تحديد مكونات الشلل الدماغي المضادة للشلل الدماغي المستهدفة ل AChE من كوبتيس شينينسيس باستخدام الترشيح الفائق للتقارب والتحقق التجريبي

ملخص

كان هدف هذه الدراسة تحديد المكونات الفعالة الرئيسية لكوبتيس شينينسيس وتوضيح تأثيره في تدخل الشلل الدماغي (CP) من خلال الترشيح الفائق للألفة والتحقق التجريبي.

الملخص

كان هدف هذه الدراسة تحديد المكونات النشطة الرئيسية لكوبتيس شينينسيس وتوضيح آليات عملها في تدخل الشلل الدماغي (CP) عن طريق الترشيح الفائق للألفة. باستخدام إنزيم أستيل كولينستيراز (AChE) كهدف، تم فحص الكوبتيسين من مستخلص C. chinensis كمكون ذو أقوى قدرة الارتباط، والذي أظهر معدل ارتباط 21.9٪ ونشاطا مثبطا ذا دلالة في المختبر (IC₅₀ = 3.24 ميكروغرام/مل). أظهرت محاكاة الالتحام الجزيئي والديناميكا الجزيئية أن الكوبتيسين يمكنه الارتباط بثبات بالجيب النشط ل AChE. لاحقا، أجريت تجارب تحقق على نموذج جرذان حديثي الولادة لتلف الدماغ نقص الأكسجين (HIBD). أظهرت النتائج أن التدخل بالكوبتيسين (10 ملغ/كغ) حسن بشكل ملحوظ من نقص التعلم المكاني والذاكرة لدى الحيوانات النموذجية، وزاد تدفق الدم الدماغي في نصف الكرة المصاب، وخفف من الضرر المرضي لأنسجة الدماغ، وكبح التنشيط غير الطبيعي ل AChE في الدماغ. باختصار، جمعت هذه الدراسة بين تقنية الترشيح الفائق للتقارب وأكدت أن الكوبتيسين، الذي تم تحديده من مستخلص C. chinensis، يمكن أن يثبط AChE ويمارس تأثيرات واقية للعصبيات وتأثيرات تحسين تدفق الدم الدماغي. يعد هذا الأساس المادي الرئيسي لعلاج C. chinensis في تحسين العجز العصبي الشبيه ب CP، مما يوفر جزيئات مرشحة وأدلة علمية لتطوير أدوية ذات صلة.

المقدمة

الشلل الدماغي (CP) هو متلازمة دائمة تحدث بسبب تلف غير تدريجي في دماغ الأجنة أو الرضع، وتتميز بشكل أساسي بخلل في الوظائف الحركية واضطرابات في الوضعية. على الرغم من توفر عدة طرق علاج سريرية حاليا للشلل الدماغي، لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية التي يمكنها إصلاح العجز العصبي بشكل أساسي مع آثار جانبية قليلة. على عكس الأدوية المصنعة كيميائيا، التي عادة ما تؤثر على أهداف فردية وتحمل سمية عالية نسبيا، توفر الأدوية الصينية التقليدية (TCMs)، بمزاياها في تنظيم متعدد المكونات والأهداف والشمولية، بالإضافة إلى ملفات السلامة المواتية التي أظهرتها الممارسة السريرية طويلة الأمد، رؤى جديدة ومخزونا من الأدوية المرشحة لعلاج اضطرابات الدماغ المعقدة^{1. 2، 3، 4، 5، 6}. لذلك، فإن استكشاف المكونات الكيميائية عالية الفعالية ومنخفضة السمية من الطب الصيني الصيني يحمل أهمية علمية كبيرة وقيمة سريرية⁷.

من بين الآليات المرضية المعقدة للشلل الدماغي، يلعب خلل الجهاز العصبي الكوليني دورا محوريا ^8,9. إنزيم أستيل كولينستيراز (AChE) هو إنزيم رئيسي يقوم بتحلل ناقل عصبي الأستيل كولين (ACh). النشاط المفرط لهذا الإنزيم يؤدي إلى استنزاف ACh، ويضعف نقل الإشارات الكولينية، وبالتالي يزيد من ضعف التحكم الحركي والوظائف الإدراكية. لذلك، برز AChE كهدف دوائي مهم وراسخ لتطوير العوامل الواقية العصبية. يعتبر تثبيط نشاط AChE لرفع مستويات ACh في الشق المشبكي أحد الاستراتيجيات الفعالة لتخفيف العجز العصبي المرتبط بالشلل الدماغي. في سياق إصابة الدماغ نقص الأكسجين-الإقفاري، قد يؤدي اضطراب النقل العصبي الكولينيني إلى تفاقم ضعف الوظائف العصبية، مما يساهم في إعاقات حركية وإدراكية ذات صلة بشلل الدماغ. لذلك، تم اختيار AChE في هذه الدراسة ليس فقط كهدف وظيفي عصبي كلاسيكي، بل أيضا كنقطة دخول ميكانيكية ذات صلة لفحص المركبات النشطة الحيوية التي قد تكون لها تأثيرات مضادة للشلل الدماغي.

أظهرت الأبحاث الحديثة أن النباتات الطبية لها مجموعة واسعة من قيم النشاط الدوائي. باعتباره دواء صينيا تقليديا كلاسيكيا لإزالة الحرارة والرطوبة الجافة، يشكل كوبتيس شينينسيس نظاما معقدا وفيرا بأنواع مختلفة من قلويدات الإيزوكينولين. بالإضافة إلى البربرين المعروف، يحتوي أيضا على سلسلة من المكونات ذات الهياكل المشابهة والأنشطة الدوائية المتنوعة، مثل الكوبتيسين، الإبيبربيرين، البالماتين، والجاتروريزين¹⁰. تشكل هذه القلويدات مجتمعة الأساس المادي للتأثيرات الدوائية ل C. chinensis. أظهرت الدراسات السابقة أن C. chinensis وقلوياته تمتلك خصائص مضادة للالتهاب، ومضادة للأكسدة، وحماية عصبية محتملة. ومع ذلك، وبالنظر إلى هذا النظام المعقد للمكونات، يصعب تحديد المكونات الفعالة الرئيسية التي تستهدف AChE بشكل مباشر وبسرعة وبدقة، مما يحد بشكل كبير من التوضيح العميق للآليات التي تقوم عليها تأثيرات C. chinensis على إصابة الدماغ¹¹.

مقارنة بالعزل التقليدي الموجه بالنشاط، الذي يتطلب عادة تكرارا للتجزئة، واختبار النشاط الحيوي، والتنقية، وقد يؤدي إلى فقدان أو إهمال المركبات منخفضة الوفرة ولكن عالية الألفة، فإن الترشيح الفائق للألفة يتيح الفحص السريع للليغاندات المرتبطة بالهدف مباشرة من خلطات معقدة. تتيح هذه التقنية "صيد" فعال وسريع للروابط النشطة التي ترتبط بأهداف محددة (مثل AChE) مباشرة من المستخلصات الخام متعددة المكونات للأجهزة التقنية الصينية. وهو مناسب بشكل خاص للأنظمة التي تحتوي على عدة مكونات قلوئيدة، مثل C. chinensis، مما يسمح بالتعرف الدقيق على المكونات الفعالة التي تتفاعل مباشرة مع الهدف من الخليط المركب¹². وبالاقتران مع الأساليب الحاسوبية بما في ذلك الالتحام الجزيئي ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، يمكنه التنبؤ بشكل حدسي بوضع الربط، وأنواع التفاعل، والاستقرار المعقد بين المكونات والبروتينات المستهدفة على المستوى الذري، مما يوفر أدلة نظرية قوية وتفسيرات ميكانيكية لنتائج الفحص التجريبي¹³.

استنادا إلى الخلفية السابقة، تقترح هذه الدراسة الفرضية العلمية التالية: من بين القلويدات المختلفة الموجودة في C. chinensis، توجد مكونات نشطة يمكنها تحديدا تثبيط AChE، وهذه المكونات هي الأساس المادي لتأثيراته المحتملة المضادة للشلل الدماغي. للتحقق من هذه الفرضية، دمجنا تقنيات الفحص الحديثة مع طرق التحقق الدوائي: أولا، باستخدام AChE كهدف، تم استخدام تقنية الترشيح الفائق للألفة لفحص المثبطات المحتملة بسرعة من مستخلص C. chinensis متعدد القلويات؛ علاوة على ذلك، تم استخدام محاكاة الالتحام الجزيئي والديناميكا الجزيئية لتوضيح آلية الارتباط على المستوى الذري؛ وأخيرا، أجريت تجارب على الحيوانات في الجسم الحي للتحقق من تحسن تأثيرات المكونات التي تم فحصها على سلوك، وأمراض أنسجة الدماغ، ونشاط AChE لدى الفئران المصابة بالشلل الدماغي.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات رفاهية الحيوان والتجارب من قبل لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان المختبرية في مستشفى الشعب الأول في زوني (رقم الأخلاقيات 2025-2-362). خلال فترة النمذجة والعلاج، تم تسجيل حالة جسم الحيوانات والبقاء على قيد الحياة يوميا.

تحضير مستخلص C. chinensis
في هذه الدراسة، تم استخدام مستخرج مذيب معجل للاستخلاص السريع لجزء n-بوتانول من المواد الطبية C. chinensis . تم وزن ما مجموعه 1 جرام من مسحوق C. chinensis المجفف بدقة ووضعه في خلايا استخراج بحجم 40 مل على التوالي. تم وضع حشوات معدنية وأغشية مرشح من ألياف زجاجية بشكل متسلسل فوق وتحت خلية الاستخراج لترشيح العينة، وتم لف العينة برمل الكوارتز. خلال عملية الاستخراج، تم ضبط درجة الحرارة والضغط على 90 درجة مئوية و100 بار على التوالي. تم جمع المستخلص المعجل، وتبخر مذيب الاستخراج حتى يصبح جافا باستخدام مبخر دوار للحصول على مستخلصات مجففة من كسور قطبية مختلفة. تم اختيار الميثانول:الماء (50:50، فولت/فولت) كمذيب لإعادة التكوين. تم ترشيح المستخلص عبر غشاء ميكرومسامي بحجم 0.45 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية. قبل اكتشاف العينة، تم دراسة النشاط المثبط لمذيب إعادة التكوين الفارغ على AChE. أظهرت النتائج أن تأثيره المثبط كان ضئيلا، مما يشير إلى أن اختيار مذيب إعادة التكوين في هذه التجربة لن يؤثر على نتائج التجارب.

اختبار تثبيط إنزيم أستيل كولينستيراز
أجريت التجربة على صفيحة تحتوي على 96 بئرا. أولا، أضيفت PBS، تلتها عينات AChE (0.1 U/mL) وC. chinensis بشكل متسلسل. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، أضيفت محلول كروموجيني 5,5′-ديثيوبيس (حمض 2-نيتروبنزويك) (DTNB) (2.5 ممول/مل) وركيزة ATChI (10 مليمول/مل). تم حضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى، وانتهى التفاعل بإضافة 60 ميكرولتر من كبريتات الصوديوم الدوديسيل 1٪ (SDS). تم قياس الامتصاص عند 405 نانومتر. تم إعداد كل عينة من C. chinensis بأربع مجموعات: المجموعة الضابطة أ: PBS (120 ميكرولتر)، محلول AChE (20 ميكرولتر)، محلول DTNB (40 ميكرولتر)، محلول ATChI (40 ميكرولتر)، ومحلول SDS (60 ميكرولتر) تمت إضافتها بشكل متسلسل؛ مجموعة التحكم الفارغة ب: PBS (120 ميكرولتر)، محلول DTNB (40 ميكرولتر)، محلول ATChI (40 ميكرولتر)، ومحلول SDS (80 ميكرولتر)؛ مجموعة العينة ج: PBS (80 ميكرولتر)، مستخلص C. chinensis (20 ميكرولتر)، محلول AChE (20 ميكرولتر)، محلول DTNB (40 ميكرولتر)، محلول ATChI (40 ميكرولتر)، ومحلول SDS (60 ميكرولتر)؛ مجموعة العينة الفارغة d: PBS (100 ميكرولتر)، مستخلص C. chinensis (20 ميكرولتر)، محلول DTNB (40 ميكرولتر)، محلول ATChI (40 ميكرولتر)، ومحلول SDS (60 ميكرولتر). تم استخدام هوبرزين A كضابط إيجابي بتركيز ابتدائي يقارب 2.5 ملغ/مل. كان التركيز الأولي لمستخلص جزء n-بوتانول حوالي 1 ملغ/مل. تم تخفيف كل من الهوبرزين A والعينات بتدرج 60٪. تم حساب معدل التثبيط باستخدام الصيغة التالية: معدل التثبيط (٪) = [1 - (ج - د)/(أ - ب)] × 100٪، حيث تمثل أ، ب، ج، ود قيم الامتصاص لمجموعة الضابطة أ، المجموعة الضابطة الفارغة ب، مجموعة العينة ج، والمجموعة الفارغة د على التوالي.

تم حساب معدل التثبيط عند كل تركيز تم اختباره باستخدام الصيغة الموضحة أعلاه. ثم تم بناء منحنيات تركيز-تثبيط عن طريق رسم معدل التثبيط مقابل لوغاريتم تركيز المركب. تم حساب قيم IC20 وIC50 وIC80 بواسطة ملاءمة الانحدار غير الخطي باستخدام برنامج GraphPad Prism بناء على منحنيات التركيز-الاستجابة المعدلة، وتم تعريفها بأنها التركيزات المطلوبة لإنتاج تثبيط 20٪، 50٪، و80٪ من نشاط AChE على التوالي.

اختبار الترشيح المفرط للتقارب
تم إجراء الترشيح الفائق للألفة لفحص المركبات المرتبطة ب AChE من مستخلص C. chinensis . باختصار، تم استخدام محلول AChE (0.1 U/mL في PBS، pH 7.4) كإنزيم نشط. تم إعداد التحكم الإنزيمي المعطل عن طريق تسخين نفس محلول AChE في حمام ماء مغلي لمدة 10 دقائق. لكل تفاعل، تم خلط 200 ميكرولتر من محلول مستخلص C. chinensis مع 200 ميكرولتر من محلول AChE النشط أو غير المنشط وحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، تم نقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي فائق الترشيح بقوة 30 كيلو دالتون وتم طرد مركزه بحرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم غسل مركب الإنزيم-ليغاند المحتفظ به ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من PBS تحت نفس ظروف الطرد المركزي لإزالة المكونات غير المرتبطة. بعد ذلك، أضيف 200 ميكرولتر من 90٪ ميثانول لفصل وفصل الروابط المرتبطة ب AChE، تلاها الحضانة لمدة 10 دقائق والطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق. تم جمع وتصفية وتحليل المحلول بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). تم اعتبار المركبات الغنية في مجموعة الإنزيمات النشطة بالنسبة للإنزيمات المقاومة المعطلة مكونات محتملة للارتباط ب AChE¹⁴.

تحليل HPLC لمستقلبات القلويدات الرئيسية
تم إجراء التحليل الكروماتوغرافي باستخدام نظام HPLC مزود بمضخة رباعية، وجهاز أخذ تلقائي، وفرن عمودي، وكاشف للأشعة فوق البنفسجية المرئية (UV-Vis). تم تحقيق الفصل على عمود كروماتوغرافي C18 (250 × 4.6 مم، 5 ميكرومتر) حافظ عليه عند 25 درجة مئوية. تكون الطور المتحرك من أسيتونيتريل (A) ومحلول بيكربونات الأمونيوم بسعة 30 ملليمول/لتر يحتوي على 0.7٪ أمونيا و0.25٪ ثلاثي إيثيل أمين (B)، ويتم تسليمه بمعدل تدفق 1.0 مل/دقيقة. كان برنامج إزالة التدرج كما يلي: 0–15 دقيقة، 90٪–75٪ B; 15–25 دقيقة، 75٪–70٪ B; 25–50 دقيقة، 70٪–55٪ B. كان حجم الحقن 5 ميكرولتر، وتم إجراء الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية عند 270 نانومتر.

للتحليل الكمي للقلويدات الرئيسية في C. chinensis، تم وزن كل عينة (0.02 جم) بدقة واستخراجها بالموجات فوق الصوتية باستخدام 10 مل من محلول حمض الهيدروكلوريك-ميثانول (1:100، فولت/فولت) لمدة 30 دقيقة. بعد الترشيح، تم تعويض فقدان الوزن بنفس مذيب الاستخلاص للوزن الأصلي، وتم ترشيح المحلول النهائي عبر غشاء بحجم 0.45 ميكرومتر قبل تحليل HPLC. تم تحليل ثمانية معايير مرجعية أصيلة، تشمل الماغنوفلورين، الجلوسين، جاتروريزين، الكولومبامين، الإبيبربيرين، الكوبتيسين، البالماتين، والبربرين، تحت نفس الظروف الكروماتوغرافية. تم بناء منحنيات معايرة لهذه المحللات باستخدام المحاليل المرجعية. نظرا لاختلاف مستويات الوفرة واستجابات الكاشف للقلويدات الثمانية بشكل كبير، تم تحسين نطاق المعايرة لكل محلل بشكل فردي بناء على تقارير الأدبيات والتجارب الأولية، بدلا من تطبيق نظام تخفيف طي متطابق على جميع المركبات. لذلك، لم يكن من المتوقع أن تكون نسب التركيز العالي إلى المنخفض للنطاقات الخطية متطابقة بين المحللات الثمانية. تم تقدير حدود الكشف (LOD) وحدود القياس (LOQ) بنسب إشارة إلى ضوضاء تقارب 3 و10 على التوالي.

لتحليل الترشيح الفائق للألفة، تم جمع الروابط التي انفصلت عن AChE بعد الترشيح الفائق من تجارب متكررة وتركيزها قبل تحليل HPLC لضمان شدة الإشارة الكافية للكشف. ثم تم تحليل الشيوات المركزة باستخدام نفس ظروف HPLC الموضحة أعلاه. تم تعيين القمم الكروماتوغرافية في اللوات من خلال مقارنة مستهدفة مع ثمانية معايير مرجعية أصيلة ومع الملف الكروماتوغرافي لمستخلص C. chinensis الذي تم الحصول عليه تحت ظروف تحليلية متطابقة. لذلك، لم يكن الهدف من التحليل الحالي توضيحا بنيويا جديدا للمركبات غير المعروفة، بل لتحديد ما إذا كانت القلويدات الرئيسية المعروفة في C. chinensis قد أغنى في الإنزيم النشط الشفاف مقارنة بالتحكم بالإنزيمات المعطلة.

اختبار الالتحام الجزيئي
في هذه الدراسة، ركز تحليل الالتحام على الكوبتيسين لأنه تم تحديده كأفضل مكون مرتبط ب AChE من خلال الترشيح الفائق للألفا، وأظهر أيضا أقوى نشاط مثبط في المختبر بين القلويات الرئيسية. تم استرجاع بلورات البروتين من بنك بيانات البروتين (PDB). تم اختيار بلورات البروتين ذات الروابط المتبلور معا كمستقبلات الالتحام النهائية، وتم اشتقاق جميع بلورات البروتين المستهدف من البشر. تم فتح ملف المستقبل باستخدام برنامج PyMOL، وتم فصل ملفات المستقبل والليجاند وحفظهما؛ تم فتح المستقبل باستخدام برنامج MGLTools، ثم إزالة جزيئات الماء، وإضافة ذرات وشحنات الهيدروجين، ودمج ذرات الهيدروجين غير القطبية، وحساب الشحنات الذرية المحلية، وغيرها، ثم حفظه بصيغة PDBQT؛ تم فتح ملف الليغاند باستخدام برنامج MGLTools، وأضيفت ذرات الهيدروجين والشحنات، وحفظت كملف بصيغة PDBQT؛ تم فتح صندوق الشبكة، وضبط التباعد على 1.000، وتم تعيين عدد نقاط الشبكة، وتم اختيار إحداثيات النقطة المركزية للصندوق وفقا للليغاند المتبلور معا، وحفظت كملف GPF ^15,16.

تم جمع هياكل المكونات الكيميائية أولا من قاعدة بيانات SciFinder وحفظها بصيغة cdx؛ تم عرض كل بنية جزيئية ثلاثية الأبعاد باستخدام وحدة ChemBio3D Ultra، وتم تنفيذ تحسين الطاقة باستخدام حقل قوة MM2، وحفظها بصيغة mol2، وتمت إزالة معلمات الشحنة. باستخدام AutoDock، تم فتح ملف صيغة mol2 باستخدام برنامج MGLTools، وأضيفت ذرات الهيدروجين والشحنات إلى الرابط، وتمت ملاحظة روابط كيميائية قابلة للدوران، وحفظها كملف بصيغة pdbqt. تم تطبيق نموذج أوتودوك فينا (الإصدار 1.2.5) لإجراء تقييم الالتحام الجزيئي.

اختبار محاكاة الديناميكا الجزيئية
تم استخدام برامج Gaussian 16 وGaussView 6 لتحسين بنية الليغاند. بعد استيراد ملف mol2 لبنية الليغاند إلى GaussView 6، تم تعيين نوع المهمة على التحسين، وتم اختيار حالة الجزيء المستهدف كحالة أرضية، وكانت طريقة الحساب نظرية دالة الكثافة (DFT)، وتم تعيين تعدد الدوران افتراضيا إلى Default Spin، والدالة المستخدمة هي B3LYP، ونموذج المذيب هو IEFPCM، وكان المذيب هو الماء. بعد الانتهاء من تحسين البنية الجزيئية، استخدم Gaussian 16 لتحويل ملف chk الناتج إلى ملف fch، والذي تم استيراده بعد ذلك إلى برنامج Multiwfn لحساب شحنة RESP للرابط.

بعد حساب شحنة RESP، تم استيراد ملف chg المتولد إلى برنامج sobtop_1.0 (dev5) لإنشاء ملف طوبولوجيا الليغاند المطلوب لمحاكاة الديناميكا الجزيئية. تم إجراء محاكاة الديناميكا الجزيئية باستخدام برنامج GROMACS 2019.6 باستخدام حقل القوة AMBER99. تم استيراد ملفات البنية لجزيء البروتين والجزيء الصغير إلى البرنامج، وتم إنشاء صندوق ثلاثي الطب بحدود دورية 1.0 نانومتر، واستخدم نموذج الماء TIP3P للملء. تم استخدام طريقة إيوالد الشبك الجسيئي (PME) لحساب التفاعلات الكهروستاتيكية بعيدة المدى، وتم استخدام أمر gmx geion لإدخال عدد مناسب من أيونات الصوديوم وأيونات الكلوريد لتحييد شحنة النظام بأكمله. تم تنفيذ المحاكاة عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 298 كلفن وضغط جوي قياسي يبلغ 100 كيلو باسكال. لتقليل الطاقة، تم تطبيق طريقة النزول الأكثر انحدارا (شديدة الانحدار). تم استخدام أوامر gmx grompp وmdrrun لأداء 10,000 خطوة من توازن NVT (مجموعة متساوية الحرارة) وNPT (مجموعة متساوية الحرارة)، مع ضبط ثابت اقتران درجة الحرارة وثابت اقتران الضغط على 0.1 بيس و0.5 بيثان على التوالي، وكانت مدة محاكاة التوازن 100 ps. بعد أن وصل النظام إلى التوازن، تم ضبط الخطوة الزمنية على 2 fs، وأجريت محاكاة ديناميكية جزيئية بطول 10 نانوثانية على المجمع، مع حفظ بيانات المسار كل 2 رطل. تم اختيار فترة الإنتاج التي تبلغ 10 نانوثانية كطول محاكاة استكشافية لتوفير تقييم ديناميكي قصير الزمن لمجمع الكوبتيسين-AChE المتصل بالتقطيع، بدلا من أخذ عينات شكلية شاملة. تم استخدام هذا الإعداد لتقييم ما إذا كان المجمع المتصل يمكنه الحفاظ على وضع ربط مستقر نسبيا مع مرور الوقت. تم استخدام أوامر gmx rms وgmx rmsf وgmx ρтиаф وgmx hbonds لحساب متوسط الانحراف التربيعي للجذر (RMSD)، وتذبذب متوسط الجذر (RMSF)، ونصف قطر دوران البروتين، وروابط الهيدروجين، ومساحة السطح المتاحة للمذيبات. تم استخدام QTgrace لعرض النتائج.

التحقق من تجربة الحيوانات
تم اختيار ثمانية عشر جراء حديثة الولادة سليمة من سبريغ-داولي (SD) (بعد 7 أيام من الولادة) من كلا الجنسين. تم إيواء جميع الحيوانات التجريبية في منشأة تجريبية خاصة خالية من مسببات الأمراض (SPF). تم تجهيز هذه المنشأة بنظام حاجز صارم، يمكنه بفعالية منع غزو الكائنات الدقيقة والطفيليات. تمت مراقبة وتنظيم المعايير البيئية لغرفة التخزين تلقائيا بواسطة نظام تحكم مركزي: درجة الحرارة 22 ± 2 درجة مئوية، الرطوبة النسبية 55٪ ± 10٪، ودورة الضوء 12 ساعة من الضوء / 12 ساعة دورة الظلام. تم استخدام نموذج جرذان حديثي الولادة لتلف الدماغ نقص الأكسجين (HIBD) تم تعديله بطريقة رايس-فانوتشي الكلاسيكية لمحاكاة الخصائص المرضية والسلوكية للشلل الدماغي.

باختصار، تم تخدير جراء الفئران بعد اليوم السابع بإحدار 2–3٪ من الإيزوفلوران للتحفيز و1–2٪ للصيانة. بعد تخدير كاف، تم إجراء شق في منتصف خط عنق الرحم، وتم عزل الشريان السباتي المشترك الأيسر بعناية وربطه بشكل دائم. ثم تم خياطة الشق، وسمح للجراء بالتعافي على وسادة تدفئة لمدة ساعة واحدة. لاحقا، تعرض الجراء في مجموعتي النموذج والكوبتيسين لنقص الأكسجين في غرفة تحتوي على 8٪ O₂ متوازن مع 92٪ N₂ لمدة ساعتين عند 37 °م لتحفيز إصابة دماغية نقص أكسجين-إقفاري. خضعت الحيوانات التي أجريت بالتخدير الصناعي لنفس التخدير والتعرض الجراحي دون ربط السباتي أو علاج نقص الأكسجين. بعد نقص الأكسجين، أعيد الجراء إلى أموها ومراقبتها يوميا للحالة العامة، والبقاء على قيد الحياة، وسلوك التغذية طوال فترة التجارب.

تم تقسيم الفئران التجريبية عشوائيا إلى ثلاث مجموعات: مجموعة الشام: تم فصل الشريان السباتي المشترك الأيسر فقط دون ربط أو علاج نقص الأكسجة، وتم إعطاء كمية مماثلة من المذيب بعد العملية؛ مجموعة النموذج: أجريت جراحة نمذجة تلف الدماغ نقص الأكسجين، وتم إعطاء كمية مماثلة من المذيب بعد العملية؛ مجموعة كوبتيسين: بعد النمذجة، تم إعطاء الكوبتيسين (10 ملغ/كغ) بواسطة جافاج. تم اختيار جرعة الكوبتيسين (10 ملغ/كغ) كجرعة في الجسم الحي بناء على الدراسات السابقة المبلغ عنها في الجسم الحي/الدوائي لكوبتيسين¹⁷. تم إعطاء الأدوية مرة واحدة يوميا في وقت محدد لمدة 14 يوما متتالية من التدخل.

اكتشاف مؤشرات الحيوانات
تكونت معدات اختبار متاهة موريس المائية (MWM) من بركة ماء دائرية كبيرة (قطرها حوالي 150 سم) مع إشارات بصرية واضحة على جدار المسبح. تم تقسيم مياه البركة إلى طبقة بيضاء حليبية معتمة، وتم التحكم في درجة حرارة الماء عند 23 ± 1 درجة مئوية. تم وضع منصة شفافة في الربع المستهدف، مغمورة بعمق 1–2 سم تحت سطح الماء. كان التدريب يجرى أربع مرات يوميا: حيث توضع الحيوانات في الماء المواجه لجدار المسبح من أربع نقاط دخول مختلفة على جدار المسبح، ويتم تسجيل الوقت اللازم للحيوانات للعثور على المنصة المخفية وتسلقها عند الدخول إلى الماء، وهو "زمن الخروج من الماء"، وهو "زمن الهروب المتأخر". كل جلسة تدريب كانت محدودة ب 60 ثانية. إذا وجد الحيوان المنصة خلال 60 ثانية، يسمح له بالبقاء عليها لمدة 15 ثانية لتثبيت الذاكرة. إذا لم يعثر عليه، كان يوجه الحيوان بلطف إلى المنصة ويسمح له بالبقاء لمدة 15 ثانية. بعد 7 أيام من التدريب، تمت إزالة المنصة المخفية. وضعت الحيوانات في الماء من نقطة الدخول المقابلة للمنصة الأصلية وسمح لها بالسباحة بحرية لمدة 60 ثانية، وتم تسجيل مسار السباحة للحيوانات بواسطة نظام فيديو. من خلال اختبار MWM، تم تسجيل مؤشرات مثل متوسط زمن الاستجابة للهروب، والوقت الذي يقضيه في الربع المستهدف، وعدد المرات التي تعبر الموقع الأصلي للمنصة.

للكشف عن التصوير بالليزر باستخدام تباين بقع (LSCI): بعد التخدير، تم تثبيت الفئران على جهاز ستيريوتاكسي، وتعرض الجمجمة وبقيت رطبة. تم استخدام نظام تصوير تدفق الدم بالليزر سبيكل لجمع صور النقاط الخام بشكل مستمر لمدة 30 ثانية مباشرة فوق الجمجمة. تم استخدام برنامج احترافي لتحويل تباين البقع المتغير مكانيا وزمانيا إلى خريطة توزيع وحدة تدفق الدم الدماغي (PU). للتحليل الكمي، تم اختيار عائد التفاعل القشري المحدد يدويا ضمن نصف الكرة العرضي في نفس الجانب في كل صورة وفقا لمنطقة التروية القشرية ذات الصلة بالآفة والمعالم التشريحية المرئية، وتم استخدام متوسط قيمة التروية ضمن هذا العائد على الاستثمار للمقارنة بين المجموعات.

تم جمع أنسجة الدماغ، وأضيف PBS المبرد مسبقا وفقا لنسبة الوزن إلى الحجم. تم إجراء التجانس الميكانيكي على الجليد، تلاها الطرد المركزي عند 8000 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 10–15 دقيقة، وتم جمع المادة الفائقة للاختبار. تم وضع أنسجة الدماغ بسرعة في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ للتثبيت لأكثر من 24 ساعة للحفاظ على شكل الأنسجة. تم إجراء تلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين (HE) من خلال عمليات مثل الجفاف، والتنظيف، ودمج البارافين، وتمت ملاحظة درجة إصابة الدماغ تحت المجهر البصري.

لقياس نشاط AChE، تم جمع وتوحيد القشرة الدماغية من نصف الكرة المصاب (نفس الجانب) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم توحيد عينات الأنسجة في مخزن الاستخراج وطرد مركزها عند 8000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم جمع المادة الفائقة للتحليل. تم تحديد نشاط AChE باستخدام مجموعة اختبار نشاط الأستيل كولينستراز التجارية (طريقة ميكرولوحة/قياس اللون). يعتمد هذا الاختبار على تحلل الأستيل كولين بواسطة AChE، يليه تفاعل مع DTNB لتوليد منتج كروموجيني، وتم قياس الامتصاص عند 412 نانومتر لحساب نشاط الإنزيم. نظرا لأن هذه المجموعة هي اختبار لوني قائم على نشاط الإنزيمات وليس مجموعة اختبار إنزيمي مرتبط بالإنزيمات (ELISA) التقليدي لقياس المستضدات، لم توفر الشركة المصنعة نطاق كشف قياسي وحساسية تحليلية. في الدراسة الحالية، كانت قيم نشاط AChE المقاسة في نسيج القشرة تقريبا ضمن نطاق 25–80 نانومول/دقيقة/ملغ بروتين.

التحليل الإحصائي
تم التعبير عن جميع البيانات التجريبية كمتوسط ± انحراف معياري (SD) وتم تحليلها باستخدام برنامج GraphPad Prism. أجريت مقارنات بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاها اختبار المقارنات المتعددة الذي أجرته توكي. في اختبار متاهة الماء موريس، تم تحليل نتيجة التدريب النهائية ومعلمات تجربة المسبار باستخدام تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه تلاها اختبار مقارنات متعددة من توكي. تم اعتبار قيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية¹⁸. تم تحليل العلاقة بين تدفق الدم الدماغي في نشاط تدفق الدم الدماغي في العائد على العائد ونشاط AChE في القشرة الدماغية المماثلة باستخدام تحليل بيرسون. تم اعتبار قيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تحليل المكونات الكيميائية في مستخلص C. chinensis
القلويات هي المكونات الرئيسية المتراكمة وكذلك المكونات النشطة الرئيسية في المواد الطبية في C. chinensis . في هذه الدراسة، تم استخدام تقنية الكروماتوغرافيا لتحليل المكونات الكيميائية الرئيسية في C. chinensis (الشكل 1A). كما هو موضح في الجدول 1، أظهرت جميع المحللات الثمانية خطية جيدة ضمن نطاقات معايرتها الخاصة. نظرا لاختلاف محتويات واستجابات الكاشف ...

المناقشة

حاليا، تم تطوير طرق وتقنيات مختلفة للوقاية وعلاج أمراض الدماغ^{20، 21، 22}. في هذه الدراسة، تم اعتماد استراتيجية متكاملة للفحص الصناعي، والمحاكاة الحاسوبية، والتحقق في الجسم الحي، لتوضيح الأساس المادي والآلية متعددة الأهداف لمادة C. chinensis بشكل منهجي في تحسين أعراض الشلل الدماغي الناتجة عن HIBD. النتيجة الأساسية هي أن الكوبتيسين، وهو قلويد مميز في C. chinensis...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	اختبار تثبيط الأسيتيل كولينستراز
الأسيتيل كولينستراز (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	اختبار تثبيط الأسيتيل كولينستراز
الأسيتيل ثيو كولين يوديت (ATChI)	شركة شانغهاي أداما للكواشف المحدودة	1037408	اختبار تثبيط الأسيتيل كولينستراز
إيتونايتريل	شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك	1162577	مرحلة موبايل الكروماتوغرافيا السائلة
AutoDock Vina	AutoDock	الإصدار 1.2.5
معيار بيربيرين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	110713-201814	تحليل التركيب الكيميائي
معيار كولومبين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	CHB180712	تحليل التركيب الكيميائي
معيار كوبتيسين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	CHB180309	تحليل التركيب الكيميائي
E-916 جهاز استخراج المذيبات المعجل	Büchi Labortechnik AG، سويسرا	E916-008	استخراج جزء n-بوتانول
معيار إبيبربيرين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	CHB180309	تحليل التركيب الكيميائي
حمض الفورميك	شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك	1270563	مرحلة موبايل الكروماتوغرافيا السائلة
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
معيار غلوكين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	CHB180615	تحليل التركيب الكيميائي
معيار جاتروريزين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	CHB180607	تحليل التركيب الكيميائي
معيار ماجنوفلورين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	CHB180205	تحليل التركيب الكيميائي
الميثانول	شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك	1162578	مرحلة موبايل الكروماتوغرافيا السائلة
غشاء مجهري مسامي	شركة Millipore Filter	2139547	ترشيح المستخلصات
معيار بالماتين	شركة تشنغدو كيلوما للكواشف	CHB180226	تحليل التركيب الكيميائي
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
كربونات الصوديوم	شركة شانغهاي أداما للكواشف	15138805	اختبار تثبيط الأسيتيل كولينستراز
سلفات دولسيل الصوديوم (SDS)	شركة شانغهاي أداما للكواشف	11019349	اختبار تثبيط الأسيتيل كولينستراز