قيمت هذه الدراسة NEAT1 كعلامة تشخيصية ومنظم لخلل وظيفة الحاجز المعوي في متلازمة القولون المتهيج السائدة بالإسهال. وقد ارتفع مستوى NEAT1 في مصل المرضى، وارتبط بـ miR-29b-3p، كما أدى تثبيطه إلى تحسين مؤشرات الحاجز المعوي، وموت الخلايا المبرمج، والقراءات الالتهابية في خلايا Caco-2 المتضررة من عديد السكاريد الشحمي (lipopolysaccharide).
مقالة بحثية
خلل وظائف الحاجز المعوي بوساطة NEAT1 عبر الارتباط بـ miR-29b-3p في خلايا Caco-2 المتضررة بسبب عديد السكاريد الشحمي
ShuMin Jiang*1 , Chunrong Ping*2 , Xiaotong He3 , Guoyu Chen3 , Lingmei Feng3 , Jieru Ji3 , Yaya Gao4
1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital
* These authors contributed equally
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
لا تزال الآلية المرضية لمتلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإسهال (IBS-D) غير واضحة، كما تظل العلاجات المتاحة محدودة. قيمت هذه الدراسة القيمة التشخيصية لـ NEAT1 في حالات IBS-D واستكشفت آلية تنظيمه المحتملة. شملت الدراسة ما مجموعه 116 مريضاً يعانون من IBS-D و116 من الأصحاء كمجموعة ضابطة. تم قياس مستويات NEAT1 وmiR-29b-3p في المصل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي مع النسخ العكسي (RT-qPCR)، واستُخدمت منحنيات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) لتقييم القيمة التشخيصية. ولإجراء الدراسات الميكانيكية، تم إنشاء نموذج لخلايا Caco-2 الظهارية المعوية المعالجة بليبوبوليسيكاريد (LPS). تم تقييم حيوية الخلايا بواسطة مقايسة Cell Counting Kit-8 (CCK-8)، وموت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي، وسلامة الحاجز المعوي بواسطة المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER)، ومستويات mRNA لكل من ZO-1 وoccludin وclaudin-2 بواسطة RT-qPCR. كما استُخدمت مقايسات مراسل اللوسيفيراز المزدوج (DLR) والترسيب المناعي للحمض النووي الريبي (RIP) للتحقق من علاقة الارتباط بين NEAT1 وmiR-29b-3p. أظهرت النتائج تعبيراً مرتفعاً لـ NEAT1 وتبيراً منخفضاً لـ miR-29b-3p لدى المرضى المصابين بـ IBS-D، وكشف مستوياتهما عن ارتباط سلبي قوي. أدى تثبيط NEAT1 إلى زيادة مستويات miR-29b-3p، وتعزيز حيوية الخلايا وقيمة TEER، وتقليل موت الخلايا المبرمج، وزيادة مستويات mRNA لـ ZO-1 وoccludin، وخفض مستويات mRNA لـ claudin-2، وتخفيف المؤشرات المرتبطة بإصابة الحاجز في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن NEAT1 في المصل يعد مؤشراً حيوياً مرشحاً لـ IBS-D، وأن محور NEAT1/miR-29b-3p قد يكون متورطاً في خلل وظيفة الحاجز المعوي.
المقدمة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تعد متلازمة القولون المتهيج المصحوبة بالإسهال (IBS-D) اضطراباً شائعاً وظيفياً في الجهاز الهضمي، يتسم بآلام البطن، وانتفاخ البطن، وتغير في عادات التغوط1. وفي الوقت الحالي، لم يتم توضيح الآلية الفسيولوجية المرضية لـ IBS-D بشكل كامل2. وتعتمد طرق العلاج في الغالب على تخفيف الأعراض، وهي ذات فعالية محدودة ومعدل انتكاس عالٍ3. ويُعتقد بشكل عام أن IBS-D تنطوي على تفاعل عوامل متعددة، مثل خلل تنظيم المحور الدماغي المعوي، وفرط الحساسية الأحشائية، والالتهاب المعوي منخفض الدرجة، واختلال وظيفة الحاجز المعوي4,5. ورغم أن هذه المعايير قد ساهمت في توحيد التشخيص إلى حد ما، إلا أنها تظل ذاتية وقد تؤدي إلى تأخر التشخيص أو خطأ في التصنيف، خاصة عندما تتداخل أعراض المريض مع أعراض مرض الأمعاء الالتهابي أو الأمراض العضوية الأخرى. وفي الممارسة السريرية الروتينية، لا توجد حالياً مؤشرات حيوية موضوعية ومعتمدة لـ IBS-D. وبناءً على ذلك، أصبح استكشاف هدف جزيئي جديد يمكن أن يعمل كأداة تشخيصية وله قيمة علاجية محتملة حاجة ملحة في مجال أبحاث IBS-D الحالية.
في السنوات الأخيرة، أظهرت الحمضيات النووية الريبية الطويلة غير المشفرة (long non-coding RNAs)، باعتبارها جزيئات رئيسية في التنظيم فوق الجيني، إمكانات كبيرة كعلامات تشخيصية وأهداف علاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض6,7. ويعد خلل وظيفة الحاجز المعوي السبب الرئيسي لمتلازمة القولون العصبي ذات الغلبة الإسهالية (IBS-D)8. إذ يؤدي تدمير بروتينات الوصلات المحكمة إلى "تسرب معوي"، مما يؤدي بدوره إلى تنشيط الاستجابة المناعية المخاطية9,10. ويؤدي تنشيط الجهاز المناعي إلى إطلاق العديد من العوامل المحفزة للالتهابات التي يمكن أن تسبب خللاً وظيفياً في الأمعاء عن طريق تنشيط الجهاز المناعي العصبي المعوي. وقد أشارت الدراسات إلى أن بعض الـ lncRNAs يمكنها تنظيم الحاجز الظهاري المعوي11,12. وقد أفيد بأن NEAT1 يزداد تعبيره في نسيج المخاطية القولونية لدى المرضى المصابين بالتهاب القولون13. كما يمكن أن يؤدي تثبيط LncRNA NEAT1 إلى تخفيف الخلل الوظيفي في الخلايا الظهارية المعوية (IECs) في حالات التهاب القولون التقرحي14. ومع ذلك، لم يتم بعد بحث ملف تعبير NEAT1 في حالات IBS-D وقيمته التشخيصية. وعلاوة على ذلك، قد يمتلك NEAT1 إمكانات كعلامة بيولوجية تشخيصية15. فإذا كان NEAT1 يُعبر عنه بشكل غير طبيعي في مصل المرضى المصابين بـ IBS-D، فقد يكمل ذلك معايير روما الرابعة (Rome IV) الحالية من خلال توفير أداة تشخيص جزيئية. وفي الوقت ذاته، تغير ملف تعبير miRNA بشكل ملحوظ لدى مرضى IBS؛ فعلى سبيل المثال، ارتبط انخفاض تعبير miR-29b-3p بنشوء مرض IBS16. ومع ذلك، لا تزال الآليات التنظيمية العلوية التي تتحكم في تعبير miR-29b-3p في IBS-D غير مستكشفة تماماً. وبوجه خاص، لم يتم بحث دور NEAT1 كحمض نووي ريبي داخلي تنافسي (ceRNA) لـ miR-29b-3p في سياق IBS-D، رغم أن هذه الآلية مثبتة جيداً في أمراض أخرى17,18. علاوة على ذلك، وبينما ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على التعبير على مستوى الأنسجة، تظل إمكانية استخدام NEAT1 الدوراني كعلامة بيولوجية مصلية غير جراحية لتشخيص IBS-D غير معروفة تماماً.
نفترض أن lncRNA-NEAT1 قد يشارك في تنظيم وظيفة الحاجز المعوي في حالات متلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإسهال (IBS-D) عن طريق العمل كـ ceRNA الذي يمتص miR-29b-3p. وبناءً على الخلفية البحثية المذكورة أعلاه، تهدف هذه الدراسة إلى: (1) تقييم مستويات NEAT1 و miR-29b-3p في مصل مرضى IBS-D وقيمتها التشخيصية؛ (2) التحقق من تفاعل الارتباط المباشر بين NEAT1 و miR-29b-3p؛ و(3) توضيح الدور الوظيفي لمحور NEAT1/miR-29b-3p في تنظيم سلامة الحاجز المعوي والالتهاب باستخدام نموذج خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
إدراج المرضى
قدم جميع المشاركين موافقة مستنيرة مكتوبة بعد الفهم الكامل لمحتوى البحث. وقد قامت لجنة الأخلاقيات بمستشفى منطقة بودونغ الجديدة الشعبية في شنغهاي بمراجعة بروتوكول هذا البحث والموافقة عليه (رقم 2024k007). تم حساب حجم العينة باستخدام برنامج G*Power: وكان الاختبار المختار هو t-test، وصُمم الاختبار الإحصائي للكشف عن الفروق بين عينتين مستقلتين. ومع حجم تأثير d = 0.5، و α = 0.05، وقوة إحصائية power = 0.9، أشار الحساب إلى ضرورة إدراج 86 شخصاً كحد أدنى في كل مجموعة. وبغرض تعويض أي ظروف غير متوقعة قد تطرأ أثناء التجربة، تم إدراج 116 مريضاً في كل مجموعة. شملت الدراسة 116 مريضاً مصاباً بـ IBS-D ممن زاروا مستشفى منطقة بودونغ الجديدة الشعبية في شنغهاي بين يوليو 2024 ويوليو 2025 كمجموعة تجريبية. وتمثلت معايير الاشتمال في: (1) الإصابة بـ IBS-D وفقاً لمعايير تشخيص Rome IV؛ (2) أن يشير تنظير القولون إلى عدم وجود آفات عضوية في المخاطية. أما معايير الاستبعاد فشملت: (1) المرضى المصابين بأمراض الأمعاء الالتهابية (IBD)، أو سرطان القولون والمستقيم، وما إلى ذلك؛ (2) مرضى السكري؛ (3) المرضى الذين لديهم تاريخ حديث من جراحات البطن؛ و(4) المرضى الذين يعانون من قصور حاد في القلب أو الكبد أو الكلى. وفي الوقت ذاته، تم استقطاب 116 متطوعاً سليماً تتطابق خصائصهم الديموغرافية، مثل العمر والجنس، مع المرضى ليكونوا مجموعة ضابطة. وتم التأكد من أن الضوابط السليمة ليس لديهم تاريخ من أمراض الجهاز الهضمي المزمنة أو الأعراض السريرية المقابلة لها. سُحب 5 mL من الدم الوريدي الطرفي من جميع الأشخاص. ثم نُقل الطافي إلى ثلاجة ذات درجة حرارة فائقة الانخفاض عند -80 °C للحفظ بالتجميد قبل عملية استخلاص RNA اللاحقة.
قام كل مشارك بتعبئة استبيان لمدة 10 أيام لتسجيل المظاهر السريرية التالية: (أ) تقييم شدة ألم البطن باستخدام المقياس البصري التناظري المكون من 10 نقاط؛ (ب) تكرار ألم البطن خلال فترة المسح (عدد الأيام المؤلمة)؛ (ج) تكرار حركة الأمعاء (أقصى عدد من مرات التبرز في اليوم)؛ (د) مقياس بريستول لأنواع البراز لتقييم خصائص البراز. كما تم تقييم الحالة العاطفية للمبحوثين باستخدام مقياس القلق والاكتئاب في المستشفى (HADS).
زراعة الخلايا والنمذجة
تم استزراع خلايا Caco-2 روتينياً في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) يحتوي على 10% من مصل العجل الجنيني (FBS) و1% من البنسلين-ستريبتومايسين، وذلك في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و5% CO₂. تتمايز سلالة خلايا Caco-2 تلقائياً إلى طبقة أحادية مستقطبة من الخلايا ذات وصلات محكمة وخملات دقيقة، مظهرةً خصائص مورفولوجية ووظيفية مشابهة لتلك الموجودة في الخلايا الظهارية المعوية الناضجة. يحفز LPS استجابة التهابية ويزيل الوصلات المحكمة في الظهارة المعوية، مما يزيد من النفاذية المعوية، وهي عملية تشبه إلى حد كبير السمات المرضية لـ IBS-D. علاوة على ذلك، ونظراً لأن خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS قد استُخدمت على نطاق واسع في دراسات سابقة19,20,21 لنمذجة خلل حاجز الأمعاء والالتهاب المرتبط بـ IBS، فقد تم اختيار معالجة خلايا Caco-2 بـ lipopolysaccharide (LPS) في هذه الدراسة لإنشاء نموذج in vitro لـ IBS-D. وبمجرد وصول الخلايا إلى حالة تلاقي تبلغ حوالي 80%، تم استبدال وسط الاستزراع بوسط كامل يحتوي على 5 µg/ml LPS22، وحُفزت الخلايا لمدة 24 h. واستُخدمت الخلايا المستزرعة تقليدياً بدون LPS كمجموعة ضابطة.
ترانسفكشن الخلايا
لبحث أدوار NEAT1 و miR-29b-3p في خلايا Caco-2، تم إجراء عملية ترانسفكشن لخلايا Caco-2. وقُسمت الخلايا إلى ست مجموعات على النحو التالي: 1. المجموعة الضابطة (بدون علاج)؛ 2. مجموعة LPS؛ 3. مجموعة LPS + si-NC؛ 4. مجموعة LPS + si-NEAT1؛ 5. مجموعة LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC؛ و6. مجموعة LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor. تم تصميم وتخليق اثنين من جزيئات RNA المتداخلة الصغيرة (si-NEAT1) التي تستهدف NEAT1 وهما: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) و si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). واستُخدم تسلسل عشوائي من siRNA غير مستهدف (si-NC) كضابط سلبي. وفي الوقت ذاته، تم تخليق مثبط miR-29b-3p والضابط السلبي الخاص به. مثبط miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. الضابط السلبي: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.
تم استزراع خلايا Caco-2 في أطباق ذات 24 بئراً، ثم أُجري لها transfection بمجرد وصول المزارع إلى درجة تلاقي 60–70%، وذلك وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تم تخفيف 1.25 µL من siRNA في 25 µL من وسط غذائي منخفض المصل لتحقيق تركيز نهائي من siRNA قدره 50 nM. ولتثبيط miRNA، تم تخفيف 2 µL من مثبط miR-29b-3p أو الضابط السلبي الخاص به في 25 µL من وسط غذائي منخفض المصل ليصل إلى تركيز نهائي قدره 100 nM. وبشكل منفصل، خُلط 1.5 µL من كاشف transfection مع 25 µL من وسط غذائي منخفض المصل. بعد ذلك، خُلط siRNA المخفف (أو المثبط/الضابط السلبي) مع كاشف transfection المخفف لتكوين معقد transfection، والذي أضيف قطرة بقطرة إلى الخلايا. وبعد ست ساعات من عملية transfection، استُبدل خليط transfection بوسط غذائي كامل وجديد، وحُفظت الخلايا لمدة 48 h أخرى قبل إجراء المقايسات الوظيفية اللاحقة. وتم التأكد من كفاءة knockdown أو التثبيط بواسطة RT-qPCR قبل المضي في التجارب الإضافية.
تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي مع النسخ العكسي (RT-qPCR)
تم عزل الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من عينات المصل وخلايا Caco-2 التي خضعت للمعالجات الموضحة. وباختصار، تم تحلل كل عينة باستخدام 1 مل من كاشف استخلاص الحمض النووي الريبوزي، ثم دُمجت مع 200 µلتر من الكلوروفورم. وبعد الطرد المركزي عند 12,000 × ج لمدة 15 دقيقة عند 4 °ج، نُقلت الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد، وخُلطت مع 500 µلتر من الإيزوبروبانول، وحُفظ في درجة حرارة -20 °لمدة 30 دقيقة. ثم تم إجراء طرد مركزي للعينات بسرعة 12,000 × ج لمدة 10 دقائق عند 4 °ج. غُسلت كريّة الحمض النووي الريبوزي (RNA) الناتجة مرتين باستخدام إيثانول بتركيز 75%، ثم جُففت بالهواء، وأُعيد تعليقها في 20 µلتر من ماء خالٍ من الريبونوكلياز (RNase). وتم قياس حصيلة ورنا (RNA) ونقاوته باستخدام مقياس طيف ضوئي دقيق (micro-spectrophotometer)، واعتُمدت فقط العينات التي بلغت قيمة A260/A280 استُخدمت قيم تتراوح بين 1.8 و2.0. وتم نسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) عكسياً إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين متمم (cDNA) وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وللكشف عن NEAT1, ZO-1، أوكلودين، كلودين-2، و GAPDH, 1 µتم استخدام غ من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) لكل 20 µتفاعل النسخ العكسي L الذي يحتوي على 1× منظم تفاعل النسخ العكسي، 0.5 ميليمولار من ديوكسي نيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، 0.5 µبادئ oligo(dT) M، و200 وحدة من إنزيم النسخ العكسي، وماء خالٍ من RNase. أُجري التفاعل عند درجة حرارة 37 °درجة حرارة C لمدة 15 دقيقة، يلي ذلك تثبيط الإنزيم عند 85 درجة مئوية °التركيز (C) لمدة 5 ثوانٍ.
أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام cDNA كقالب عبر نظام PCR في الوقت الحقيقي يعتمد على SYBR Green. تم قياس مستويات تعبير NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, و claudin-2 باستخدام بادئات خاصة بكل جين. استُخدم U6 كجين مرجعي لـ miR-29b-3p، بينما استُخدم GAPDH لمعايرة NEAT1 والجينات المرتبطة بالوصلات المحكمة. حُسب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCt. تسلسلات البادئات مدرجة في الجدول 1.
اختبار حيوية الخلايا
تم استزراع خلايا Caco-2 في طور النمو اللوغاريتمي في أطباق ذات 96 بئراً بمعدل 1 × 104 خلية لكل بئر. تم إعداد مجموعة ضابطة فارغة (تحتوي على وسط الاستزراع فقط)، ومجموعة ضابطة (خلايا غير معالجة)، ومجموعة تجريبية (خلايا Caco-2 تحت ظروف معالجة مختلفة)، مع تخصيص 5-6 آبار مكررة في كل مجموعة. وُزعت الخلايا على أربع نقاط زمنية: 0، و24، و48، و72 h. تم تحضير طبق استزراع منفصل لكل نقطة زمنية لتجنب فتح الحاضنة بشكل متكرر أثناء القياسات. وبعد فترة الاستزراع، أُضيف 10 µL من محلول CCK-8 إلى كل بئر، مع تجنب تكون الفقاعات. بعد ذلك، أُعيد طبق الاستزراع إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 °C و5% CO₂ وحُضن في الظلام لمدة 2 h. تم قياس الامتصاصية لكل بئر فوراً عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة. وفي النهاية، عُبّر عن حيوية الخلايا كنسبة مئوية.
اختبار موت الخلايا المبرمج
تم قياس موت الخلايا المبرمج كمياً بواسطة قياس التدفق الخلوي بعد الصبغ بـ Annexin V-FITC/PI. حُصدت خلايا Caco-2 من كل مجموعة علاجية وغُسلت مرتين باستخدام PBS مبرد بالثلج. أُجري الطرد المركزي بسرعة 300 × g لمدة 5 min عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، أُعيد تعليق كتلة الخلايا في 100 µL من binding buffer بتركيز 1×، تلا ذلك إضافة 5 µL من Annexin V-FITC و5 µL من PI بالتتابع. وبعد الخلط اللطيف، حُضنت العينات لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد ذلك، أُضيف 300 µL من binding buffer بتركيز 1×، ومُزج المعلق بعناية قبل نقله إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 mL. حُللت العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي خلال 1 h.
المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER)
تم تقييم النفاذية عن طريق قياس قيم TEER لخلايا Caco-223. تم تلقيح خلايا Caco-2 في غرف Transwell وزراعتها لمدة 21 يوماً لتكوين طبقة أحادية كثيفة. أُجريت ست مكررات بيولوجية مستقلة تحت كل حالة تجريبية، كما أُجريت خمس مكررات تقنية تحت كل حالة. قبل وبعد المعالجة التجريبية، قيست قيم TEER لكل مجموعة بواسطة مقياس المقاومة عبر الغشائية باستخدام أقطاب كهربائية معقمة بالإيثانول ومعادلة بمحلول PBS. وباختصار، غُمر القضيب الطويل للقطب في وسط الزراعة القاعدي الجانبي (basolateral)، والقضيب القصير في وسط الزراعة القمي (apical)، لتجنب التلامس مع الغشاء المرشح. بعد الاستقرار، قُرئت قيمة المقاومة (Ω)، وكُررت القياسات حتى يتم الحصول على ثلاث قراءات متسقة. كما قيست مقاومة مرشحات Transwell الفارغة (بدون خلايا) تحت نفس الظروف، وطُرحت هذه القيمة من جميع القراءات التجريبية. TEER (Ω·cm2) = (مقاومة العينة – مقاومة الفراغ) × مساحة الغشاء الفعالة. عُرضت البيانات على النحو التالي: (المجموعة التجريبية/المجموعة الضابطة) × 100%.
المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)
تم جمع الموائع الطافية لخلايا Caco-2 من مجموعات علاجية مختلفة بعد 24 h من الزرع. وقِيست مستويات السيتوكينات المحرضة للالتهاب، بما في ذلك عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، وإنترلوكين-6 (IL-6)، وإنترلوكين-8 (IL-8)، وإنترلوكين-1β (IL-1β)، باستخدام كواشف ELISA التجارية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وقد أُجري الفحص بدقة طبقاً للتعليمات؛ حيث أضيفت العينات والمعايير إلى الآبار المطلية مسبقاً بالأجسام المضادة، ثم حُضنت وغُسلت. بعد ذلك، أُضيف الجسم المضاد للكشف المبيوتن. وبعد فترة تحضين وغسيل أخرى، أُضيف الستريبتاديفين المسمى ببيروكسيداز الفجل الحذفي. وفي النهاية، أُضيفت مادة الركيزة TMB لإظهار اللون، وأُوقف التفاعل باستخدام محلول الإيقاف. وقِيست الامتصاصية لكل بئر فوراً عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.
لطخة ويسترن
عُزلت البروتينات من خلايا Caco-2 بعد المعالجات المذكورة باستخدام منظم RIPA الذي يحتوي على مثبطات البروتياز. وقِيست مستويات البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينكونينيك (BCA). وبالنسبة لكل عينة، تم تحميل 30 µg من البروتين في كل مسار، وفصلها على هلام SDS-PAGE بتركيز 10%، ثم نقلها إلى أغشية PVDF. حُجبت الأغشية في حليب خالي الدسم بتركيز 5% لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، ثم حُضنت طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة ضد ZO-1 (1:1,000)، وoccludin (1:500)، وclaudin-2 (1:1,000)، وGAPDH (1:5,000). وبعد الغسيل، حُضنت الأغشية مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ HRP لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. كُشفت الحزم عن طريق التلألؤ الكيميائي المعزز (ECL)، وحُللت كثافة الحزم باستخدام برنامج ImageJ. واستُخدم GAPDH كضابط تحميل.
مقايسة مراسل لوسيفيريز المزدوج (DLR)
تم التنبؤ بمواقع الارتباط المحتملة لـ miR-29b-3p بتسلسل NEAT1 من خلال قاعدة بيانات ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). بعد ذلك، تم استنساخ قطع NEAT1 التي تحتوي على مواقع ارتباط من النوع البري (WT) أو الطافر (MUT) في ناقل المراسل pmirGLO. وتم إجراء ترانسفكشن مشترك للبلازميد المؤتلف الذي تم إنشاؤه في الخلايا مع محاكات miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’؛ Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) أو مثبطاتها وعناصر التحكم السلبية الخاصة بها (mimic NC، Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’؛ Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). وبعد ثمانٍ وأربعين ساعة من الترانسفكشن، تم جمع الخلايا وتحديد أنشطة لوسيفيريز اليراع ولوسيفيريز رينيلا باستخدام كاشف الكشف عن اللوسيفيريز المزدوج. وقد استُخدم نشاط لوسيفيريز رينيلا كمرجع داخلي للمعايرة.
مقايسة الترسيب المناعي للحمض النووي الريبي (RIP)
بالنسبة لمقايسة RIP، تم حصاد خلايا Caco-2، وشطفها باستخدام PBS، وحضنها على الثلج لمدة 15 min في 200 µL من محلول RIP lysis buffer المضاف إليه مثبطات البروتياز وRNase. تم إجراء طرد مركزي لنواتج تحلل الخلايا عند 16,000 × g لمدة 10 min عند 4 °C، والاحتفاظ بـ 10 µL من كل سائل طافٍ كعينة تحكم مدخلة (input control). ولإجراء الترسيب المناعي، تم تدوير 40 µL من حبيبات Protein A/G المغناطيسية مع 5 µg من الجسم المضاد anti-Ago2 أو IgG طبيعي في 200 µL من محلول RIP wash buffer لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات باستخدام 500 µL من محلول RIP wash buffer، تم دمج 100 µL من معلق الحبيبات مع 100 µL من ناتج التحلل، وضبط الحجم النهائي ليصبح 1 mL باستخدام RIP wash buffer، ثم الحضن طوال الليل عند 4 °C مع التدوير. بعد ذلك، غُسلت الحبيبات خمس مرات باستخدام 500 µL من محلول RIP wash buffer وأُعيد تعليقها في 150 µL من المحلول نفسه. تم إجراء هضم البروتين بإضافة 15 µL من proteinase K (20 mg/mL) و15 µL من 10% SDS، يليه الحضن عند 55 °C لمدة 30 min مع الرج. تم جمع السائل الطافٍ، وعزل الـ RNA باستخدام كاشف الاستخلاص وترسيبه طوال الليل. ثم تم تقييم إثراء NEAT1 وmiR-29b-3p عن طريق تقنية RT-qPCR.
تحليل التموضع تحت الخلوي
تم فصل خلايا Caco-2 إلى أجزاء نووية وسيتوبلازمية باستخدام كاشف فصل نووي-سيتوبلازمي متاح تجارياً، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. استُخلص الحمض النووي الريبي الشامل (Total RNA) من هذين المكونين، وتم الكشف عن توزيع NEAT1 في النواة والسيتوبلازم بواسطة تقنية RT-qPCR. أُجريت عملية المعايرة باستخدام U6 (نووي بشكل أساسي) و GAPDH mRNA (سيتوبلازمي بشكل أساسي) كمؤشرات على كفاءة الفصل.
التحليل الإحصائي
بالنسبة لعينات المصل السريرية، أشار تحليل القوة (t-test, d = 0.5, α = 0.05, power = 0.9) إلى أن الحد الأدنى المطلوب هو 86 شخصاً لكل مجموعة. ولتجنب أي ظروف غير متوقعة خلال التجربة، تم إدراج 116 مريضاً في كل مجموعة للكشف عن الفروق ذات الدلالة السريرية. تم تقييم طبيعية البيانات للمتغيرات المستمرة باستخدام اختبار Shapiro-Wilk. وبما أن جميع البيانات المستمرة كانت موزعة بشكل طبيعي (P > 0.05)، فقد تم تطبيق التحليلات المعلمية. أما المتغيرات الفئوية فقد تم تحليلها باستخدام اختبار مربع كاي. تضمنت التجارب القائمة على الخلايا ست مكررات بيولوجية مستقلة، مع خمس مكررات تقنية لكل مكرر بيولوجي. تُعرض البيانات كمتوسط ± SD. أُجريت المقارنات بين مجموعتين من المتغيرات المستمرة باستخدام اختبار Student’s t-test، بينما تم تحليل المقارنات بين مجموعات متعددة بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه يليه اختبار Tukey’s post hoc. حُددت الدلالة الإحصائية عندما تكون P < 0.05.
النتائج
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تعبير NEAT1 والقيمة التشخيصية
مقارنة بمجموعة الضوابط الصحية (HC)، كانت مستويات تعبير NEAT1 لدى مرضى IBS-D أعلى بشكل ملحوظ (P < 0.0001؛ الشكل 1A). وقد بلغت المساحة تحت المنحنى (AUC) لـ NEAT1، كما يظهر في منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC)، 0.867 (95% CI: 0.821–0.913). وكانت خصوصيته 75.9%، بينما بلغت حساسيته 84.5% (الشكل 1B). وهذا يشير إلى أن التعبير غير الطبيعي لـ NEAT1 في مصل مرضى IBS-D يمكن أن يعمل كعلامة حيوية تشخيصية جديدة لهذه الحالة.
بالإضافة إلى ذلك، تمت مقارنة البيانات السريرية للمرضى في مجموعتي الأصحاء ومرضى متلازمة القولون العصبي من النوع الإسهالي (IBS-D). وأظهرت النتائج عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين من حيث العمر، أو الجنس، أو الخصائص الأخرى (P > 0.05). ومع ذلك، كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في مقياس HADS، وحركات الأمعاء، وأشكال البراز (P < 0.0001، الجدول 2). وفيما يتعلق بتكرار آلام البطن، عانى 69 مريضاً من الأعراض لمدة ≥ 5 أيام، وهو ما يمثل 59.48% من الحالات. أما بالنسبة لشدة آلام البطن، فقد سجل 72 مريضاً درجة ≥ 5، وهو ما يمثل 62.07% (الجدول 2). وهذا يعني أن مرضى IBS-D يمكن تمييزهم بوضوح عن مجموعة الضبط من خلال أعراضهم. ونظراً للارتباط السريري بين ارتفاع مستوى NEAT1 وأعراض IBS-D، بحثنا بعد ذلك في التأثير الوظيفي لـ NEAT1 على سلامة الحاجز المعوي باستخدام نموذج خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS.
تأثيرات المستويات المنخفضة من NEAT1 على تلف الحاجز المعوي والاستجابات الالتهابية في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS
لنمذجة خلل وظيفة الحاجز المعوي والالتهاب منخفض الدرجة الملاحظ في متلازمة القولون المتهيج ذات الغلبة الإسهالية (IBS-D)، قمنا بمعالجة خلايا Caco-2 بـ LPS. وعند إضافة LPS إلى الخلايا، ارتفعت مستويات NEAT1 مقارنة بمجموعة الضابطة. وبعد عفن (transfection) باستخدام si-NEAT1، انخفض مستوى NEAT1 بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة LPS + si-NC (P < 0.0001، الشكل 2A). أدت المعالجة بـ LPS إلى تقليل حيوية الخلايا وزيادة الموت الخلوي المبرمج (apoptosis) بالنسبة لمجموعة الضابطة. وبعد تثبيط (knocking down) NEAT1، زادت حيوية الخلايا وانخفض معدل الموت الخلوي المبرمج مقارنة بمجموعة LPS + si-NC (P < 0.001؛ الشكل 2B،C). وبعد تثبيط NEAT1، استُعيدت قيمة TEER التي خفضها LPS بشكل ملحوظ (P < 0.0001، الشكل 2D). كما قلل LPS من التعبير عن mRNA لـ ZO-1 وoccludin وزاد من التعبير عن claudin-2 بالنسبة لمجموعات الضابطة، بينما عكس تثبيط NEAT1 هذه التغيرات (P < 0.001، الشكل 2E-G). يمكن أن تحفز المعالجة بـ LPS استجابة التهابية في الخلايا؛ حيث كانت مستويات العوامل المحفزة للالتهاب TNF-α وIL-6 وIL-8 وIL-1β في الخلايا أعلى مما كانت عليه في مجموعة الضابطة. وبعد تثبيط NEAT1، انخفضت محتويات العوامل المحفزة للالتهاب في الخلايا بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة si-NC (P < 0.0001، الشكل 3A-D). يشير هذا إلى أن انخفاض مستويات NEAT1 يقلل من خلل وظيفة الحاجز المعوي والاستجابات الالتهابية الناجمة عن LPS، وأن NEAT1 قد يساهم في تطور IBS-D.
الارتباط المباشر لـ NEAT1 والتأثيرات على miR-29b-3p في خلايا Caco-2
في خلايا Caco-2، يتواجد NEAT1 بشكل أساسي في السيتوبلازم (الشكل 4A). تم التنبؤ بمواقع ارتباط NEAT1 و miR-29b-3p بواسطة قاعدة بيانات ENCORI. وبناءً على ذلك، صممنا تسلسلات WT-NEAT1 و MUT-NEAT1 (الشكل 4B). أشارت نتائج تجربة DLR إلى أن محاكيات miR-29b-3p قللت من النشاط الإنزيمي لـ WT-NEAT1 مقارنة بـ mimic NC، بينما أدت مثبطاته إلى زيادته مقارنة بـ inhibitor NC. وعلى العكس من ذلك، لم يؤثر أي من العلاجين على MUT-NEAT1 (P < 0.0001، الشكل 4C). وكشف تحليل RIP أن NEAT1 و miR-29b-3p كانا وفيرين بشكل ملحوظ في جزء anti-Ago2 مقارنة بمجموعة anti-IgG، مما يشير إلى وجود تفاعل محدد بين الاثنين (P < 0.0001، الشكل 4D). وتشير هذه النتائج إلى أن NEAT1 يرتبط تحديداً بـ miR-29b-3p. وفي الوقت نفسه، انخفض مستوى miR-29b-3p بشكل ملحوظ لدى مرضى IBS-D مقارنة بمجموعة HC (P < 0.0001، الشكل 4E). وكانت قيمة AUC لمنحنى ROC الخاص به 0.856 (95% CI: 0.808–0.905)، بحساسية بلغت 89.7% ونوعية بلغت 71.6% (الشكل 4F). كما كشف تحليل ارتباط بيرسون عن وجود ارتباط عكسي بين مستويات NEAT1 وتعبير miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001، الشكل 4G).
تأثيرات انخفاض NEAT1 على تلف الحاجز المعوي في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS ومستويات miR-29b-3p
في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS، انخفض تعبير miR-29b-3p بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة التحكم. وأدى عفن (transfection) خلايا بـ si-NEAT1 إلى زيادة مستويات miR-29b-3p، بينما أدى العفن بمثبط miR-29b-3p إلى خفض مستويات miR-29b-3p مرة أخرى (P < 0.0001، الشكل 5A). أدى تثبيط (knockdown) NEAT1 إلى زيادة حيوية الخلايا وتقليل الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، وقد أُلغيت هذه التأثيرات بواسطة مثبط miR-29b-3p (P < 0.01، الشكل 5B،C). كما استُعيد الانخفاض في TEER الناجم عن LPS من خلال تثبيط NEAT1، وتم منع هذا الاستعادة مرة أخرى بواسطة مثبط miR-29b-3p (P < 0.0001، الشكل 5D). أدت المعالجة بـ LPS إلى انخفاض تعبير mRNA لكل من ZO-1 وoccludin وزيادة تعبير mRNA لـ claudin-2 مقارنة بمجموعة التحكم. وبعد تثبيط NEAT1، ارتفعت مستويات miR-29b-3p، وزادت مستويات mRNA لـ ZO-1 وoccludin، وانخفضت مستويات mRNA لـ claudin-2 مقارنة بمجموعة LPS + si-NC. وبعد تثبيط miR-29b-3p، انخفضت مستويات mRNA لـ ZO-1 وoccludin، وزادت مستويات mRNA لـ claudin-2 مقارنة بمجموعة LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC (P < 0.001، الشكل 5E-G). يعمل NEAT1 (وبشكل أساسي النمط الظاهري السيتوبلازمي NEAT1_1) كإسفنجة لـ miR-29b-3p. ويؤدي تثبيط NEAT1 إلى تحرير miR-29b-3p، مما يؤدي بشكل غير مباشر إلى زيادة تنظيم ZO-1 وoccludin وتقليل تنظيم claudin-2، وهو ما يخفف من خلل الحاجز الناجم عن LPS. وتشير هذه النتائج إلى أنه في هذا النموذج، ينظم miR-29b-3p بشكل إيجابي تعبير ZO-1 وoccludin وينظم claudin-2 بشكل سلبي، وأن تأثيرات تثبيط NEAT1 تتم بوساطة miR-29b-3p، جزئيًا على الأقل.
قمنا بمزيد من الفحص لمستويات تعبير بروتينات الوصلات المحكمة باستخدام تحليل western blot. وكما هو موضح في الشكل 5H، أدى تثبيط NEAT1 إلى زيادة تعبير ZO-1 و occludin اللذين انخفضا بفعل LPS، كما ثبط تعبير claudin-2 مقارنة بمجموعة LPS + si-NC. ومع ذلك، أدى التعدي المشترك بمثبط miR-29b-3p إلى إضعاف التأثير الوقائي لتثبيط NEAT1 مقارنة بمجموعة LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. وتدعم هذه النتائج الاستنتاج بأن تثبيط NEAT1 يستعيد تعبير بروتينات الوصلات المحكمة، وذلك جزئياً على الأقل من خلال زيادة تنظيم miR-29b-3p، مما يؤدي بدوره إلى تحسين وظيفة الحاجز المعوي.
تأثيرات انخفاض مستويات NEAT1 على الالتهاب المعوي في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS وتعبير miR-29b-3p
في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS، أدى LPS إلى تحفيز استجابة التهابية. كانت مستويات العوامل المحفزة للالتهاب TNF-α وIL-6 وIL-8 وIL-1β أعلى بكثير مما كانت عليه في المجموعة الضابطة. وبعد تثبيط NEAT1، ارتفعت مستويات miR-29b-3p، بينما انخفضت مستويات العوامل المحفزة للالتهاب بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة si-NC. وبعد تثبيط miR-29b-3p، ارتفعت مستويات العوامل الالتهابية مرة أخرى (P < 0.0001، الشكل 6A-D). وبناءً على ذلك، فإن تثبيط NEAT1 يكبح إطلاق السيتوكينات الالتهابية، جزئياً على الأقل، من خلال زيادة تنظيم miR-29b-3p.
تشير هذه النتائج إلى أن مستويات NEAT1 مرتفعة بشكل غير طبيعي في مصل المرضى المصابين بمتلازمة القولون المتهيج من النوع الإسهالي (IBS-D)، وأن NEAT1 يمتلك مساحة تحت المنحنى (AUC) عالية للتمييز بين المرضى المصابين بـ IBS-D والمجموعات الضابطة السليمة. ومن الناحية الميكانيكية، يرتبط NEAT1 مباشرة بـ miR-29b-3p ويعزله في السيتوبلازم. وفي النماذج الخلوية وتجارب الإنقاذ الوظيفي، أدى تثبيط NEAT1 إلى زيادة تعبير miR-29b-3p، وتحسين بقاء الخلايا والمقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER)، وتقليل الموت الخلوي المبرمج، وتخفيف إطلاق السيتوكينات المسببة للالتهابات. وتدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن NEAT1 ينظم بشكل سلبي سلامة الحاجز المعوي من خلال تثبيط miR-29b-3p، وتشير إلى أن استهداف NEAT1 قد يوفر استراتيجية تشخيصية وعلاجية محتملة لـ IBS-D.
توفر البيانات:
تتوفر البيانات الخام التي تستند إليها الأشكال والجداول في الملف التكميلي 1 (جدول بيانات البيانات الخام) والملف التكميلي 2 (صور لطخة وسترن غير المعدلة).
الشكل 1. تعبير والقيمة التشخيصية لـ NEAT1 لدى المرضى المصابين بـ IBS-D. (A) مستويات تعبير NEAT1 في مصل المجموعة الضابطة الصحية (HC، العدد = 116) ومرضى IBS-D (العدد = 116) والتي تم الكشف عنها بواسطة RT-qPCR؛ (B) تحليل منحنى ROC لـ NEAT1 للتمييز بين مرضى IBS-D والمجموعة الضابطة الصحية. البيانات معروضة في صورة المتوسط ± SD (العدد = 116 لكل مجموعة). **** P < 0.0001. الاختصارات: IBS-D = متلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإسهال؛ ROC = خاصية تشغيل المستقبل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. تأثير NEAT1 على تلف الحاجز المعوي الناجم عن LPS في خلايا Caco-2. (A) يؤدي ترانسفكشن si-NEAT1 إلى خفض مستويات NEAT1 الناجم عن LPS؛ (B) قياس حيوية الخلايا بواسطة مقايسة CCK-8 عند 0 و24 و48 و72 h. يعزز تثبيط NEAT1 من حيوية الخلايا؛ (C) تحديد معدل الموت الخلوي المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي مع صبغ Annexin V-FITC/PI. يقلل إسكات NEAT1 من معدلات الموت الخلوي المبرمج؛ (D) قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) في طبقات أحادية من خلايا Caco-2. يؤدي تثبيط NEAT1 إلى زيادة TEER الخلوية؛ (E-G) مستويات التعبير عن mRNA لكل من (E) ZO-1، و(F) occludin، و(G) claudin-2 مقاسة بواسطة RT-qPCR. يرفع إسكات NEAT1 من التعبير عن mRNA لـ ZO-1 وoccludin، ويخفض مستويات mRNA لـ claudin-2. البيانات معروضة كمتوسط ± SD من ست تجارب مستقلة (n = 6 لكل مجموعة). *** P < 0.001; **** P < 0.0001، LPS مقارنة بالمجموعة الضابطة، وLPS + si-NEAT1 مقارنة بـ LPS + si-NC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. تأثير تثبيط NEAT1 على إطلاق السيتوكينات المحفزة للالتهاب والمستحثة بـ LPS في خلايا Caco-2. (A-D) تركيزات (A) TNF-α، و(B) IL-6، و(C) IL-8، و(D) IL-1β في رواشح المزارع الخلوية المقاسة بواسطة تقنية ELISA. يؤدي تثبيط NEAT1 إلى خفض مستويات TNF-α وIL-6 وIL-8 وIL-1β المستحثة بـ LPS. البيانات معروضة كمتوسط ± SD من ست تجارب مستقلة (n = 6 لكل مجموعة). **** P < 0.0001، LPS مقابل المجموعة الضابطة، وLPS + si-NEAT1 مقابل LPS + si-NC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. الارتباط المباشر لـ NEAT1 والاقتران مع miR-29b-3p. (A) التموضع دون الخلوي لـ NEAT1 في خلايا Caco-2 الذي تم تحديده عن طريق تجزئة النواة والسيتوبلازم (U6: تحكم نووي، GAPDH: تحكم سيتوبلازمي). يتواجد NEAT1 بشكل أساسي في السيتوبلازم؛ (B) تسلسلات الارتباط المتوقعة للنوع البري (WT) والنوع الطافر (MUT) لـ NEAT1 مع miR-29b-3p من قاعدة بيانات ENCORI؛ (C) أكد مقايسة DLR علاقة الارتباط بين NEAT1 و miR-29b-3p؛ (D) أكد تحليل RIP علاقة الارتباط بين NEAT1 و miR-29b-3p. البيانات في A و C و D هي المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من ست تجارب مستقلة (n = 6 لكل مجموعة). (E) مستويات تعبير miR-29b-3p في المصل لدى الضوابط الصحية (HC, n = 116) ومرضى IBS-D (n = 116)؛ (F) منحنى ROC لـ miR-29b-3p للتمييز بين مرضى IBS-D والضوابط الصحية؛ (G) تحليل ارتباط بيرسون بين مستويات NEAT1 و miR-29b-3p لدى مرضى IBS-D. ارتبط NEAT1 ارتباطاً عكسياً مع تعبير miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001). البيانات في E هي المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) (n = 116 لكل مجموعة). **** P < 0.0001. الاختصارات: WT = النوع البري؛ MUT = الطافر؛ DLR = مراسل لوسيفيراز المزدوج؛ RIP = الترسيب المناعي لـ RNA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5. تأثيرات تثبيط NEAT1 على وظيفة الحاجز المعوي في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS و miR-29b-3p. (A) يؤدي تثبيط NEAT1 إلى زيادة مستويات miR-29b-3p، بينما يقلل ترانسفكشن مثبطات miR-29b-3p من تعبير miR-29b-3p. (B) قياس حيوية الخلايا بواسطة مقايسة CCK-8. تعزز المستويات المنخفضة من NEAT1 حيوية الخلايا عن طريق زيادة miR-29b-3p؛ (C) تحديد معدل الموت الخلوي المبرمج بواسطة قياس التدفق الخلوي. تقلل المستويات المنخفضة من NEAT1 من معدل الموت الخلوي المبرمج عن طريق زيادة miR-29b-3p؛ (D) تزيد المستويات المنخفضة من NEAT1 من قيمة TEER للخلايا عن طريق رفع مستوى miR-29b-3p؛ (E-G) تعبير mRNA لـ (E) ZO-1، و (F) occludin، و (G) claudin-2. تزيد المستويات المنخفضة من NEAT1 من تعبير ZO-1 و occludin وتقلل من تعبير mRNA لـ claudin-2 عن طريق تعزيز miR-29b-3p. (H) صور تمثيلية للطخة ويسترن تظهر التعبير البروتيني لـ ZO-1 و occludin و claudin-2 و GAPDH تحت ظروف المعالجة المحددة. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD من ست تجارب مستقلة (n = 6 لكل مجموعة). ** P < 0.01؛ *** P < 0.001؛ **** P < 0.0001، LPS مقابل مجموعة التحكم، LPS + si-NEAT1 مقابل LPS + si-NC، LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor مقابل LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. الاختصارات: miR-inhibitor = مثبط miR-29b-3p؛ TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6. تأثيرات تثبيط NEAT1 على الالتهاب في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS وmiR-29b-3p. (A-D) تركيزات (A) TNF-α، و(B) IL-6، و(C) IL-8، و(D) IL-1β في المادة الطافية للمزارع الخلوية مقاسة بواسطة ELISA. تؤدي المستويات المنخفضة من NEAT1 إلى تقليل محتوى TNF-α وIL-6 وIL-8 وIL-1β في المادة الطافية للخلايا عن طريق زيادة miR-29b-3p. البيانات معروضة كمتوسط ± SD من ست تجارب مستقلة (n = 6 لكل مجموعة). **** P < 0.0001، LPS مقابل control، وLPS + si-NEAT1 مقابل LPS + si-NC، وLPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor مقابل LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. الاختصار: miR-inhibitor = مثبط miR-29b-3p. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الجين | تتابع البادئ |
| بادئ NEAT1 | 5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’ |
| عكس NEAT1 | 5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’ |
| بادئ ZO-1 | 5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′ |
| عكس ZO-1 | 5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’ |
| بادئ أوكلودين (Occludin forward) | 5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’ |
| عكس الأوكلودين | 5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’ |
| بادئ كلودين-2 (Claudin-2 forward) | 5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’ |
| عكس كلودين-2 (Claudin-2 reverse) | 5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’ |
| بادئ miR-29b-3p الأمامي | 5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’ |
| النسخة العكسية من miR-29b-3p | 5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’ |
| بادئ GAPDH الأمامي | 5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’ |
| البادئ العكسي لـ GAPDH | 5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’ |
| بادئ U6 | 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ |
| عكس U6 | 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’ |
الجدول 1: تسلسلات البادئات.
| المؤشر | المجموعة الضابطة (N=116) | مجموعة متلازمة القولون العصبي مع الإسهال (N=116) | P |
| العمر، سنة | |||
| < 40 | 63 | 54 | 0.293 |
| ≥ 40 | 53 | 62 | |
| الجنس | |||
| ذكر | 64 | 66 | 0.895 |
| أنثى | 52 | 50 | |
| التدخين | |||
| لا | 58 | 53 | 0.599 |
| نعم | 58 | 63 | |
| شرب الكحول | |||
| لا | 63 | 58 | 0.599 |
| نعم | 53 | 58 | |
| مقياس HADS، الدرجة | |||
| < 8 | 96 | 26 | < 0.0001 |
| ≥ 8 | 20 | 90 | |
| حركات الأمعاء، عدد/يوم | |||
| < 4 | 103 | 51 | < 0.0001 |
| ≥ 4 | 13 | 65 | |
| شكل البراز، مقياس بريستول | |||
| < 5 | 87 | 25 | < 0.0001 |
| ≥ 5 | 29 | 91 | |
| تكرار ألم البطن، عدد الأيام | |||
| < 5 | / | 47 | / |
| ≥ 5 | / | 69 | |
| شدة ألم البطن، الدرجة | |||
| < 5 | / | 44 | / |
| ≥ 5 | / | 72 |
الجدول 2: مقارنة بين الخصائص الديموغرافية والسريرية للمجموعات الضابطة السليمة والمرضى المصابين بمتلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإسهال (IBS-D). القيم موضحة كأعداد المشاركين لكل مجموعة (n = 116/مجموعة). تم تقييم الاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار مربع كاي. الاختصارات: HADS = مقياس القلق والاكتئاب في المستشفى؛ IBS-D = متلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإسهال.
الملف التكميلي 1: البيانات الخام التي تستند إليها الأشكال والجداول. يحتوي هذا الملف على البيانات الرقمية الخام المستخدمة لإنشاء النتائج الكمية الموضحة في الشكل 1، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5، والشكل 6، والبيانات الديموغرافية/السريرية الملخصة في الجدول 2.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: صور لطخة ويسترن غير معدلة. يحتوي هذا الملف على صور لطخة ويسترن غير المعدلة لكل من ZO-1 وoccludin وclaudin-2 وGAPDH والمقابلة للوحة لطخة ويسترن التمثيلية الموضحة في الشكل 5H.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يُعد متلازمة القولون العصبي ذات الغلبة الإسهالية (IBS-D) اضطراباً وظيفياً شائعاً في الجهاز الهضمي، ولم يتم توضيح آليتها المرضية بشكل كامل بعد. وفي السنوات الأخيرة، أظهرت الحموض النووية الريبوزية الطويلة غير المشفرة (lncRNA)، بصفتها جزيئات رئيسية في التنظيم فوق الجيني، إمكانات كبيرة في مجال تشخيص الأمراض وعلاجها. وقد تمت دراسة lncRNA NEAT1 في أمراض متنوعة، مثل سرطان القول والمستقيم24، والدبقيات25، واحتشاء عضلة القلب26. وأظهرت دراسات متعددة أن NEAT1 يشارك في تنظيم الاستجابات الالتهابية13، وتكاثر الخلايا27، وسلامة الحاجز المعوي28. ومع ذلك، فإن التعبير النوعي لـ NEAT1 في حالات IBS-D، وقيمته السريرية، والآليات التنظيمية الكامنة وراء IBS-D لم يتم استكشافها بدقة بعد.
يزداد تعبير NEAT1 في مختلف الحالات الالتهابية، مثل الالتهاب الرئوي29، والفصال العظمي30، والتهاب الأنف31، وإنتان الدم32. وتتوافق نتائجنا مع تلك الواردة في هذه الدراسات: حيث يزداد تعبير NEAT1 بشكل ملحوظ لدى المرضى المصابين بمتلازمة القولون المتهيج المصاحبة للإسهال (IBS-D). وهذا يشير إلى احتمالية ارتباطه بظهور IBS-D. حالياً، يعتمد تشخيص IBS-D بشكل أساسي على معايير روما IV للأعراض، ولا تتوفر مؤشرات حيوية مخبرية موضوعية. ورغم أن هذه المعايير قد أثبتت فعاليتها في الأبحاث وفي العديد من السياقات السريرية، إلا أنها لا تزال تعاني من بعض القصور، بما في ذلك الذاتية، وتداخل الأعراض مع أمراض أخرى، والتأخر في التشخيص. ويشير تحليل منحنى ROC الإضافي إلى أن NEAT1 يمتلك قيمة تشخيصية جيدة نسبياً لدى المرضى المصابين بـ IBS-D. حيث تميزت مستويات تعبير NEAT1 في المصل بفعالية بين مرضى IBS-D والمجموعات الضابطة السليمة، مع وصول قيمة AUC إلى 0.867 وحساسية ونوعية عاليتين. وهذا يشير إلى أن NEAT1 يمثل أداة واعدة لاستكمال معايير روما IV في التشخيص أو كعلامة تشخيصية جديدة لـ IBS-D. فعلى سبيل المثال، يمكن تقييم المرضى الذين يعانون من آلام بطنية مزمنة وتغيرات في عادات التبرز والذين لديهم مستويات مرتفعة من NEAT1 بثقة أكبر عند النظر في نتائج المؤشرات الحيوية جنباً إلى جنب مع معايير روما IV. وهذا يسهل البدء المبكر في العلاج الموجه للأعراض ويتجنب الفحوصات الغازية غير الضرورية. وبالعكس، بالنسبة للمرضى الذين تظهر نتائج مؤشراتهم الحيوية طبيعية ولكنهم يستوفون معايير روما IV، فإن المراقبة الدقيقة تكون مبررة لاستبعاد الأمراض العضوية الأخرى. لذا، من المتوقع أن يؤدي دمج هذه المؤشرات الحيوية في الممارسة السريرية إلى تحسين دقة وكفاءة التشخيص، وإن كان ذلك لا يزال يتطلب التحقق الاستشرافي في السياقات السريرية.
قد ترتبط الأعراض السريرية التي يعاني منها مرضى متلازمة القولون العصبي مع الإسهال (IBS-D) بضعف وظيفة الحاجز المعوي33. وتتم هذه الوظيفة بشكل أساسي عبر بنية الموصلات المحكمة (TJ) الموجودة بين الخلايا الظهارية المعوية، حيث تلعب بروتينات ZO-1 والأوكلودين (occludin) أدواراً مهمة34,35. يشارك ZO-1 في الحفاظ على الحاجز الميكانيكي ونفاذية الظهارة المخاطية36، بينما يكون الأوكلودين مسؤولاً بشكل أساسي عن تكوين الموصلات المحكمة بين الخلايا، وهي ضرورية للحفاظ على وظيفة الحاجز37. ويلعب بروتين الموصلات المحكمة كلاودين-2 (claudin-2) دوراً هاماً في تكوين قنوات المسام الجانبية للخلايا، من بين وظائف أخرى38. وفي مرضى IBS-D، ينخفض مستوى ZO-1 والأوكلودين عادةً، بينما يزداد كلاودين-2، مما يؤدي إلى تضرر الحاجز المعوي وزيادة النفاذية. وقد وجدت هذه الدراسة أن إسكات جين NEAT1 أدى إلى زيادة المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) في نموذج الخلايا in vitro، مما يدعم وجود تأثير ضار لـ NEAT1 على الحاجز المعوي في هذا النموذج. وعلى المستوى الجزيئي، أدى تثبيط تعبير NEAT1 إلى ارتداد ملحوظ في مستويات تعبير mRNA لبروتينات الموصلات المحكمة الرئيسية ZO-1 والأوكلودين، بينما انخفض تعبير كلاودين-2. يشير هذا إلى أن NEAT1 قد ينظم بشكل سلبي تعبير بروتينات الموصلات المحكمة، مما يؤدي إلى تعطيل الحاجز الفيزيائي للظهارة المعوية وزيادة نفاذيتها. وفي نهاية المطاف، يمكن أن يؤدي ذلك إلى ظاهرة "الأمعاء المتسربة". بالإضافة إلى ذلك، فإن الالتهاب منخفض الدرجة المنتشر في IBS-D يعد عاملاً مهماً يفاقم تلف الحاجز39. وقد أكدت دراسات عديدة أن الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) يمكن أن يعمل كعقد تنظيمية رئيسية في مسارات إشارات الالتهاب40. وتتوافق أبحاثنا مع ذلك؛ حيث أدى إسكات NEAT1 إلى تقليل إفراز السيتوكينات المحفزة للالتهاب TNF-α وIL-6 وIL-8 وIL-1β التي يحفزها LPS بشكل ملحوظ. وهذا يشبه إلى حد كبير دور NEAT1 كـ lncRNA محفز للالتهاب في نماذج التهابية أخرى، مما يشير إلى أنه في حالات IBS-D، قد تكون هناك حلقة مفرغة من الالتهاب وتلف الحاجز والالتهاب، يلعب فيها NEAT1 دوراً هاماً.
تُعد جزيئات الـ MicroRNAs (miRNAs) فئة أخرى هامة من العوامل المشاركة في تنظيم الأمراض. ويُعبر عن miR-29b-3p بمستويات منخفضة في مختلف الاستجابات الالتهابية الخلوية الناتجة عن LPS41,42. وتماشياً مع معظم الدراسات، وجدنا أن مستويات miR-29b-3p كانت منخفضة بشكل ملحوظ في مصل مرضى IBS-D وأظهرت ارتباطاً سلبياً قوياً مع زيادة تعبير NEAT1. كما أثبتنا كذلك أن NEAT1 يرتبط مباشرة بـ miR-29b-3p ويعمل كإسفنجه لامتصاصه في السيتوبلازم في هذا النموذج. وأظهرت تجربة الإنقاذ الوظيفي أن NEAT1 يؤثر على حيوية وموت الخلايا المبرمج في خلايا Caco-2، وكذلك على مستويات mRNA لكل من ZO-1, occludin, and claudin-2، وذلك جزئياً على الأقل من خلال miR-29b-3p، مما يؤثر في النهاية على سلامة الحاجز المعوي. ومن الملاحظ أن بياناتنا تشير إلى أنه في سياق خلل وظيفة الحاجز المعوي المرتبط بـ IBS، ترتبط مستويات miR-29b-3p إيجابياً بمستويات ZO-1 وoccludin. وقد يكون هذا التنظيم الإيجابي غير مباشر؛ فعلى سبيل المثال، قد يقوم miR-29b-3p بتثبيط نسخ بروتينات الموصلات المحكمة عن طريق استهداف الكابتات النسخية الخاصة بها، مما يؤدي إلى رفع الكبت وتعزيز تعبير ZO-1 وoccludin. وهذه الفرضية مدعومة أيضاً بدراسات سابقة، أفادت بأن miR-29b-3p يلعب دوراً وقائياً في الحالات الالتهابية من خلال استهداف المنظمات السلبية لوظيفة الحاجز42.
ومع ذلك، فإن الجينات المستهدفة التي ينظم miR-29b-3p من خلالها تعبير mRNA لبروتيني ZO-1 وoccludin تتطلب مزيداً من الاستقصاء لاستكمال شبكة ceRNA، وهو ما يمثل أحد قصور دراستنا الحالية. بالإضافة إلى ذلك، تعاني دراستنا من قيود أخرى: أولاً، كانت هذه دراسة أحادية المركز مع حجم عينة صغير نسبياً (شملت 116 مريضاً فقط بمتلازمة القولون العصبي من النمط الإسهالي IBS-D). ولا تزال القيمة التشخيصية السريرية لـ NEAT1 بحاجة إلى مزيد من التحقق من خلال دراسات أتراب استباقية واسعة النطاق ومتعددة المراكز. ثانياً، تعتمد هذه الدراسة بشكل أساسي على تحليل الارتباط السريري ونماذج الخلايا في المختبر. وفي المستقبل، ستكون هناك حاجة إلى نماذج حيوانية للتحقق من دور هذا المحور في الجسم الحي. ثالثاً، لم يتم بعد توضيح شبكة الجينات المستهدفة المحددة لـ miR-29b-3p المشاركة في إمراضية IBS-D بشكل كامل. يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على: (1) التحقق من القيمة التشخيصية لـ NEAT1 و miR-29b-3p في المرضى الذين يعانون من IBS-C و IBS-M؛ (2) اختبار الفعالية العلاجية للتدخلات التي تستهدف NEAT1 في النماذج الحيوانية؛ و(3) توضيح الآلية الجزيئية الدقيقة التي ينظم بها miR-29b-3p بروتينات الوصلات المحكمة. ومن شأن هذه الجهود أن تسهل الترجمة السريرية لنتائجنا.
وفي الختام، يتم التعبير عن NEAT1 بشكل عالٍ لدى المرضى الذين يعانون من متلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإسهال (IBS-D)، وله قيمة تشخيصية جيدة في هذه المجموعة من المرضى. يمكن أن تؤدي المستويات المنخفضة من NEAT1 إلى تعزيز حيوية الخلايا، وتقليل موت الخلايا المبرمج، وتخفيف تلف الحاجز المعوي، وتثبيط الاستجابات الالتهابية عن طريق زيادة مستويات miR-29b-3p في خلايا Caco-2 المعالجة بـ LPS. ويوفر محور NEAT1/miR-29b-3p منظوراً جديداً حول الآليات الفسيولوجية المرضية المعقدة لـ IBS-D. قد يعمل NEAT1 كعلامة بيولوجية تشخيصية محتملة لـ IBS-D، وقد يمثل محور NEAT1/miR-29b-3p هدفاً علاجياً محتملاً لهذه الحالة.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق 24 عينًا | Corning | CLS3524 | لاستزراع الخلايا |
| أطباق 96 عينًا | Corning | CLS3599 | لاستزراع الخلايا في مقايسات CCK-8 |
| طقم Annexin V-FITC/PI للكشف عن الموت الخلوي المبرمج | Invitrogen | V13242 | للكشف عن معدلات الموت الخلوي المبرمج |
| جسم مضاد أحادي النسيلة لـ Anti-AGO2 | Proteintech | 67934-1-Ig | للترسيب المناعي لمعقدات RNA المرتبطة بـ Ago2 |
| جسم مضاد لـ Anti-Claudin-2 | Invitrogen | 32-5600 | جسم مضاد أولي، تخفيف 1:1000 |
| جسم مضاد لـ Anti-GAPDH | Cell Signaling Technology | 5174 | جسم مضاد أولي، تخفيف 1:5000؛ ضابط تحميل |
| جسم مضاد لـ Anti-Human IgG | Proteintech | 10284-1-AP | يُستخدم كضابط سلبي لمقايسة RIP |
| جسم مضاد لـ Anti-Occludin | Abcam | ab31721 | جسم مضاد أولي، تخفيف 1:500 |
| جسم مضاد لـ Anti-ZO-1 | Proteintech | 21773-1-AP | جسم مضاد أولي، تخفيف 1:1000 |
| خلايا Caco-2 | SUNNCELL | SNL-068 | لبناء نماذج الحاجز الظهاري المعوي |
| طقم CCK-8 | Solarbio | CA1210 | طقم مقايسة تكاثر الخلايا |
| كلوروفورم | Sigma-Aldrich | C2432 | لفصل الأطوار في استخلاص RNA |
| وسط DMEM | Gibco | 11965092 | لاستزراع الخلايا |
| طقم مقايسة لوسيفرين المزدوج (Dual-Luciferase Reporter Assay Kit) | ThermoFisher | 16186 | للكشف عن نشاط اللوسيفرين |
| طقم ELISA (لـ IL-1β) | R&D Systems | DY201 | للكشف عن البروتينات المستهدفة في طافات المزارع الخلوية |
| طقم ELISA (لـ IL-6) | R&D Systems | D6050B | للكشف عن البروتينات المستهدفة في طافات المزارع الخلوية |
| طقم ELISA (لـ IL-8) | R&D Systems | NBP3-28022 | للكشف عن البروتينات المستهدفة في طافات المزارع الخلوية |
| طقم ELISA (لـ TNF-α) | R&D Systems | DTA00D | للكشف عن البروتينات المستهدفة في طافات المزارع الخلوية |
| ركيزة التألق الكيميائي المعزز (ECL) | Thermo Fisher | 32106 | لتصور حزم البروتين |
| إيثانول (75%) | Sigma-Aldrich | 459844 | لغسل كتلة RNA المترسبة |
| مصل جنين البقر (FBS) | Gibco | 10099141 | لاستزراع الخلايا |
| جهاز قياس التدفق الخلوي (Flow cytometer) | Beckman Coulter | B53002 | للكشف عن معدلات الموت الخلوي المبرمج |
| أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ HRP | Cell Signaling Technology | 7074 | تحفيز توليد إشارة تألق كيميائي من ركائز ECL |
| إيزوبروبانول | Sigma-Aldrich | 1133502500 | لترسيب RNA |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | كاشف تعداء |
| عديد السكاريد الشحمي (LPS) | Sigma-Aldrich | L2880 | لتحفيز بناء النموذج الخلوي |
| قارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader) | BioTek | Epoch 2 | لقياس امتصاص العينات في أطباق 96 عينًا |
| جهاز Nanodrop لقياس الطيف الضوئي الدقيق | Thermo Scientific | ND-2000C | لتحديد تركيز ونقاء RNA |
| حليب مجفف خالي الدسم | Coolaber | CN7861 | لحجب الأغشية (محلول بتركيز 5%) |
| طقم PARIS | Thermo Fisher | AM1921 | للفصل بين المكونات النووية والسيتوبلازمية |
| بنسلين–ستربتوميسين | Gibco | 15140122 | لمقاومة التلوث أثناء نمو الخلايا |
| طقم Pierce BCA لتقدير البروتين | Thermo Fisher | 23225 | لتحديد تركيزات البروتين |
| ناقل pmirGLO Dual-Luciferase | Promega | E1330 | ناقل جين مراسل للوسيفرين المزدوج |
| طقم PrimeScript RT | Takara | RR047A | لعملية النسخ العكسي لـ RNA إلى cDNA |
| غشاء PVDF | Millipore | IPVH00010 | لنقل البروتين بعد الفصل الكهربائي (SDS-PAGE) |
| جهاز PCR كمي بفلورة في الوقت الحقيقي | Applied Biosystems | 4365464 | للكشف عن الجينات المستهدفة |
| محلول RIPA للتحلل (مع مثبطات البروتياز) | Thermo Fisher | 89901 | لاستخلاص البروتين الكلي من الخلايا |
| طقم الترسيب المناعي للبروتينات المرتبطة بـ RNA | Sigma-Aldrich | 17-701 | مقايسة الترسيب المناعي للبروتينات المرتبطة بـ RNA (RIP) باستخدام خرزات مغناطيسية Protein A/G |
| كواشف SDS-PAGE (هلام بتركيز 10%) | TargetMol | C0189 | لفصل البروتينات حسب الوزن الجزيئي |
| مزيج SYBR Green الرئيسي | Thermo Fisher | 4309155 | للاستخدام في اختبار PCR |
| مقياس TEER (مقياس فولت-أوم) | Millipore | MERS00002 | مقياس المقاومة عبر الغشاء، لقياس سلامة الطبقة الواحدة |
| غرف Transwell | Corning Costar | CLS3413 | لاستزراع الطبقات الخلوية الأحادية وقياس TEER |
| كاشف TRIzol | Invitrogen | 15596026CN | لاستخلاص RNA الكلي |
المراجع
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
- Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
- Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
- Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
- Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
- Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
- Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
- Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
- Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
- Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
- Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
- Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
- Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
- Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
- Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
- Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
- Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
- Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
- Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
- Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
- Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
- Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
- Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
- Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
- Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
- Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
- Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
- Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
- Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
- Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
- Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
- Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
- Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
- Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
- Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
- Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
- Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
- Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
- Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
- Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
- Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
- Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن