نضج بويضات الفأر في المختبر، والتخصيب، وزراعة الأجنة قبل الانغراس

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراءات النضج المختبري لبويضات الفئران، والتلقيح الصناعي ، والزراعة الجنينية اللاحقة حتى مرحلة الكيسة الأريمية.

الملخص

نضج بويضات الفئران في المختبر ، مع التلقيح الصناعي وزرع الأجنة اللاحق، يمكن من توليد الأجنة قبل الزرع تحت ظروف محددة. تسهل هذه الإجراءات دراسة الوظائف البيولوجية والآليات الجزيئية الكامنة وراء نضج البويضات، والتخصيب، وتطور الأجنة المبكر. ومع ذلك، يعتمد التطبيق الناجح لهذا النهج على التعامل الدقيق مع البويضات والحيوانات المنوية، وظروف الزراعة المناسبة، والتقييم الدقيق لتقدم النمو في كل مرحلة. هنا، نصف طرق عزل مركبات الركام-البويضات غير الناضجة (COCs) من مبايض الفئران، ونضج البويضات في المختبر ، والتلقيح الصناعي ، والزراعة المخبرية للأجنة حتى مرحلة الكيسة الأريمية. تشمل هذه الإجراءات تحضير وتوازن أطباق الأوساط والزراعة، وعزل واختيار الكليمات المائية بعد تشريح المبيض، وجمع الحيوانات المنوية وتسعتها، وإجراء التلقيح في ظروف موحدة، ثم زراعة الأجنة لتقييم النمو. يتم تقييم تقدم النمو باستخدام معايير شكلية، بما في ذلك تكوين النوى البنوية الذكرية والأنثوية، والانقسام إلى مرحلة الخلية، وتكوين الكيسة الأريمية. يمكن دمج هذا البروتوكول في دراسات نضج البويضات ووظيفة عامل الأم، مما يوفر أداة قيمة للبحث الأساسي في علم الأحياء التناسلي للثدييات.

المقدمة

فهم جودة البويضة وكفاءتها التطورية أمر أساسي لتحقيق التخصيب الناجح والتطور الجنيني اللاحق ^1,2. يتطلب نضج البويضات ليس فقط فصلا دقيقا للكروموسومات أثناء النضج النووي، بل أيضا النضج السيتوبلازمي، بما في ذلك إعادة توزيع العضيات وتراكم الحمض النووي المغناطيسي المتعدد الأم والبروتينات³. يعتمد التطور الجنيني المبكر على mRNA والبروتينات التي توفرها الأم، وتدعم المخزونات الأمومية في البويضة تطور ما قبل الانغراس. ومع ذلك، لا تزال هويات ووظائف العديد من منظمي الأم لتكوين الأجنة في الثدييات غير مفهومة بشكل كامل.⁴. لذلك، هناك حاجة إلى دراسات منهجية إضافية لتوضيح الآليات الكامنة وراء نضج البويضات، والتخصيب، وتطور الأجنة.

يعد الفأر نظاما نموذجيا مستخدما على نطاق واسع للتحقيق في تطور الأجنة قبل الانغراس. يشير النضج في المختبر (IVM) إلى جمع البويضات غير الناضجة من المبيض ونضجها تحت ظروف مختبرية مضبوطة⁵. لاحقا، يتيح التلقيح الصناعي (IVF) حضانة البويضات الناضجة مع الحيوانات المنوية المكثفة لتوليد زيجوت لدراسات التطور الجنيني المبكرة. ومع ذلك، مقارنة بالتلقيح الصناعي التقليدي باستخدام البويضات الناضجة في الجسم الحي، غالبا ما تظهر البويضات المشتقة من IVM معدلات نضج وتخصيب أقل وانخفاض في كفاءة التطور⁶. تعزى هذه القيود إلى حد كبير إلى عدم التزامن بين النضج النووي والسيتوبلازم تحت ظروف الزراعة المختبرية . علاوة على ذلك، فإن استقرار المغزل الانقساطي في بويضات الفئران حساس لتغيرات الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة أثناء الانقسام الداخلي، وقد يساهم اضطراب المغزل في توقف النضج⁷. وبالتالي، يظل انخفاض كفاءة البويضات المشتقة من IVM عائقا رئيسيا، يحد من إنتاج الأجنة الفعال للدراسات التطورية والميكانيكية.

يمكن أيضا الحصول على أجنة ما قبل الزرع من خلال جمع الزيجوت المشتقة من الجسم الحي وزراعتها في المختبر (IVC). توفر الزيجوت المشتقة من الجسم الحي التي جمعت من قنوات البيض نقطة انطلاق متزامنة نسبيا للتجارب التي تركز على أحداث ما بعد الإخصاب⁸. ومع ذلك، يحدث نضج البويضات وتراكم العوامل الأمومية قبل التخصيب في الجسم الحي؛ لذا، في الداخل الحي، تكون الزيجوت المشتقة من الجسم أقل قابلية للتلاعب التجريبي في ظروف النضج أو المخزونات الأمومية لتقييم تأثيراتها على تطور الجنين اللاحق⁴. لذلك، فإن تحسين بروتوكولات IVM وIVF واعتماد إجراءات تشغيل موحدة مع رقابة جودة صارمة (مثل الإدارة الصارمة لدرجة الحرارة، الرقم الهيدروجيني، وممارسات التعامل مع الجهاز) أمر ضروري لتقليل التغيرات المتعلقة بالإجراءات وحماية كفاءة نمو البويضات والجنين.

هنا، نصف بروتوكول IVM–IVF–IVC الذي يوضح تحضير الوسائط، وعزل واختيار COCs، وإجراءات IVM وIVF، وزراعة الأجنة في المختبر (الشكل 1). يتضمن البروتوكول نقاط تحقق عملية وخاصة بالمراحل لمراقبة الجودة الروتينية، بما في ذلك بروز الجسم القطبي الأول (PB1)، وتكوين النوى الأولية للذكر والأنثى (2PN)، وانقسام الخليتين، وتكوين الكيسة الأريمية. يتيح هذا البروتوكول توليد أجنة قابلة للتكرار وفعالة قبل الزرع تحت ظروف محددة، مما يدعم الدراسات الميكانيكية، وتحسين التربية، والتطبيقات اللاحقة في علم الأحياء التطوري والتكاثري.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع تجارب الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة نورثويست A&F في الصين (رقم التصريح: 20230503).

1. صيانة الحيوانات

1. احصل على أنثى النوع البري C57BL/6 وذكور فئران DBA/2 واحتفظ بها في ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) محددة، مع دورة ضوء وظلام لمدة 12 ساعة بدرجة حرارة 20–22 درجة مئوية ورطوبة 55٪ ± 10٪. وفر نظاما غذائيا للتربية والماء بحرية اللازم. ذكور الفئران المنزلية منفردة (ذكر واحد لكل قفص).

2. تحضير وسائل الإعلام

1. لتحضير محلول عامل PMSG بسعة 50 وحدة دولية/مل، قم بإذابة 5000 وحدة دولية من غدد التناسل الحاملة (PMSG) في 100 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
   ملاحظة: قم بتقسيم المحلول إلى أجزاء 1 مل للاستخدام مرة واحدة وخزنها عند -20 درجة مئوية. قم بإذابة كل قطعة في درجة حرارة الغرفة مباشرة قبل الاستخدام.
2. لتحضير وسط زراعة IVM، أضف المكونات المدرجة في الجدول 1 إلى 100 مل من الوسط الأساسي 199 (M199). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3–7.4، ثم قم بترشيح الوسط بالتعقيم عبر فلتر 0.22 ميكرومتر إلى زجاجات وسط معقم. ضع علامة "IVM" على الزجاجة بالأحرف الأولى وتاريخ الصنع وتاريخ الانتهاء، واحتفظ بها على درجة حرارة 4 °م لمدة تصل إلى شهر واحد.
3. لتحضير محلول هيالورونيداز بنسبة 0.1٪ (بدون حجم/ضج)، قم بإذابة 10 ملغ من الهيالورونيداز في 10 مل من وسط M2.
   ملاحظة: قم بتخزين كميات للاستخدام الواحد بمقدار 1 مل عند –20 درجة مئوية ودفأة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

3. تحضير الأطباق (الشكل 2)

ملاحظة: قم بضبط عدد قطرات IVM وIVF وIVC وفقا للأعداد المتوقعة من COCs والأجنة، باستخدام 20–30 COC لكل 100 ميكرولتر للتلقيح الصناعي والتلقيح الصناعي و20–30 جنينا لكل 100 ميكرولتر لزراعة الأجنة.

1. جهز عددا مناسبا من أطباق جمع البويضات بحجم 35 مم، كل منها يحتوي على 2 مل من وسط M2 مع تغذية 0.2 ملليمتر 3-إيزوبيوتيل-1-ميثيلزانثين (IBMX). استخدم طبقا واحدا لثقب المبايض وجمع مركبات الأكبن (طبق لكل أنثين)، وآخر لغسل الزينة. سخن الصحون إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. حضر أطباق IVM.
   1. في طبق بحجم 60 مم، حضر خمس قطرات بحجم 100 ميكرولتر من وسط IVM للغسل (ضع علامة على الطبق ك "IVM wash").
   2. في طبق منفصل بحجم 60 مم، حضر عدة قطرات بحجم 100 ميكرولتر من وسط IVM للنضج (ضع علامة "IVM").
   3. أضف بحذر كمية كافية من الزيت المعدني لتغطية القطرات، ونظم الصحون على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة_CO2 بنسبة 5٪ لمدة لا تقل عن ساعتين قبل بدء جمع البويضات.
3. حضر أطباق أطفال الأنابيب.
   1. في طبق بحجم 60 مم، حضر قطرة أو قطرتين بحجم 300 ميكرولتر من وسط زراعة الأجنة المسبق التوازن لإطلاق الحيوانات المنوية وتقيؤها (وسم الطبق ك "تقويم الحيوانات المنوية").
      ملاحظة: يتم إعداد القطرة الثانية للسعة كاحتياطي للحالات التي يكون فيها حركة الحيوانات المنوية في القطرة الأولى غير كافية، أو يجب جمع عينة جديدة من الحيوانات المنوية البربخية وتسعها، أو يجب تعديل تركيز الحيوانات المنوية قبل التلقيح.
   2. حضر طبقين منفصلين بحجم 60 مم، كل منهما يحتوي على خمس قطرات من وسط الزراعة المتوازن مسبقا بحجم 100 ميكرولتر للغسل (ضع علامة على الطبق ك "غسل أطفال الأنابيب الصناعي").
      ملاحظة: استخدم طبق "غسل أطفال الأنابيب" لغسل الكونورات الناضجة في IVM قبل التلقيح، واستخدم طبق "غسل التلقيح الصناعي" الآخر لغسل الزيجوت المفترضة بعد الحضانة المشتركة لإزالة خلايا الركام والحيوانات المنوية المتبقية.
   3. في طبق منفصل بحجم 60 مم، حضر عدة قطرات بحجم 100 ميكرولتر من وسط زراعة الأجنة المسبق التوازن للتلقيح (وسم الطبق باسم "IVF").
      ملاحظة: يستخدم وسط زراعة الأجنة المسبق التوازن لكل من تسعة الحيوانات المنوية والتلقيح للحفاظ على ظروف ثابتة أثناء تحضير الحيوانات المنوية والتخصيب.
   4. أضف بعناية كمية كافية من الزيت المعدني لتغطية القطرات، ونظم الصحون على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة_CO2 بنسبة 5٪ لمدة لا تقل عن 12 ساعة قبل بدء إجراء تقويم الحيوانات المنوية.
4. حضر أطباق IVC.
   1. في طبق بحجم 60 مم، حضر خمس قطرات بحجم 100 ميكرولتر من وسط زراعة الأجنة المسبق التوازن لغسل الأجنة (وضع علامة على الطبق "غسل IVC").
   2. في طبق منفصل بحجم 60 مم، حضر عدة قطرات بحجم 100 ميكرولتر من وسط زراعة الأجنة المسبق التوازن لزراعة الأجنة (وسم الطبق باسم "IVC").
   3. أضف بحذر كمية كافية من الزيت المعدني لتغطية القطرات، ونظم الصحون على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة بتركيز ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة لا تقل عن 12 ساعة قبل بدء زراعة الأجنة.

4. مجموعة المبايض

1. أعط 10 جرعات من PMSG داخل الصفاق لفئران الإناث C57BL/6 في عمر 8–10 أسابيع.
2. بعد 48 ساعة من حقن PMSG، قم بقتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم وضعه مستلقيا. رش البطن بنسبة 70٪ إيثانول لترطيب الفرو ومنعه من دخوله إلى تجويف البطن.
3. باستخدام مقص دقيق للتشريح، قم بعمل شق صغير في أسفل البطن وافتح الجلد بلطف باستخدام اليدين المكسوتين بالقفازات لكشف الغشاء البريتوني.
4. افتح الغشاء الصفاقي وحرك الأمعاء جانبا برفق. حدد موقع القرن الرحمي واتبعه نحو المبيض. حدد المبيض بالقرب من الكلية، وغالبا ما يكون محاط بوسادة دهنية.
5. استخدم مقصا دقيقا لفصل المبيض عن قرن الرحم، وقص الأنسجة الضامة والدهون الزائدة.
6. انقل المبايض فورا إلى وسط M2 مسخن مسبقا مع إضافة IBMX. كرر العملية لجمع المبيض المقابل ونقله إلى نفس الطبق.
7. ضع الطبق تحت المجهر المجسم وتابع عملية ثقب الجريبات وجمع الصبغات.

5. جمع COCs وثقافتها

1. تحت المجهر المجسم، قم بلطف بثقب الجريبات الأنفترالية المرئية باستخدام إبرة حقنة معقمة لإطلاق مركبات الطيور في وسط M2.
   ملاحظة: عند جمع بويضات المرحلة العظيمية للفئران، تفضل أن تطعن بصيلات الصدر الكبيرة على سطح المبيض، والتي عادة ما تبدو منتفخة وشبه شفافة مع تجويف أنترال شفاف.
2. باستخدام ماصحة باستور زجاجية مسحوبة بدقة، اجمع ناقلات الكربون المطبوعة المنبعثة وانقلها إلى طبق نظيف بقطر 35 مم يحتوي على وسط M2 مسخن مسبقا مع IBMX.
3. غسل مركبات ال COC عن طريق النقل التسلسلي إلى منطقة نظيفة من الطبق 35 مم حسب الحاجة لإزالة خلايا الحبيبات المنفصلة وحطام الأنسجة، مع ترك الحطام خلفه في كل نقل (الشكل 3).
   ملاحظة: استخدم فقط COCs ذات ثلاث طبقات خلايا ركامية مضغوطة أو أكثر وسيتوبلازم محبب بشكل منتظم بدون فراغات واضحة للخطوات^{التالية 9,10}. يتم استبعاد بويضات GV الخالية من البويضات المغلفة جزئيا بالكتلة الجزئية من هذا البروتوكول. في ظل ظروفنا التجريبية، تم الحصول على متوسط 26 وحدة COC غير ناضجة لكل أنثى فأرة.
4. بعد إزالة الحطام، انقل COCs إلى طبق الغسيل IVM واغسلها بالنقل المتسلسل عبر خمس قطرات بحجم 100 ميكرولتر من وسط الغسيل IVM.
   ملاحظة: أثناء النقلات، قلل حجم النقل لمنع التلوث المتقاطع بين القطرات.
5. نقل مركبات الكربون المغسولة إلى قطرة 100 ميكرولتر من وسط IVM (20–30 COC لكل قطرة) وزراعة عند 37 درجة مئوية في_CO2 بنسبة 5٪ لمدة 14 ساعة.
   ملاحظة: جمع وغسل ونقل COCs إلى وسط IVM مع تأخير بسيط للمساعدة في الحفاظ على إمكانيات النمو.
6. (اختياري) بعد IVM، قم بحضن COCs لفترة وجيزة في 1 ملغ/لتر هيالورونيداز وقم بعمل ماصة برفق مرارا وتكرارا باستخدام ميكروبايبت حتى يتم إزالة خلايا الركام بالكامل.
   ملاحظة: قلل من التعرض للهيالورونيداز إلى حد لا يزيد عن 3 دقائق، لأن التعرض المطول قد يضر بالبويضات.
7. (اختياري) اغسل البويضات العارية في وسط M2 طازج على مرحلة مسخنة، ثم قيم نضج البويضات تحت المجهر المجسم.
8. (اختياري) تعتبر الخلايا المائية ذات الجسم القطبي الأول المبثور ناضجة وفي مرحلة الطور الثاني (MII). احسب معدل النضج كأنه عدد البويضات ذات الجسم القطبي الأول المنبثق مقسوما على إجمالي عدد البويضات المزروعة.
   ملاحظة: تستخدم الخطوات 5.6–5.8 لتقييم نضج الخلايا بعد IVM عن طريق إزالة مجموعة تقييم محددة قبل تقييم PB1. هذه الخطوات ليست مطلوبة للعمليات التي تذهب مباشرة إلى أطفال الأنابيب.

6. جمع الحيوانات المنوية وتحضيرها

ملاحظة: يصف هذا القسم جمع وتنشيط الحيوانات المنوية الطازجة. قبل التلقيح، يجب حضانة الحيوانات المنوية الطازجة في وسط زراعة جنين مسبق التوازن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بالتكوين.

1. قم بقتل ذكر ناضج واحد من فأر DBA/2 (عمره 10–16 أسبوعا) وإزالة مشاكل الذيل البربخية، مع تجنب أكبر قدر ممكن من الدهون والدم وسوائل الأنسجة (الشكل 4).
2. لكل ذكر، انقل كلا الذيلين البريديميدين إلى قطرة 300 ميكرولتر من وسط G-IVF مسبق التوازن لإطلاق الحيوانات المنوية وتقويصها.
3. قم بتثبيت بربخ الذيل باستخدام ملقط، وقم بعمل خمسة إلى سبع جروح في البربخ الذيلي باستخدام إبرة حقنة معقمة، ثم اضغط بلطف على الأنسجة لإطلاق الحيوانات المنوية المركزة.
   ملاحظة: قيم حركة الحيوانات المنوية وابدأ فقط عندما تظهر غالبية الحيوانات المنوية حركة تقدمية (PR)، والتي تعرف بالحركة النشطة للأمام، بدلا من الحركة غير التقدمية (NP) أو عدم الحركة¹¹.
4. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ لمدة ساعة واحدة للسماح بتكوين الحيوانات المنوية.

7. التلقيح الصناعي

1. بعد 14 ساعة من IVM، اغسل COCs بالنقل التسلسلي عبر خمس قطرات بحجم 100 ميكرولتر من وسط غسيل IVF، ثم انقل COCs المغسولة إلى قطرات تلقيح IVF (20–30 COC لكل قطرة 100 ميكرولتر).
2. حضن طبق التسميد الذي يحتوي على مركبات الكربون المكونة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 30 دقيقة قبل التلقيح.
3. بعد التكثف، حدد تركيز الحيوانات المنوية باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي.
4. استنادا إلى تركيز الحيوانات المنوية، احسب حجم اللقاح المطلوب وأضف الحيوانات المنوية السعة إلى كل قطرة تلقيح صناعي لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 4 ×^{10 5} –1 × 10⁶ حيوانات منوية/مل.
   ملاحظة: بعد إضافة الحيوانات المنوية، تأكد من وجود حيوانات منوية متحركة في كل قطرة تلقيح.
5. حضن أطباق التلقيح الصناعي التي تحتوي على مركبات الطيور والحيوانات المنوية عند حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ لمدة 4–6 ساعات.

8. ثقافة الأجنة

1. بعد 4–6 ساعات من الحضانة، استخدم ماصة باستور زجاجية مسحوبة بدقة بقطر داخلي أكبر قليلا من البويضة لاستنشاق الزيجوت المفترض بحجم ضئيل ونقلها إلى قطرات غسل التلقيح الصناعي.
2. اغسل الزيجوت المفترضة عن طريق النقل المتسلسل عبر خمس قطرات غسيل أطفال الأنابيب، مع إزالة الماصات بلطف داخل كل قطرة لإزالة السائل المنوي والحطام الزائد (الشكل 5).
3. انقل الزيجوت المفترض المغسول إلى طبق الغسيل IVC واغسلها بالنقل المتسلسل عبر خمس قطرات غسيل وسط زراعة الأجنة المسخن مسبقا، مما يقلل من انتقال وسط التلقيح الصناعي.
4. ضع الزيجوت المفترضة في قطرات الزراعة المتوسطة لزراعة الأجنة، والزراعة عند 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ CO₂ (20–30 جنينا لكل قطرة 100 ميكرولتر).
5. بعد 6–8 ساعات من التلقيح، قيم الإخصاب تحت المجهر المجسم عن طريق تسجيل وجود النوى الذكرية والأنثوية، وتخلص من البويضات التي تحتفظ بجسم قطبي واحد فقط ولا تظهر أي نوى مرئية.
6. بعد 24 ساعة من التلقيح، عد عدد الأجنة ذات الخلية الثنائية واحسب معدل الخلية الثنائية ك (أجنة ثنائية الخلية / بويضات متلقحة).
7. بعد العد، قم بإزالة وتخلص من الأجنة غير المقطوعة، واستمر في زراعة الأجنة المقطوعة المتبقية.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، قد يتم تزجيج الأجنة، أو نقلها إلى الإناث المتلقيات، أو الحفاظ عليها في الزراعة حتى مرحلة الكيسة الأريمية.
8. استمر في زراعة الأجنة تحت نفس ظروف الحضانة حتى 96 ساعة بعد التلقيح (hpi). تقييم تكوين الكيسة الأريمية عند 96 حصان في البوصة بناء على معايير شكلية.
   ملاحظة: لا حاجة لتغيير المتوسط إضافي خلال هذه الفترة. يتم التعرف على الكيسة الأريمية الطبيعية بوجود تجويف مرئي للبلاستوكويل، وكتلة خلية داخلية مميزة، وطبقة تغذية للأديم سليمة.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، تمت معالجة COCs للفئران بشكل متسلسل من خلال النضج المختبري ، والتلقيح الصناعي ، والزراعة الجنينية في المختبر ، مما أدى إلى توليد أجنة قابلة للتكرار قبل الزرع وتطور إلى مرحلة الكيسة الأريمية في الظروف الموصوفة. بعد 14 ساعة من IVM، أظهرت مراكز البكرات عادة توسع الركام وشكل البويضات سليمة. تم قياس نضج البويضات الانقسام عن طريق إزالة مجموعة تقييم محددة بعد IVM وتسجيل بروز PB1 (الشكل 6A). عبر ثلاث نسخ مستقلة، بل...

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول إجراء موحدا لنضج بويضات الفئران في المختبر، والتلقيح الصناعي، والزراعة في المختبر باستخدام مركبات الطيران غير الناضجة، مما يتيح توليد وتقييم الأجنة قبل الزرع القابلة للتكرار وتقييمها خلال مرحلة الكيسة الأريمية تحت ظروف مختبر محددة. في العديد من الدراسات، تكون نتائج IVM حساسة للفروق الخاصة بالمختبر في الأوساط وأوقات الحضانة والتعامل، مما قد يقلل من الكفاءة التنموية بعد IVM^12,13

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(preequilibriated) medium for culturing embryos
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X