مقالة منهجية

منصة ميكروفلويدية لدراسة ترسيب أكاسيد المعادن في الميكروبات في الأوساط المسامية

243 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71047

⸱

يونيو 12, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول نظاما ميكروفلويديا لدراسة ترسيب ميكروبي لأكسيد المنغنيز. يتم قياس تكوين المعادن الحيوية في الموقع باستخدام المجهر البصري وتحليل الصور. يمكن تكييف هذا النهج لدراسة ترسيب معادن حيوية ملونة مميزة أخرى في البيئات المسامية.

الملخص

الكائنات الدقيقة عادة ما ترسيب جزيئات أكسيد المعادن النانوية في التربة والرواسب وغيرها من الأوساط المسامية ذات الصلة البيئية. ومع ذلك، لا تزال تكون وتفاعل أكاسيد المنغنيز (Mn) والحديد (Fe) غير موصوفة بشكل جيد في البيئات الفيزيائية المعقدة. بينما يمكن لأنظمة المختبر دمج الوسائط المسامية كأساس لها، إلا أنها تتطلب عينة مدمرة وليست سهلة التحليل على مقياس المسام. لذا، تتطلب الطبيعة الديناميكية ولكن غير المتاحة للوسط المسامي القدرة على تحليل ترسيبات المعادن الميكروبية في الموقع وفي الوقت الحقيقي. لسد هذه الفجوة، تم تطوير منصة ميكروفلويدية لتقييم ترسيب أكاسيد المعادن الميكروبي في فضاء المسامات النموذجية. تم التحقق من صحة هذه المنصة بواسطة بكتيريا Pseudomonas putida GB-1 المؤكسدة لل Mn. يتم تصور تطور الأغشية الحيوية وترسيبات أكسيد المونثيوم تحت تدفق مستمر باستخدام مجهر الحقل الساطع بالألوان الزمنية. يتم دمج خوارزمية طرح الصورة مع قياسات كتلة النهاية لتقدير معدل هطول أكسيد الميلينيو. يوفر هذا النهج أداة لاختبار كيفية تغير ترسيب أكاسيد المعادن الميكروبي استجابة للظروف الفيزيائية والكيميائية المتغيرة.

المقدمة

تلعب معادن أكسيد المعادن دورا حيويا في الدورة الكيميائية الحيوية1. أكاسيد المنغنيز (Mn) والحديد (Fe) تكون سالبة الشحنة عند درجة حموضة محيطة وتمتص بسهولة المعادن الكاتيونية 2,3,4,5,6,7,8، مما ينظم توفر المغذيات الدقيقة وحركة الملوثات في الريزوسفير والمنطقة الهيفوريكية. تؤثر هذه المعادن على استقرار وتحلل المادة العضوية 9,10,11,12، مما يحدد امتصاص الكربون من قبل النباتات والميكروبات في التربة. في الأنظمة الهندسية (مثل مرشحات معالجة المياه، الأراضي الرطبة المبنية)، يتم استغلال ترسيبات أكسيد المعادن مباشرة لإزالة ومعالجة الملوثات المتزامنة 13,14,15,16,17. يمكن التعرف على هذه الأكاسيد المعدنية من ألوانها المميزة، التي تتراوح من الأوكر إلى البني الداكن إلى الأسود18,19.

عادة ما يتم تسهيل ترسيب أكاسيد المعادن بواسطة الكائنات الدقيقة في عملية تعرف باسم التمعدنالحيوي 20,21,22. تقوم العديد من البكتيريا والفطريات المؤكسدة لل MN بتصنيع أكسيدازات متعددة النحاس وبيروكسيدازات تحفز انتقال الإلكترونات من Mn(II) إلى Mn(III) و Mn(IV) تحت ظروف هوائية، مما يؤدي إلى ترسيب معادن أكسيد Mn(III, IV)شبيهة بالبيرنسيت 2,23,24. بالإضافة إلى ذلك، تقوم بكتيريا مؤكسدة للحديد المتنوعة بأكسدة الإنزيمات من Fe(II) إلى Fe(III) في البيئات المحايدة أو الحمضية المحدودة بالأكسجين، مما ينتج أكاسيد Fe(II, III) (أوكسيهيدر) أكسيد Fe(II, III) بما في ذلك الفيريهيدريت والمغنيتيت 25,26,27,28. تترسب هذه المعادن الحيوية بجوار أسطح الخلايا وتتراكم على البوليمرات خارج الخلية والأغلفة وغيرها من الهياكل الخلوية، مكونة تجمعات ميكروبية-معدنية 2,23,25,27,29,30.

على الرغم من انتشار التمعدن الحيوي للمنغنيوم والحديد في البيئات المعقدة، إلا أن الرؤى المتعلقة بمقياس المسامات تفتقر إلى النتائج. المساحات المسامية غير متجانسة هيكليا، وتظهر تدفق سائل تفضيلي ونقل متفاعلات غير منتظم يحدد توزيع التفاعلات البيوجيوكيميائية 31,32,33,34,35. علاوة على ذلك، قد تولد النشاط الميكروبي تدرجات جيوكيميائية محلية تعزز أو تحد من التمعدن الحيوي، بينما قد تعزز تقلبات كيمياء سائل المسامات (مثل الرقم الهيدروجيني، الأكسجين المذاب، جهد الأكسدة والاختزال) من ترسيب المعادن أو تسهل الذوبان34,35. تعتمد دراسات التمعدن الحيوي للمونتيجين والفيرين عادة إما على ظروف دفعات مختلطة جيدا30، 36، 37، 38، 39، 40 أو الأعمدة41، 42، 43، 44 لتحديد حركية الأكسدة أو توصيف الرواسب المعدنية الحيوية. ومع ذلك، تفتقر التجارب الدفعية إلى التباين المكاني المتأصل في الأنظمة المسامية. توفر الأعمدة التي تحتوي على وسائط حبيبية مضغوطة بنية فيزيائية ذات صلة لكنها محدودة في فائدتها لأنها تتطلب أخذ عينات مدمرة عند نقاط زمنية ثابتة، مما يوقف تقدم التجربة ويمنع الملاحظات المسامية غير المتأثرة. لذلك، هناك حاجة إلى مناهج تجريبية جديدة للتحقيق في ترسيب أكاسيد المعادن في الميكروبات في الأوساط المسامية.

تعد أنظمة الميكروفلويدية أداة لدراسة التفاعلات الكيميائية الحيوية في الموقع وفي الوقت الفعلي. يمكن تصنيع المفاعلات الميكروفلويدية بسرعة وبتكلفة منخفضة باستخدام هندسات قابلة للتكرار والتخصيص تحاكي الوسائط المسامية الطبيعية أو المثالية45. الأجهزة الناتجة شفافة بصريا، مما يسهل التصور غير التدمر وقياس العمليات على مقياس المسام، بما في ذلك تكوين الأغشية الحيوية 46,47,48,49، تطور النقاط الساخنة50,51، ترسيب المعادن اللاحية52,53، والتمعدن الحيوي للكالسيت 34,54,55,56. بالإضافة إلى ذلك، تتيح أنظمة الميكروفلويدية للمستخدمين التحكم في ظروف الحدود وتغييرها بشكل منهجي، بما في ذلك تركيز المعادن، ووجود أو غياب الأكسجين المذاب، ومعدل تدفق السوائل. وأخيرا، اعتمادا على مادة ركيزة المفاعل، يمكن الحصول على قياسات مباشرة لتفاعلات الميكروبات والمعادن والسائل باستخدام الأشعة السينية أو الرامان أو التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء57. يوفر تطوير مثل هذه المنصة القائمة على الميكروفلويدكس لدراسة ترسيب أكاسيد المعادن الميكروبي طريقا لأبحاث جديدة حول تكوين وتفاعل أطوار المعادن من Mn أو Fe التي تدفع دورة الكربون والمغذيات والملوثات في البيئات المسامية.

يستخدم هذا العمل التمعدن الحيوي للغنيديوم كدراسة حالة لقياس الترسيب الميكروبي لأكاسيد المعادن في بيئة ديناميكية مسامية. يوضح البروتوكول التالي كيفية تصنيع وتحصيح مفاعل ميكروفلويد ببكتيريا نموذجية معروفة بأكسدة Mn(II) إلى Mn(III, IV) في مرحلتها الثابتةمن النمو 58,59. باستخدام نظام تحكم تدفق قائم على الضغط، يتم حقن وسط النمو الغني بالمغذيات ومحلول الملح الأدنى بشكل متسلسل لتعزيز تكوين الأغشية الحيوية وتحفيز ترسيب أكسيد الغن على التوالي. يتم جمع صور ملونة عالية الدقة من فضاء المسامات الميكروفلويدية على فترات زمنية منتظمة، تلتقط التباين اللوني بين أغشية P. putida GB-1 الحيوية وأكاسيد Mn المتراكمة. في نهاية كل تجربة، تهضم جميع أكاسيد المونغنيوم الموجودة داخل المفاعل، ويتم قياس الكتلة الكلية باستخدام مطيافية كتلة البلازما المقترنة بالحث (ICP-MS). يقدر معدل هطول أكسيد الميليغن كدالة للزمن من خلال دمج هذه القياسات الكتلية في النهاية مع خوارزمية طرح الصورة. يمكن تكييف هذا السير بسهولة لدراسة الكائنات الأخرى أو عمليات ترسيب أكسيد المعادن تحت ظروف بيئية متنوعة.

البروتوكول

ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول عدة افتراضات حول معرفة المستخدمين الخلفية والأدوات المتاحة. أولا، يجب أن يكون لدى المستخدمين إما إمكانية الوصول إلى غرفة نظيفة وأن يكونوا على دراية بإجراءات الفوتوليثوغرافيا لصنع قالب ميكروفلويديك أو شراء قالب تجاري. بعد ذلك، يجب أن يكون المستخدمون على دراية بطرق الميكروبيولوجيا الأساسية، مثل استخدام تقنية المعقم، وتحضير المحاليل المخزنة، وألواح الخطوط الخطوطية. يحتاج المستخدمون أيضا إلى جهاز تعقيم (معقم إلكتروني)، وجهاز طرد مركزي دقيق، وحاضن هزاز، ومطياف كتلة. أخيرا، يجب أن يكون المستخدمون ماهرين في المجهر البصري وتحليل الصور.

1. تصنيع وتجميع المفاعل الميكروفلويديك

ملاحظة: المفاعلات الميكروفلويدية المستخدمة في هذا البروتوكول مصممة باستخدام AutoCAD مع هندسة حبيبات الرمل مقتبسة من وانغ وآخرون 55. ينتج كل قالب ست قنوات مكررة بمساحة مسام 15 مم × 10 مم، ومسامية 0.41، وحجم مسام 2.3 ميكرولتر. باستثناء معالجة البلازما، تصنع المفاعلات في خزانة تدفق طبقية للحفاظ على بيئة منخفضة الغبار.

  1. صب قنوات الميكروفلويديك في بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) باستخدام الطباعة الحجرية اللينة.
    1. في كوب بلاستيكي، وزن قاعدة الإلاستومر وعامل المعالجة بنسبة 10:1 (هنا، 25 جرام و2.5 جرام على التوالي).
    2. باستخدام سكين بلاستيكي، اخلط قاعدة الإلاستومر وعامل المعالجة جيدا لمدة 10 دقائق.
    3. قم بإزالة غاز PDMS من الكوب باستخدام مجفف الهواء لمدة ساعة واحدة لإزالة فقاعات الهواء.
    4. اسكب PDMS في القالب وقم بإزالة الغاز لمدة 30 دقيقة لإزالة أي هواء متبق.
    5. ضع القالب على صفيحة ساخنة وتجد لمدة 3 ساعات عند 95 درجة مئوية.
    6. بعد أن يتصلب ويبرد، استخدم مشرط لقطع PDMS وتقشيره من القالب.
    7. على حصيرة قطع، اقطع القنوات الستة الميكروفلويدية بشفرة حلاقة، تاركا 2–3 مم حول حافة كل قناة. قم بثقب فتحات المدخل والمخرج في كل قناة باستخدام ثقب خزعة.
    8. غط جانبي كل قناة ميكروفلويدية بشريط لاصق شفاف لمنع تراكم الغبار وخزنها في طبق بتري بقطر 100 مم.
  2. قبل يوم واحد من التجربة، قم بتجميع المفاعل الميكروفلويديك النهائي باستخدام بلازما الهواء.
    1. أزل الشريط الشفاف من قناة ميكروفلويدية واحدة، ثم شطف PDMS وغطاء زجاجي بنسبة 70٪ إيثانول وجففه بالنيتروجين المضغوط.
      تحذير: الإيثانول قابل للاشتعال. تعامل مع البيانات وتخزينها وفقا لورقة بيانات السلامة.
    2. ضع قناة الميكروفلويديك وغطاء الغطاء مكشوفا في منظف بلازما. أخلي الحجرة لمدة دقيقة واحدة، ثم طبق البلازما لمدة دقيقة واحدة (18 واط و~0.5 تور).
    3. قم بإزالة قناة الميكروفلويدك وغطاء الغطاء من منظف البلازما وضع غطاء الغطاء على جهاز PDMS، مع النقر بلطف لضمان التماسك. تخزين المفاعل المجمع في طبق بترى بقطر 100 مم طوال الليل.

2. نظام التحكم في تدفق الميكروفلويديك

ملاحظة: يستخدم نظام معياري من إلففلو لتسهيل حقن السائل المتسلسل مع تقليل الاضطرابات في الضغط ومعدل التدفق. تشمل مكونات النظام ضاغط هواء، وحدة تحكم التدفق، صمام التوزيع، حساس تدفق، رف خزان السوائل (لأنابيب مخروطية بقطر 15 مل)، وبرنامج واجهة إلففلو الذكية (ESI) (الشكل 1). يمكن استخدام أنظمة التحكم في التدفق الأخرى، مثل مضخات الحقنة، إما في أوضاع التسريب أو السحب، مع حقن أو خزانات مخصصة لكل محلول متدفق وصمام تقسيم منخفض الحجم الميت لتسهيل حقن السائل المتسلسل عبر خط أنبوب واحد. ومع ذلك، يجب توخي الحذر باستخدام مضخات الحقنة لتقليل تقلبات الضغط التي قد تؤدي إلى إزاحة الأغشية الحيوية.

figure-protocol-1
الشكل 1: نظام التحكم في التدفق وهندسة المفاعل الميكروفلويدية. يتكون النظام التجريبي من وحدة تحكم في التدفق: (1) متصلة عبر أنابيب هوائية، (2) بحامل خزان السوائل، (3)، صمام توزيع لتوفير حقن متسلسل لوسط النمو (GMMn)، ومحلول الملح (SSMn)، (4)، ومستشعر تدفق (5) متصل بوحدة التحكم في التدفق لتوفير تغذية راجعة وضبط التدفق في الوقت الحقيقي، (6)، وأنابيب PEEK ذات قطر داخلي صغير لتوفير مقاومة سائلة، (7)، ومصائد فقاعات، (8) أعلى مفاعل الميكروفلويد، (9). مخطط النظام ليس للمقياس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. قم بإعداد ومعايرة جميع الأجهزة حسب تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تم تركيب رف خزان السوائل، وصمام التوزيع، وحساس التدفق داخل حاضنة مجهر مصممة خصيصا للحفاظ على التجربة عند 30 درجة مئوية.
  2. اضبط منظم ضغط ضاغط الهواء على 3 بار ووصل مخرج ضاغط الهواء بمدخل وحدة التحكم بالتدفق باستخدام أنابيب البولي يوريثان الهوائية.
  3. قم بتوصيل مرشح كاره للماء على مخرج وحدة التحكم في التدفق لمنع تدفق السائل العكسي، ثم توصيل وحدة التحكم بالتدفق بمنفذين للدخول في رف خزان السوائل باستخدام أنابيب بولي إيثر هوائية من البولي يوريثان باستخدام مجمع ومحولات شائكة.
  4. قم بتوصيل رف خزان السوائل، وصمام التوزيع، وحساس التدفق بالأنابيب كما يلي، باستخدام وصلات فلانجلس لأنابيب خارجية بقطر 1/16 بوصة ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. توصيل منفذين من رف خزان السوائل بأول منفذين للدخول في صمام التوزيع باستخدام أنبوب بولي رباعي فلورو إيثيلين (PTFE) بقطر داخلي بقطر 1/32 بوصة (ID) بقطر 80 سم.
    2. قم بتوصيل منفذ مخرج صمام التوزيع بمنفذ مدخل حساس التدفق باستخدام أنبوب PTFE ID بطول 15 سم بطول 500 ميكرومتر وتركيب محول.
    3. قم بتوصيل أنبوب كيتون بولي إيثر ID بطول 63.5 ميكرومتر بقطر 60 سم على منفذ مخرج حساس التدفق باستخدام وصلة محول.
      ملاحظة: بالنسبة للتجارب التي تتطلب معدلات تدفق مختلفة، قم بضبط طول أنبوب PEEK حسب الحاجة لتوفير مقاومة سائلة كافية لاستقرار التدفق.
    4. قم بتوصيل أنبوب PEEK بأنبوب PTFE ID بقطر 10 سم بقطر 500 ميكرومتر باستخدام وصلة اتحاد.
    5. قم بتثبيت أنبوب PTFE بمنفذ السحب في مصيدة فقاعات ميكروفلويدية مزودة بفلتر غشاء PTFE (حجم المسام ~10 ميكرومتر).
    6. قم بتثبيت أنبوب PTFE ID بقطر 75 سم بقطر 200 ميكرومتر على منفذ مخرج فقاعات الفقاعات لخلق ضغط عكسي لإزالة الفقاعات بشكل فعال. هذا الأنبوب سيتصل بفتحة مدخل المفاعل الميكروفلويدية.
  5. قبل كل تجربة، يتم تعقيم نظام التحكم في التدفق بحيث يتم توصيل جميع الأنابيب والأجهزة عن طريق غسل محلول مبيض بنسبة 1٪ لثلاثة أضعاف حجم النظام (~4 ساعة لكل خط أنابيب عند 7.0 ميكرولتر·دقيقة في الدقيقة)، يليه ماء فائق نقي معقم لنفس المدة.
  6. بين التجارب، نظف نظام التحكم في التدفق كما يلي.
    1. شطف صمام التوزيع وحساس التدفق عن طريق غسل 100٪ من الأيزوبروبانول ومياه فائقة النقية معقمة لمنع تراكم البقايا أو الرواسب.
      تحذير: الأيزوبروبانول قابل للاشتعال. تعامل مع البيانات وتخزينها وفقا لورقة بيانات السلامة.
    2. استخدم مصيدة الفقاعات المعقم (autoclave pob).
    3. استبدال فلتر غشاء الفقاعات وأنبوب PTFE ID بسعة 200 ميكرومتر بعد كل تجربة لمنع الانسداد (مرشح الغشاء) أو استعمار البكتيريا (الأنابيب).

3. الوسائط التجريبية والحلول

  1. حضر وسط مرق لوريا السائل (LB، تركيبة ميلر) عن طريق وضع مسحوق 2.5٪ LB في ماء فائق النقي عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بالنسبة لألواح الأجار الصغيرة، استخدم الأوتوكلاف 2.5٪ مسحوق LB و1.5٪ أجار في ماء فائق النقاء عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم اسكب في أطباق بتري بقياس 100 مم (~20 مل لكل طبق) واتركه يبرد حتى يصبح صلبا.
  2. من المحاليل المعقمة بالفلترة المحضرة باستخدام الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS) أو بالمواد البكتيرية في مياه فائقة النقي، ينتج 30 مل من كل من التالي. تم اقتباس محلول الملح وتركيب وسط النمو من Gehin وآخرون 59.
    1. تحضير محلول ملحي بدون Mn(II) (SS0): 0.4 mM CaCl2·2H2O، 0.25 mM MgSO4.7H 2O، 0.25 mM Na2HPO4·2H2O، 0.15 mM KH2PO4، 1:2 Fe(III)-EDTA (20 ميكرومولار FeCl3·6H2O و40 ميكرومولار EDTA معدلة إلى pH 6.5 مع 1M NaOH)، 10 مللي مولار من محلول HEPES (معدل إلى pH 7.0 مع 1M NaOH)، 5 مللي مولار (NH4)2SO4، والمعادن النزرة (40 نانوميل CuSO4·5H2O، 273 نانوموتر ZnSO4·7H2O، 84 نانوموتر CoCl2·6H2O، 53.7 نانومولار Na2MoO4.2H 2O) في مياه فائقة النقية معقمة.
    2. تحضير محلول ملحي مع Mn(II) (SSMn): نفس محلول SS0 مع إضافة 50 ميكرومولار MnCl2.4H 2O.
    3. تحضير وسط نمو بدون Mn(II) (GM0): نفس مستوى SS0 بقوة 1.5 جم· مستخلص الخميرة L-1 و1.5 جرام· أضيف حمض الكازامينو L-1 .
    4. تحضير وسط نمو مع Mn(II) (GMMn): نفس GM0 مع إضافة 50 ميكرومولار MnCl2.4H 2O.
      تحذير: تحتوي محاليل الملح ووسائط النمو على معادن تحمل مخاطر صحية وبيئية. تعامل مع وتخزين اللعبة وفقا لبيانات السلامة.
  3. حضر محلول حمضي يحتوي على 40 ملليمول من حمض الأكساليك ديهيدرات و2٪ حمض النيتريك في ماء فائق النقاء لهضم أكاسيد الميليغنات داخل المفاعل الميكروفلويد.
    تحذير: حمض الأكساليك ثنائي هيدرات وحمض النيتريك يسببان التآكل، وحمض النيتريك مؤكسد قوي. تعامل مع وتخزين اللعبة وفقا لبيانات السلامة.
  4. حضر محلول حمض نيتريك بنسبة 1٪ في ماء فائق النقاء لتخفيف عينات ICP-MS.

4. الزراعة البكتيرية

ملاحظة: يتم إجراء الزراعة البكتيرية بتقنية المعقمة على سطح الطاولة باستخدام موقد بنسن. المواد معقمة ما لم يذكر خلاف ذلك. مدة الحضانة خاصة ب P. putida GB-1 وقد تحتاج إلى تعديل لتناسب كائنات دقيقة أخرى.

  1. من مخزون بدرجة -80 درجة مئوية، يظهر شريط P. putida GB-1 على صفيحة أجار LB. حضن الطبق لمدة تقارب 20 ساعة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية للسماح بنمو مستعمرات البكتيريا.
  2. في الليلة التي تسبق التجربة، أضف 10 مل من وسط LB إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل وقم بتطعيم بمستعمرة واحدة من الصفائح. حضن التربية المسبقة LB في حاضنة هزاز عند 30 درجة مئوية و180 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة للوصول إلى المرحلة الثابتة.
  3. بعد 16 ساعة من الحضانة، يتم جمع 1 مل من الزراعة المسبق للكتلة في أنبوب وطرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 8000 × جم لإزالة البكتيريا.
  4. اغسل القطعة ثلاث مرات لإزالة وسط LB المستهلك عن طريق التخلص من السوبرناتانت، وإعادة تعليق الحبيبات الخلوية في 1 مل من SS0، وتوصيل الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 8,000 × جرام. أعد تعليق الحبيبة النهائية في 1 مل من SS0.
  5. قس الكثافة البصرية (OD600) لتعليق الخلية المغسولة في كوفيت غير معقم باستخدام مقياس كثافة الخلايا. الكمية المتوقعةمن OD 600 ل P. putida GB-1 هي 3.6–3.8 في هذه المرحلة، لذا يتطلب الأمر تخفيفا على الأقل 5 مرات في SS0 .
  6. قم بتحصيح 20 مل من GM0 مع تعليق خلية مغسولة إلى جرعة OD600 أولية من 0.01 في قارورة إيرلينماير سعة 50 مل. الحضانة عند 30 درجة مئوية و180 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات للوصول إلى المرحلة الأسية المتوسطة.

5. تجربة التمعدن الحيوي

  1. في صباح يوم التجربة، جهز نظام التحكم في التدفق.
    1. قم بتسخين حاضنة المجهر إلى 30 درجة مئوية.
    2. صب 10 مل من GMMn وSS Mn في أنبوبين مخروطيين بحجم 15 مل وربط الأنابيب برف خزان السائل. يتم تفريغ SSMn لحوالي ثلاثة أضعاف حجم النظام (~4 ساعات عند 7.0 ميكرولتر·دقيقة-1)، يليهMn GM لنفس المدة.
  2. قم بتشبع المفاعل الميكروفلويديك المحضر لمدة 5 ساعات بعد تلقيح الثقافة الأسية المتوسطة.
    ملاحظة: يتم إجراء تشبع المفاعل والتطعيم باستخدام تقنية المعقمة على سطح الطاولة باستخدام موقد بنسن. المواد معقمة ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. قم بإزالة الغاز من المفاعل في مجفف فراغ لمدة 20 دقيقة.
    2. أثناء إزالة الغازات من المفاعل، اسحب 1–2 مل من SS0 إلى حقنة بلاستيكية بسعة 3 مل، ثم قم بتثبيت إبرة ذات طرف غير حاد وأنبوب تيغون ID بقطر 0.02 بوصة بطول 20 سم. اضغط على مكبس الحقنة حتى تتشبع الأنابيب بالكامل.
    3. أزل المفاعل من جهاز المجفف، ثم قم بتثبيت الأنبوب بفتحة مخرج المفاعل باستخدام ملقط مائل وتشبع المفاعل يدويا بالحقنة حتى تتكون قطرة عند فتحة مدخل المفاعل.
    4. قم بتثبيت أنبوب تايجون ID بقطر 0.02 بوصة بقطر 20 سم على فتحة مدخل المفاعل. استمر في صرف SSMn إلى المفاعل حتى تزال جميع فقاعات الهواء (200–300 ميكرولتر).
  3. جهز لقاح المفاعل وقم بتطعيم المفاعل الميكروفلويد.
    1. قم بإزالة الزراعة الأسية المتوسطة من حاضنة الهزاز بعد 6 ساعات من التطعيم وقاس كمية OD600. التوزيع الخارجيالمتوقع 600 هو 1.6–1.8 في هذه الخطوة، لذا يوصى بتخفيف أربع مرات في SS0 .
    2. قم بتخفيف الزراعة الأسية المتوسطة في 2 مل من SSMn إلى OD600 أولي 0.005 في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 2 مل. اقلب الأنبوب عدة مرات ليتم خلطه.
    3. ضع أنبوب دخول المفاعل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، مع التأكد من أن قطرة سائل تلامس اللقاح لمنع دخول الهواء إلى الأنبوب. أغلق جزئيا أنبوب الطرد المركزي الدقيق وثبت الغطاء بشريط لاصق لمنع التلوث.
    4. اسحب 4–5 مل من SSMn إلى حقنة زجاجية محكمة الإغلاق بسعة 5 مل لترطيب السبطانة، ثم وزعها حتى يبقى 0.5 مل في الحقنة. حمل الحقنة في مضخة الحقنة.
    5. أزل الإبرة من الحقنة البلاستيكية وثبتها على الحقنة الزجاجية، مع الحرص على عدم حبس الهواء في محور الإبرة.
    6. قم بتلقيح المفاعل بمضخة الحقنة عن طريق سحب اللقاح إلى داخل المفاعل لمدة 20 دقيقة بمعدل تدفق 8.33 ميكرولتر·دقيقة ( ~70 حجم مسام).
    7. بعد التلقيح، أطفئ مضخة الحقنة ودع البكتيريا تستقر وتلتصق لمدة ساعة دون تدفق.
    8. بعد ساعة، أزل الحقنة من مضخة الحقنة لكن اتركها متصلة بأنبوب المخرج.
  4. ربط المفاعل الميكروفلويديك الملقح بنظام التحكم في التدفق.
    1. انقل المفاعل والحقنة من سطح الطاولة إلى حاضنة المجهر.
    2. في مرحلة المجهر، قم بإزالة أنبوب الإدخال من المفاعل.
    3. اضغط بلطف على مكبس الحقنة لتكوين قطرة عند فتحة مدخل المفاعل.
    4. قم بثني أنبوب PTFE يدويا من نظام التحكم في التدفق بزاوية قائمة (~1 سم من نهاية الأنبوب) بحيث يتصل بشكل عمودي على سطح PDMS، مما يقلل من القوى الجانبية وتسرب الهواء إلى فتحة مدخل المفاعل.
    5. اغمس نهاية أنبوب PTFE في محلول يحتوي على 1٪ بولي إيثيلين جليكول دياكريلات (PEG-DA) لترطيب الجزء الخارجي من الأنبوب الكاره للماء. تأكد من وجود قطرة من GMMn في نهاية أنبوب PTFE، واثبت الأنبوب بفتحة مدخل المفاعل.
    6. افصل الحقنة وضع أنبوب المخرج في أنبوب طرد مركزي دقيق غير معقم بقطر 5 مل لجمع مصارف المفاعل.
    7. اضبط معدل التدفق إلى 1.33 ميكرولتر·دقيقة واحدة في برنامج نظام التحكم في التدفق. أنشأ برنامجا لتزويدالمونغناط المعدلة وراثيا لمدة 15 ساعة (~500 حجم مسام) لتعزيز تكوين الأغشية الحيوية، يليه SSMn لمدة 28.5 ساعة (~1,000 حجم مسام) لتحفيز التمعدن الحيوي للحزن.
  5. قم بتركيب المفاعل الميكروفلويذي في إدخال مرحلة المجهر.
    ملاحظة: يستخدم نظام إشعاع بالأشعة فوق البنفسجية (UVC) مخصص الصنع ملحق بإدخال مرحلة المجهر للحد من النمو البكتيري غير المرغوب فيه وتساقط المعادن خارج فضاء المسام الميكروفلويدية (الشكل 2). تم تعديل هذا التصميم من راموس وآخرون 60 ويمكن التحكم فيه ببرنامج آلي. انظر فاديلي وآخرون 61 لمزيد من التفاصيل.
    1. ضع إطار عينة تحت المفاعل للاستقرار، ثم ثبت الإطار والمفاعل بشكل صلب في إدخال المسرح، لضمان تثبيتهما بالكامل.
    2. ثبت أنبوب PTFE على إدخال المرحلة بقطعة شريط لاصق لمنع انفصال الأنبوب عن فتحة مدخل المفاعل.
    3. قم بمحاذاة أذرع UVC على مسافة 3 مم من حافة الفراغ المسام على جانب المدخل و2 مم على جانب المخرج لتقليل تشتت الأشعة فوق البنفسجية وتلف الأغشية الحيوية داخل الفراغ المسامي.
      ملاحظة: المحاذاة الصحيحة للأشعة فوق البنفسجية ستؤدي إلى تراكم قليل أو معدوم للكتلة الحيوية في منطقة مدخل المفاعل (الشكل 3A). يؤدي محاذاة أذرع UVC بعيدا جدا عن حافة مدخل الفضاء المسام (الشكل 3B) أو غياب الإشعاع (الشكل 3C) إلى ترسيب المعادن في أعلى الفراغ المسامي.
    4. قم بإعداد برنامج لرش المفاعل. عالج منطقة المدخل والمخرج لمدة 5 دقائق عند t = 0 ساعة لتعطيل البكتيريا المتوقرة أثناء التطعيم، ثم عالج منطقة المخرج لمدة 5 دقائق فقط عند t = 17.5 ساعة لتعطيل أي أغشية حيوية متبقية.

figure-protocol-2
الشكل 2: نظام إشعاع فوق بنفسجي C مخصص للمفاعلات الميكروفلويدية (UVC). (أ). العرض العلوي للنظام مركب على إدخال مرحلة المجهر يظهر أذرعا قابلة للحركة (أزرق) مع مصفوفات صمامات ثنائية الأشعة العاتية للضوء UVC (مستطيلات صفراء) ومفاعل ميكروفلويديك مثبت على إطار عينة (مستطيل رمادي صغير). (ب). عرض أسفل النظام يظهر مصابيح UVC (مربعات بلون البيج) مدمجة في الأذرع القابلة للحركة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-3
الشكل 3: تأثير إشعاع UVC على منطقة مدخل المفاعل الميكروفلويد. (أ). منطقة مدخل المفاعل مع معالجة UVC لمدة 5 دقائق عند t = 0 ساعة، مما يظهر محاذاة صحيحة لإزالة الأغشية الحيوية غير المرغوب فيها بالكامل. (ب). منطقة مدخل المفاعل ذات مصفوفة UVC غير محاذية بشكل صحيح، مما ترك أغشية حيوية متبقية في فتحة السحب وخارج الفراغ المسامي، مما يسمح لأكاسيد المونغنيوم بالترسيب في الأعلى. (ج). منطقة مدخل المفاعل بدون معالجة UVC، مما يؤدي إلى نمو واسع النطاق للغشاء الحيوي وترسيبات المعادن. تحدد الظلال الرمادية مساحة المسام. شريط القياس هو 2 مم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. المجهر البصري بتقنية التايم لابس

ملاحظة: يستخدم مجهر Nikon Ti2 Eclipse مقلوب بفلورية مقلوبة مزود بكاميرا رقمية (2304 × 2304 بكسل لكل مجال رؤية)، ومحرك ضوء أبيض، وهدف 4x (1.62 ميكرومتر·بكسل-1)، وبرنامج NIS Elements لتصوير الحقول الساطعة للألوان. كما أن المجاهر البصرية الأخرى القادرة على التصوير بالألوان مناسبة أيضا. استخدام التصوير الملوني يحسن الحساسية لانخفاض كتلة أكسيد الميليغن. إذا لم تكن أتمتة التايم لابس خيارا، يمكن للمستخدمين جمع الصور يدويا ومعالجتها لاحقا كسلسلة زمنية.

  1. للحصول على صور عالية الجودة، قم بتنفيذ خطوات المحاذاة والتصحيح التالية:
    1. لضمان إضاءة متساوية، قم بضبط محاذاة كولر يدويا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. تحسين إضاءة الحقول الساطعة لمنع التشبع المنخفض أو الزائد (لوحة الاندماج > اللون > السطوع التلقائي ولوحة الاندماج > اللون > الأبيض التلقائي).
      ملاحظة: من الأفضل تحسين إضاءة المجال الساطع مرة واحدة فقط على مفاعل يحتوي بالفعل على أغشية حيوية وأكاسيد Mn، ثم تطبيق نفس زمن التعريض وتوازن الألوان على جميع التجارب اللاحقة لتحقيق إضاءة متسقة. هنا، يتم استخدام إضاءة 5 مللي ثانية مع إضاءة بالأحمر عند 97.58، والأخضر عند 44.76٪، والأزرق عند 100٪.
    3. لمنع ظهور تشوهات في التداخل عند التقاط صور مخيطة لمساحة المسامات الميكروفلويدية، قم بتصحيح التظليل (احصل على لوحة تصحيح التظليل >).
  2. اضبط الإحداثي المركزي للصورة المخيطة (ND Acquisition > XY).
  3. قم بإعداد منطقة مسح الصورة المخيطة (هنا، 5 × 4 مجالات عرض) وطبق تداخل بنسبة 1٪ (اكتساب ND > صورة كبيرة).
  4. قم بإعداد التقاط صور الحقول الساطعة الملونة باستخدام هدف 4x (اكتساب ND > λ).
  5. قم بضبط تردد التصوير بفواصل زمنية 1 ساعة ل 15 ساعة (مرحلة النمو) و0.5 ساعة ل 28.5 ساعة (مرحلة التمعدن) (ND Acquisition > Time)، ثم شغل برنامج التايم لابس.
    ملاحظة: مدة مراحل النمو والتمعدن خاصة ب P. putida GB-1 ويمكن تعديلها حسب الحاجة للكائنات الدقيقة الأخرى.
  6. عند اكتمال التجربة، قم بتصدير الصور كصيغة ملف صورة موسوم (TIFF) (لوحة الماكرو > تصدير الصور إلى TIFF).

7. الهضم الحمضي وقياس كتلة المنيلوغ

ملاحظة: يستخدم جهاز ICP-MS لقياس كتلة Mn المحتجزة في المفاعل الميكروفلويد، لكن أجهزة أخرى مثل مطياف الانبعاث البصري (ICP-OES) مقبولة أيضا. إذا لم تتوفر أجهزة تحليلية، فقد ترسل عينات مهضوضة بحمض إلى مختبر تجاري.

  1. في نهاية التجربة، قم بإزالة المفاعل من إدخال مرحلة المجهر وفصل أنابيب المدخل والمخرج.
  2. اسحب 1.5 مل من محلول الحمض إلى حقنة زجاجية محكمة الإغلاق بسعة 5 مل (منفصلة عن حقنة التطعيم). قم بتثبيت إبرة ذات طرف غير حاد وأنبوب PTFE بقطر 20 سم من أنبوب PTFE ID بقطر 1/32 بوصة على الحقنة وقم بتوزيع الحمض يدويا حتى تتكون قطرة في نهاية الأنبوب.
  3. على سطح المطبخ، قم بتحميل المحقنة في مضخة الحقنة وربط الأنبوب بفتحة مدخل المفاعل، مع الحرص على عدم حبس فقاعات الهواء التي قد تمنع المحلول الحمضي من اختراق جميع المسام. قم بتوصيل أنبوب PTFE بقطر 30 سم من أنابيب PTFE بقطر 1/32 بوصة إلى فتحة مخرج المفاعل ووضع نهاية أنبوب المخرج في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 2 مل.
  4. حقن محلول الحمض في المفاعل لمدة 10 دقائق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر·دقيقة 1.
  5. بعد حقن محلول الحمض، افصل إبرة الرأس العريض عن الحقنة الزجاجية. املأ حقنة بلاستيكية بسعة 10 مل بالهواء وقم بتوصيلها بإبرة الطرف الباهت، ثم قم يدويا بتوزيع كل الهواء في الحقنة لتصريف الحمض المتبقي من المفاعل والأنبوب إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل.
    ملاحظة: بينما قد يبقى حجم صغير من محلول الحمض محبوسا داخل الفراغ بعد حقن الهواء، إلا أنه ضئيل مقارنة بالحجم الإجمالي المحقون. قد يفكر المستخدمون الذين يعملون في هندسات منخفضة المسامية في تنظيف كميات إضافية من الهواء لإزالة الأغشية السائلة والحماض المتبقية من المسامات المتصلة بشكل سيء.
  6. تخفيف العينة المهضومة بحمض نيتريك بنسبة 1٪ وفقا لنطاق معايرة ICP-MS. هنا، جهز تخفيفا 100x (حجم إجمالي 5 مل) في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
  7. قس تركيز Mn في العينة المخففة باستخدام ICP-MS. تصحيح التركيز المقاس باستخدام عامل التخفيف وحجم العينة الكلي لتحديد كتلة الميلينيوسن المحتجزة في المفاعل.

8. تحليل الصور

ملاحظة: يوصى ب MATLAB بسبب وظائفه المدمجة لتحليل الصور، والتي تدرج في النص. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام أدوات أخرى مثل مكتبات تحليل الصور في ImageJ أو بايثون لإجراء تحليلات مماثلة. تظهر خطوات تحليل الصور الرئيسية في الشكل 4. جميع نصوص تحليل الصور مقدمة كملفات تكميلية (الملف التكميلي 1، الملف التكميلي 2، والملف التكميلي 3).

figure-protocol-4
الشكل 4: سير عمل طرح الصورة لعزل ترسبات أكسيد المونغن. من صور الحقل المضيء الملونة بالفاصل الزمني، تم تحديد صورة مرجعية (tref) (1) لإزالة شدة الأغشية الحيوية الثابتة الأساسية من جميع صور النقطة الزمنية اللاحقة (tn) (2) تم توليد أقنعة ثنائية لكل tn (3) وضربها في كل من tref (4) والtn المقابل (5) لالتقاط امتداد الفيلم الحيوي-المعدن الحيوي. وأخيرا، تم طرح tn المقنعة من التريف المقنع (6). تقوم المصفوفات المصححة بالشدة الناتجة بقياس الانخفاض في الشدة (a.u.) الناتج عن تراكم أكسيد Mn عند كل بكسل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. قم بتحميل ملف TIFF عالي الدقة لهندسة الفضاء المسام الميكروفلويدية (المصدرة من AutoCAD) إلى مساحة العمل لاستخدامها كقناع حبيبات (غير مقروء).
  2. قم بتقويم وتسجيل صور الحقول المضيئة لتطبيق قناع الحبيبات بشكل فعال.
    1. إنشاء ملف تسجيل لصورة النقطة الزمنية الأولى (t = 0 h).
      1. قم بتحميل ملف TIFF الخاص بالألوان في مساحة العمل (غير مقروء).
      2. اقتصاص الصورة بشكل أكبر قليلا من حجم مساحة المسامة (مع القطع).
      3. قم بزيادة وضوح الصورة لتحسين دقة حدود الحبيبات (imsharpen).
      4. قم بتثنيين الصورة باستخدام عتبة تكيفية تعطي الأولوية للميزات الداكنة (rgb2gray، adaptthresh مع قطبية المقدمة = "داكن" والحساسية مضبوطة حسب الحاجة، دمج الدواء، غير الممتمل).
      5. ملء حبيبات الملف الثنائي الناتج لتكوين ميزات صلبة (مع ملء "ثقوب" محددة). لاحظ أنه ليس كل الحبوب قد تكون محشوة.
      6. قم بتآكل الثنائي التسجيل حسب الحاجة لإزالة الضوضاء الخلفية، ثم توسيع المسافة لتعويض البكسلات المفقودة عند حواف الحبيبات (imerode، immodate).
    2. استخدم خوارزمية تسجيل تحويل الميزات الثابتة بالمقياس (SIFT) لحساب مصفوفة التحويل اللازمة لمحاذاة الثنائي التسجيل مع قناع الحبيبات (DetectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d مع نوع التحويل = "affine").
    3. طبق مصفوفة التحويل هذه على الصورة الثنائية للتسجيل والصورة الزمنية الأولى، ثم وضعها فوقها مع قناع الحبيبات لتقييم التوافق (imwarp، imshowpair).
    4. إذا استمر سوء المحاذاة بعد تسجيل SIFT، قم بتطبيق التسجيل المحلي حسب الحاجة (cpselect، fitgeotform2d مع نوع التحويل = "lwm"، imwarp).
    5. قم بقص الصورة المسجلة وقناع الحبيبات حسب الحاجة لإزالة عيوب التسجيل عند حواف المصفوفة، ثم إعادة الحجم إلى أبعاد مساحة المسام (15 مم × 10 مم) (قص، إعادة تصغير).
    6. قم بتدوير جميع صور الحقول الساطعة الملونة لتطبيق نفس التسجيل (imwarp).
  3. حدد صورة مرجعية بصريا (مرجع t، اللوحة 1 في الشكل 4) عندما تدخل الأغشية الحيوية المرحلة الثابتة لأول مرة، والتي تحدد على أنها عدم استمرار الحركة أو النمو (هنا، t = 18.5 ساعة).
  4. قم بتثنيين كل صورة في نقطة زمنية (tn، اللوحة 2 في الشكل 4) (rgb2gray، adaptthresh مع قطبية المقدمة = "داكن" وتعديل الحساسية حسب الحاجة، امبيناريز، غير متكامل) بحيث تجمعات البيوفيلم-المعدن الحيوي = 1 والحبيبات والمسام الفارغة = 0. اضرب كل قناع نقطة زمنية في قناع الحبيبات المقلوب (غير متكمل) لإزالة حدود الحبيبات المتبقية.
  5. اضرب tn في قناع النقطة الزمنية المقابل لها (اللوحة 3 في الشكل 4) لعزل منطقة الغشاء الحيوي-المعدن الحيوي محل الاهتمام (اللوحة 5 في الشكل 4)، ثم اضرب tref في كل قناع نقطة زمنية لعزل نفس المنطقة (اللوحة 4 في الشكل 4).
  6. اطرح كل tn المقنع منمرجع t المقنع لقياس انخفاض شدة البكسل المرتبط بتراكم أكسيد Mn في كل نقطة زمنية (اطرح)، ثم حول إلى مصفوفات مركبة مصححة للشدة (rgb2gray، اللوحة 6 في الشكل 4).
  7. لتقييم التوزيع المكاني للمعدن عبر فضاء المسامات (a.u.)، اجمع على طول الأعمدة (المجموع مع البعد = 1) لكل مصفوفة مصححة للشدة.
  8. لتقدير معدل هطول أكسيد المنيلوجين عبر الزمن (ميكروغرام·h-1):
    1. نجمع كل مصفوفة مصححة بالشدة (المجموع مع البعد = "الكل") لقياس إجمالي الشدة المصححة في كل نقطة زمنية.
    2. اقسم إجمالي الشدة المصححة في كل نقطة زمنية على إجمالي الشدة المصححة في النقطة الزمنية النهائية بحيث تكون النقطة الزمنية النهائية = 1 وجميع القيم السابقة كسرية. أعد تكبير الكتلة إلى ميكروغرام عن طريق الضرب في كتلة المغنيون المقاسة بواسطة ICP-MS.
    3. خذ المشتقة بالنسبة للزمن بقسمة زيادة الكتلة (μg) بين نقاط زمنية متسلسلة (تفاضل) على الفترة الزمنية بين الصور (0.5 ساعة).

النتائج

يوفر هذا البروتوكول منصة تجريبية للتصوير الزماني المحدد، لتكون الأغشية الحيوية والمعادن الحيوية للغشاء المغناطيسي. أظهرت صور الحقول المضيئة الملونة أن أغشية P. putida GB-1 كانت موزعة بشكل موحد عبر فضاء المسام الميكروفلويدية عند t = 18.5 ساعة قبل بدء ترسيب أكسيد Mn (الشكل 5A). لاحقا، تتراكم أكاسيد Mn بشكل تفضيلي على جانب المدخل من الفضاء المسامي الأقرب إلى مصدر Mn(II) المؤثر (الشكل 5B). كشف الفرق بين الصورة المرجعية ونقاط الزمن اللاحقة عن المساهمة المعزولة لترسيب أكسيد المونيغن في شدة الصورة الكلية (الشكل 5C) ومكن من قياس تدرج المقياس الملحوظ على مستوى المفاعل في تراكم المعادن (الشكل 5D). على مستوى الأغشية الحيوية، التقط هذا النهج في طرح الصور الترسيب التدريجي لأكاسيد Mn على أسطح الأغشية الحيوية وتراكم المعادن عند حواف الأغشية الحيوية عند ملامسة سائل المسامات (الشكل 6).

يوفر البروتوكول أيضا سير عمل لتقدير حركية ترسيب أكسيد الميليغن من طرح الصور وقياسات ICP-MS. احتوت المفاعلات الميكروفلويدية الثلاثية على 4.29 ± 0.22 ميكروغرام ميلينيوتن في النقطة الزمنية التجريبية النهائية. تم التحقق من صحة الهضم الحمضي لمحتويات المفاعل سابقا باستخدام قياسات تعتمد على السنكروترون لكتلة Mn oxide، وتبين أن الخطأ أقل من 18٪61. لذلك، تم إعادة تكبير المصفوفات المصححة للشدة إلى هذه الكتلة النهائية. كان معدل هطول أكسيد النيليون المقدر الناتج غير أحادي التون، حيث زاد بشكل حاد بين t = 19.5 ساعة و t = 21 ساعة، قبل أن يبلغ ذروته عند 0.29 ± 0.04 ميكروغرام·h-1 ويتباطأ تدريجيا حتى t = 43.5 ساعة (الشكل 7). يجدر بالذكر أن هذا الحساب للمعدل لا يأخذ في الاعتبار أي أكاسيد نانوية للجسيمات Mn أقل من دقة المجهر البصري أو أي كتلة أكسيد مفقودة بسبب النقل خلال مدة التجربة، والتي من المتوقع أن تكون قليلة. لذلك يستفيد هذا النهج من تقنيات المجهر المتاحة لتقييم الاتجاهات الزمنية في حركيات التمعدن الحيوي بشكل شبه كموي.

figure-results-1
الشكل 5: توزيع الأغشية الحيوية وأكاسيد المونجنات على مستوى المفاعل. (أ). صورة حقل الألوان الساطع لأغشية P. putida GB-1 داخل فضاء المسام الميكروفلويدية عند بداية الطور الثابت (t = 18.5 ساعة،t مرجع). (B). صورة الحقل الساطع الملونة لترسب أكسيد Mn على وحول أغشية P . putida GB-1 في النقطة الزمنية التجريبية النهائية (t = 43.5 ساعة). (ج). مصفوفة تراكم المعادن المصححة بالشدة في النقطة الزمنية التجريبية النهائية (t = 43.5 ساعة)، مع ظهور الحبيبات باللون الرمادي والمسام باللون الأبيض. شريط المقياس هو 1 مم (D). توزيع مكاني أحادي البعد لشدة المصححة الكلية من المدخل (الأيسر) إلى الجانب المخرج (الأيمن) من فضاء المسامة (t = 43.5 ساعة). يمثل الخط الصلب متوسطا متحركا بمقدار 1 مم على طول الفراغ المسامي من المدخل إلى المخرج يتم تسويته عبر تجارب ثلاثية المكررات، ويمثل التظليل الانحراف المعياري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 6: تراكم أكسيد المنيلوغيوم على مستوى الغشاف الحيوي. (أ). اختر صور ملونة ساطعة للأغشية الحيوية الممثلة ل P. putida GB-1. تم اكتشاف أكاسيد المنغنيز أولا كتغير لوني من الرمادي إلى البني على أسطح البيوفيغميل (يظهر عند t = 20 ساعة و t = 21 ساعة) ولاحقا كتراكم من ترسبات بنية داكنة عند حواف الغشية الحيوية (تظهر عند t = 33 ساعة و t = 43 ساعة). (ب). مصفوفات مصححة للشدة لتراكم المعادن مع حبيبات رمادية داكنة، مسام بيضاء، وأغشية حيوية تحتها باللون الرمادي الفاتح. شريط المقياس هو 150 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 7: تقدير معدل هطول Mn oxide مع مرور الوقت. تم قياس المعدل (μg·h-1) عن طريق إعادة تكبير الشدة المصححة الكلية في كل نقطة زمنية إلى الكتلة النهائية Mn المقاسة ب ICP-MS، ثم أخذ المشتقة بالنسبة للزمن. تمثل العلامات متوسط التجارب الثلاثية، وتمثل التظليل الانحراف المعياري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: الساعة Step1_ImageRegistrationيرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: Step2_ImageSubtraction مساء.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: الساعة Step3_Figuresيرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

توفر هذه المنصة التجريبية فرصا فريدة للتحقيق في الديناميكيات الزمانية المكانية للعمليات الكيميائية الحيوية في البيئات المسامية الخالية من القطع الأثرية التي تمنع جمع بيانات عالية الدقة. هذا النهج مناسب بشكل خاص لتحويل المعادن الحيوية للمونثونيتين والفئين، حيث ينتجان رواسب معدنية بدرجات مميزة من الأوكر والبني والأسود يمكن تقسيمها بسهولة باستخدام المجهر البصري وتحليل الصور. باستخدام التمعدن الحيوي للمونثيوم كدراسة حالة، من الممكن تقييم أنماط ومعدلات هطول المعادن في الموقع بدقة مكانية وزمنية عالية.

مكنت عدة جوانب من هذا البروتوكول جمع قياسات قابلة لإعادة إنتاج التحولات البيوجيوكيميائية. أولا، سهل استخدام صمام حقن متسلسل ذو حجم ميت منخفض التجارب مع سوائل متعددة دون إزعاج الأغشية الحيوية داخل فضاء المسام الميكروفلويدية. حافظ هذا الإعداد على التوزيع المكاني الأولي للغشاء الحيوي من خلال منع اندفاعات الضغط التي قد تؤدي إلى انزلاق أو إزاحة الأغشية الحيوية عند تبديل السوائل المحقونة، وهو ما قد يحدث مع أجهزة أخرى مثل مضخات الحقنة. يوفر هذا المكون للمستخدم أيضا المرونة لتخصيص الظروف الجيوكيميائية المفروضة على الكائنات الدقيقة المقيمة. وأخيرا، وبما أنه يحافظ على توزيع الغشاء الحيوي الأولي، يسمح هذا الإعداد للمستخدم باختبار كيفية تأثير أشكال الغشاء الحيوي المختلفة أو كميات الكتلة الحيوية على توزيع ومعدل ترسيب أكسيد الغن.

ثانيا، سمح التخفيف من تكون وتسلل الفقاعات في فضاء المسام الميكروفلويدية بإجراء تجارب متعددة الأيام التقطت الجداول الزمنية البيئية ذات الصلة بالتمعدن الحيوي للغنيلات. الفقاعات، وهي مشكلة شائعة وغالبا حتمية في التجارب الطويلة فوق درجة حرارةالغرفة 62,63، يمكن أن تفكك وتمنع المسام الفردية، وتعيد توجيه تدفق السوائل، وتعطيل تقدم التفاعل. لمنع احتباس الفقاعات في الفراغ المسامي، كان المفاعل مشبعا بالكامل قبل التطعيم. لتقليل إدخال الفقاعات عبر نظام التحكم في التدفق، تم ضبط حاضنة المجهر على 30 درجة مئوية قبل التجربة بفترة طويلة، وتم غسل عدة أحجام من محلول التأثير قبل تركيب المفاعل المطعم. أزال هذا الخطوة الهواء المحبوس من الأنابيب والتركيبات وقلل من خطر خروج السائل أثناء التجربة. كما تم دمج مصيدة فقاعات في نظام التحكم في التدفق لالتقاط أي فقاعات متبقية، مع أنبوب PTFE ID بطول 200 ميكرومتر مثبت على مخرج المصيدة لزيادة المقاومة وتعزيز كفاءة إزالة الفقاعات. وأخيرا، لمنع احتجاز الهواء أو تسرب الهواء عند الواجهة بين الأنبوب المؤثر وفتحة مدخل المفاعل، تم إجراء جميع الوصلات بقطرات سائل على طرفي الأنبوب والثقب المثقوب، وتم تغطية أنبوب PTFE الكاره للماء بنسبة 1٪ PEG-DA، وتم الحفاظ على نهاية الأنبوب المدخل عموديا على سطح PDMS طوال التجربة.

ثالثا، دمج نظام إشعاع UVC مخصص في منصة التجربة حافظ على حالة حدودية جيوكيميائية محددة وتم تقييد التمعدن الحيوي للمونغن داخل فضاء المسام الميكروفلويدية. أظهرت التجارب التجريبية أن الأغشية الحيوية الخارجة في منطقة مدخل المفاعل ترسبت أكاسيد المونغنيوم في أعلى الفراغ المسامي، مما قيد توفر Mn(II) في الأسفل من المياه. منع تعريض منطقة المدخل والمخرج للمفاعل بشكل مؤقت بشكل صحيح بعد فترة عدم التدفق، تطور الأغشية الحيوية من أي بكتيريا ترسبت في البداية. منع تدفق السائل أحادي الاتجاه المستمر إعادة استعمار منطقة مدخل المفاعل بعد هذا العلاج الأولي بالأشعة فوق البنفسجية. أدى تعريض منطقة مخرج المفاعل عند t = 17.5 ساعة قبل بدء الطور الثابت وهطول أكسيد الميليغن المرئي إلى تقليل كمية تراكم المعادن أسفل الفراغ المسامي. سهل ذلك المقارنة المباشرة بين بيانات صور الحقول الساطعة الملونة مع كتلة Mn التي تم هضمها وقياسها باستخدام ICP-MS.

وفر الجمع بين طرح الصورة وقياسات كتلة النهاية طريقة شبه كمية لتقييم حركية ترسيب أكسيد الميليغن في الموقع. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن شدة البكسل تتوقف عن أن تكون متناسبة طرديا مع كتلة Mn أكسيد عند كثافة معدنية عالية جدا بسبب حساسية الكاميرا المحدودة للألوان الداكنة61. يمكن تحسين تقييم هذا السلوك غير الخطي عن طريق هضم عينات حمضية في نقاط زمنية محددة ومقارنة الكتلة المهضومة بالكتلة الأصلية التي تم قياسها بنقطة التجربة النهائية. إذا كان من الضروري قياس دقيق لكتلة المعدن، يمكن للمستخدمين تطوير منحنى معايرة باستخدام عينات معدنية ذات شدة وكتلة معروفة، وهو ما تم إثباته سابقا في Fadely وآخرون 61، أو إجراء قياسات مباشرة باستخدام فلورة أشعة إكس القائمة على السينكروترون.

يمكن تطبيق منصة الميكروفلويدية المعروضة هنا لدراسة عمليات التمعدن الحيوي تحت مجموعة واسعة من الظروف البيئية. بينما تم تحسين التجارب التمثيلية ل P. putida GB-1، يمكن استخدام هذا الإعداد لاختبار مجموعة من الكيمياء المؤثرة للمحلول بشكل منهجي (مثل تركيز Mn أو Fe، مصدر الكربون، وجود معادن متزامنة)، معدلات التدفق، درجات الحرارة، أو وجود اتحاد ميكروبي. يمكن محاكاة الظروف الحمضية أو الغاصمة المحددة، مثل تلك المواتية للبكتيريا المؤكسدة للحديد، عن طريق تقليل الرقم الهيدروجيني المؤثر أو تغطية PDMS ببوليمر غير منفذ للأكسجين. يمكن الحصول على رؤى حول الضوابط الميكروبية على التمعدن الحيوي من خلال تطبيق سلالات اندماج جينات الإبلاغ وتتبع التألق البصري الناتج 59,64. يمكن إعادة تصميم المفاعلات الميكروفلويدية لمحاكاة مجموعة من البيئات المسامية عن طريق تغيير توزيع حجم الجسيمات أو شكل الجسيمات أو المسامية، أو من خلال تحويل PDMS إلى وظيفة الشحنة السطحية لجزيئات الطين أو المادة العضوية الطبيعية. مع تعديلات إضافية (مثل استبدال ركيزة المفاعل الزجاجي بالبلاستيك)، يمكن للمفاعلات دعم قياسات طيفية مباشرة لحالة أكسدة المعادن، أو علم المعادن، أو ارتباطات العضويات-المعادن، أو امتصاص أو ترسيبه المعادن الثانوية. أخيرا، يمكن توسيع هذه المنصة التجريبية لدراسة ترسيب المعادن الحيوية المعدنية الأخرى (مثل الفوسفات، الكربونات، الكبريتيدات)، بشرط أن تكون خصائصها البصرية مميزة بما يكفي للسماح بتقسيم الصورة. لذلك، يوفر هذا البروتوكول إطارا للتحقيق الشامل في التمعدن الحيوي وتفاعلات الميكروبات المعدنية والسائل في البيئات المسامية ذات الصلة.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا المشروع مركز المؤسسة الوطنية للعلوم الأمريكية للجيوتكنيكس البيولوجية المستوحاة من العلوم الحيوية (ERC-1449501)، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (200021_188546)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الأمريكية (MCA-2322428، EAR-1847689، DMR-2003849). تم إجراء جزء من هذه الدراسة في مركز جامعة كاليفورنيا ديفيس للتصنيع النانوي والميكروي (CNM2). نشكر ستيفن لوسيرو ومسبك جامعة كاليفورنيا ديفيس للتقنية على تصميم وتصنيع حاضنة المجهر ونظام الإشعاع UVC. نشكر أيضا الدكتورة يوز وانغ والدكتور جيسون ديجونغ على توفير الهندسة المتوسطة المسامية المستخدمة في تصنيع المفاعلات الميكروفلويذية، والدكتورة أرونيما بهاتاشارجي، والدكتور نوح غوشي، والدكتور غريغوري جيراردي، والدكتور هايهيون كيم على المناقشات المفيدة و/أو تقديم التدريب على الطباعة الضوئية والطباعة الحجرية الناعمة. وأخيرا، نشكر الدكتور غايتان جيهين، والدكتورة تونيا كول، والدكتور فيليبو ميلي، والدكتور تشارلز جرادي على النقاشات القيمة حول تصميم التجارب وتحليل الصور.

المواد

```html
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 إلى 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08يُستخدم للواجهة بين مستشعر التدفق والتجهيزات بدون شفة.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744يُستخدم لصب الأطباق من أجل زراعة المخزون المجمد.
Air compressor (Jun-Air)ElveflowKCP-110يُستخدم لضغط وحدة التحكم في التدفق.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915يُستخدم للوسائط والحلول التجريبية.
Angled tweezersTDI International7-SAيُستخدم لربط الأنبوب بمفاعل الميكروفلويديك.
AutoCAD softwareAutodesk --يُستخدم لتصميم هندسة مفاعل الميكروفلويديك.
AutoclaveSteris--يُستخدم لتعقيم المواد والسوائل. 
BalanceMettler ToledoME2002Tيُستخدم لوزن قاعدة إيلاستم PDMS وعامل المعالجة.
Barbed adapter (1/4-28 swivel إلى 3/32-in barbed)ElveflowKFI-06يُستخدم لتوصيل أنبوب البولي إيثر البولي يوريثين بالشبكة وحامل الخزان السائل.
Biopsy punch (Rapid-Core, 1.2-mm diameter)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25يُستخدم لثقب فتحات الدخول/الخروج في قنوات PDMS الميكروفلويديك. 
Bleach (Chlorox)ULINES-19719يُستخدم لتعقيم نظام التحكم في التدفق. يُخفف إلى 1٪ في ماء فائق النقاء.
Blunt-tip needle (Jensen Global, 21-gauge)QSourceJG21-10HPX-J004يُستخدم لتوصيل الأنبوب بالحقن. يُعقم بالبخار لمدة 30 دقيقة.
Bunsen burnerHumboldtH-5970يُستخدم للحفاظ على مساحة عمل تجريبية معقمة.
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79يُستخدم للوسائط والحلول التجريبية.
Casamino acid (Fisher BioReagents, acid casein peptone)Fisher ScientificBP1424يُستخدم للوسائط التجريبية.
Cell density meter (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906يُستخدم لقياس OD600 للثقافات البكتيرية. 
Clear tape (Scotch Magic)ULINES-10223يُستخدم لمنع الطين من الالتصاق بقنوات PDMS الميكروفلويديك.
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599يُستخدم للوسائط والحلول التجريبية.
Compressed nitrogenAirgasNIUHP300يُستخدم لتجفيف مكونات المفاعل الميكروفلويديك.
Conical tube (Falcon, 15-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-959-49Bيُستخدم للحلول المتدفقة وعينات ICP-MS. مُعقم مسبقًا.
Conical tube (Falcon, 50-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-432-22يُستخدم لزراعة LB المسبقة. مُعقم مسبقًا.
Copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027يُستخدم للوسائط والحلول التجريبية.
Cutting matULINES-18543يُستخدم لقطع قنوات PDMS الميكروفلويديك وثقبها لفتحات الدخول/الخروج.
Cuvette (Fisherbrand, 1.5-mL volume, polystyrene)Fisher Scientific 14-955-127يُستخدم لقياس OD600 للثقافات البكتيرية. 
Digital camera (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115يُستخدم لتصوير التباين اللوني والوقت لتجارب الميكروفلويديك.
Distribution valve (MUX)ElveflowMUX-D-12يُستخدم للحقن المتسلسل لسوائل متعددة.
Elveflow Smart Interface (ESI) softwareElveflow --يُستخدم للتحكم في معدل/ضغط التغذية المرتدة بين وحدة التحكم في التدفق ومستشعر التدفق وأداء تبديل صمام التوزيع.
Erlenmeyer flask (Fisherbrand, 50-mL volume)Fisher ScientificFB50050يُستخدم للزراعة في منتصف المرحلة الأسية. مُعقم بالبخار لمدة 30 دقيقة.
Ethanol (Fisher Chemical, reagent alcohol, 90% purity, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4يُستخدم لتنظيف PDMS وألواح الغطاء لصُنع المفاعل. يُخفف إلى 70٪ في ماء فائق النقاء.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSيُستخدم للوسائط والحلول

المراجع

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
  5. Peña, J., et al. Mechanisms of nickel sorption by a bacteriogenic birnessite. Geochim Cosmochim Acta. 74, 3076-3089 (2010).
  6. Toner, B., Manceau, A., Webb, S. M., Sposito, G. Zinc sorption to biogenic hexagonal-birnessite particles within a hydrated bacterial biofilm. Geochim Cosmochim Acta. 70, 27-43 (2006).
  7. Castro, L., Blázquez, M. L., González, F., Muñoz, J. A., Ballester, A. Heavy metal adsorption using biogenic iron compounds. Hydrometallurgy. 179, 44-51 (2018).
  8. Whitaker, A. H., Duckworth, O. W. Cu, Pb, and Zn sorption to biogenic iron (oxyhydr)oxides formed in circumneutral environments. Soil Syst. 2, 18 (2018).
  9. Brüggenwirth, L., et al. Interactions of manganese oxides with natural dissolved organic matter: implications for soil organic carbon cycling. Geochim Cosmochim Acta. 366, 182-200 (2024).
  10. Li, H., Santos, F., Butler, K., Herndon, E. A critical review on the multiple roles of manganese in stabilizing and destabilizing soil organic matter. Environ Sci Technol. 55, 12136-12152 (2021).
  11. Li, Q., Hu, W., Li, L., Li, Y. Interactions between organic matter and Fe oxides at soil micro-interfaces: quantification, associations, and influencing factors. Sci Total Environ. 855, 158710 (2023).
  12. Song, X., et al. Towards a better understanding of the role of Fe cycling in soil for carbon stabilization and degradation. Carbon Res. 1, 5 (2022).
  13. Hennebel, T., De Gusseme, B., Boon, N., Verstraete, W. Biogenic metals in advanced water treatment. Trends Biotechnol. 27, 90-98 (2009).
  14. Marsidi, N., Abu Hasan, H., Sheikh Abdullah, S. R. A review of biological aerated filters for iron and manganese ions removal in water treatment. J Water Process Eng. 23, 1-12 (2018).
  15. Li, Y., Xu, Z., Ma, H., Hursthouse, A. S. Removal of manganese(II) from acid mine wastewater: a review. Water. 11, 2493 (2019).
  16. Li, S., et al. Biomineralization mediated by iron-oxidizing microorganisms. Minerals. 15, 868 (2025).
  17. Skousen, J., et al. Review of passive systems for acid mine drainage treatment. Mine Water Environ. 36, 133-153 (2017).
  18. Post, J. E. Manganese oxide minerals: crystal structures and economic and environmental significance. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 3447-3454 (1999).
  19. Cornell, R. M., Schwertmann, U. . The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences and uses. , (2003).
  20. Cosmidis, J., Benzerara, K. Why do microbes make minerals?. C R Geosci. 354, 1-39 (2022).
  21. Ehrlich, H., Bailey, E., Wysokowski, M., Jesionowski, T. Forced biomineralization: a review. Biomimetics. 6, 46 (2021).
  22. Hoffmann, T. D., Reeksting, B. J., Gebhard, S. Bacteria-induced mineral precipitation: a mechanistic review. Microbiology. 167, 001049 (2021).
  23. Hansel, C. M., Learman, D. R., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of manganese. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  24. Tebo, B. M., Johnson, H. A., McCarthy, J. K., Templeton, A. S. Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends Microbiol. 13, 421-428 (2005).
  25. Kappler, A., Emerson, D., Gralnick, J. A., Roden, E. E., Muehe, E. M., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of iron. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  26. Emerson, D., Fleming, E. J., McBeth, J. M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective. Annu Rev Microbiol. 64, 561-583 (2010).
  27. Fortin, D., Langley, S. Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals. Earth Sci Rev. 72, 1-19 (2005).
  28. Konhauser, K. O. Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol Rev. 20, 315-326 (1997).
  29. Toner, B., et al. Spatially resolved characterization of biogenic manganese oxide production. Appl Environ Microbiol. 71, 1300-1310 (2005).
  30. Miot, J., et al. Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol. 75, 5586-5591 (2009).
  31. Bottero, S., Storck, T., Heimovaara, T. J., van Loosdrecht, M. C. M., Enzien, M. V., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29, 1069-1086 (2013).
  32. Dentz, M., Le Borgne, T., Englert, A., Bijeljic, B. Mixing, spreading and reaction in heterogeneous media: a brief review. J Contam Hydrol. 120-121, 1-17 (2011).
  33. Gerke, H. H. Preferential flow descriptions for structured soils. J Plant Nutr Soil Sci. 169, 382-400 (2006).
  34. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Rev Environ Sci Biotechnol. 21, 27-52 (2022).
  35. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30, 1505-1527 (2007).
  36. Toyoda, K., Tebo, B. M. The effect of Ca2+ ions and ionic strength on Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 101, 1-11 (2013).
  37. Toyoda, K., Tebo, B. M. Kinetics of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 189, 58-69 (2016).
  38. Learman, D. R., Wankel, S. D., Webb, S. M., Martinez, N., Madden, A. S., et al. Coupled biotic–abiotic Mn(II) oxidation pathway mediates the formation and structural evolution of biogenic Mn oxides. Geochim Cosmochim Acta. 75, 6048-6063 (2011).
  39. Bargar, J. R., et al. Biotic and abiotic products of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. Am Mineral. 90, 143-154 (2005).
  40. Mao, Q., Qin, W., Yan, B., Luo, L. Ferrous iron oxidation efficiency and kinetics by indigenous iron-oxidizing bacteria in acid mine drainage. Environ Technol Innov. 36, 103785 (2024).
  41. Farnsworth, C. E., Voegelin, A., Hering, J. G. Manganese oxidation induced by water table fluctuations in a sand column. Environ Sci Technol. 46, 277-284 (2012).
  42. Haukelidsaeter, S., et al. Efficient chemical and microbial removal of iron and manganese in a rapid sand filter and impact of regular backwash. Appl Geochem. 162, 105904 (2024).
  43. Li, C., et al. Immobilization of iron- and manganese-oxidizing bacteria with a biofilm-forming bacterium for effective removal of iron and manganese from groundwater. Bioresour Technol. 220, 76-84 (2016).
  44. Breda, I. L., Søborg, D. A., Ramsay, L., Roslev, P. Manganese removal processes during start-up of inoculated and non-inoculated drinking water biofilters. Water Qual Res J. 54, 47-56 (2019).
  45. Zhu, X., Wang, K., Yan, H., Liu, C., Zhu, X., et al. Microfluidics as an emerging platform for exploring soil environmental processes: a critical review. Environ Sci Technol. 56, 711-731 (2022).
  46. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., de Anna, P., Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).
  47. Aufrecht, J. A., Fowlkes, J. D., Bible, A. N., Morrell-Falvey, J., Doktycz, M. J., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14, e0218316 (2019).
  48. Kurz, D. L., et al. Competition between growth and shear stress drives intermittency in preferential flow paths in porous medium biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 119, e2122202119 (2022).
  49. Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. Morphogenesis of biofilms in porous media and control on hydrodynamics. Environ Sci Technol. 57, 5666-5677 (2023).
  50. Borer, B., Tecon, R., Or, D. Spatial organization of bacterial populations in response to oxygen and carbon counter-gradients in pore networks. Nat Commun. 9, 769 (2018).
  51. Ceriotti, G., Borisov, S. M., Berg, J. S., de Anna, P. Morphology and size of bacterial colonies control anoxic microenvironment formation in porous media. Environ Sci Technol. 56, 17471-17480 (2022).
  52. Park, S., Anggraini, T. M., Chung, J., Kang, P. K., Lee, S. Microfluidic pore model study of precipitates induced by pore-scale mixing of an iron sulfate solution with simulated groundwater. Chemosphere. 271, 129857 (2021).
  53. Wielinski, J., et al. Spatiotemporal mineral phase evolution and arsenic retention in microfluidic models of zerovalent iron-based water treatment. Environ Sci Technol. 56, 13696-13708 (2022).
  54. Elmaloglou, A., et al. Microfluidic study in a meter-long reactive path reveals how structural heterogeneity shapes MICP-induced biocementation. Sci Rep. 12, 19553 (2022).
  55. Wang, Y., Soga, K., DeJong, J. T., Kabla, A. J. A microfluidic chip and its use in characterising particle-scale behaviour of microbial-induced calcium carbonate precipitation. Géotechnique. 69, 1086-1094 (2019).
  56. Wang, Y., et al. Microscale investigations of temperature-dependent microbially induced carbonate precipitation in the range 4–50 °C. Acta Geotech. 18, 2239-2261 (2023).
  57. Pucetaite, M., Ohlsson, P., Persson, P., Hammer, E. Shining new light into soil systems: spectroscopy in microfluidic soil chips reveals microbial biogeochemistry. Soil Biol Biochem. 153, 108078 (2021).
  58. Geszvain, K., McCarthy, J. K., Tebo, B. M. Elimination of manganese(II,III) oxidation in Pseudomonas putida GB-1 by a double knockout of two putative multicopper oxidase genes. Appl Environ Microbiol. 79, 357-366 (2013).
  59. Gehin, G., et al. Population-level control of two manganese oxidases expands the niche for bacterial manganese biomineralization. NPJ Biofilms Microbiomes. 11, 1-12 (2025).
  60. Ramos, G., Toulouze, C., Rima, M., Liot, O., Duru, P., et al. Ultraviolet control of bacterial biofilms in microfluidic chips. Biomicrofluidics. 17, 024107 (2023).
  61. Fadely, E. C., et al. Enhanced manganese oxidation at the biofilm–fluid interface drives pore-scale patterns in mineral precipitation. Environ Sci Technol. 60, 654-663 (2026).
  62. Lochovsky, C., Yasotharan, S., Günther, A. Bubbles no more: in-plane trapping and removal of bubbles in microfluidic devices. Lab Chip. 12, 595-601 (2012).
  63. Pereiro, I., Khartchenko, A. F., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: a guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19, 2296-2314 (2019).
  64. Gehin, G., et al. Pseudomonas putida coordinates the expression of two manganese oxidases and optimizes manganese oxide precipitation in response to aqueous Mn(II). Environ Sci Technol. 59, 13777-13786 (2025).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Pseudomonas Putida

مقالات ذات صلة