطرد المركزي وغسل مرتين. أعد تعليق حبيبة الخلية في 0.175 مل من الجلسرول 10٪ يحتوي على 0.05٪ (v/v) تايلوكسابول وأضف 2 ميكرولتر من حمض نووي pYUB1169 (100-200 نانوغرام من الحمض النووي).
    5. انقل MC27902 وpYUB1169 إلى كوفيت كهربائي بقطر 0.2 سم. انتظر 10 دقائق. انقر على الكوفيت من 2 إلى 3x لإزالة فقاعات الهواء والضغط الكهربائي عند 2500 مللي فولت، 1000 Ω، 25 ميكروفهرنايت، ثابت زمني 20 مللي ثانية، في درجة حرارة الغرفة.
    6. أضف 1 مل من ميدلبروك 7H9 المعقم مع إثراء OADC (10٪ (v/v))، الجلسرول (0.2٪ (v/v))، D-بانتوثينات (24 ملغ/لتر)، L-ليوسين (50 ملغ/لتر)، L-أرجينين (200 ملغ/لتر)، بروبيونات الصوديوم (0.1 مليغرام)، وتايلوكسابول (0.05٪ (v/v)) إلى الكوفيت وانقل محتويات الكوفيت إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 15 مل. حضن الأنبوب أثناء هزه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    7. طبق بحجم 0.1 مل من خليط التحويل على صفيحة ميدلبروك 7H10 أجار مع إضافة تخصيب OADC (10٪ (v/v))، الجلسرول (0.2٪ (v/v))، D-بانتوثينات (24 mg/L)، L-ليوسين (50 mg/L)، L-أرجينين (200 mg/L)، بروبيونات الصوديوم (0.1 mM)، وكاناميسين (20 mg/L). قم بطرد المركزي بخليط التحول المتبقي، وتخلص من 0.9 مل من المادة الفائقة، وإعادة تعليق الحبيبات الخلوية في المادة الفائقة المتبقية. ضع الخلايا المعلقة على طبق أجار ثاني من نوع ميدلبروك 7H10 يحتوي على نفس المكملات والمضادات الحيوية. حضن الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 3–4 أسابيع. تشير المستعمرات الوردية إلى نجاح المحولات.
    8. اختر مستعمرة وردية معزولة ونموها عند حرارة 37 درجة مئوية، مع هز بطيء، في 5 مل من ميدلبروك 7H9 المعقم مع مكمل تخصيب OADC (10٪ (v/v))، الجلسرول (0.2٪ (v/v))، D-بانتوثينات (24 ملغ/لتر)، L-لوسين (50 ملغ/لتر)، L-أرجينين (200 ملغ/لتر)، بروبيونات الصوديوم (0.1 مليمول)، تايلوكسابول (0.05٪ (v/v)) و20 ملغ/لتر كاناميسين في زجاجة حبر سعة 30 مل.
  2. تحضير MC28471 للعدوى الوريدية
    1. ازرع 10 مل من mc28471 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، مع هز بطيء، في Middlebrook 7H9 المعقم مع إثراء OADC (10٪ (v/v))، الجلسرول (0.2٪ (v/v))، D-بانتوثينات (24 ملغ/لتر)، L-ليوسين (50 ملغ/لتر)، L-أرجينين (200 ملغ/لتر)، بروبيونات الصوديوم (0.1 ملغ)، تايلوكسابول (0.05٪ (v/v))، و20 ملغ/لتر كاناميسين في زجاجة حبر 30 مل حتى مرحلة منتصف اللوغاريوم (OD600 نانومتر يجب أن يكون بين 0.7 و1.0).
    2. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند حرارة 3000 x جرام في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.05٪ (v/v) تايلوكسابول (PBS-T، الغسيل #1). كرر الطرد المركزي وغسل مرتين. أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من PBS-T وقم بسوتيكيت الخلايا بقوة 100 واط، 2×1000 جول.
    3. قس الكثافة الضوئية للثقافة وتخفيفها ب PBS-T لتركيز نهائي 5 ×10 6 وحدات CFU لكل حقنة، باستخدام التحويل التقريبي الذي يعادل OD600 نانومتر من 1 يعادل 1 × 108 CFU/mL. نظرا لأن هذه العلاقة قد تختلف حسب ظروف الإجهاد والنمو، يجب معايرة OD600 نانومتر تجريبيا مقابل قيم CFU المطلية لضمان الدقة وقابلية التكرار.

2. زرع نافذة الرئة الدائمة في الفئران للتصوير داخل الجسم

  1. جهز فأرة Rag2KO MacBlue للتصوير داخل الحيوية. في هذه الدراسة، تم استخدام فأر ذكر يبلغ من العمر 10 أسابيع ووزنه 30 جرام. ومع ذلك، فإن الفئران من كلا الجنسين، والتي تتراوح أعمارها بين 8-12 أسبوعا، وضمن النطاق المتوقع للوزن لهذا العمر، مناسبة لهذا العملية. تعبر هذه السلالة عن بروتين فلوري سيان معزز (ECFP) في البلعم على خلفية Rag2-knockout، وقد تم توليدها عن طريق تهجين فئران B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 (Rag2، نموذج RAGN12) مع فئران Tg (Csf1r-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J (رقم المخزون 026051).
  2. زرع نافذة التصوير عالي الدقة للرئة (WHRIL) قبل 24 ساعة من العدوى البكتيرية لتوفير وصول بصري مستقر إلى الرئة والسماح بالتعافي قبل التصوير.
  3. تحفز التخدير باستخدام 5٪ إيزوفلوران في غرفة الحث. تأكد من عمق التخدير المناسب قبل بدء أي إجراء وراقب الحيوان طوال فترة الجراحة والتصوير لمنع الألم أو الضيق أو ضعف التنفس.
  4. أعط مسكنات قبل العملية: حقن 10 ميكرولتر (0.1 ملغ/كجم) من البوبرينورفين مخفف في 90 ميكرولتر من متلازمة PBS المعقمة تحت الجلد.
  5. ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
  6. اربط خياطة حريرية 2-0 حول قاعدة قسطرة 22G، مع ترك ذيول بطول ~2 بوصة لتثبيت القسطرة.
  7. قم بأنبوب أنبوب الفأر باستخدام القسطرة المربوطة بالخياطة. تصور فتحة القصبة الهوائية عن طريق الإضاءة الانتقالية وتأكيد وضعها باستخدام مصباح انتفاخ (ارتفاع الصدر الجانبي).
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي التنبيب غير السليم إلى إصابة في مجرى الهواء أو تهوية غير كافية. تابع فقط بعد تأكيد الوضع الصحيح من خلال توسيع الصدر الجانبي.
  8. ثبت قسطرة التنبيب بربط خياطة الحرير 2-0 حول الخطم بعد نجاح التنبب. وصل القسطرة بجهاز التنفس الصناعي.
  9. ضع الفأر في الذراع الجانبي الأيمن على منصة جراحية ساخنة لكشف الصدر الأيسر، ثم ثبت الأطراف الأمامية والخلفية والخلف بشريط لاصق للحفاظ على الوضع المستقر طوال العملية.
  10. قلل من الأيزوفلوران إلى 3٪ لبقية الجراحة. قم بإزالة الشعر من أعلى الصدر الأيسر باستخدام كريم إزالة الشعر.
  11. جهز المجال الجراحي بمحلول مطهر. ارفع الجلد وقم بعمل شق دائري بقطر 5-10 مم باستخدام ثقب خزعة (33-35-SH) على بعد حوالي 7 مم إلى يسار عظمة القص و7 مم فوق الحافة تحت الضلعية، مركزا فوق المساحةبين الأضلاع6 إلى 7.
  12. افحص المجال المكشوف بحثا عن الأوعية السطحية. إذا كان من الضروري تقسيم الوعاء المرئي، قم بكي كلا الطرفين للحفاظ على التعويش. قم بإزالة الأنسجة الرخوة العلوية لكشف الأضلاع بوضوح قبل دخول التجويف الصدري.
  13. أمسك وارفع الضلع السادس أو السابع باستخدام الملقط واثقب العضلة بين الأضلاع بينهما بلطف باستخدام مقص دقيق غير دقيق (جانب مستدير يواجه الرئة) لدخول التجويف الصدري.
    ملاحظة: ادخل التجويف الصدري بلطف وتحت الرؤية المباشرة لتجنب تمزيق الرئة أو الأوعية الوربية أو الأنسجة المحيطة.
  14. ضع دفعات قصيرة ولطيفة من الهواء المضغوط عند الفتحة بين الأضلاع لتفريغ سطح الرئة المجاور بشكل مؤقت وفصله عن جدار الصدر قبل إنشاء فتحة النافذة.
  15. ضع ثقب الخزعة على أداة القطع ووجه أداة القطع عبر الفتحة بين الأضلاع، مع الحفاظ على توازيها مع جدار الصدر. اضرب عيبا دائريا بقطر 5 مم في القفص الصدري.
  16. ضع خياطة حريرية بحجم 5-0 على بعد ~1 مم من حافة العيب الدائري، تمر بين الأضلاع المجاورة لتحيط بالفتحة.
  17. ثبت إطار النافذة بحيث تناسب حواف عيب جدار الصدر أخدود الإطار، ثم شد وتثبيت خيط الحقيبة لتثبيت الإطار في مكانه.
  18. حمل لاصق جل السيانو أكريلات في حقنة بسعة 1 مل. ارفع الإطار بلطف لفصله عن الرئة، ثم ضع طبقة رقيقة من لاصق السيانو أكريلات على السطح السفلي للإطار.
  19. جفف سطح الرئة باستخدام تيار مستمر ولطيف من الهواء المضغوط حتى يبدو السطح غير لامع.
    ملاحظة: استخدم فقط تيار هواء لطيف وتجنب الجفاف المطول، لأن القوة المفرطة أو الإفراط في التجفيف قد يؤذي سطح الرئة ويضعف التصاق النوافذ.
  20. باستخدام ضغط الزفير الإيجابي (PEEP)، قم بنفخ الرئة ثم ثبت النافذة على الإطار. حرر جهاز PEEP وابق الضغط على إطار النافذة لمدة 20-30 ثانية.
    ملاحظة: الضغط الزائد أثناء الانتفاخ أو وضع الإطار قد يتلف الرئة أو يضعف الختم. ضع فقط الحد الأدنى من الضغط اللازم لتحقيق تثبيت لطيف.
  21. ضع خيطة حريرية ثانية بحجم 5-0 على بعد <1 مم من حافة شق الجلد. قم بإحكام الجلد تحت الإطار، وتأكد من أن أي جلد زائد محتجز تحت إطار النافذة أو قصته، ثم شد خيط الحقيبة بإحكام واربطه بإحكام.
  22. باستخدام بيك أب مفرغ، ضع طبقة رقيقة جدا من اللاصق على الجانب السفلي من غطاء الغطاء بحجم 5 مم، مع كشط الفائض من حافة زجاج الغطاء المستطيل. مرة أخرى، جفف سطح الرئة بتدفق مستمر ولطيف من الهواء المضغوط.
  23. ضع الغطاء الدائري داخل تجويف إطار النافذة بزاوية ضحلة (~15°) فوق سطح الرئة. زد ضغط مجرى الهواء لفترة وجيزة لنفخ الرئة، ثم قم بتدوير غطاء الغطاء إلى وضع مواز بحيث يعارض سطح الرئة الجانب السفلي للزجاج. حافظ على ضغط خفيف لمدة تقارب 25 ثانية أثناء تثبيت اللاصق، ثم فصل جهاز التفريغ عن غطاء الغطاء.
    ملاحظة: تجنب حبس الفقاعات أو تطبيق اللاصق الزائد أثناء وضع الغطاء الانزلاق، لأن ذلك قد يقلل من جودة الصورة، أو يسبب الختم أو يؤذي سطح الرئة.
  24. ضع كمية صغيرة من السيانو أكريلات السائل عند الواجهة بين غطاء الغطاء والإطار المعدني لتعزيز الختم المحكم.
  25. اربط إبرة معقمة بحقنة أنسولين سعة 1 مل. أدخل الإبرة أسفل النتوء الزيفوئيد مباشرة وتقدم نحو الكتف الأيسر عبر الحجاب الحاجز إلى التجويف الصدري. استنشق الهواء بلطف لإزالة الهواء داخل الصدر المتبقي.
    ملاحظة: ادفع الإبرة بحذر لتجنب ثقب الرئة أو القلب أو الأوعية الرئيسية. استنشق الهواء بلطف وفقط حتى يتم إزالة الهواء المتبقي.
  26. أوقف الإيزوفلوران واستمر في التهوية مع 100٪ أكسجين حتى يستأنف معدل التنفس اليقظ القريب من الطبيعي. لا تترك الحيوان دون مراقبة أثناء التعافي. إذا لم يستأنف التنفس التلقائي الطبيعي بسرعة، قدم الرعاية الداعمة المناسبة أو قم بالقتل الرحيم وفقا لإرشادات المؤسسات.
  27. أزل الغرز المثبت، وأخرج أنبوب الفأر، وضعه في قفص نظيف ودافئ للتعافي. راقب الحيوان حتى يصبح قادرا على الحركة بالكامل؛ يجب القتل الرحيم للفئران التي لا تستعيد تنفسه الطبيعي وفقا لإرشادات المؤسسات.
  28. إعطاء مسكنات بعد العملية: حقن 10 ميكرولتر (0.1 ملغ/كغ) من البوبرينورفين مخفف في 90 ميكرولتر من PBS المعقم تحت الجلد.

3. التصوير داخل الحيوية

  1. اترك الفئران تتعافى بعد زرع النافذة قبل التصوير. إجراء التصوير بعد يوم إلى خمسة أيام من الجراحة.
  2. قم بتحفيز التخدير باستخدام 3٪ من إيزوفلوران، ثم حافظ على 1.5٪ طوال مدة التصوير.
  3. أدخل محول إطار النافذة المخصص بين الجلد والحافة الخارجية لإطار نافذة الرئة وثبت لوحة مرحلة مجهر قياسية باستخدام شريط لاصق.
  4. ضع الفأرة مع محول إطار النافذة المخصص للمرحلة المثبت على مرحلة الترجمة المجهرية. حافظ على درجة حرارة الجسم عند ~37 درجة مئوية باستخدام غرفة تسخين بالهواء القسري مع حلقة تغذية راجعة لحساس الحرارة.
  5. مع وضع الفأر على لوحة المسرح، اسحب الجلد حول العين بلطف من جانب الحقن لكشف الكابينثوس الإنسي وحقن FITC-dextran (150 كيلو دالتون؛ 20 ملغ/مل، 100 ميكرولتر) بزاوية خلفية الحجاجية لتحديد الأوعية الدموية.
  6. احصل على صور سريعة أو صور z-stack أو صور زمنية لوعاء رئتي قبل حقن البكتيريا باستخدام المعايير التالية.
    1. لإعدادات المجهر الكونفوكلي: عمق البت: 12 بت، معدل الإطار: 2 إطار في الثانية، حجم الصورة: 512 × 512 بكسل، حجم البكسل: 0.497 ميكرومتر/بكسل، 0.994 ميكرومتر/بكسل، حجم خطوة Z: 2 ميكرومتر، عمق الزاوية الكلي: 50–70 ميكرومتر، متوسط الإطار: 3، سرعة المسح: 2 ميكروثانية/بكسل (977 خطا/ثانية)، أطوال موجية الإثارة بالليزر: 405 نانومتر، 488 نانومتر، 559 نانومتر، قوة الليزر عند العينة: 230 ميكرووات (405 نانومتر)، 75 ميكروواط (488 نانومتر)، 40 ميكروواط (559 نانومتر)، فلاتر الكشف: 430-470 نانومتر (أزرق)، 505-540 نانومتر (أخضر)، 575-675 نانومتر (أحمر)، كسب الكاشف: 800 فولت للأزرق، 650 فولت للأخضر، 700 فولت للأحمر، قطر الثقب الدبوس: 60 ميكرومتر أو وحدة هوائية واحدة ل 559 نانومتر
    2. بالنسبة للمجهر متعدد الفوتون، استخدم نفس معايير التصوير المستخدمة في المجهر الكونفوكي، باستثناء أن ليزر الإثارة بسرعة 920 نانومتر تم استخدامه بقوة ليزر 25 ميلاواط عند العينة.
  7. حقن مداري رجعي 5 ×10 6 وحدات CFU tdمعبرة عن الطماطمmc 28471.
    ملاحظة: قم بإجراء حقن الرجع الحجاجي فقط مع التدريب المناسب وضبط النفس، لأن التقنية غير الصحيحة قد تسبب إصابة في العين، أو نزيفا، أو فشل في توصيل اللقاح.
  8. احصل على صور لحظة، وصور z-stack، وصور زمنية لمرض السل والخلايا والأوعية الدموية الموسومة بالفلورية باستخدام معلمات التصوير في 3.6.1 و3.6.2. اضبط كسب جميع الكواشف لتعظيم الإشارة مع تجنب تشبع الكاشف.
  9. بعد التصوير، أوقف الإيزوفلوران وأخرج الفأرة من المجهر. حافظ على دفء الفأرة وراقبها حتى التعافي الكامل.
  10. تكرار التصوير في النقاط الزمنية التالية بعد حقن MC28471: 0-60 دقيقة، 6 ساعات، و3 أيام. في كل جلسة تصوير، أعد حقن FITC-dextran (100 ميكرولتر، باتجاه الخلف الحجاري) لرؤية الأوعية الدموية، ثم التقاط صور كما هو موضح في الخطوات 3.8-3.9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد التسامية الكهربائية واختيار الكاناميسين، أظهرت مستعمرات معزولة من mc28471 فلورة حمراء زاهية، مما يؤكد تعبيرا مستقرا ل tdTomato الطبيعي. تم توسيع بكتيريا MC28471، وتحضيرها كتعليق خلية واحدة، وأعطيت عن طريق الوريد للفئران التي تحمل WHRIL المزروع جراحيا. تم إجراء تصوير داخل الحيوية لرؤية ديناميكيات عدوى الدراجات الجبلية المبكرة في البيئة الدقيقة للرئة. في هذه الدراسة، تم التقاط صور أساسية للأوعية الدموية الرئوية قبل العدوى (الشكل 1A)، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعالج هذه المنصة فجوة حقيقية في أبحاث السل من خلال تمكين التصور المباشر للعصيات وتفاعلات الخلايا المضيفة داخل الرئة الثديية السليمة تحت ظروف BSL-2. مكنت استراتيجيات التصوير الحية السابقة، بما في ذلك الكشف البصري للجسم بالكامل باستخدام الإثارة المجهريةبالألياف البصرية 20، وتصوير الفلورة بإنزيمالمبلغين 21، وMtb22 المعبرة عن البروتين الفلوري القريب تحت الحمراء، من المراقبة الطولية الحساسة للعبء البكتيريا واستجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المنح التالية: AI26170؛ مؤسسة عائلة إيفلين-ليبر ومركز جروس ليبر للبيوفوتونيات. نشكر الدعم من منشأة التصوير التحليلي، المدعومة بمنحة مركز NCI للسرطان P30 CA013330.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 ml conical tubeCorning430790
2-0 silk tie Ethicon, IncLA55G
5 mm coverslipElectron Microscopy Sciences72296-05
5 mm disposable biopsy punchIntegra33-35-SH
5-0 silk purse-string suture Ethicon, Inc640G
Blunt micro-dissecting scissorsRobozRS-5980
BuprenorphineHospira0409-2012-32حقنة من 10 ميكرولترات من البوبرينورفين (0.3 مجم / مل محلول أساسي) المخفف في 90 ميكرولتر من PBS معقم (الجرعة النهائية = 0.1 مجم / كجم) 
Compressed air canisterFalconDPSJB-12
Cyanoacrylate adhesiveLoctite234790
D-calcium pantothenateAcros243305000
ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety standBTX Harvard Apparatus45-0051
Electroporation cuvetteFisher ScientificFB102
FITC-DextranSigma-AldrichFD150S-1G150 كيلو دالتون
GlycerolFisher ChemicalsG33-1
Graefe forcepsRobozRS-5135لإمساك ورفع الضلع أثناء إجراء زراعة نافذة الرئة
Isoflurane Pivetal78949580
Isoflurane vaporizerSurgiVetVCT302
KanamycinGoldbio.comK-120-25
L-arginine monohydrochlorideSigma-AldrichA5131-100G
L-leucineSigma-AldrichL8000
MacBlue miceJackson LabsStrain #: 026051
Middlebrook 7H10 AgarDifco262710
Middlebrook 7H9 brothDifco271310
Middlebrook OADC EnrichmentBecton Dickinson 212351
Murine ventilatorKent ScientificPS-02PhysioSuite
NairChurch & Dwight Co., Inc.40002957
PBSCorning21-031-CV
PETG media inkwell bottleThermo Scientific342020
PhysioSuiteKent ScientificPS-5623لمراقبة حجم الهواء الراجع للفأر عن طريق التنبيب أثناء الجراحة
Plasmid pYUB1169Plasmid custom made
Rag2 KO miceJackson LabsStrain #: 008449
Small animal lung inflation bulbHarvard Apparatus72-9083
Sodium propionateThermo ScientificA17440.36
SonicatorFisher ScientificFB705
Sorval Centrifuge X pro seriesThermo Scientific75009020
Spectrophotometer Genesys 10 UVThermo Spectronic335903
SurgiSuiteKent ScientificSURGI-M02منصة جراحية متعددة الوظائف للفئران، مع تدفئة
Tracheal catheterExelint International2674622G
TyloxapolSigma-AldrichT0307-50G
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc.528-112

المراجع

  1. Scheele, C., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).
  2. Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy. Cytometry A. 97 (5), 445-447 (2020).
  3. Perrin, L., Bayarmagnai, B., Gligorijevic, B. Frontiers in Intravital Multiphoton Microscopy of Cancer. Cancer Rep (Hoboken). 3 (1), e1192(2020).
  4. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  5. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  6. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).
  7. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J Vis Exp. (116), e62761(2016).
  8. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  9. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  10. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917(2014).
  12. Prunier, C., Chen, N., Ritsma, L., Vrisekoop, N. Procedures and applications of long-term intravital microscopy. Methods. 128, 52-64 (2017).
  13. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  14. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  15. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  16. Magnen, M., et al. Immediate myeloid depot for SARS-CoV-2 in the human lung. Sci Adv. 10 (31), eadm8836(2024).
  17. Neupane, A. S., et al. Patrolling Alveolar Macrophages Conceal Bacteria from the Immune System to Maintain Homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125.e11 (2020).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. van de Wall, S., et al. Dynamic landscapes and protective immunity coordinated by influenza-specific lung-resident memory CD8(+) T cells revealed by intravital imaging. Immunity. 57 (8), 1878-1892.e5 (2024).
  20. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensitivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with beta-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. 10 (6-7), 821-829 (2017).
  21. Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J Vis Exp. (132), e56801(2018).
  22. Sommer, R., Cole, S. T. Monitoring Tuberculosis Drug Activity in Live Animals by Near-Infrared Fluorescence Imaging. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01280-19(2019).
  23. Castanheira, F. V. S., et al. Intravital imaging of three different microvascular beds in SARS-CoV-2-infected mice. Blood Adv. 7 (15), 4170-4181 (2023).
  24. Barlerin, D., et al. Biosafety Level 3 setup for multiphoton microscopy in vivo. Sci Rep. 7 (1), 571(2017).
  25. Vilcheze, C., et al. Rational Design of Biosafety Level 2-Approved, Multidrug-Resistant Strains of Mycobacterium tuberculosis through Nutrient Auxotrophy. mBio. 9 (3), e00938-18(2018).
  26. Shinkai, Y., et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell. 68 (5), 855-867 (1992).
  27. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  28. Cohen, S. B., et al. Alveolar Macrophages Provide an Early Mycobacterium tuberculosis Niche and Initiate Dissemination. Cell Host Microbe. 24 (3), 439-446.e4 (2018).
  29. Pandey, A. K., Sassetti, C. M. Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (11), 4376-4380 (2008).
  30. Bhatt, A., et al. Deletion of kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5157-5162 (2007).
  31. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  32. Vilcheze, C., Porcelli, S. A., Chan, J., Jacobs, W. R. Jr Sterilization by Adaptive Immunity of a Conditionally Persistent Mutant of Mycobacterium tuberculosis. mBio. 12 (1), e02391-20(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

232 232 JoVE
التصوير داخل القيد الحيوي لمرض الفطرية المضافة للسلال المخفف في رئة الفأر خلال العدوى الوعائية المبكرة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.