إنتاج وتنقية المواد المؤتلفة لمادة الهيدروفوبين SC16 من الإشريكية القولونية ومراقبة تجميعها الذاتي باستخدام اختبارات التألق

ملخص

يصف هذا البروتوكول إنتاج وتنقية الهيدروفوبين SC16 من الإشريكية القولونية ويوفر اختبارات قائمة على الفلورة لمراقبة تجميعه الذاتي.

الملخص

الهيدروفوبينات هي بروتينات صغيرة أمفيباتية تتجمع ذاتيا عند واجهات كارهة للماء–الماء، لتشكيل طبقات مقاومة للماء مستقرة فوق الأبواغ الفطرية. تشكل الهيدروفوبينات من الفئة الأولى "عصي صغيرة" مستقرة بشكل خاص تحتوي على هياكل شبيهة بالأميلويدات المرتبة تغطي الأسطح. تمنحها هذه الكيمياء السطحية غير العادية تطبيقات محتملة في توصيل الأدوية، وتثبيت الرغوة، واستحلب، وتعديل الأسطح. لإنتاج الهيدروفوبينات، هناك حاجة إلى بروتوكولات شاملة عالية العائد من أنظمة التعبير البسيطة. علاوة على ذلك، من الضروري توفير طرق سهلة لتوصيف وظيفة الهيدروفوبين بعد إنتاج وتنقية المواد المؤتلفة. هنا نصف بروتوكولات إنتاج وتوصيف SC16، وهو نوع من الهيدروفوبين من فئة IB ينتجه فطر Schizophyllum commune، والذي يمكن التعبير عنه بشكل مؤتلف في الإشريكية القولونية ثم تنقيه لاحقا في ظروف طبيعية غير مختزلة. يتضمن ذلك تحويل بلازميد تعبيري يشفر SC16 مع بروتين اندماج N-terminal إلى الإشريكية القولونية، وتحفيز تعبير البروتين، وتحلل الخلية في الظروف الأصلية، وكروماتوغرافيا الألفة، وانقسام البروتياز لعزل الهيدروفوبين عند عوائد ≥5 ملغ. يمكن بعد ذلك مراقبة التجميع الذاتي ل SC16 بواسطة اختبارات الفلورة النهائية أو الحركية باستخدام ثيوفلافين T. كلا الاختبارين يتضمنان حضانة SC16 مع خلط طويل لتعزيز التجميع الذاتي عند واجهات الهواء والماء، ويتم مراقبتهما بواسطة قياسات الفلورة. معا، توفر هذه الأساليب بروتوكولات مبسطة لتنقية SC16 ومراقبة تجميعه الذاتي، ويمكن توسيعها لتشمل أنظمة أخرى تتضمن تجميع بروتيني ذاتي مماثل.

المقدمة

الهيدروفوبينات هي بروتينات أمفيباتية نشطة على السطح تفرزها فطريات تتجمع ذاتيا عند واجهات كارهة للماء ومحبة للماء (مثل واجهات الهواء-الماء على هياكل الفطريات). في الطبيعة، تتمثل أدوارها في تغطية الأبواغ^{والأجسام} المثمرة^{، مما} يجعلها مقاومة للماء، ومنع تجمع قنوات الهواء، وتسهيل التشتت¹. نظرا لكيمياء سطحها الفريدة، فإن للهيدروفوبينات تطبيقات صناعية متنوعة، بما في ذلك الطلاءات لزيادة التوافق الحيوي للزرعات والأطراف الصناعية ^3,4,5، والمواد السطحية المتوافقة حيويا لتوصيل الأدوية والعلاجات الطبية ^6,7,8,9,10، والمرشحات لالتقاط النانوبلاستيك¹¹.

يمكن تقسيم الهيدروفوبينات إلى الفئة الأولى والفئة الثانية، وكلاهما يتجمع ذاتيا عند واجهات كارهة للماء–ماء محبة للماء، بما في ذلك الهواء–الماء، والنفط–الماء 12,13,14، وواجهات البلاستيك–الماء 15,16,17. من السمات المميزة للهيدروفوبينات من الفئة الأولى أنها تشكل هياكل "رودليت" مستقرة للغاية عند واجهاتها، تحتوي على ميزات شبيهة بالأميلويدات المرتبة (غنية بصفائح β)¹⁸، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص للتطبيقات التي تتضمن تعديل أو حماية السطح. على النقيض من ذلك، لا تشكل الهيدروفوبينات من الفئة الثانية هياكل شبيهة بالأميلويد بل تشكل أغشية يمكن تفكها بسهولة ^1,18. ومن المثير للاهتمام أن هناك فئة ثالثة من الهيدروفوبينات موجودة أيضا، مع الحفاظ على الميزات الهيكلية من الفئة الأولى والثانية^18,19. وبسبب هذه الاختلافات، فإن مراقبة التجميع الذاتي للهيدروفوبينات مهمة للتصنيف وتقييم الطي الصحيح ووظيفة الهيدروفوبينات الناتجة معاد تركيبها.

يمكن مراقبة التجميع الذاتي للهيدروفوبينات بسهولة باستخدام طرق فلورومتري باستخدام أصباغ الارتباط بالأميلويد مثل ثيوفلافين تي (ThT)، الذي يرتبط بهياكل β متقاطعة الموجودة في الأميلويدات²⁰. يحتوي ThT على رابطة تساهمية واحدة تفصل بين حلقتين عطريتين تدوران عادة بحرية. عند الارتباط بهياكل β متقاطعة، يصبح هذا الدوران مقيدا، مما يؤدي إلى فلورة²⁰. وبفضل الفلورة الانتقائية، يستخدم ThT على نطاق واسع لمراقبة التجميع الذاتي للهيدروفوبينات عند واجهات الهواء والماء 21,22,23,24,25,26,27,28. توفر اختبارات ThT معلومات حركية تعتمد على الوقت حول التجميع الذاتي للهيدروفوبين 23,27,28، مما يوفر مزايا على تقنيات مثل المجهر بالقوة الذرية (AFM) وقياسات زاوية التلامس، التي تكون أقل إنتاجية وأقل ملاءمة للتحليل المعتمد على الزمن. بالإضافة إلى ذلك، يظهر ThT تحسينا قويا في الفلورة عند ارتباط هياكل β متقاطعة، مع أقل قدر ممكن من التألق في شكله الحر²⁰. تجعل هذه الخصائص اختبارات ThT طرقا بسيطة وحساسة لمراقبة التجميع الذاتي للهيدروفوبين، والتي يمكن تكاملها بتقنيات هيكلية أكثر كثافة.

نظرا لتطبيقات الهيدروفوبينات المتنوعة، هناك حاجة إلى بروتوكولات متاحة لمراقبة تجميعها الذاتي. على وجه التحديد، يوفر البروتوكول الحالي إطارا لتحسين تنقية وتوصيف الوظيفة للهيدروفوبينات المؤتلفة. سابقا، وضع موريس وسوندي (2013) بروتوكولات للتعبير المؤتلف في الإشريكية القولونية، والتنقية، والمراقبة المعتمدة على ThT لتجميع الهيدروفوبين^{الذاتي 21}. يوسع هذا العمل هذه الطرق بوصف إجراء معدل لتنقية الهيدروفوبين SC16. SC16 هو هيدروفوبين من الفئة الأولى (من مجتمع الفصام) يمكن تطهيره بسهولة من الإشريكية القولونية دون الحاجة إلى إزالة أو تقليل أو إعادة أكسدة الروابط ثنائية الكبريتيد. بروتين SC16 الناتج وظيفي، كما أظهرت اختبارات التجميع الذاتي المعتمدة على ThT في نقطة النهاية والحركة التي تراقب تكوين القضبان الصغيرة. هدف هذه المقالة هو تفصيل بروتوكول شامل ومبسط لإنتاج وتنقية المواد المؤتلفة والاختبارات الوظيفية القائمة على ThT لفئة IB للهيدروفوبين SC16.

البروتوكول

هذه الدراسة لا تشمل المشاركين البشريين أو الحيوانات الفقارية أو أخذ عينات الأنسجة. لذلك، لم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقية.

1. تعبير الهيدروفوبين SC16 في الإشريكية القولونية

1. تحويل T7 شفل يعبر عن خلايا الإشريكية القولونية بواسطة صدمة حرارية عند 42°م لمدة 45 ثانية باستخدام بلازميد تعبير pET-21 يشفر مجال B1 موسوم بالهيكساهيستيدين من بروتين G الملتصق ب SC16 (H-GB1-SC16).
   ملاحظة: تم اختيار خلايا Shuffle T7 Express لقدرتها على تعزيز تكوين الرابطة ثنائية الكبريتيد الصحيح²⁹. يمكن توليد بلازميد H-GB1-SC16 عن طريق استنساخ إنزيم التقييد كما هو موضح سابقا³⁰.
2. تلقيح 2 مل من مرق الليسوجيني (LB) الذي يحتوي على 100 ميكروغرام مل⁻¹ أمبيسيلين مع مستعمرة واحدة. حضن الحوض طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج.
3. قم بتطعيم 1 لتر من LB (في قارورة دائرية ذات قاع دائري بسعة 2.8 لتر) ب 1 مل من الزراعة الليلية. قم بزراعة الزراعة عند 37°م مع الاهتزاز (~120–135 دورة في الدقيقة، مدار دائري 19 مم) حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.6 ± 0.1.
4. أضف إيزوبروبيل-β-D-1-ثيوجالاكتوبيرانوزيد إلى تركيز نهائي 0.5 ملليمولار لتحفيز تعبير H-GB1-SC16. حضن الحوض طوال الليل عند 20 درجة مئوية مع الرج.
   ملاحظة: تم اختيار هذه درجة الحرارة لتقليل خطر تكون جسم الشمول والطي غير الصحيح³¹.
5. اجمع الخلايا بالطرد المركزي عند 4000 × جرام لمدة 20 دقيقة. اسكب السوبرناتانت.
   نقطة توقف: خزن حبيبة الخلية عند −20°C لمدة تصل إلى 3 أسابيع قبل الانتقال إلى التنقية. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.

2. تنقية الهيدروفوبين SC16

1. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في 30 مل من محلول التحلل (20 ملليمولايتر تريس(هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان [تريس]، pH 8، 250 ملليمولار NaCl).
2. قم بتحليل الخلايا عن طريق حضن التعليق في حمام ماء بدرجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اخلط بلطف كل 5 دقائق أثناء الحضانة.
   ملاحظة: تعتمد هذه الخطوة على استقرار الحرارة SC16 وقد لا تكون مناسبة لبروتينات أخرى.
   تحذير: استخدم قفازات مقاومة للحرارة عند التعامل مع الأنابيب والحمامات المائية عند 80°C. تجنب رش السائل الساخن أثناء الخلط وإزالة الأنبوب.
3. قم بعمل جهاز الطرد المركزي لتحليل الخلية عند 25,000 جرام × لمدة 20 دقيقة عند 4°C. قم بتحميل المادة الفائقة على عمود جاذبية يحتوي على راتنج كروماتوغرافيا معدنية ثابتة^{بسعة 2+} شحنة من 2–3 مل من Ni.
4. غسل العمود باستخدام مخزن تحلل يحتوي على 30 مللي مولار إيميدازول. بروتين الإيلوت باستخدام 10 مل من محلول التحلل يحتوي على 300 ملليمول إيميدازول.
5. قم بتحليل الجزء المائل مقابل 1 لتر من المحلول المؤقت الذي يحتوي على تريس (pH 8؛ 20 مللي م) وNaCl (50 ملم) لمدة 3 ساعات باستخدام أنابيب غسيل الكلى بوزن جزيئي بوزن قطع 3500 كيلو دالتون، مع التحريك عند 100 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: قد تختلف سرعة التحريك أثناء الغسيل حسب الإعداد (على سبيل المثال، حجم الأنبوب وهندسة الكأس). حرك عند الحد الأدنى من سرعة الدوران اللازمة لتحفيز تدوير لطيف لكيس الغسيل.
6. أضف بروتياز الثرومبين (20 وحدة ملغ ^إلى 1 بروتين اندماج) مباشرة إلى كيس الغسيل الكلوي (10 مل إجمالي حجم تفاعل) لقطع بروتين الاندماج. استبدل المخزن المؤقت (buffer).
   نقطة توقف: بعد إضافة البروتيز واستبدال البامز، استمر في الغسيل طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استأنف التطهير في اليوم التالي. تحقق من اكتمال الانقسام بواسطة SDS-PAGE (توقع اختفاء نطاق ~18 كيلو دالتون وظهور الأشرطة عند ~10 و~8 كيلو دالتون).
7. أعد تحميل العينة المحللة على عمود IMAC المشحون بنيكل²⁺. غسل وأنبوب يحتوي كل منهما على حوالي 12 مل من المخزن يحتوي على 30 ملليمول و300 ملليمول إيميدازول على التوالي.
8. تحليل الكسور المجمعة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام الدوديكيل كبريت-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) تحت ظروف اختزال (باستخدام β-ميركابتوإيثانول في مخزن التحميل). حدد SC16 من خلال وجود شريط في جزء الغسيل عند الوزن الجزيئي المتوقع (~10 كيلو دالتون). قم بتحليل جزء الغسيل الذي يحتوي على SC16 بالكامل مقابل 1 لتر من المخزن الذي يحتوي على تريس (pH 8؛ 20 ملم) وNaCl (50 ملم) لمدة 3 ساعات لإزالة الإيميدازول المتبقي.
   ملاحظة: عادة ما يتم اكتشاف SC16 في نسبة الغسيل، بينما عادة ما يتم إثراء H-GB1 في التدفق الشفاف. قد يكون هناك أيضا كمية صغيرة من SC16 المتبقية في اللوات.
9. قم بقياس SC16 بطريقة مختارة (مثل تحليل الأحماض الأمينية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، اختبار برادفورد، أو الامتصاص عند 280 نانومتر). باستخدام هذه الطريقة، من المتوقع تحقيق إنتاجية ≥5 ملغ من SC16 لكل لتر من الزرعة.
   ملاحظة: تقوم مجموعتنا بقياس SC16 بشكل روتيني من خلال الامتصاص عند 280 نانومتر باستخدام معامل انقراض متوقع يبلغ 3480 M⁻¹ cm^{−1 32} هذه هي الطريقة المفضلة لقياس SC16 بسبب بساطتها.
10. جمع العينات أثناء عملية التنقية لتحليل SDS-PAGE.

3. اختبار التألق في نقطة النهاية للتجميع الذاتي ل SC16

1. تحضير خليط تفاعلي ثلاثي التكرار يحتوي على 50 ميكروغرام ^{ملليتر−1} SC16، و50 ملمولار NaCl، و20 ملليمول لكل منها من 2-(N-مورفولينو)إيثانيسلفونيك حمض (MES)، تريس، وفوسفات الصوديوم. جهز مخزن مخزوني مسبقا يحتوي على MES وتريس وفوسفات الصوديوم مع تعديل إلى درجة حموضة نهائية تبلغ 6.5 عن طريق إضافة الهيدروكلوريد المركزة أو 1 مليون مليون ناأوه. أضف البروتين وNaCl مباشرة قبل بدء الاختبار.
   ملاحظة: يمكن تجهيز أدوات التحكم في هذه الخطوة. على سبيل المثال، تضمين الضوابط الإيجابية التي تحتوي على SC16 التي لا تخضع لدوران متطرف وضوابط سالبة تحتوي فقط على المخزن المؤقت. تم اختبار تركيزات SC16 من 25–100 ميكروغرام ملليتر^، وكانت النتائج الأكثر اتساقا عند 50 ميكروغرام ملليتر^. قم بتحسين هذا المعامل حسب الحاجة.
2. انقل الخلطات إلى أنابيب بحجم 2–5 مل.
   ملاحظة: تأكد من أن أنبوب العينة مملوء بسعة 50٪ للسماح بالخلط الصحيح عند الانعكاس.
3. قم بتدوير الأنابيب رأسا على عقب بسرعة 20 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. انقل 100 ميكرولتر من كل عينة إلى صفيحة أسود معتمة ذات قاع 96 بئر مع آبار دائرية على شكل مدخنة.
4. أضف ThT المصفاة إلى تركيز نهائي 20 ميكرومولار لجميع العينات.
5. اضبط قارئ الميكروبلويت على أطوال موجية الإثارة والانبعاث ضمن النطاق المناسب لفلورة ThT 33,34,35,36. اضبط الكسب على 55 وزمن التكامل إلى 20 ميكروثانية. قس شدة الفلورة لكل عينة مباشرة بعد فترة الدوران التي تبلغ ساعتين.
   ملاحظة: أقصى درجات الإثارة والانبعاث المبلغ عنها ل ThT هي 450 نانومتر و490 نانومتر³⁷ على التوالي. استخدمت هذه التجربة قيم الإثارة والانبعاث 438 و494 نانومتر على التوالي، بناء على توفر المرشح البصري. تم إجراء الدوران من الطرف إلى الطرف باستخدام جهاز دوران صناعي.

4. اختبار التألق الحركي للتجميع الذاتي SC16

1. تحضير خلطات تفاعل بسعة 100 ميكرولتر ثلاث مرات في صفيحة سوداء بسعة 96 بئر.
2. تشمل 50 ميكروغرام ^{ملليتر−1} SC16، 50 ملليمولار NaCl، 20 ميكرومولار ThT مفلتر، و20 ملليمولار لكل من MES وتريس وفوسفات الصوديوم. جهز عناصر التحكم السلبية التي تحتوي فقط على ThT والمخزن المؤقت (بدون SC16).
3. قم بضبط درجة الحموضة للمخزن (الذي يحتوي على تريس، MES، وفوسفات الصوديوم) إلى 5.5، 6.5، 7.5، أو 8.5 باستخدام HCl مركز أو 1 M NaOH قبل إضافة SC16 وThT. يسمح نظام المخزن المؤقت المختلط بضبط الرقم الهيدروجيني دون تغيير هوية المخزن.
4. ضع اللوحة في قارئ الميكروبلايت.
5. اضبط أطوال موجات الإثارة والانبعاث ضمن النطاق المناسب لتوهج ThT 33,34,35,36.
6. برمج القارئ لقياسات دورية كل 70 ثانية.
7. يشمل 60 ثانية من اهتزاز المدار عند 432 دورة في الدقيقة، تليها فترة راحة لمدة 10 ثوان في كل دورة.
8. اضبط وقت التكامل إلى 20 ميكروثانية وزيادة على 55.
9. شغل الاختبار لمدة 120 دورة لمراقبة تغيرات الفلورة خلال ساعتين من الاهتزاز.
   ملاحظة: تأكد من اختيار الاهتزاز المداري؛ قد يؤدي الاهتزاز الخطي إلى نتائج تجميع ذاتي غير متسقة أو غير مثالية.

النتائج

يعرض الشكل 1 جل SDS-PAGE مصبوغ بكوماسي يراقب تنقية SC16. تمثل الرموز العلامة (M)، قبل الحث (B)، بعد الحث (A)، النسبة القابلة للذوبان (S)، التدفق عبر (F)، الغسيل (W)، التشبع (E)، والتحليل (D). في أول إلوايت IMAC، يتوافق نطاق بوزن جزيئي يقدر ~18 كيلو دالتون مع بروتين H-GB1-SC16 قبل انقسام الثرومبين. بعد القطع مع الثرومبين، لا يوجد بروتين في الجزء الثاني من تدفق IMAC، ويوجد نطاق ~10 كيلو دالتون يقابل SC16 في الغسيل. في المسح الثاني من IMAC، يوجد بعض بقايا SC16 وبروتين أصغر بحجم ~8 كيلو دالتون يقابل H-GB1. ثم تم استخدام SC16 المنقى في اختبارات التجميع الذاتي للنهاية والحركة. تؤكد هذه النتائج نجاح تنقية SC16، كما يتضح من وجود نطاق الوزن الجزيئي المتوقع وانفصال شريك اندماج H-GB1 بعد انقسام الخثارة.

الشكل 1. تحليل SDS-PAGE لتنقية SC16 للفصل الأول (قبل انقسام الثرومبين) والثاني (بعد انقسام الثرومبين) IMAC. يظهر مؤشر وزن جزيئي (M)، إلى جانب عينات مجمعة قبل الحث (B)، وبعد الحث (A)، والمادة الفائقة لتحلل الخلية (S)، والتدفق عبر الجسم (F)، والغسل (W)، والأجزاء المشوهة (E)، بالإضافة إلى العينة المحللة (D). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يكشف اختبار ThT في نقطة النهاية للتجميع الذاتي ل SC16 المعروض في الجدول 1 عن زيادة بمقدار 11 ضعفا في شدة فلورية ThT بعد ساعتين من دوران الطاولة مقارنة بعناصر التحكم التي تحتوي على البروتين ولم يتم تدويرها. وبالمثل، لا نلاحظ أي تغيير كبير في شدة التألق عند تدوير عينات العازلة. يمثل هذا الارتفاع في فلورة ThT عند تحريك SC16 تكوين صفائح β شبيهة بالأميلويدات تدل على التجميع الذاتي ل SC16^24,25. تظهر هذه النتائج أن الاختبار المعتمد على الفلورة الموصوف يراقب بفعالية تجميع SC16 الذاتي تحت الظروف التي تم اختبارها.

عينة	الفلورة ThT (تحسب ± SD)
SC16 بدون دوران	2679 ± 177
SC16 بعد التناوب	30315 ± 2141
المخزن بعد الدوران	665 ± 888

الجدول 1. تم جمع قياسات الفلورة بعد دوران متقطع لعينات SC16. تم حضنة عينات SC16 (50 ميكروغرام ^ملل−1) إما دون تحريك أو تعرضت للدوران لمدة ساعتين. تمت إضافة ThT (20 ميكرومولار) قبل قياسات الفلورة. تم قياس الفلورة عند أطوال موجية للإثارة والانبعاث 438 و494 نانومتر على التوالي، ويتم الإبلاغ عنها كعداد خام. تعرض القيم كمتوسط ± انحراف معياري (SD).

يتم عرض اختبار التجميع الحركي الذاتي ل SC16 عند تحريك في مخازن متغيرة لعدة ساعات في الشكل 2. تشمل منحنيات التجميع الحركي الذاتي النموذجية على شكل حرف S للرجفان الأميلويدي فترات التأخر، النمو، والهضبة المميزة³⁸. بالنسبة ل SC16، لا يلاحظ فترة تأخر كبيرة أثناء القراءات الأولية، رغم أن هذا السلوك قد تم توثيقه لأنواع أخرى من الهيدروفوبينات مثل EAS^21,23. منحنيات التجميع الذاتي لكل رقم حموضة قابلة للمقارنة، مع منحدرات قوية وموجبة تتوافق مع تكوين القضبان الصغيرة. بعد حوالي 20 دقيقة من التحريك، تستقر شدة الفلورة ثم تتناقص ببطء. في عينات التحكم التي تفتقر إلى SC16، لا توجد تغييرات جوهرية في التألق طوال التجربة.

الشكل 2. تم قياس منحنيات التجميع الذاتي ل SC16 باستخدام اختبار فلوري ThT الحركي. تم تحضير SC16 عند 50 ميكروغرام ^{ملليتر−1} في مخزن متعدد المكونات يحتوي على 20 ميكرومولار من ThT، و50 ملليمولار NaCl، و20 ملليمولار فوسفات الصوديوم، و20 ملليمولار MES، و20 ملليمولار تريس. تم إجراء القياسات بعد 60 ثانية من اهتزاز المدار وفترة راحة استمرت 10 ثوان. يمثل المحور x زمن الاهتزاز (إجمالي ساعتين). تم قياس الفلورة باستخدام أطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 438 نانومتر و494 نانومتر على التوالي، ويبلغ عنها كعداد × 10⁻³. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (n = 3). الألواح تتوافق مع درجة الحموضة 5.5 (أعلى اليسار)، 6.5 (أعلى يمين)، 7.5 (أسفل اليسار)، و8.5 (أسفل اليمين). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 3 مثالا على النتائج غير المثالية لاختبار التجميع الذاتي الحركي. في هذه الحالة، تم إكمال الاختبار كما هو موضح في قسم البروتوكول، باستثناء استخدام إعداد اهتزاز "خطي" بدلا من إعداد الاهتزاز "المداري".

الشكل 3. مثال على بيانات التجميع الحركي الذاتي غير المثالية ل SC16 تم الحصول عليها باستخدام اختبار الفلورة الحركي ThT. في هذه الحالة، تم إجراء الهزاز باستخدام إعداد خطي بدلا من الاهتزاز المداري. تم إعداد العينات كما هو موضح في الشكل 2. تم إجراء القياسات بعد 60 ثانية من الاهتزاز الخطي وفترة راحة لمدة 10 ثوان. يمثل المحور x زمن الاهتزاز (إجمالي ساعتين). تم قياس التألق باستخدام أطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 438 نانومتر و494 نانومتر على التوالي، ويبلغ عنها كعداد × 10⁻³. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (n = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

هنا، نلخص بروتوكولات التعبير والتنقية للهيدروفوبين SC16، بالإضافة إلى اختبارات الفلورة منخفضة وعالية الإنتاجية لتجميع SC16 ذاتيا، ولكل منها مزايا وعيوب مميزة. يمكن تطبيق هذه التدفقات على الأنظمة ذات الصلة لمراقبة تجميع البروتين ذاتيا. في هذا البروتوكول، تستخدم الحرارة لتحليل الخلايا قبل تنقية SC16، على عكس معظم البروتوكولات التي تستخدم طرقا تقليدية لتحليل الإشريكية القولونية. وجدنا أن H-GB1-SC16 قابل للذوبان وثابت للحرارة حتى 80 درجة مئوية، وأن التحلل الحراري يعمل كخطوة أولية لتنظيف العينات عن طريق ترسيب بروتيازات غير مستقرة للحرارة وبروتينات ملوثة أخرى داخل محلل الخلية³⁹. ومع ذلك، يمثل SC16 حالة خاصة، حيث غالبا ما تعبر عن الهيدروفوبينات بشكل لا يذوب في أجسام الشمول ^12,21,40. عند التعبير عنها كأجسام احتواء، عادة ما تكون شروط التغيير مطلوبة، تليها إعادة الطي باستخدام البروتوكولات المعتمدة 21,40,41.

في هذا البروتوكول، يستخدم SDS-PAGE لتقييم تنقية SC16 في كل خطوة، بما في ذلك الحبيبات الخلوية قبل وبعد الحث، والنسبة القابلة للذوبان بعد تحلل الخلية، وجميع الكسور اللاحقة في الأعمدة. هذا موضح في الشكل 1؛ ومع ذلك، مقارنة ب H-GB1، فإن النطاق المقابل ل SC16 ضعيف نسبيا. وجدنا أنه بالنسبة للعديد من الهيدروفوبينات، بما في ذلك SC16، فإن تحقيق تلوين كوماسي متسق ومكثف يمثل تحديا. عادة ما يظهر SC16 كنطاق متوسط الشدة عند استخدام β-ميركابتوإيثانول كعامل اختزال (الشكل 1). في بعض الحالات، قد يكون من الضروري تلوين الفضة لرؤية الهيدروفوبينات بشكل أوضح.

يمكن استخدام اختبارات الفلورة الطرفية والحركية لمراقبة التجميع الذاتي ل SC16. اختبار ThT النهائي مفيد لأنه يوفر تقييما سريعا وبسيطا للتجميع الذاتي. بالإضافة إلى زيادة التألق بعد ساعتين من دوران سطح الطاولة، غالبا ما يصاحب التجميع الذاتي عكر أبيض مرئي في أنبوب التفاعل. يستخدم هذا الاختبار دوارا بسيطا على سطح الطاولة للخلط، مما يقلل من تآكل مكونات قارئ اللوحة الدقيقة. من خلال تجربتنا، هذا الاختبار غير حساس نسبيا للمعايير الآلية، مثل إعدادات الاهتزاز في قارئ الميكروبلايت.

يوفر اختبار ThT الحركي معلومات أكثر تفصيلا عن التجميع الذاتي. على سبيل المثال، لا يعتمد التجميع الذاتي ل SC16 بشكل ملحوظ على ظروف المخزن²⁴، رغم أن هناك تباين أكبر بين النسخ عند قيم pH أعلى. ومع ذلك، فإن هذا السلوك ليس شائعا بين الهيدروفوبينات، وعوامل مثل تركيز الملح، ودرجة الحموضة 24,27,42، والإضافات (مثل المظافيق أو الكحول) معروفة بتأثيرها على التجميع الذاتي للهيدروفوبينات ^27,28. على سبيل المثال، يظهر الهيدروفوبين SLH4 تجميع ذاتي أكثر كفاءة عند قوة أيونية منخفضة ودرجة حموضة^{منخفضة 24}، في حين أبلغ أن التجميع الذاتي ل HFBII مستقل عن الرقم الهيدروجيني وتركيز الإلكتروليت⁴²، مشابه ل SC16. وقد ربطت دراسات أخرى تأثير الإضافات على تكوين العصي الصغيرة مع تغيرات التوتر السطحي^27,28. نظرا لهذه الاختلافات، من المهم مراعاة تركيب المخزن ودرجة الحموضة لكل نظام ومراقبة تأثيرها على منحنى التجميع الذاتي، بما في ذلك طور التأخر، والنمو، ومناطق الهضبة.

قيد مهم هو أن اختبار ThT الحركي حساس جدا لمعلمات القارئ الدقيقة وقد يختلف بين الأجهزة. على سبيل المثال، يلاحظ فرق كبير في التجميع الذاتي ل SC16 بين إعدادات الاهتزاز المداري (الحركة الدائرية) والخطوط (ذهابا وإيابا) (الشكل 2 والشكل 3 على التوالي). بينما توفر اختبارات ThT طريقة فعالة لنمذجة التجميع الذاتي للهيدروفوبين، إلا أن لها قيودا جوهرية بسبب الانتقائية المتغيرة، والتي قد تؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة أو سلبية كاذبة⁴³. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤثر تشتت الضوء من تجمعات الهيدروفوبين على شدة الفلورية المقاسة⁴⁴، مما يقلل من دقة القياس. قد يساعد تخفيف العينة وتقليل طول المسار في التخفيف من هذه التأثيرات.

توفر البروتوكولات الملخصة هنا طرقا فعالة لتنقية ومراقبة التجميع الذاتي ل SC16. اختبار نقطة النهاية بسيط وأقل اعتمادا على الأجهزة، بينما يوفر الاختبار الحركي معلومات مفصلة بدقة زمنية، وإن كان ذلك بحساسية أكبر تجاه المعايير الآلية. يوضح هذا البروتوكول نهجا بسيطا لتنقية SC16 وقد يكون قابلا للتطبيق على مائية أخرى مطوية بشكل صحيح معبر عنها في الإشريكية القولونية. على الرغم من أن اختبارات ThT الموصوفة لها قيود جوهرية، إلا أنها توفر معلومات تجميع ذاتي تعتمد على الوقت وسهلة الوصول مقارنة بتقنيات مثل AFM أو قياسات زاوية التلامس وحدها. يمكن تكييف هذه السير للبروتينات ذات الصلة، وهي ذات صلة خاصة في تطبيقات تطوير المواد الحيوية، وتوصيل الأدوية، وغيرها من المجالات التي يكون فيها فهم التجميع الذاتي للبروتينات أمرا مهما.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	145224-94-8	مكون العازلة لتجارب التجميع الذاتي
5 mL round bottom polystyrene tube	Falcon	352054	يستخدم لتجارب التجميع الذاتي ذات الإنتاج المنخفض
96-well black polystyrene microplate	Grenier	655076	يستخدم لقياسات الفلورية في قارئ اللوحات المجهرية
Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) solution (40%)	BioShop	ACR004.500	يستخدم لتحضير جل SDS-PAGE
Agar	BioShop	AGR002.1	الجيلوز المستخدم في إعداد ألواح LB المقاومة للأمبيسلين
Ampicillin	IBI Scientific	IB02040	مضاد حيوي يستخدم في ألواح LB-agar
Baffled 2.8 L Fernbach flasks	Fisher Scientific	955239	يستخدم لنمو زراعة البكتيريا بكميات كبيرة
β-mercaptoethanol	TCI Chemicals	60-24-2	عامل مختزل يستخدم في تحضير عينة SDS-PAGE
Column (1.5 cm diameter gravity column)	Bio-Rad	7371522	يستخدم لتنقية النيكل بالانحياز
Dialysis tubing (3500 kDa MWCO)	BioDesign	D302	يستخدم لتبادل العازلة أثناء التنقية
Emission filter	Edmund Optics	84080	يستخدم لتجارب ThT (494 نانومتر، عرض النطاق 20 نانومتر)
Excitation filter	Edmund Optics	67012	يستخدم لتجارب ThT (438 نانومتر، عرض النطاق 24 نانومتر)
Fluorescence microplate reader	Tecan	Infinite F200 Pro	يستخدم لقياس شدة فلورية ThT
Hotplate	Lab Fish	HS5C	يستخدم لإعداد حمام مائي مع مراقبة درجة الحرارة
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	يستخدم لضبط درجة الحموضة في العازلات
Imidazole	TCI Chemicals	288-32-4	يستخدم في تنقية IMAC (مستحلبات الغسل والفصل)
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1	يحفز التعبير عن البروتين في E. coli
LB broth (Lennox)	BioShop	LBL405.5	وسط نمو لزراعة البكتيريا
Low-speed refrigerated centrifuge	Beckman Coulter	360291	يستخدم لترسيب الخلايا قبل التخزين
Nickel NTA agarose beads	GoldBio	H-350-50	راتنج يستخدم في تنقية الالتحام لبروتينات His-tagged
SC16 plasmid	BioBasic	N/A	تركيب DNA مخصص يشفر بروتين انصهار H-GB1-SC16
SHuffle T7 Express competent E. coli	New England Biolabs	C3029J	سلالة مستضيف تستخدم للتعبير عن البروتين المؤتلف
Sodium chloride (NaCl)	BioShop	SOD001.5	مكون العازلة ومنظم القوة الأيونية
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Chemical	SS255-1	يستخدم لضبط درجة الحموضة في العازلات
Sodium phosphate	BioShop	SPD579.1	مكون العازلة للحفاظ على درجة الحموضة
Spectrophotometer	Pharmacia Biotech	5096	يستخدم لتقدير SC16
Thioflavin T (ThT)	Acros Organics	2390-54-7	صبغة فلورية تستخدم لمراقبة التجميع الذاتي للبروتين
Thrombin protease	Sigma-Aldrich	04-04-9002	يستخدم لفصل بروتين انصهار H-GB1-SC16
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	BioShop	TRS001.5	المحلول العازل المستخدم في التنقية وحلول التجارب
High-speed refrigerated centrifuge	Sorvall	46915	يستخدم لتوضيح المستحلب بعد تحلل الخلية
SDS-PAGE setup	Bio-Rad	1658000EDU	يستخدم لتحضير وتشغيل جل SDS-PAGE