Method Article

نظام ميكروفلويديك لنمذجة خلل البطانة تحت إجهاد القص النابض الفسيولوجي وارتفاع السكر التذبذب

DOI:

10.3791/71037

⸱

May 12th, 2026

 ,  ,  , 
1Institute of Cardio-Cerebrovascular Medicine, Central Hospital of Dalian University of Technology, 2School of Mechanical Engineering, Dalian University of Technology, 3School of Biomedical Engineering, Faculty of Medicine, Dalian University of Technology, 4Key Laboratory of Integrated Circuit and Biomedical Electronic System, Dalian University of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا لتصنيع وتشغيل نظام ميكروفلويديك يعرض خلايا البطانة البطانية لارتفاع سكر الدم المتذبذب المتزامن وإجهاد القص النابض. يوفر هذا النهج نموذجا فسيولوجيا ذو صلة في المختبر لدراسة خلل بطانة البطانة السكري. يتيح هذا البروتوكول القياس الكمي للإجهاد التأكسدي واستجابات الخلايا البطانية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلل البطانة في مضاعفات الأوعية الدموية السكري يتضمن تفاعلات معقدة بين اضطرابات الأيض، وبشكل خاص الجلوكوز التذبذب (OG) والإجهاد القصي النابض (PSS). على الرغم من دراسة هذه العوامل بشكل منفصل، لا تزال النماذج التقليدية محدودة بارتفاع الجلوكوز الثابت أو التدفق الطبقي المبسط، تفتقر إلى القدرة على محاكاة الترابط الزماني الداخلي المتكامل الموجود في الأوعية الدموية السكرية. من خلال استخدام منصة ميكروفلويدية قابلة للبرمجة، يوفر هذا البروتوكول منصة قيمة للتحقيق في التأثيرات المتكاملة لارتفاع سكر الدم المتذبذب المتزامن وPSS الفسيولوجي على خلايا البطانة. يهدف هذا البروتوكول إلى نمذجة خلل البطانة تحت ظروف الأيض والميكانيكية المترابطة ذات صلة فسيولوجيا. يسمح استخدام شريحة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) مع نظام تحكم مدفوع بالضغط بتعديل دقيق ومستقل لموجات التدفق وملفات تركيز الجلوكوز. يتم التحقق من دقة النظام الديناميكية الدموية بواسطة قياس سرعة صورة الجسيمات الدقيقة (Micro-PIV)، بينما يتم تمييز الاستجابة الخلوية كميا من خلال مراقبة مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) وحيوية الجسم. تظهر النتائج الممثلة أن PSS الفسيولوجي يخفف بشكل فعال من الإصابة التأكسدية الناتجة عن الأكسدة النباتية. يظهر هذا التأثير من خلال انخفاض مستويات ROS داخل الخلية وتحسين قدرة الخلايا على البقاء تحت ظروف التحفيز المركبة. اعتمادا على سؤال البحث، يمكن تعديل معلمات مثل أنماط إجهاد القص، وترددات تذبذب الجلوكوز، وهندسة القنوات. تعد هذه الطريقة أداة متعددة الاستخدامات للدراسات الميكانيكية للمسارات الميكانيكانوبيولوجية وفحص الأدوية للتدخلات العلاجية في أمراض الأوعية الدموية السكري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد خلل البطانة حدثا مبكرا حرجا في تطور مضاعفات الأوعية الدموية السكرية، مدفوعا بكل من الاضطرابات الأيضية والقوى الديناميكية الدموية غير الطبيعية 1,2. مستويات OG، وليس فرط سكر الدم المستمر فقط، تعرف بشكل متزايد كمحفزات قوية للإجهاد التأكسدي والإشارات الالتهابية في الخلايا البطانية، مما يؤدي إلى إصابة الأوعية الدموية وضعف التوازنالداخلي 3,4,5. في الوقت نفسه، يعد إجهاد القص الديناميكي الدموي عاملا رئيسيا محددا للنمط الظاهري للبطانة، حيث يعزز PSS تحت ظروف التمرين الفسيولوجية إنتاج أكسيد النيتريك، والدفاع ضد مضادات الأكسدة، وحماية الأوعية الدموية 6,7,8. لذلك، فإن فهم التأثيرات المتكاملة لفرط سكر الدم التذبذبذي والتحفيز الديناميكي للدم أمر ضروري لتوضيح آليات خلل البطانة.

النماذج التقليدية في المختبر، التي غالبا ما تعتمد على ظروف عالية الجلوكوز الثابتة أو التدفق الطبقي المبسط، تفشل في تكرار التفاعل المعقد والديناميكي بين الإشارات الأيضية والميكانيكية الموجودة في الجسم الحي 9,10,11. بينما تلتقط نماذج الحيوانات الجوانب الجهازية لمرض السكري، إلا أنها تفتقر إلى الدقة على مستوى الخلية اللازمة لتحليل الإشارات تحت ظروف بيئية دقيقةمضبوطة 12. تقدم تقنية الميكروفلويدية بديلا فعالا، حيث توفر تحكما دقيقا في المكان-زمان للمحفزات الكيميائية الحيوية والميكانيكية الحيوية في الهندسات الفسيولوجية ذات الصلة13، وقد أدت إلى تقدمات حديثة مهمة في تطبيقات طبية حيوية مبتكرةمتنوعة 14،15. على سبيل المثال، صمم تشين وآخرون جهازا ميكروفلويديا يحتوي على إجهاد القص المكاني والزماني للجدار وإشارات ATP لدراسة ديناميكيات Ca2+ داخل الخلايا البطانية. طور يو وآخرون نظام شريحة ميكروفلويدية هيموديناميكية لاكتشاف الاستجابات الخلوية تحت تركيبات مختلفة من PSS الفسيولوجي وتركيزات الجلوكوز العالية. على الرغم من استخدام هذه الأنظمة لدراسة استجابات البطانة لضغط القص أو الاضطرابات الأيضية ذات العامل الواحد، إلا أن القليل منها نجح في دمج كل من اهتزازات الجلوكوز وPSS داخل نظام واحد. لذلك، لا يزال هناك بروتوكول موحد وقابل للتكرار يزامن بين العاملين في بيئة ميكروفلويدية محكمة السيطرة مفقودا.

تعالج هذه الطريقة هذه الفجوة من خلال إنشاء نظام ميكروفلويديك قابل للتكرار قادر على توصيل OG وPSS المرتبطين. الهدف الأساسي من هذا النهج هو نمذجة الإجهاد التأكسدي، وضعف بقاء الخلايا، والاستجابات الميكانيكانوبيولوجية التي تكمن وراء خلل البطانة الداخلي بطريقة ذات صلة فسيولوجيا. على عكس الزراعة الثابتة أو غرف التروية التقليدية، يحسن هذا النهج النماذج الحالية من خلال تمكين التعديل المتزامن والمتحكم فيه لكل من المنبهات الأيضية والميكانيكية، مما يقترب بشكل أقرب من البيئة الوعائية الدقيقة للسكري. علاوة على ذلك، يتوافق النظام مع تصوير الخلايا الحية، والمراقبة الفورية، والتحليل الجزيئي، مما يجعله مناسبا لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك الدراسات الميكانيكية، ونمذجة الأمراض، وفحص الأدوية لوظائف البطانة الداخلية والإصابات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاقيات:

ملاحظة: جميع الكواشف والأجهزة والبرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. تصنيع رقائق الميكروفلويدية

  1. استخدم برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD) لتصميم بنية شريحة الميكروفلويديك (عرض × طول × H = 2 مم × 30 مم × 0.1 مم، الشكل 1A) وصنع قالب SU-8 الرئيسي من خلال شركة تجارية.
  2. اخلط عامل المعالجة PDMS مع البوليمر المسبق بنسبة 10:1 حسب الوزن في كوب خلط نظيف وحركه يدويا بقوة لمدة 5 دقائق.
  3. ضع الحاوية في غرفة تفريغ تحت -0.08 ميغاباسكال لمدة لا تقل عن 15 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء المحبوسة أثناء عملية الخلط.
    ملاحظة: لتسريع إزالة الفقاعات ومنع الفيضان، قم بتهوية الغرفة مؤقتا إلى ضغط جوي لتفجير الفقاعات الكبيرة، ثم أعد تطبيق الفراغ فورا. كرر دورة التهوية هذه 2–3 مرات حتى يصبح الخليط السائل شفافا تماما وخاليا من الفقاعات الماكروسكوبية.
  4. اسكب PDMS على الويفر الموضوع في طبق بتري زجاجي.
  5. قم بإزالة الغازات، وصب PDMS على الويفر في مجفف لمدة 15 دقيقة إضافية لإزالة أي فقاعات قد تكون تكونت أثناء الصب.
    ملاحظة: إذا بقيت أي فقاعات دقيقة عنيدة محبوسة بالقرب أو داخل هياكل القالب الرئيسي لطائرة SU-8، قم بنفخها بلطف إلى الحافة أو انفجرها باستخدام منفاخ هواء مطاطي يدوي. الإزالة الكاملة لفقاعات الهواء أمر بالغ الأهمية لمنع العيوب الهيكلية في القنوات الدقيقة.
  6. ضع طبق البتري الذي يحتوي على العفن والبوليمر في فرن ساخن مضبوطا على 80 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    تحذير: استخدم قفازات مقاومة للحرارة عند التعامل مع المواد الساخنة
  7. قم بتقشير لوح البوليمر المتصلب من القالب الرئيسي باستخدام مشرط.
  8. استخدم أداة تثقيب النواة (مثل قطر 1.2 مم) لإنشاء منافذ دخول ومخرج عند نهايات القناة المخصصة على لوح البوليمر.
  9. نظف غطاء الزجاج والوجه المزخرف للبلاطة البوليمرية بشريط لاصق.
    نقطة توقف: يمكن تخزين ألواح PDMS المعالجة والمثقبة في حاوية نظيفة (مثل طبق بتري مغلق) في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع قبل معالجة البلازما والارتباط.
  10. عالج كل من لوح البوليمر وغطاء الزجاج بمنظف بلازما بقوة 65 واط تحت هواء الغرفة لمدة 60 ثانية.
  11. قم فورا بمحاذاة وجه قناة البوليمر مع الجانب المعالج من غطاء الزجاج.
  12. اضغط بلطف لتكوين قناة ميكروفلويدية دائمة ومغلقة.

2. تحضير وزرع الخلايا البطانية

  1. ضع شريحة الميكروفلويديك الملتصقة في زجاجة زجاجية مثقلة بالبورون مملوءة بماء منزوع الأيونات وقم بتعقيمه عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية و15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: اغمر الشريحة في الماء أثناء الأوتوكلاف لتسوية الضغط ومنع تشوه قنوات PDMS الدقيقة. يساعد ذلك أيضا في إزالة فقاعات الهواء المحبوسة ويهيئ القنوات لإدخال السائل لاحقا.
    نقطة توقف: يمكن تخزين رقائق الميكروفلويديك المعقمة بأمان في زجاجة زجاجية محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عدة أسابيع حتى تصبح ضرورية لزراعة الخلايا.
  2. ضع الشريحة المعقمة في طبق زراعة بحجم 60 مم مملوء بخليط بنسبة 1:1 من محلول محلول الفوسفات (PBS) ومتوسط النسر المعدل منخفض الجلوكوز من دولبيكو (DMEM).
  3. إدخال 100 ميكروغرام·مل-1 فيبرونكتين في القناة باستخدام حقنة بسعة 1 مل، وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    ملاحظة: تأكد من وضع شريحة الميكروفلويديك تحت مستوى السائل. وصل خرطوم المحول بإبرة الحقنة، املأ الخرطوم بالسائل وأدخله تحت مستوى السائل، وصل المدخل ثم حقن لضمان عدم دخول فقاعات.
  4. أضف 24.5 ملليمول D-مانيتول إلى DMEM منخفض الجلوكوز (5.5 ملليمول) لرفع الضغط الأسموزي. أضف 5 ملليموتر D-glucose إلى DMEM عالي الجلوكوز (25 ملليمولار) إلى 30 ملليمولار نهائيا. اجعل وسط زراعة الجلوكوز الطبيعي (NG) ووسط زراعة عالي الجلوكوز (HG) مع مكمل بنسبة 20٪ مصل البقر الجيني (FBS)، و1٪ بنسلين/ستربتوميسين (P/S) على التوالي.
  5. دافئة 1× PBS، التربسين، التغذية الطبيعية، ومواد الهيدروليكيت في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. احصد خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs) من طبق الزراعة عند 90٪ من التقاء الجسم. افصل الخلايا باستخدام محلول تريبسين-إيدتا بنسبة 0.25٪ وحضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. عد الخلايا المستخرجة وضبط التركيز إلى 1 × 106 خلايا/مل في وسط الغاز الطبيعي ووسط الهيدروليمتر على التوالي.
  6. حقن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في منفذ السحب لشريحة ميكروفلويدية باستخدام حقنة بسعة 1 مل، باستخدام وسط الغاز الطبيعي للمجموعة الضابطة ووسط HG للمجموعة التجريبية. ضع شرائح الميكروفلويديك في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: دع الخلايا تلتصق لمدة لا تقل عن 4 ساعات قبل المعالجة الإضافية. تناوب يدويا بين وسطي الزراعة كل ساعتين لتحفيز ارتفاع سكر الدم التذبذبذي أثناء مرحلة الزراعة الثابتة. حافظ على نسبة جلوكوز الخلايا عند 5.5 ملليمولار طوال الليل لمحاكاة الحالة الحية (الشكل 1B).

3. إعداد التحفيز الديناميكي

  1. ملء خزانين بسعة 100 مل بوسائط زراعة الغاز الطبيعي وزيت الهيدروليجين، على التوالي، وربطهما بالقنوات المقابلة لنظام التحكم في الضغط القابل للبرمجة.
  2. اربط المكامن والصمام المغناطيسي ذو الوضعين الثلاثي الاتجاه، والشريحة الميكروفلويدية باستخدام أنابيب السيليكون.
  3. استخدم موصلات الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 1.3 مم بزاوية 90° لتثبيت منافذ المدخل والمخرج في شريحة PDMS بالأنبوب.
    ملاحظة: قم بتعقيم خزانات 100 مل، وأنابيب السيليكون، والموصلات المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في جهاز معقم عالي الضغط ودرجة حرارة عالية مسبقا.
  4. احسب معدل التدفق (Q) المطلوب لتحقيق PSS المستهدف (τ). استخدم الصيغة τ = (6μQ)/(wh2)، حيث μ اللزوجة، w هو عرض القناة، و h هو ارتفاع القناة.
  5. حدد معدل تدفق فسيولوجي مستهدف (τ = 10 ± 2 دين·سم-2، 1 هرتز)، والذي يعادل معدل تدفق محسوب يبلغ 200 ± 40 ميكرولتر·دقيقة 1.
  6. برمج مضخة الهواء القابلة للبرمجة لتوليد دالة موجة جيبية للحفاظ على PSS. برمج وحدة التحكم في الصمامات لتبديل القنوات كل 5 دقائق لتوليد تذبذب جلوكوز بموجة مربعة أثناء التحفيز الديناميكي.
  7. شغل نظام المضخة القابل للبرمجة لتوصيل ال OG وPSS المدمجين لمدة 30 دقيقة إجمالا.

4. Micro-PIV للتحقق من حقل التدفق

  1. جهز وسط الغاز الطبيعي والهيدروليكيت الذي يحتوي على تركيز حجمي 0.05٪ من الجسيمات الفلورية الدقيقة (1 ميكرومتر). تأكد من أن الجزيئات متوزعة بشكل متساو وخالية من التجمع.
  2. ضع شريحة ميكروفلويدية نظيفة وخالية من الخلايا (مطابقة للشريحة المستخدمة في تجارب الخلية) على مرحلة المجهر الفلوري المقلوب.
  3. ربط جميع المكونات في النظام (الشكل 1C).
    1. وصل مصدر الضغط بوحدة التحكم في الضغط.
    2. قم بتوصيل وحدة التحكم في الضغط بوحدة تحكم الصمامات، والتي ترتبط بالحاسوب للتحكم الآلي في موجات الضغط.
    3. قم بتوصيل مخارج التحكم في الضغط بخزانات HG وNG عبر خطوط أنابيب منفصلة.
    4. وصل كلا الخزانين بصمام الضغط 3/2، الذي ينتقل بين وسائط HG وNG وفقا لبروتوكول الجلوكوز التذبذبذي المبرمج.
    5. وصل مخرج صمام الضغط 3/2 إلى مدخل شريحة الميكروفلويديك عبر الأنابيب.
    6. وصل مخرج شريحة الميكروفلويديك بخزان النفايات.
    7. ضع شريحة الميكروفلويديك على منصة المجهر لتصوير الخلايا الحية طوال فترة التجربة.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع وصلات الأنابيب آمنة وخالية من التسربات قبل بدء التدفق.
  4. شغل الكاميرا عالية السرعة (التي تعمل على 15 هرتز في وضع الإطار المزدوج) بعد أن يكون التدفق ثابتا لالتقاط أزواج الصور المتسلسلة للجسيمات الدقيقة المتدفقة. اضبط التأخير الزمني الدقيق (Δt) بين إطاري كل زوج إلى 80 ميكروثانية.
  5. التقط الصور لمنطقة الاهتمام (ROI) داخل القناة. اختر عائد الاستثمار في مركز قسم القناة المستقيمة (الشكل 2A)، على مسافة متساوية من كل من المدخل والمخرج، لتجنب التأثيرات النهائية وضمان قياسات تدفق تمثيلية.
  6. معالجة أزواج الصور المكتسبة باستخدام برنامج تحليل PIV. استخدم خوارزمية تكيفية متعددة التمريرات للارتباط المتقاطع، بدءا من مساحة استجواب أولية تبلغ 64 × 64 بكسل ثم تحسن إلى مساحة نهائية 16 × 16 بكسل مع حجم خطوة شبكة 8 × 8 بكسل، لتحديد متجه الإزاحة (Δx) للجسيمات بين الإطارين.
  7. احسب متجه السرعة (v) لكل منطقة استجواب باستخدام الصيغة v = Δx / Δt.

5. جمع البيانات

ملاحظة: قم بقياس مدى بقاء ووظيفة الخلية باستخدام مجموعة كالسيين-AM/يوديد البروبيديوم (PI) ومسبار فلوري إجهاد التأكسدي للخلايا الحية للتحقق من الضرر الناتج عن تقلبات الجلوكوز وتقييم تأثير التحفيز المشترك.

  1. قابلية الخلايا للبقاء
    1. جهز حل العمل Calcein-AM/PI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في نقطة التجربة النهائية.
      تحذير: PI هو مادة معروفة بالطفرات ومشتبه بها بأنها مسرطنة تداخل في الحمض النووي. تعامل معها بحذر شديد. ارتد قفازات ومقبض داخل مكان عمل آمن مخصص.
    2. قم بغسل القناة مرة واحدة باستخدام PBS وأدخل حل Calcein-AM/PI العامل في القناة. حضن الجهاز عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 30 دقيقة في الظلام.
    3. التقط فورا صورا فلورية للخلايا الملونة باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بعدسة موضوعية بحجم 10×. استخدم فلتر FITC (الأخضر) ل Calcein-AM ومرشح TRITC أو Rhodamine (الأحمر) ل PI.
  2. قياس ROS داخل الخلية
    1. جهز محلول العمل لجهاز الفلورسنت التأكسدي الحي (انظر جدول المواد) عند التركيز الذي حدده المصنع (5 ميكرومتر) في PBS.
      تحذير: يمكن أن تكون المجسات الفلورية والمذيبات الشائعة فيها (مثل DMSO) سامة وقد تسهل امتصاص المواد الخطرة عبر الجلد. ارتد قفازات ومقبض داخل مكان عمل آمن مخصص.
    2. قم بغسل القناة ثلاث مرات ب PBS وإدخال محلول المجس الفلوري التأكسدي للخلايا الحية إلى القناة. حضن الشريحة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    3. قم بغسل القناة ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة المجس غير المرتبط. التقط فورا الصور الفلورية باستخدام مجموعة مرشح فار ريد (الإثارة 640 نانومتر، الانبعاث 665 نانومتر) عبر عدسة موضوعية 20×، مع الحفاظ على نفس معايير التعريض لجميع المجموعات.
      ملاحظة: تشير شدة الفلورة المتزايدة إلى مستويات أعلى من ROS.

6. تحليل البيانات

نقطة التوقف: بمجرد التقاط جميع الصور الفلورية الخام وصور الكاميرا عالية السرعة وحفظها بأمان على قرص صلب، يمكن إيقاف معالجة الصور، والتحليل الكمي، والمقارنات الإحصائية اللاحقة وإجراء الاختبارات في أي وقت لاحق.

  1. قم بقياس قابلية بقاء الخلايا
    1. افتح الصور المكتسبة Calcein-AM (خضراء) وPI (حمراء) في ImageJ (انظر جدول المواد). قم بضبط العتبة يدويا لكل قناة لتمييز إشارات الفلورسنت عن الخلفية. استخدم وظيفة عداد الخلية لعد الخلايا الفلورية، مع تعديل الحد الأدنى لحجم الخلية حسب حجم الخلية المرصود، وعد عدد الخلايا الحية (Nحية) والميتة (Nميتة) في عدة مجالات رؤية.
      ملاحظة: NLive يشير إلى عدد الخلايا الخضراء الإيجابية ل Calcein-AM، وNDead يشير إلى عدد الخلايا الحمراء الإيجابية PI.
    2. احسب نسبة الخلايا الحية (Nحية / (Nحية + Nميتة) × 100٪) لكل حالة تجريبية باستخدام برامج جداول البيانات. احسب المتوسط والانحراف المعياري عبر عدة مجالات رؤية باستخدام برامج التحليل الإحصائي للمقارنة بين المجموعات.
  2. قم بقياس ROS داخل الخلايا
    1. سحب الصورة التي تختارها في ImageJ. حدد المقياس عن طريق معايرة حجم البكسل باستخدام بيانات المجهر الوصفية (أو شبكة مرجعية معروفة): تحليل | حدد المقياس.
    2. إزالة إشارة خلفية غير محددة موحدة من الصورة بأكملها باستخدام دالة طرح الخلفية: العملية | اطرح الخلفية.
    3. قم بضبط شريط العتبة يدويا لتقسيم وتعريف إشارة ROS داخل الخلية: صورة | تعديل | عتبة. بمجرد تحديد العتبة، استخدم Analysis | اضبط القياسات لاختيار المساحة والقيمة الرمادية المتوسطة. حدد الحد الأدنى لحجم الخلية وفقا لحجم الخلية المرصود وقس متوسط شدة الإشارة المجزأة داخل العائد على الاستثمار الأحادي الطبقة في الخلية: تحليل | تحليل الجسيمات.
    4. أبلغ عن مستوى ROS لكل حالة تجريبية كمتوسطات القيم المقاسة (مثل متوسط الشدة) المشتقة من ثلاثة حقول رؤية عشوائية على الأقل لكل شريحة.
  3. إجراء المقارنات الإحصائية
    1. أدخل النتائج الكمية (نسبة القابلية للجدوى وشدة متوسط ROS) في برامج تحليل البيانات ورسم الرسوم البيانية (انظر جدول المواد).
    2. تحديد الدلالة الإحصائية بمقارنة المجموعات التجريبية مع المجموعة الضابطة باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) يليه اختبار توكي بعد الاختبار، بمستوى دلالة p = 0.05. استخدم البرنامج لإجراء التحليل وتوليد مخططات تحتوي على أشرطة خطأ تمثل الانحراف المعياري (SD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحقق من حقل التدفق داخل القناة الميكروفلويدية بواسطة Micro-PIV
يوفر الشكل 1D نظرة عامة على منصة الميكروفلويدية المستخدمة لدراسة استجابات البطانة للتحفيز الأيضي والميكانيكي المترابط. يدمج النظام شريحة ميكروفلويدية PDMS ذات قناة مستقيمة مع وحدة تحكم في التدفق مدفوعة بالضغط، مما يتيح تطبيق حالة OG مع PSS الفسيولوجي. تم استخدام استراتيجية تحويل الصمامات القابلة للبرمجة لتوليد التناوب الدوري بين وسائط الغاز الطبيعي والهيغليتر، بينما تم مزام...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر النظام الميكروفلويدي الموضح هنا منصة قوية وذات صلة فسيولوجية لدراسة التأثيرات المتكاملة ل OG و PSS على وظيفة الخلايا البطانية. تكمن الميزة الأساسية لهذه الطريقة في قدرتها على التحكم الدقيق وفصل المحفزات الميكانيكية والكيميائية الحيوية ضمن بيئة دقيقة محددة. على عكس الثقافات الثابتة التقليدية التي تفتقر إلى قوى الهيموديناميكا أو النماذج الحيوانية التي غالبا ما تخفي إشارات المستوى الخلوي 4,17,18,19، فإن هذا البروتوكول يتيح التع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حظي هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 12372304 و 12172081) وصناديق البحث الأساسي للجامعات المركزية (DUT25YG272).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTANEST Biotechnology Co., Ltd.211052فصل الخلايا
محقنة 1 ملShanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.1mLحقن السوائل
طبق زراعة 60 ملمNEST Biotechnology Co., Ltd.705001زراعة الخلايا
موصل من الفولاذ المقاوم للصدأ بزاوية 90 درجةLuoyang Mayer Trading Co.,Ltd.1.3 ملمجهاز ختم المحول
برنامج AutoCADAutodeskRRID:SCR_014981برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب
زجاجة زجاجية مع طبقة من البورونHunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.مزدوجة المنفذ 100ملالخزان
كيت الكالسيوم/PIBeyotimebyt-c2015الصباغ
حاضنة الخلاياESCOEsco CelMateزراعة الخلايا
CellROX Deep RedInvitrogenC10422الصباغ
D-glucoseSigma Aldrich47249الجلوكوز
D-mannitolMacklinM813423موازنة الضغط الاسموزي
DynamicStudioDantec DynamicsV8.6برنامج تحليل PIV
مصل جنيني بقريّ (FBS)Gibco14190-094الوسط
الفيبرونيكتينSigma AldrichF-2006التصاق الخلايا
جزيئات فلوريةThermo ScientificG0100PIV الصغير
غطاء زجاجيCitotest Scientific Co.,Ltd.#1رقاقة مايكروفلويديك
DMEM عالي الجلوكوزSolarbio12100الوسط
كاميرا عالية السرعةDantec DynamicsFlowSense EOPIV الصغير
ImageJNIHRRID:SCR_003070برنامج معالجة الصور
مجهر فلوري مقلوبOlympusIX73صلاحية الخلية
مجهر فلوري مقلوبOlympusIX83المراقبة والاستحواذ
DMEM منخفض الجلوكوزSolarbio31600الوسط
OriginOriginLabRRID:SCR_014212برنامج تحليل البيانات ورسم الرسوم البيانية
PDMSDow lnc.184رقاقة مايكروفلويديك
البنسللين/الستربتومايسين (P/S)NEST Biotechnology Co., Ltd.211092الوسط
محلول فوسفات الملح المتوازن (PBS)NEST Biotechnology Co., Ltd.211031زراعة الخلايا
منظف البلازماJiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.PC-6Dرقاقة مايكروفلويديك
نظام التحكم في الضغط البرمجيElvesysOB1 MK4تحكم التدفق
أنبوب سيليكونNanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.964101مم*3مم
قالب SU-8 الرئيسيBoao Biology Group Co. Ltd.N/Aرقاقة مايكروفلويديك
جهاز تحكم في الصمامElvesysMUX Wire V3تحكم التدفق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., Dellsperger, K. C., Zhang, C. The link between metabolic abnormalities and endothelial dysfunction in type 2 diabetes: An update. Basic Research in Cardiology. 107 (1), 237(2011).
  2. Yang, D. R., Wang, M. Y., Zhang, C. L., Wang, Y. Endothelial dysfunction in vascular complications of diabetes: A comprehensive review of mechanisms and implications. Front Endocrinol. 15, 1359255(2024).
  3. Piconi, L., et al. Constant and intermittent high glucose enhances endothelial cell apoptosis through mitochondrial superoxide overproduction. Diabetes Metab Res Rev. 22 (3), 198-203 (2006).
  4. Liu, T. S., et al. Oscillating high glucose enhances oxidative stress and apoptosis in human coronary artery endothelial cells. J Endocrinol Invest. 37 (7), 645-651 (2014).
  5. Alfieri, V., et al. The role of glycemic variability in cardiovascular disorders. Int J Mol Sci. 22 (16), 8393(2021).
  6. Adams, J. A., Uryash, A., Lopez, J. R., Sackner, M. A. The endothelium as a therapeutic target in diabetes: A narrative review and perspective. Front Physiol. 12, 638491(2021).
  7. Cheng, H., et al. Effects of shear stress on vascular endothelial functions in atherosclerosis and potential therapeutic approaches. Biomed Pharmacother. 158, 114198(2023).
  8. Jackson, M. L., Bond, A. R., George, S. J. Mechanobiology of the endothelium in vascular health and disease: In vitro shear stress models. Cardiovasc Drugs Ther. 37 (5), 997-1010 (2022).
  9. Liu, X. F., Yu, J. Q., Dalan, R., Liu, A. Q., Luo, K. Q. Biological factors in plasma from diabetes mellitus patients enhance hyperglycaemia and pulsatile shear stress-induced endothelial cell apoptosis. Integr Biol. 6 (5), 511-522 (2014).
  10. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11 (11), 1856-1863 (2011).
  11. Yu, J. Q., Liu, X. F., Chin, L. K., Liu, A. Q., Luo, K. Q. Study of endothelial cell apoptosis using fluorescence resonance energy transfer (FRET) biosensor cell line with hemodynamic microfluidic chip system. Lab Chip. 13 (14), 2693-2700 (2013).
  12. La Sala, L., Mrakic-Sposta, S., Micheloni, S., Prattichizzo, F., Ceriello, A. Glucose-sensing microRNA-21 disrupts ROS homeostasis and impairs antioxidant responses in cellular glucose variability. Cardiovasc Diabetol. 17 (1), 105(2018).
  13. Alpural, A., et al. Systematic review on the role of microfluidic platforms in advancing scalable and precise microbial bioprocessing. Eng Life Sci. 25 (9), e70034(2025).
  14. Chen, Z. H., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036(2021).
  15. Hao, S. Y., et al. Periosteum Organoid: Biomimetic Design Inspired From the Bone Healing Process. Exploration. 5 (6), 20240298(2025).
  16. Chen, Z. Z., et al. A microfluidic device with spatiotemporal wall shear stress and ATP signals to investigate the intracellular calcium dynamics in vascular endothelial cells. Biomech Model Mechanobiol. 18 (1), 189-202 (2019).
  17. Chen, W., et al. Importance of mitochondrial calcium uniporter in high glucose-induced endothelial cell dysfunction. Diab Vasc Dis Res. 14 (6), 494-501 (2017).
  18. Hu, S. Y., et al. An integrated shear-glucose system to study how shear stress repairs oscillating glucose-induced endothelial cell damage via ROS/Ca2+/eNOS signaling. Microchemical Journal. 215, 114415(2025).
  19. Maeda, M., Hayashi, T., Mizuno, N., Hattori, Y., Kuzuya, M. Intermittent high glucose implements stress-induced senescence in human vascular endothelial cells: Role of superoxide production by NADPH oxidase. PLoS One. 10 (4), e0123169(2015).
  20. Na, J. T., et al. Fabricating a multi-component microfluidic system for exercise-induced endothelial cell mechanobiology guided by hemodynamic similarity. Talanta. 253, 123933(2023).
  21. Na, J. T., et al. A microfluidic system for precisely reproducing physiological blood pressure and wall shear stress to endothelial cells. Analyst. 146 (19), 5913-5922 (2021).
  22. Pereiro, I., Fomitcheva Khartchenko, A., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).
  23. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  24. Sahin, M. A., Shehzad, M., Destgeer, G. Stopping microfluidic flow. Small. 20 (20), e2307956(2024).
  25. Sullender, C. T., et al. Using pressure-driven flow systems to evaluate laser speckle contrast imaging. J Biomed Opt. 28 (3), 036003(2023).
  26. Toma, L., et al. Oscillating glucose induces the increase in inflammatory stress through Ninjurin-1 up-regulation and stimulation of transport proteins in human endothelial cells. Biomolecules. 13 (4), 626(2023).
  27. Wu, N., et al. Acute blood glucose fluctuation enhances rat aorta endothelial cell apoptosis, oxidative stress and pro-inflammatory cytokine expression in vivo. Cardiovasc Diabetol. 15 (1), 109(2016).
  28. Gao, J., Pan, H., Guo, X., Huang, Y., Luo, J. Y. Endothelial Kruppel-like factor 2/4: Regulation and function in cardiovascular diseases. Cell Signal. 130, 111699(2025).
  29. He, L., Zhang, C. L., Chen, Q., Wang, L., Huang, Y. Endothelial shear stress signal transduction and atherogenesis: From mechanisms to therapeutics. Pharmacol Ther. 235, 108152(2022).
  30. Han, Y., Huang, K., Yao, Q. P., Jiang, Z. L. Mechanobiology in vascular remodeling. National Science Review. 5 (6), 933-946 (2018).
  31. Cheng, C. K., Wang, N., Wang, L., Huang, Y. Biophysical and biochemical roles of shear stress on endothelium: A revisit and new insights. Circ Res. 136 (7), 752-772 (2025).
  32. Tovar-Lopez, F., et al. A microfluidic system for studying the effects of disturbed flow on endothelial cells. Front Bioeng Biotechnol. 7, 81(2019).
  33. Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions. Biomicrofluidics. 5 (3), 032006(2011).
  34. Van Engeland, N. C. A., et al. A biomimetic microfluidic model to study signalling between endothelial and vascular smooth muscle cells under hemodynamic conditions. Lab Chip. 18 (11), 1607-1620 (2018).
  35. Ma, Q., Ma, H., Xu, F., Wang, X., Sun, W. Microfluidics in cardiovascular disease research: State of the art and future outlook. Microsyst Nanoeng. 7, 19(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial DysfunctionMicrofluidic SystemPulsatile Shear StressOscillatory HyperglycemiaDiabetic Vascular DiseasePolydimethylsiloxane ChipPressure Driven ControlMicro Particle Image VelocimetryReactive Oxygen SpeciesCell Viability
Video Coming Soon

Related Articles