تخفف الإكسوزومات المشتقة من المشيمة من موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج والتقدم الالتهابي الناجم عن نقص الأكسجة عبر SASH1

ملخص

تم تحديد البروتين 1 المحتوي على نطاقي SAM وSH3 (SASH1) كمنظم رئيسي لموت الخلايا المبرمج في الخلايا الأرومية الغاذية والالتهابات في حالة تسمم الحمل (PE). وتعمل الإكسوسومات المشتقة من المشيمة (P-EXOS) على تخفيف الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة عن طريق تثبيط تعبير SASH1. وتكشف هذه النتائج عن آلية جديدة تكمن وراء إمراضية تسمم الحمل، وتشير إلى أن SASH1 قد يمثل هدفًا علاجيًا محتملًا.

الملخص

يُعد SASH1 بروتيناً مهايئاً للإشارات يشارك في نمو الخلايا، وموت الخلايا المبرمج، والتنظيم المناعي، وقد تزايدت دراسته في الخلايا الورمية والمناعية. وتشير الأدلة الناشئة إلى أن SASH1 يلعب دوراً هاماً في الاستجابات الالتهابية والتوازن الخلوي، وهي عمليات ترتبط ارتباطاً وثيقاً بتطور تسمم الحمل (PE). هدفت هذه الدراسة إلى تحديد ما إذا كان SASH1 يساهم في موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج والاستجابات الالتهابية في حالات تسمم الحمل، وما إذا كانت P-EXOS تظهر تأثيرات وقائية من خلال تنظيم SASH1. في هذه الدراسة، تم تحليل ثلاث مجموعات بيانات ترانسكريبتومية مرتبطة بتسمم الحمل (GSE75010 وGSE10588 وGSE60438) لتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المشتركة، متبوعة بتحليلات إثراء الوجود الجيني (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG). كما تم تطبيق خوارزميات التعلم الآلي لغربلة الجينات المرشحة الرئيسية، واستُخدمت بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتوصيف التباين الخلوي في أنسجة المشيمة وتحديد أنماط التعبير الخاصة بكل نوع من الخلايا. تم تحديد SASH1 كجين مرشح متوافق، وكان تعبيره مرتفعاً بشكل ملحوظ في الخلايا الأرومية الغاذية من عينات تسمم الحمل. In vitro، تم إنشاء نموذج لخلايا أرومية غاذية من نوع HTR-8/SVneo معالجة بنقص الأكسجة، مدمجاً مع تثبيط SASH1، والإفراط في تعبير SASH1، والزراعة المشتركة مع P-EXOS. وأظهرت التجارب الوظيفية أن تثبيط SASH1 أدى إلى كبح موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة بشكل كبير وقلل من إفراز السيتوكينات المحفزة للالتهابات، بما في ذلك IL-6 وIL-1β وTNF-α، بينما أدى الإفراط في تعبير SASH1 إلى تعزيز موت الخلايا المبرمج والاستجابات الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك، قلل العلاج بـ P-EXOS بشكل ملحوظ من تعبير SASH1 على مستويي mRNA والبروتين وخفف من إصابة الخلايا الأرومية الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجة، بينما أدى الإفراط في تعبير SASH1 إلى إلغاء هذه التأثيرات الوقائية إلى حد كبير. وبناءً على ذلك، تشير هذه النتائج إلى أن SASH1 يلعب دوراً حاسماً في موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج والاستجابات الالتهابية في تسمم الحمل. وقد تخفف P-EXOS من إصابة الخلايا الأرومية الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجة عن طريق تثبيط تعبير SASH1، مما يوفر رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية والأهداف العلاجية المحتملة لتسمم الحمل.

المقدمة

تُعد تسمم الحمل (PE) اضطراباً متعدد الأنظمة خاصاً بفترة الحمل، يحدث عادةً بعد الأسبوع العشرين من الحمل، ويتميز سريرياً بارتفاع ضغط الدم، وبيلة البروتين، واختلال وظائف أعضاء متعددة. ولا يزال هذا الاضطراب سبباً رئيسياً للمراضة والوفيات لدى الأمهات وحديثي الولادة في جميع أنحاء العالم¹. وعلى الرغم من التقدم المستمر في الإدارة السريرية، إلا أن العلاج الجذري لتسمم الحمل لا يزال يتمثل في ولادة المشيمة، مما يؤكد عدم الفهم الكامل لمسارات إمراضه والحاجة الملحة لتحديد آليات جزيئية وخلوية جديدة، بالإضافة إلى أهداف علاجية محتملة^2,3.

يعد الغزو الكافي للأرومة الغاذية وتعزيز التطور الطبيعي للمشيمة آليتين حاسمتين تكمنان وراء نشوء مسببات مرض PE⁴. فخلال الحمل الطبيعي، تغزو خلايا الأرومة الغاذية الساقط الرحمي وتعيد تشكيل الشرايين الحلزونية لإنشاء دورة دموية منخفضة المقاومة وعالية السعة. ويؤدي ضعف غزو وهجرة خلايا الأرومة الغاذية إلى انخفاض تروية المشيمة، مما يؤدي إلى بيئة مستمرة من نقص الأكسجة والإجهاد التأكسدي. يؤثر نقص الأكسجة بشكل مباشر على الموت الخلوي المبرمج، كما يؤدي الإطلاق غير الطبيعي للوسائط المحفزة للالتهاب إلى اختلال التوازن في الواجهة بين الأم والجنين، مما يؤدي إلى تفاقم خلل وظائف المشيمة⁵. كما يعتبر الالتهاب محركاً هاماً لمرض PE؛ حيث وجد أن مستويات IL-17 وIL-6 وTNF-α مرتفعة بشكل ملحوظ في مشيمة والدم المحيطي للمرضى المصابين بـ PE⁶. ويعزز نقص الأكسجة والالتهاب بعضهما البعض، مما يشكل حلقة مفرغة تضخم الالتهاب الجهازي، وتسبب تلفاً في البطانة الغشائية، وتساهم في حدوث تشوهات مشيمية. ولا تزال الشبكات الجزيئية الأساسية التي تحكم الموت الخلوي المبرمج للأرومة الغاذية والاستجابات الالتهابية غير معروفة إلى حد كبير.

يعتبر SASH1 عضواً في عائلة SLy/SASH1 من البروتينات السقالية داخل الخلوية التي تعمل كمحول إشارات⁷. وقد تم توصيف SASH1 بشكل أساسي ككابح للأورام يثبط الانتقال الظهاري الميزنكيمي (EMT)، وهجرة الخلايا، والغزو من خلال التفاعلات مع شركاء الإشارات مثل CRKL ومسار PI3K-Akt-mTOR^8,9. وإلى جانب أدواره في كبح الأورام، تشير الأدلة الناشئة إلى أن SASH1 يشارك في إشارات الالتهاب والتنظيم المناعي⁷. ومع ذلك، لم يتم استقصاء تعبير ووظيفة SASH1 في المشيمة، لا سيما في سياق بيولوجيا الخلايا أرومية الساق (trophoblast) وما قبل تسمم الحمل (PE).

برزت الإكسوسومات كوسائط خلوية مهمة وتتم دراستها بشكل متزايد في سياق الحمل¹⁰. تقوم الإكسوسومات بنقل حمولات مختلفة من المواد النشطة بيولوجياً، بما في ذلك البروتينات والليبيدات والحمض النووي الريبي غير المشفر، لتعديل وظيفة الخلية المستقبلة. وتشير الأدلة المتزايدة إلى أن P-EXOS تلعب دوراً حاسماً في التنظيم المناعي أثناء الحمل، وأن نشاطها وحمولتها يتغيران بشكل ملحوظ في حالات PE، مما قد يؤدي إلى تكثيف الحالة الالتهابية¹¹. كما ارتبطت الإكسوسومات بتنظيم الإجهاد التأكسدي¹² وتكون الأوعية الدموية¹³، مما قد يمارس تأثيرات مفيدة في المضاعفات المرتبطة بالحمل. ومع ذلك، لا تزال أهدافها الجزيئية وآليات عملها في حالات PE غير مفهومة بشكل كامل.

تم افتراض أن SASH1 يكون مختلاً في مشيمة ما قبل الارتعاج (PE) ويعمل كمحرك رئيسي لموت الخلايا المبرمج في الأرومة الغاذية والاستجابات الالتهابية، وأن P-EXOS قد تمارس تأثيرات وقائية ضد إصابة الأرومة الغاذية من خلال تعديل تعبير SASH1. ولاختبار هذه الفرضية، تم دمج مجموعات بيانات نسخية متعددة لمرض ما قبل الارتعاج وبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية مع تعلم آلي متعدد الخوارزميات لتحديد الجينات المرشحة الرئيسية. وباستخدام نموذج خلايا الأرومة الغاذية HTR-8/SVneo المعالجة بنقص الأكسجة وتجارب التدخل القائمة على الإكسوسومات، تم استقصاء الدور الوظيفي لـ SASH1 في خلل وظيفة الأرومة الغاذية والقدرة العلاجية لـ P-EXOS في حالات ما قبل الارتعاج.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شيجياتشوانغ الرابع (رقم الموافقة 20200031). تم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من جميع المتبرعين بأنسجة المشيمة قبل جمع العينات. أُجريت جميع الإجراءات التي شملت مشاركين بشريين وفقاً لإعلان هلسنكي. تتوفر قائمة كاملة بالكواشف والمستهلكات والمعدات والبرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

جمع البيانات

تم الحصول على بيانات RNA-seq من قاعدة بيانات GEO. تضمنت مجموعات البيانات GSE75010، والتي تحتوي على بيانات التعبير الجيني من 157 مشيمة مصابة بـ PE و173 مشيمة غير مصابة بـ PE (العدد = 330). وتحتوي GSE10588 على بيانات التعبير الجيني من 26 مشيمة طبيعية و17 مشيمة مصابة بـ PE شديد (العدد = 43). بينما تحتوي GSE60438 على بيانات توصيف الترانسكريبتوم للغشاء الساقط القاعدي (decidua basalis) من مريضات مصابات بما قبل الإرجاج والحوامل ذوات الضغط الطبيعي (العدد = 125). كما تم الحصول على بيانات ترانسكريبتوم الخلية الواحدة من مجموعة بيانات GEO رقم GSE183338، والتي تتضمن عينات من النواة الواحدة من الزغابات الكوريونية/الواجهة الأمومية الجنينية في حالات الحمل المصابة بـ PE والحمل الصحي.

تحليل الجينات المعبّر عنها تفاضلياً (DEGs)

تم أولاً معالجة وتطبيع مجموعات البيانات GSE75010 وGSE10588 وGSE60438 المتعلقة بالجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المرتبطة بـ PE. بعد ذلك، أُجري تحليل تفاضلي باستخدام حزمة "limma" ¹⁴ في لغة R بناءً على معلومات تجميع العينات. تم اختيار الجينات التي كانت قيمة p < 0.05 وقيمة |log2FC| > 0.5. تم إنشاء مخططات البركان (Volcano plots) للجينات ذات التعبير التفاضلي باستخدام حزمة ggplot2 في لغة R. كما رُسمت الخرائط الحرارية لأعلى 20 جيناً من الجينات ذات التعبير التفاضلي باستخدام حزمة pheatmap في لغة R. لاحقاً، تم إيجاد التقاطع بين الجينات ذات التعبير التفاضلي المختارة من مجموعات البيانات الثلاث، وبُنيت شبكة تفاعل بروتين-بروتين (PPI) للجينات المرشحة باستخدام منصة STRING الإلكترونية، بدرجة تفاعل ≥0.15. تم تحديد أعلى 20 جيناً محورياً (hub genes) من شبكة PPI هذه بناءً على درجة اتصالها، وصُنفت باستخدام برنامج Cytoscape. وتم تصور نتائج شبكة PPI باستخدام برنامج Cytoscape أو منصة STRING.

تحليل الإثراء

تَم إجراء تحليل إثراء الجينات باستخدام حزمتي ClusterProfiler وDOSE بالاشتراك مع موقع Metascape الإلكتروني. وتم الحصول على قواعد البيانات من GO وKEGG. أُجري تحليل الإثراء باستخدام دالة “EnrichGO”. واعتُبرت المسارات التي كانت قيمة p < 0.05 مُثرية بشكل معنوي. وتم تمثيل نتائج الإثراء بصرياً باستخدام حزمتي “ggplot2” و“ggpubr”.

تعلم الآلة

لتحديد الجينات المعبّر عنها تفاضلياً (DEGs) التي تتسم بالمتانة والأهمية البيولوجية المرتبطة بمرض ما قبل الارتعاج (PE)، تم إجراء تحليل لاختيار الميزات باستخدام تعلم الآلة متعدد النماذج، وذلك بناءً على مجموعة بيانات النسخ المتوفرة علناً GSE60438 (المنصة: GPL6884). تحتوي مجموعة البيانات هذه على ملفات تعريف التعبير الجيني لعينات من الساقط الأساسي (decidua basalis) التي جُمعت من حالات حمل مصابة بما قبل الارتعاج وحالات حمل ذات ضغط دم طبيعي أثناء العملية القيصرية. تم توحيد الجينات المعبّر عنها تفاضلياً التي تم ترشيحها مسبقاً، واستُخدمت مصفوفة التعبير، جنباً إلى جنب مع معلومات التصنيف السريري المقابلة، كمدخلات لأربعة خوارزميات متميزة لتعلم الآلة من أجل تقليل انحياز النموذج وتعزيز استقرار اختيار الميزات.

تم تطبيق الخوارزميات الأربع في وقت واحد، دون ترتيب محدد. أُجري تحليل LASSO باستخدام حزمة "glmnet" لإجراء تحليل الانحدار واختيار الجينات ذات الميزات الهامة. تمت إضافة حد تنظيم L1 إلى دالة الخسارة، مما يؤدي إلى تقليص معاملات الميزات الأقل أهمية إلى الصفر، وبذلك يتم تحقيق اختيار الميزات. نُفذت خوارزمية SVM-RFE باستخدام حزمة "e1071" لبناء آلة ناقلات الدعم مع حذف الميزات المتكرر. تم تدريب مصنف أولاً باستخدام SVM، ثم أُزيلت الميزات الأقل إفادة بشكل تكراري بناءً على أوزان الميزات، مما أدى إلى الحصول على مجموعة فرعية مثلى من الميزات. طُبقت خوارزمية XGBoost باستخدام حزمة "xgboost" لبناء أشجار قرار متعددة؛ حيث قامت كل شجرة بملاءمة المتبقيات من الشجرة السابقة، وجُمعت المخرجات المرجحة للحصول على التنبؤ النهائي. أُجري تحليل Boruta باستخدام حزمة "randomForest"، حيث تم إنشاء ميزات ظلية تنافست مع الميزات الحقيقية في تدريب الغابة العشوائية، وتم الاحتفاظ بالميزات التي كانت قيم أهميتها أعلى بكثير من الضوضاء العشوائية.

تحليل بيانات النسخ transcriptome للخلية الواحدة

تم الحصول على بيانات النسخ transcriptome أحادية الخلية من قاعدة بيانات GEO، واستُرجعت مصفوفة العد الخام من GSE183338. استُوردت مصفوفة العد باستخدام دالة “Read10X” من حزمة Seurat وحُوّلت إلى تنسيق dgCMatrix. دُمجت الكائنات الفردية في كائن تجميعي واحد باستخدام دالة “merge”، وجُعلت تسميات الخلايا فريدة باستخدام “RenameCells”. تم ترشيح الخلايا منخفضة الجودة بناءً على المعايير التالية: إزالة الجينات التي تم التعبير عنها في أقل من ثلاث خلايا، واستبعاد الخلايا التي تعبر عن أقل من 200 جين. خضعت الخلايا التي اجتازت مراقبة الجودة لعملية التسوية (normalization) وتم تحديد الجينات عالية التباين. طُبقت تسوية القياس الشاملة باستخدام “LogNormalize” (معامل القياس = 10,000)، واختيرت الجينات عالية التباين (n = 2,000) باستخدام “FindVariableFeatures”، وتم قياس البيانات باستخدام “ScaleData”. أُجري تحليل المكونات الرئيسية على الميزات عالية التباين، وتم الاحتفاظ بأعلى 30 مكوناً رئيسياً. صُححت تأثيرات الدفعة (batch effects) بين العينات باستخدام طريقة Harmony. تم تصور الخلايا وتقليل أبعادها باستخدام UMAP. أُنشئت رسوم الجيران الأقرب المشتركة باستخدام “FindNeighbors” و“FindClusters” بناءً على خوارزمية Louvain. تم تحسين معامل الدقة في “FindClusters” بين 0.1 و1. تم تصور شجرة التجميع باستخدام دالة “clustree”، واختيرت دقة 0.9 لتحديد تجمعات الخلايا. أُزيلت الثنائيات (doublets) المحتملة باستخدام خوارزمية Scrublet. تم توصيف تجمعات الخلايا من خلال تحديد الجينات المرجعية ذات التعبير التفاضلي باستخدام دالة “FindAllMarkers”. طُبق اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب (Wilcoxon rank sum test) غير المعلمي مع تصحيح بونفيروني. عُينت هويات الخلايا بناءً على المؤشرات السطحية، والمؤلفات العلمية ذات الصلة، وقاعدة بيانات تصنيف الخلايا¹⁵.

زراعة الخلايا

تم استزراع خط خلايا الأرومة الغاذية HTR-8/SVneo في وسط RPMI-1640 مضاف إليه 10% من مصل الجنين البقري و1% من البنسلين/ستربتوميسين. تم تهيئة ظروف نقص الأكسجة عن طريق استزراع الخلايا عند 1% O₂ و5% CO₂ و94% N₂ لمدة 24 h؛ بينما تم الحفاظ على ضوابط سويّة الأكسجة عند 20% O₂ و5% CO₂¹⁶. يجب تنفيذ جميع إجراءات استزراع الخلايا داخل كابينة سلامة حيوية من الفئة الثانية (Class II biosafety cabinet) باستخدام تقنية تعقيمية. كما يجب التخلص من أوساط الاستزراع وكواشف عفن الخلايا ونفايات الخلايا وفقاً لإرشادات السلامة الحيوية المؤسسية.

ترانسفكشن الخلايا

تم تخليق بلازميدات تحتوي على sh-SASH1 وsh-NC وOE-SASH1 وOE-NC. وزعت خلايا HTR-8/SVneo بكثافة 5 × 10⁵ خلية لكل بئر في أطباق ذات ستة آبار. بعد ذلك، تم نقل 2 µg من بلازميد sh-SASH1 أو sh-NC أو OE-SASH1 أو OE-NC لكل بئر إلى الخلايا باستخدام كاشف نقل وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وباختصار، تم تخفيف DNA البلازميد وكاشف P3000 في وسط Opti-MEM، ومزجهما مع Lipofectamine 3000 المخفف بشكل منفصل في Opti-MEM، ثم حضن الخليط لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة، وأضيف إلى الخلايا عندما وصلت درجة تلاقيها إلى 70–80%. وبعد ثمان وأربعين ساعة من عملية النقل، تم تقييم تعبير SASH1 عن طريق RT-qPCR واللطخة الغربية (Western blot). وتظهر تسلسلات الهدف لـ shRNA المستخدمة لتثبيط SASH1 في الجدول التكميلي 1.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي

تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من خلايا HTR-8/SVneo وتحويله عكسياً إلى cDNA باستخدام مجموعة أدوات النسخ العكسي عند 42 °C لمدة 30 min، تلاها 85 °C لمدة 5 min. وأُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) باستخدام مزيج SYBR Green الرئيسي وفقاً لظروف الدورات التالية: 95 °C لمدة 10 min، تلاها 40 دورة من 95 °C لمدة 15 s و60 °C لمدة 1 min. وحُسب التعبير النسبي لـ mRNA باستخدام طريقة ΔΔCt، مع اعتبار β-actin مرجعاً داخلياً. تسلسلات البادئات المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في الجدول التكميلي 2.

مقايسة لطخة ويسترن

تم استخلاص البروتين الكلي من خلايا HTR-8/SVneo باستخدام محلول التحلل (lysis buffer). جُمعت نواتج تحلل الخلايا، وحُضنت على الثلج، ثم طُردت مركزياً عند 12,000 × g لمدة 30 min عند 4 °C لإزالة الحطام غير القابل للذوبان. حُدد تركيز البروتين باستخدام جهاز المطياف الضوئي (spectrophotometer). وفُصلت كميات متساوية من البروتين (50 µg) عن طريق الفصل الكهربائي لهلام SDS-PAGE، ثم نُقلت لاحقاً إلى أغشية PVDF. عولجت الأغشية بـ 5% من الحليب الخالي من الدسم لغلق مواقع الارتباط غير المحددة (blocked)، وحُضنت مع الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 °C. وبعد الغسل، حُضنت الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المناظرة، وتم تصور حزم البروتين باستخدام نظام كشف التألق الكيميائي المُعزز (enhanced chemiluminescence detection system).

للكشف عن البروتين، شملت الأجسام المضادة الأولية anti-SASH1 و β-actin. كما استُخدمت أجسام مضادة ثانوية مناسبة مقترنة بإنزيم بيروكسيديز الفجل (HRP)، وهي goat anti-rabbit و goat anti-mouse. واستُخدم β-actin كضابط تحميل داخلي لضمان تساوي كميات البروتين المحملة. وقد تم قياس كثافة حزم البروتين وتقديرها كميًا باستخدام برنامج ImageJ.

عزل P-EXOS

تم عزل P-EXOS من نسيج الزغابات المشيمية الذي تم الحصول عليه من مشيمات مكتملة النمو لنساء أصحاء خضعن لعملية قيصرية اختيارية. غُسل نسيج الزغابات المشيمية جيداً بـ PBS معقم، ثم قُطع إلى شظايا بحجم 1 mm³ تقريباً، وزُرع في وسط RPMI-1640 مضاف إليه 10% FBS منزوع الإكسوزومات عند 37 °C في 5% CO₂ لمدة 48 h. خضع الوسط المكيف لطرد مركزي تفاضلي على النحو التالي: 300 × g لمدة 10 min لإزالة الخلايا وبقايا الأنسجة؛ و2,000 × g لمدة 20 min لإزالة بقايا الخلايا؛ و10,000 × g لمدة 30 min لإزالة الحويصلات الدقيقة، وكل ذلك عند 4 °C. ثم تم إجراء طرد مركزي فائق للمادة الطافية الناتجة عند 120,000 × g لمدة 70 min عند 4 °C لترسيب الإكسوزومات. غُسلت الرواسب مرة واحدة بـ PBS وأعيد إخضاعها للطرد المركزي الفائق عند 120,000 × g لمدة 70 min عند 4 °C. وأخيراً، أُعيد تعليق الرواسب النهائية في PBS. تم توصيف الإكسوزومات المعزولة عن طريق تحليل Western blot للكشف عن علامات الإكسوزومات (PLAP و CD63 و TSG101، مع استخدام GM130 كضابط سلبي) وفُحصت كذلك بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ للملاحظة المورفولوجية.

تجربة الامتصاص الخلوي لـ P-EXOS

لتأكيد الامتصاص الخلوي لـ P-EXOS، تم وسم الإكسوسومات فلوريسنتياً باستخدام صبغة الغشاء المحبة للدهون PKH67 وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وباختصار، تم تحضين P-EXOS مع PKH67 (4 µM) في Diluent C لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة، ثم أوقف التفاعل بإضافة حجم مساوٍ من ألبومين المصل البقري (BSA) بتركيز 1%. أعيد عزل الإكسوسومات الموسمة عن طريق الطرد المركزي الفائق (120,000 × g، 70 min، 4 °C) لإزالة الصبغة غير المرتبطة. ثم أضيفت P-EXOS الموسمة بـ PKH67 (50 µg/mL) إلى خلايا HTR-8/SVneo وحُضنت معاً لمدة 24 h تحت ظروف طبيعية أو ظروف نقص الأكسجة (1% O₂). غُسلت الخلايا لاحقاً ثلاث مرات باستخدام PBS، وثُبتت باستخدام بارافورمالدهيد بتركيز 4% لمدة 15 min، وصُبغت النوى بصبغة DAPI (1 µg/mL). تم تصوير الامتصاص الخلوي للإكسوسومات الموسمة بـ PKH67 باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر (CLSM؛ إثارة 490 nm، انبعاث 502 nm). أما بالنسبة لتجارب الزراعة المشتركة الوظيفية، فقد عولجت خلايا HTR-8/SVneo بـ P-EXOS بتركيز 50 µg/mL (ما يعادل البروتين) في وسط RPMI-1640 كامل مضاف إليه 10% FBS خالية من الإكسوسومات تحت ظروف نقص الأكسجة (1% O₂) لمدة 24 h.

المقايسة الامتصاصية المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)

تم جمع السوائل الطافية من المزارع الخلوية، وقياس مستويات IL-6 و IL-1β و TNF-α باستخدام أطقم ELISA الخاصة بـ IL-6 و IL-1β و TNF-α على التوالي، وفقاً لتعليمات الشركات المصنعة. تم قياس الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة، وحُسبت التركيزات الفعلية من منحنيات القياس المعيارية.

وسم نهايات القطوع بـ dUTP بوساطة إنزيم TdT (تقنية TUNEL)

تم الكشف عن الخلايا المبرمجة (Apoptotic cells) باستخدام مجموعة أدوات مقايسة TUNEL وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وباختصار، تم تثبيت الخلايا باستخدام 4% paraformaldehyde لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة، ثم جعل غشاؤها نفاذاً باستخدام 0.1% Triton X-100 في PBS لمدة 5 min على الثلج، وحُضنت مع خليط تفاعل TUNEL لمدة 60 min عند 37 °C في الظلام. تمت صبغ الأنوية صبغاً مضاداً باستخدام DAPI، ووُثقت الخلايا الموجبة لـ TUNEL باستخدام مجهر فلوري، وتم قياسها كمياً عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ TUNEL في خمسة حقول مختارة عشوائياً على الأقل لكل عينة.

التحليل الإحصائي

تم تحليل جميع البيانات باستخدام برنامج R وبرنامج GraphPad Prism. عُرضت المتغيرات المستمرة في شكل المتوسط ±الانحراف المعياري (SD). أُجريت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t لـ Student، بينما أُجريت المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) متبوعاً باختبار Tukey للمقارنات البعدية. وقُيمت الدلالة الإحصائية للمتغيرات الفئوية باستخدام اختبار مربع كاي (Chi-square test) أو اختبار فيشر الدقيق (Fisher’s exact test). وما لم ينص على خلاف ذلك، حُسبت الارتباطات بين الجزيئات باستخدام تحليل ارتباط سبيرمان. نُفذت تجارب توصيف الإكسوزومات باستخدام P-EXOS المعزولة من ثلاثة متبرعين مستقلين بالمشيمة. وأُجريت التجارب القائمة على الخلايا في ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، تمثل تجارب مستقلة أُجريت في مناسبات منفصلة باستخدام خلايا HTR-8/SVneo من ممرات مختلفة، مع استخدام P-EXOS المعزولة من متبرع مشيمي مختلف في كل مكرر. واعتُبرت القيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

التحليل الترانسكريبتومي للمرضى الأصحاء والمرضى المصابين بتسمم الحمل

لتحليل الاختلافات في التعبير الجيني بين المجموعة الطبيعية (Normal) والمرضى المصابين بما قبل تسمم الحمل (PE)، تم تحليل التعبير التفاضلي باستخدام حزمة limma البرمجية في لغة R على مجموعات البيانات المدمجة. تم تحديد ما مجموعه 89 من الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) (p < 0.05 و |log₂FC| > 0.5)، منها 69 جينًا زاد تعبيرها و20 جينًا انخفض تعبيرها في مجموعة البيانات GSE75010 (الشكل 1A). وهناك 2,097 جينًا ذا تعبير تفاضلي، حيث زاد تعبير 1,121 جينًا وانخفض تعبير 976 جينًا (الشكل 1B). كما يوجد 7,633 جينًا من الـ DEGs في مجموعة بيانات GSE60438، مع زيادة تعبير 3,371 جينًا وانخفاض تعبير 4,262 جينًا (الشكل 1C). ومن المرجح أن تعكس الاختلافات الجوهرية في أعداد الـ DEGs عبر مجموعات البيانات الثلاث اختلافات في حجم العينة، ومنشأ النسيج (الزغابات المشيمية مقابل السوط القاعدي)، وتصنيف شدة الإصابة بما قبل تسمم الحمل، مما يؤكد بشكل أكبر على قيمة إيجاد التقاطع بين مجموعات البيانات لتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي المشتركة والقوية.

تحليل الإثراء الوظيفي للجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs)

من أجل التحديد المنهجي للجينات المعبر عنها تفاضلياً (DEGs) الرئيسية المرتبطة بما قبل تسمم الحمل (PE)، تم إجراء تحليل فين (Venn analysis) على الجينات المعبر عنها تفاضلياً من مجموعات بيانات PE رقم GSE75010 وGSE10588 وGSE60438، وفي النهاية تم تحديد 56 جيناً مشتركاً معبراً عنها تفاضلياً (الشكل 2A). تم بناء شبكة تفاعلات البروتين-بروتين (PPI) لهذه الجينات الـ 56 المشتركة باستخدام المنصة الإلكترونية STRING (درجة التفاعل ≥0.15)، كما تم تحديد أهم 20 جيناً محورياً (hub genes) بناءً على درجة اتصالها داخل الشبكة، وتم ترتيبها باستخدام برنامج Cytoscape (الشكل 2B). وبناءً على هذه الجينات، تم أيضاً إجراء تحليل إثراء الوجود الأنطولوجي للجينات (GO enrichment) لاستكشاف الوظائف المحتملة في العمليات البيولوجية (BP)، والمكونات الخلوية (CC)، والوظائف الجزيئية (MF) (الشكل 2C). كانت الجينات المعبر عنها تفاضلياً أكثر إثراءً في إفراز الهرمونات وتنظيم إشارات كيناز السيرين/الثريونين للمستقبلات عبر الغشائية. ومن حيث الخلايا، توزعت الجينات بشكل أساسي في الالتصاقات البؤرية، والوصلات بين الخلية والركيزة، ومجموعة متنوعة من الجينات المرتبطة بالحويصلات والجسيمات الحالة. وفيما يخص الوظائف الجزيئية، كانت المصطلحات المثرية هي نشاط بروليل هيدروكسيلاز، والنشاط الهرموني، والنقل عبر الغشائي للجزيئات المرتبطة بالدهون. وتشير هذه النتائج إلى أن الجينات المعبر عنها تفاضلياً قد تلعب أدواراً مهمة في إشارات الخلايا المشيمية، والتفاعل بين الخلية والمصفوفة، والحفاظ على الوظائف المرتبطة بالغدد الصماء. وفي الوقت ذاته، وجد أن إثراء مسارات KEGG قد أظهر أن الجينات المعبر عنها تفاضلياً كانت أكثر عرضة للإثراء في تفاعل السيتوكين مع مستقبل السيتوكين، وتفاعل جزيئات التصاق الخلايا، ومسارات إشارات TGF-β وHIF-1 (الشكل 2D). ومن المرجح أن إثراء بعض المصطلحات المرتبطة بالفيروسات (مثل فيروسات التهاب الكبد وفيروس إيبولا) يعكس تداخلاً غير محدد مع جينات تنظيم مناعية مشتركة بدلاً من وجود ارتباط بيولوجي مباشر مع PE؛ ولذلك يظل التركيز التفسيري على المسارات المرتبطة بالالتهابات والالتصاق ونقص الأكسجة. ترتبط هذه المسارات بالاستجابة الالتهابية، والإشارات التي يتوسطها التصاق الخلايا، والإشارات المرتبطة بنقص الأكسجة، وقد يكون لها تأثير على تطور PE عن طريق تغيير الحالة الالتهابية المناعية والتواصل بين الخلايا في البيئة المجهرية للمشيمة.

تعرّف تقنيات تعلم الآلة على SASH1 كجين رئيسي في PE

لتحديد الجينات الإنذارية الرئيسية، تم تطبيق أربعة طرق من طرق التعلم الآلي لاختيار الميزات. أظهر تحليل انحدار LASSO مع التحقق المتقاطع أن النموذج حقق الحد الأدنى من خطأ التحقق المتقاطع عندما كانت قيمة log(λ.min) = -3.8075. وقد تم اختيار الجينات ذات المعاملات غير الصفرية عند قيمة λ هذه كميزات رئيسية حددها تحليل LASSO (الشكل 3A–B). وتقوم خوارزمية Boruta بتقييم أهمية الميزة من خلال مقارنتها بميزات الظل (shadow features)؛ حيث تم تصنيف الجينات التي كانت قيم أهميتها أعلى من shadowMax على أنها "مؤكدة" (Confirmed) واعتُبرت جينات مرشحة رئيسية، بينما صُنفت الجينات ذات قيم الأهمية الأقل من shadowMin على أنها "مرفوضة" (Rejected) واعتُبرت غير ذات مساهمة معنوية. أما الجينات التي وقعت بين هذين الحدين فقد صُنفت على أنها "محتملة" (Tentative)، مما يشير إلى أهمية محتملة ولكنها غير مؤكدة (الشكل 3C). وأظهر تحليل SVM-RFE أنه عند الاحتفاظ بـ 40–50 ميزة، وصلت دقة التحقق المتقاطع إلى أعلى مستوى أو مستوى قريب من الأعلى، مما يشير إلى أداء تنبؤي أمثل عند هذا النطاق من الميزات (الشكل 3D). وتشير دقة التحقق المتقاطع المتوسطة (~0.6) إلى عدم وجود خوارزمية واحدة عملت بشكل مثالي لهذه المجموعة من البيانات؛ ولذلك تم اعتماد استراتيجية تقاطع متعدد الخوارزميات لتعزيز قوة اختيار الميزات. وقام نموذج XGBoost بقياس الأهمية النسبية للجينات باستخدام قيم الكسب (Gain)، وبذلك حدد الميزات ذات المساهمات الأعلى في تنبؤ النموذج (الشكل 3E). وحدد تحليل تقاطع فين (Venn intersection analysis) للنتائج المستخلصة من الطرق الأربع أن SASH1 هو الجين المتداخل الوحيد. وعلى الرغم من تصنيف SASH1 كجين "محتمل" بواسطة خوارزمية Boruta، فإن اختياره المتسق عبر الخوارزميات الثلاث الأخرى يدعم تعيينه كجين مرشح بالإجماع (الشكل 3F).

تحليل الخلية الواحدة

تم استقصاء التباين الخلوي والعمليات الجزيئية في أنسجة المشيمة المصابة بـ PE. خضعت الخلايا لعملية تصفية للجودة بناءً على عدد الجينات المكتشفة، وعدد عدات RNA، ونسبة التعبير الجيني الميتوكوندري. وقد تمت إزالة الخلايا منخفضة الجودة (التي تحتوي على أقل من 200 جين مكتشف أو أكثر من 20% من المحتوى الجيني الميتوكوندري) للحصول على عينة خلايا مفردة عالية الجودة للتحليلات اللاحقة. تظهر مقاييس مراقبة الجودة وتحديد الجينات شديدة التباين في الشكل التكميلي 1A–B. وبعد إجراء التسوية وتحديد الجينات شديدة التباين، تم إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) باستخدام أعلى 2,000 جين شديد التباين، وتحديد المكونات الرئيسية ذات الدلالة باستخدام تحليل JackStraw وتحليل ElbowPlot (الشكل التكميلي 2A–B).

بناءً على المكونات الرئيسية، تم استخدام التقريب والإسقاط متعدد المجموعات الموحد (UMAP) لتقليل الأبعاد وإجراء تجميع غير خاضع للإشراف، حيث صُنفت جميع الخلايا إلى 22 مجموعة، مما يسلط الضوء على التباين الخلوي العالي في أنسجة المشيمة (الشكل 4A). ومن خلال دراسة تعبير الجينات العلامة الخاصة بكل مجموعة وتصور الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) في خريطة حرارية (الشكل 4B)، تم تعيين ملاحظات لكل مجموعة بناءً على علامة تقليدية وإسقاطها مرة أخرى على تضمين UMAP (الشكل 4C). وبناءً على ذلك، تم تحديد المجموعات الخلوية الرئيسية في المشيمة، بما في ذلك الخلايا البائية/الخلايا البلازمية، والخلايا البطانية، والخلايا الليفية/الخلايا السدوية، والبلاعم/الخلايا التغصنية، والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا التائية، والخلايا الأرومية الغاذية. وتكشف المقارنات بين مجموعتي المراقبة وما قبل تسمم الحمل (PE) أن عدة أنواع من الخلايا تظهر توزيعاً نسبياً كبيراً في مشيمات حالات PE، مما يشير إلى إعادة تشكيل البيئة الدقيقة للمشيمة (الشكل 4D).

تم استخدام أصل النسيج وحالة المرض لتتبع الخلايا في نفس تضمين UMAP بناءً على مصدر النسيج (الساقط مقابل الزغابات) ومجموعة المرض (المجموعة الضابطة مقابل PE) (الشكل 4E). كانت توزيعات أعداد الخلايا منفصلة جزئيًا حسب أصل النسيج، بينما كانت الخلايا من مجموعات المرض المختلفة مترابطة للغاية. يشير هذا إلى أن PE لا يعيد ترتيب البنية الترانسكريبتومية الكاملة بشكل جوهري، ولكن قد يكون له تأثيرات على مجموعات خلوية فردية أو على سمات جزيئية محددة. تم إسقاط تعبير SASH1 على UMAP لاستكشاف توزيعه بين المجموعات الخلوية المشيمية (الشكل 4F–G). يظهر SASH1 تعبيرًا قويًا خاصًا بنوع الخلية، مع وجود فروق ملحوظة بين المجموعات الخلوية الساقطة والزغابية. كشفت المقارنة الإحصائية لتعبير SASH1 بين مجموعتي PE والمجموعة الضابطة عبر أنواع الخلايا (اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب) عن وجود فروق ذات دلالة إحصائية في مجموعات خلوية مشيمية متعددة، حيث لوحظ الارتفاع الأكثر وضوحًا في خلايا الأرومة الغاذية من عينات PE (الشكل 4H). توفر هذه النتيجة دليلًا على مستوى الخلية الواحدة بأن خلل تنظيم SASH1 يكون واضحًا بشكل خاص في جزء الأرومة الغاذية، مما يدعم استخدام خط خلايا الأرومة الغاذية HTR-8/SVneo للتجارب الوظيفية اللاحقة.

تثبيط SASH1 يمنع موت الخلايا المبرمج في الخلايا الأرومية الغاذية والاستجابات الالتهابية الناجمة عن نقص الأكسجة

للتحقق من صحة التنبؤات المعلوماتية الحيوية، تم إنشاء نموذج خلوي للأرومة الغاذية مرتبط بمرض PE تحت ظروف نقص الأكسجين (1% O₂). وقد أُجريت تحليلات qPCR وWestern blot لتقييم تعبير SASH1 (Figure 5A–B). وبالمقارنة مع خلايا HTR-8/SVneo في ظروف الأكسجة الطبيعية، أظهرت الخلايا المعالجة بنقص الأكسجين زيادة ملحوظة في مستويات تعبير mRNA وبروتين SASH1، مما قدم تحققاً تجريبياً أولياً لنتائج المعلوماتية الحيوية. ولتقييم تأثير تثبيط SASH1 على العمليات المرضية المرتبطة بمرض PE، تم إسكات SASH1 في خلايا HTR-8/SVneo المعالجة بنقص الأكسجين. وأظهرت تحليلات qPCR وWestern blot (Figure 5C–D) أن تعبير SASH1 انخفض بشكل ملحوظ في جميع مجموعات sh-SASH1 مقارنة بمجموعة sh-NC. ومن بين هذه المجموعات، أظهر sh-SASH1#3 أعلى كفاءة تثبيط، ولذلك تم اختياره للتجارب اللاحقة. كما أُجري صبغ TUNEL واختبار ELISA تحت ثلاث ظروف: تحكم في الأكسجة الطبيعية (Normal)، ونقص الأكسجين مع shRNA للتحكم السلبي (Hypoxia + sh-NC)، ونقص الأكسجين مع تثبيط SASH1 (Hypoxia + sh-SASH1). وبالمقارنة مع مجموعة Normal، أظهرت مجموعة Hypoxia + sh-NC زيادة ملحوظة في موت الخلايا المبرمج وارتفاعاً في إفراز السيتوكينات المحفزة للالتهاب IL-1β وIL-6 وTNF-α، مما يؤكد إصابة الأرومة الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجين. وقد أدى تثبيط SASH1 إلى تخفيف هذه التأثيرات بشكل ملحوظ، حيث خفض موت الخلايا المبرمج (Figure 5E) ومستويات السيتوكينات (Figure 5F) إلى مستويات تقترب من مستويات مجموعة Normal، مما يشير إلى أن تثبيط SASH1 يمكن أن ينقذ إلى حد كبير موت الخلايا المبرمج والاستجابات الالتهابية في الأرومة الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجين. ولإثبات الدور السببي لـ SASH1 بشكل أكبر، أُجريت تجارب زيادة الوظيفة. وأكدت تحليلات qPCR وWestern blot نجاح الإفراط في تعبير SASH1 في خلايا HTR-8/SVneo (Figure 5G–H). وتحت ظروف الأكسجة الطبيعية، أدى الإفراط في تعبير SASH1 (OE-SASH1) إلى زيادة ملحوظة في موت الخلايا المبرمج للأرومة الغاذية وإفراز السيتوكينات المحفزة للالتهاب مقارنة بمجموعة OE-NC، مما يحاكي النمط الظاهري الناجم عن نقص الأكسجين (Figure 5I–J). وبناءً على ذلك، تثبت بيانات فقدان الوظيفة وزيادتها أن SASH1 ضروري وكافٍ لتحفيز موت الخلايا المبرمج والاستجابات الالتهابية في الأرومة الغاذية، مما يؤكد دوره السببي في الاعتلال المرضي المرتبط بمرض PE.

تثبط P-EXOS موت الخلايا المبرمج في الأرومة الغاذية والاستجابات الالتهابية الناجمة عن نقص الأكسجة عن طريق تعديل SASH1

تعتبر P-EXOS ذات قيمة علاجية محتملة في حالات PE. وفي هذه الدراسة، أشار تحليل المعلوماتية الحيوية إلى أن SASH1 يرتبط بمسارات التأشير المرتبطة بالإكسوسومات (كما هو موضح في إثراء GO وKEGG، الشكل 2C–D)، مما دفعنا إلى افتراض أن P-EXOS قد تمارس تأثيراً وقائياً في حالات PE من خلال تنظيم SASH1. وقبل البدء في الدراسات الوظيفية، تم أولاً توصيف P-EXOS المعزولة. وأكد تحليل Western blot وجود البروتينات الواصمة للإكسوسومات PLAP وCD63 وTSG101، مع عدم وجود تعبير يمكن اكتشافه للواصم Golgi GM130، مما يشير إلى النقاوة العالية للحويصلات المعزولة. كما كشف المجهر الإلكتروني النافذ عن وجود هياكل حويصلية نموذجية على شكل كوب (الشكل 6A–B). وللتحقق مما إذا كان يمكن للخلايا المستهدفة امتصاص P-EXOS بكفاءة، أُجري صبغ مناعي فلوري لتقييم الامتصاص الخلوي لـ P-EXOS. وبالمقارنة مع مجموعة التحكم، أظهرت خلايا HTR-8/SVneo المعالجة بـ P-EXOS إشارات تموضع مشترك بارزة في الصور المدمجة، مما يشير إلى أن P-EXOS قد تم امتصاصها بفعالية من قبل خلايا HTR-8/SVneo (الشكل 6C).

بعد ذلك، تم استزراع خلايا HTR-8/SVneo بشكل مشترك مع P-EXOS في ظروف نقص الأكسجين. وأظهرت كل من فحوصات PCR الكمية وبصمة ويسترن انخفاضاً ملحوظاً في مستويات mRNA وبروتين SASH1 في المجموعة المعالجة بـ P-EXOS مقارنة بالمجموعات الضابطة (الشكل 6D–E)، مما قدم دليلاً أولياً على وجود تفاعل تنظيمي بين P-EXOS وSASH1. وتماشياً مع هذه التغيرات الجزيئية، كشف صبغ TUNEL عن تخفيف كبير في الموت الخلوي المبرمج الناجم عن نقص الأكسجين في خلايا HTR-8/SVneo بعد المعالجة بـ P-EXOS (الشكل 6F). وفي الوقت ذاته، أظهرت فحوصات ELISA انخفاضاً ملحوظاً في إفراز السيتوكينات المحرضة للالتهابات، بما في ذلك IL-6 وIL-1β وTNF-α (الشكل 6G).

لتحديد ما إذا كانت التأثيرات الوقائية لـ P-EXOS تعتمد ميكانيكيًا على تثبيط SASH1، أُجريت تجربة إنقاذ في ظروف نقص الأكسجة. وتمت مقارنة الخلايا التي تفرط في تعبير SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) مع خلايا التحكم السلبية (OE-NC + P-EXOS). أدى الإفراط في تعبير SASH1 إلى إلغاء التأثيرات الوقائية لـ P-EXOS بشكل ملحوظ، وهو ما ظهر جليًا من خلال زيادة الموت الخلوي المبرمج (الشكل 6H) وارتفاع إفراز السيتوكينات المحفزة للالتهابات (الشكل 6I) مقارنة بمجموعة OE-NC + P-EXOS. وتثبت هذه النتائج أن التأثير الوقائي لـ P-EXOS يتم التوسط فيه تحديدًا من خلال تثبيط SASH1، وليس عبر مسارات موازية، مما يؤكد الإمكانات العلاجية لـ P-EXOS في حالات تسمم الحمل (PE).

توافر البيانات:

إن مجموعات البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة متاحة للعموم، وقد تم الحصول عليها من قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO) عبر الرابط (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)، تحت أرقام الوصول GSE75010 وGSE10588 وGSE60438 وGSE183338. وقد أُجري توصيف أنواع الخلايا بالرجوع إلى قاعدة بيانات Cell Classification Database عبر الرابط (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). كما تتوفر صور Western blot غير المقصوصة وجميع البيانات التجريبية الخام الأخرى التي تدعم نتائج هذه الدراسة في الـ البيانات الخام التكميلية مجلد

الشكل 1: تحديد الجينات ذات التعبير المتباين (DEGs) في أنسجة المشيمة والنسيج الساقط لدى المصابات بما قبل تسمم الحمل (PE) عبر ثلاث مجموعات بيانات مستقلة. (A) مخطط Volcano plot للجينات ذات التعبير المتباين (DEGs) بين 157 عينة مشيمة مصابة بـ PE و 173 عينة مشيمة غير مصابة بـ PE من مجموعة بيانات GSE75010 المدمجة. (B) مخطط Volcano plot للجينات ذات التعبير المتباين (DEGs) بين عينات مشيمة مصابة بـ PE شديد (n = 17) وعينات مشيمة طبيعية (n = 26) من مجموعة بيانات GSE10588. (C) مخطط Volcano plot للجينات ذات التعبير المتباين (DEGs) بين عينات النسيج الساقط المصابة بـ PE وعينات النسيج الساقط الضابطة ذات الضغط الطبيعي من مجموعة بيانات GSE60438. تم تحديد الجينات ذات التعبير المتباين (DEGs) باستخدام p < 0.05 و |log₂FC| > 0.5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تحليل الإثراء الوظيفي وتفاعلات البروتين-بروتين (PPI) للجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المشتركة المرتبطة بما قبل تسمم الحمل. (A) مخطط فين للجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المحددة من مجموعات البيانات المرتبطة بما قبل تسمم الحمل GSE75010 وGSE10588 وGSE60438. (B) شبكة تفاعلات البروتين-بروتين (PPI) لأهم 20 جينًا محوريًا تم اختيارها من بين 56 جينًا مشتركًا ذا تعبير تفاضلي بناءً على درجة الاتصال، والترتيب باستخدام برنامج Cytoscape (درجة تفاعل STRING ≥0.15). (C) تحليلات إثراء GO وKEGG للجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المشتركة معروضة في شكل رسوم بيانية شريطية. (D) تحليلات إثراء GO وKEGG للجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المشتركة، معروضة في شكل مخططات وترية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: فحص الجينات المركزية المرشحة المرتبطة بما قبل تسمم الحمل باستخدام التعلم الآلي. (أ) تحليل انحدار LASSO يوضح ملفات المعاملات للجينات المرشحة. (ب) اختيار معامل التنظيم الأمثل (λ) بواسطة انحدار LASSO باستخدام التحقق المتقاطع. (ج) خوارزمية Boruta. (د) تحليل SVM-RFE. (هـ) خوارزمية XGBoost. (و) مخطط فين يوضح التقاطع بين الجينات المرشحة التي حددتها خوارزميات LASSO وBoruta وSVM-RFE وXGBoost. الاختصارات: LASSO = عامل الاختيار والتقليص المطلق الأدنى؛ SVM-RFE = استبعاد الميزات المتكرر لآلة متجه الدعم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: يكشف تحليل الترانسكريبتوم للخلية الواحدة عن أنماط تعبير SASH1 الخاصة بنوع الخلية في ما قبل تسمم الحمل. (A) تجميع UMAP لمجموعة بيانات الخلية الواحدة. (B) تحليل تعليق أهم خمس علامات لمجموعة بيانات ترانسكريبتوم الخلية الواحدة GSE183338 الخاصة بما قبل تسمم الحمل (PE). (C) تعليق المجموعات الفرعية من الخلايا. (D) مخطط شريطي يوضح توزيع نسب الخلايا في عينات الضبط وعينات ما قبل تسمم الحمل (PE). (E) مخطط UMAP ملون حسب أصل النسيج (الساقط والزغابات) وحالة المرض (الضبط وما قبل تسمم الحمل). (F) مخطط UMAP يوضح تعبير SASH1 في مجموعات خلايا المشيمة مصنفة حسب أصل النسيج (الساقط والزغابات). (G) مخطط UMAP يوضح تعبير SASH1 في مجموعات خلايا المشيمة مصنفة حسب حالة المرض (الضبط وما قبل تسمم الحمل). (H) مخطط كمان يوضح توزيع تعبير SASH1 عبر أنواع خلايا المشيمة المختلفة. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. الاختصارات: UMAP = التقريب والإسقاط المتشعب الموحد؛ ns = غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: ينظم SASH1 موت الخلايا المبرمج والالتهاب في الخلايا الأرومية الغاذية الناجم عن نقص الأكسجة. (A) تحليل qPCR لتعبير mRNA الخاص بـ SASH1 والتقدير الكمي الكثافتي لمستويات بروتين SASH1 في خلايا HTR-8/SVneo تحت ظروف طبيعية وظروف نقص الأكسجة. (B) صور ممثلة للطخة ويسترن مقابلة للبيانات الكثافية الموضحة في (A). (C) تحليل qPCR لتعبير mRNA الخاص بـ SASH1 والتقدير الكمي الكثافتي لمستويات بروتين SASH1 في خلايا HTR-8/SVneo المعالجة بنقص الأكسجة والمعدلة بـ sh-NC أو بنيات sh-SASH1 (sh-SASH1#1 و sh-SASH1#2 و sh-SASH1#3). (D) صور ممثلة للطخة ويسترن مقابلة للبيانات الكثافية الموضحة في (C). (E) صبغ TUNEL لخلايا HTR-8/SVneo في مجموعات Normal و Hypoxia + sh-NC و Hypoxia + sh-SASH1(#3). شريط المقياس = 20 µm. (F) تحليل ELISA للسيتوكينات الالتهابية (IL-1β و IL-6 و TNF-α) في مجموعات Normal و Hypoxia + sh-NC و Hypoxia + sh-SASH1(#3). (G) تحليل qPCR لتعبير mRNA الخاص بـ SASH1 والتقدير الكمي الكثافتي لمستويات بروتين SASH1 في خلايا HTR-8/SVneo المعدلة بـ OE-NC أو بنيات OE-SASH1. (H) صور ممثلة للطخة ويسترن مقابلة للبيانات الكثافية الموضحة في (G). (I) صبغ TUNEL لخلايا HTR-8/SVneo في مجموعات Normal + OE-NC و Normal + OE-SASH1. شريط المقياس = 20 µm. (J) تحليل ELISA للسيتوكينات الالتهابية (IL-1β و IL-6 و TNF-α) في مجموعات Normal + OE-NC و Normal + OE-SASH1. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. تُمثَّل البيانات كمتوسط ± SD من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: تعمل P-EXOS على تخفيف إصابة الخلايا الغاذية الناتجة عن نقص الأكسجة عبر تثبيط SASH1. (A) تحليل لطخة وسترن للبروتينات الواسمة لـ P-EXOS وهي PLAP وCD63 وTSG101، مع استخدام GM130 كضابط سلبي. (B) تحليل المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لشكل P-EXOS. شريط المقياس = 1.0 µm. (C) صور المجهر المسحي الليزري البؤري التي توضح امتصاص P-EXOS المصبوغة بـ PKH67 (باللون الأخضر) في خلايا HTR-8/SVneo (باللون الأحمر). صُبغت النوى بـ DAPI (باللون الأزرق). شريط المقياس = 20 µm. (D) تحليل qPCR للتعبير عن mRNA لـ SASH1 والتقدير الكمي الكثافي لمستويات بروتين SASH1 في خلايا HTR-8/SVneo في مجموعتي الضابطة وP-EXOS. (E) صور ممثلة لطخة وسترن المقابلة للبيانات الكثافية الموضحة في (D). (F) صبغ TUNEL لخلايا HTR-8/SVneo في مجموعتي الضابطة وP-EXOS. شريط المقياس = 20 µm. (G) تحليل ELISA للسيتوكينات الالتهابية (IL-1β وIL-6 وTNF-α) في خلايا HTR-8/SVneo المعالجة بنقص الأكسجة في مجموعتي الضابطة وP-EXOS. (H) صبغ TUNEL لخلايا HTR-8/SVneo في مجموعتي OE-NC + P-EXOS وOE-SASH1 + P-EXOS. شريط المقياس = 20 µm. (I) تحليل ELISA للسيتوكينات الالتهابية (IL-1β وIL-6 وTNF-α) في خلايا HTR-8/SVneo المعالجة بنقص الأكسجة في مجموعتي OE-NC + P-EXOS وOE-SASH1 + P-EXOS. الاختصارات: P-EXOS = إكسوزومات مشتقة من المشيمة؛ TEM = المجهر الإلكتروني النافذ؛ PLAP = الفوسفاتاز القلوي المشيمي؛ TSG101 = جين القابلية للإصابة بالأورام 101. *p < 0.05; **p < 0.01. تُمثل البيانات كمتوسط ±SD من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: مراقبة جودة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (single-cell RNA-seq). (A) مخطط الكمان لمستويات التعبير الجيني بعد مراقبة الجودة. (B) مخطط الميزات المتغيرة الذي يوضح الجينات عالية التباين التي تم تحديدها بعد مراقبة الجودة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تحديد المكونات الرئيسية ذات الدلالة الإحصائية لتجميع الخلايا المفردة. (A(مخطط JackStraw النقطي المستخدم لتحديد المكونات الرئيسية ذات الدلالة الإحصائية.)B) مخطط نقطي للمرفق يوضح التباين الذي تفسره المكونات الرئيسية.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: تسلسلات shRNA المستهدفة المستخدمة لتثبيط SASH1.تسلسلات shRNA المستهدفة (5′–3′) للضابط السلبي (sh-NC) وثلاثة تركيبات تستهدف SASH1 (sh-SASH1#1 وsh-SASH1#2 وsh-SASH1#3) المستخدمة لإسكات الجينات.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: تسلسلات البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.تسلسلات البادئات الأمامية والعكسية (5′–3′) لـ SASH1 و β-actin (التحكم المرجعي الداخلي) المستخدمة في تحليل qPCR.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

في هذه الدراسة، تم تحديد SASH1 كجين رئيسي مختل التنظيم في تسمم الحمل (PE) من خلال تحليل ترانسكريبتومي متكامل، وتسلسل الخلية الواحدة، وتعلم الآلة متعدد الخوارزميات، وهو نهج ذو أهمية خاصة نظرًا لعدم توفر علاجات مستهدفة لتسمم الحمل¹⁷. وقد ثبت أن SASH1 يزداد تعبيره بشكل ملحوظ في الخلايا الأرومية الغاذية المعرضة لنقص الأكسجة، ويرتفع تحديداً في قسم الخلايا الأرومية الغاذية في مشيمات المصابات بتسمم الحمل بدقة على مستوى الخلية الواحدة. ومن خلال تجارب فقدان واكتساب الوظيفة، تم إثبات أن SASH1 ضروري وكافٍ لتحفيز موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج وإفراز السيتوكينات المحفزة للالتهابات. علاوة على ذلك، أدى العلاج بـ P-EXOS إلى تخفيف إصابة الخلايا الأرومية الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجة، وقد تلاشى هذا التأثير الوقائي عند زيادة تعبير SASH1، مما يؤكد أن الحماية الخلوية التي توفرها P-EXOS تعتمد ميكانيكياً على تثبيط SASH1.

بالإضافة إلى ذلك، لُحظت تغيرات في نسب أنواع متعددة من خلايا المشيمة في حالات تسمم الحمل (PE)، بما في ذلك الخلايا البائية/الخلايا البلازمية، والخلايا البطانية، والخلايا الليفية/الخلايا السدوية، والبلاعم/الخلايا الشجرية، وخلايا NK، والخلايا التائية، والخلايا الأرومية الغاذية. وتشير هذه النتائج إلى أن البيئة المجهرية للمشيمة تخضع لإعادة تشكيل جوهرية أثناء الإصابة بتسمم الحمل. ولا تكتفي هذه البيئة المجهرية الالتهابية بتفاقم خلل وظائف الخلايا الأرومية الغاذية فحسب، بل قد تعجل أيضاً من تطور المرض من خلال التفاعلات بين المناعة والمصفوفة خارج الخلوية¹⁸. علاوة على ذلك، ثبت مؤخراً تورط المصائد الخارج خلوية للعدلات (NETs) في تفاقم التهاب المشيمة في حالات تسمم الحمل¹⁹. ويُعتقد أن SASH1 يلعب دوراً هاماً في تطور تسمم الحمل من خلال مشاركته في إشارات الالتهاب، والتصاق الخلايا، والعمليات المرتبطة بنقص الأكسجة. في هذه الدراسة، تم استخراج ملفات التعبير الجيني من عينات مشيمة لمرضى تسمم الحمل وحالات الحمل ذات ضغط الدم الطبيعي باستخدام حزمة limma، واُستخدمت خوارزميات تعلم آلي متعددة لاختيار الميزات، وهي: انحدار LASSO، وSVM-RFE، وXGBoost، وBoruta. ومن خلال جميع الخوارزميات، ظهر SASH1 باستمرار كجين مرشح متفق عليه. وعلى مستوى الخلية الواحدة، أظهر SASH1 تعبيراً خاصاً بنوع الخلية عبر مجموعات متنوعة من خلايا المشيمة، وحافظ على تعبير مرتفع في عينات تسمم الحمل، مع ملاحظة الفرق الأكثر وضوحاً في الخلايا الأرومية الغاذية، مما يشير إلى أنه قد يمارس تأثيرات وظيفية متميزة في سياقات خلايا المشيمة المختلفة.

يُعد SASH1 بروتين محول للإشارات أُفيد بمشاركته في عمليات بيولوجية متنوعة، بما في ذلك هجرة الخلايا وغزوها، والانتقال الظهاري المتوسط، وتنظيم الإشارات المستجيبة للإجهاد^8,9. وللتحقيق في الدور الوظيفي لـ SASH1 في الاعتلالات المرضية المرتبطة بمقدمات الارتعاج (PE)، تم إنشاء نموذج للأرومات الغاذية المحفزة بنقص الأكسجة باستخدام خلايا HTR-8/SVneo. وأظهرت نتائجنا أن التعرض لنقص الأكسجة أدى إلى زيادة تعبير SASH1 بشكل ملحوظ، بينما أدى تثبيط SASH1 إلى تخفيف الموت الخلوي المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة بشكل واضح وتقليل إفراز السيتوكينات المحفزة للالتهاب، بما في ذلك IL-1β وIL-6 وTNF-α. وعلى العكس من ذلك، كان الإفراط في تعبير SASH1 في ظروف الأكسجة الطبيعية كافيًا لمحاكاة النمط الظاهري الناجم عن نقص الأكسجة، مما يثبت الدور السببي لـ SASH1 في تحفيز إصابة الأرومات الغاذية. وتشير هذه النتائج إلى أن SASH1 قد ينظم الحالة الوظيفية للأرومات الغاذية سلبًا عن طريق تعديل الاستجابات الالتهابية. ونظرًا لأن الأرومات الغاذية تمثل مصدرًا رئيسيًا للوسائط الالتهابية المشيمية²⁰، فإن التعبير غير الطبيعي لـ SASH1 قد يشكل أساسًا جزيئيًا حاسمًا لتضخيم الالتهاب في حالات PE. ومن الملاحظ أن الوظائف المحفزة للموت الخلوي المبرمج والمحفزة للالتهاب لـ SASH1 الملاحظة في خلايا الأرومات الغاذية تتناقض مع دوره التقليدي كمثبط للأورام في الخلايا السرطانية، حيث يعمل عادةً على تثبيط EMT والهجرة^8,9. وقد يعكس هذا الازدواج الوظيفي المعتمد على السياق اختلافات خاصة بنوع الخلية في الشركاء المتفاعلين مع SASH1 وشبكات الإشارات النهائية، وهو ما يستدعي مزيدًا من البحث.

تُعرف الإكسوسومات بأنها وسائط هامة للتواصل بين الخلايا، وقد ارتبطت بنشوء وتطور تسمم الحمل (PE)²¹. وبوجه خاص، قد تلعب الإكسوسومات المشيمية (P-EXOS) دوراً هاماً في التنظيم المناعي أثناء الحمل الطبيعي، مثل الحفاظ على التسامح المناعي بين الأم والجنين، مما قد يوفر حماية ضد تسمم الحمل (PE)²². وفي هذه الدراسة، كشف التحليل المعلوماتي الحيوي عن وجود ارتباط بين SASH1 ومسارات الإشارات المرتبطة بالإكسوسومات، مما دفع إلى إجراء مزيد من الاستقصاء حول دور P-EXOS في تنظيم وظيفة الخلايا الأرومية الغاذية. وأظهرت تجارب الزراعة المشتركة أن المعالجة بـ P-EXOS قللت بشكل كبير من مستويات mRNA وبروتين SASH1 في الخلايا الأرومية الغاذية المعالجة بنقص الأكسجة، وخففت بشكل ملحوظ من الاستجابات الالتهابية والموت الخلوي المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة. والأهم من ذلك، أن الإفراط في تعبير SASH1 ألغى هذه التأثيرات الوقائية، مما يؤكد أن الحماية الخلوية التي تتوسطها P-EXOS تعتمد آلياً على تثبيط SASH1 بدلاً من العمل عبر مسارات موازية.

لا تزال الآليات الجزيئية التي تقوم من خلالها P-EXOS بتثبيط تعبير SASH1 بحاجة إلى توضيح. ومن المعروف أن P-EXOS تحمل حمولات متنوعة ذات نشاط بيولوجي، بما في ذلك microRNAs والبروتينات والدهون، والتي يمكنها تعديل التعبير الجيني في الخلايا المستقبلة¹⁰. وأحد الاحتمالات هو أن P-EXOS تنقل miRNAs محددة تستهدف SASH1 بشكل مباشر أو غير مباشر. وبدلاً من ذلك، قد تقوم P-EXOS بتعديل مسارات التأشير upstream—مثل NF-κB أو PI3K-Akt—التي تتقارب في التنظيم النسخي لـ SASH1. ونظرًا لأن SASH1 قد ارتبط بمسار PI3K-Akt-mTOR في الخلايا السرطانية⁸، فمن المرجح أن يساهم التعديل الذي تتوسطه الإكسوسومات لهذا المحور في خفض تنظيم SASH1 في خلايا الأرومة الغاذية. وستكون هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تستخدم تسلسل حمولة الإكسوسومات ومثبطات خاصة بالمسارات لتفكيك الشلال الجزيئي الدقيق الذي تنظم من خلاله P-EXOS تعبير SASH1.

في هذه الدراسة، تم دمج التنميط الترانسكريبتومي مع تسلسل RNA أحادي الخلية لاستقصاء التغيرات الجزيئية في أنسجة المشيمة في حالة تسمم الحمل (PE). وقد تبين أن SASH1 يلعب دوراً رئيسياً في استماتة الخلايا الأرومية الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجة والاستجابات الالتهابية، وأن P-EXOS يمكن أن تؤدي تأثيراً وقائياً عن طريق تثبيط تعبير SASH1، مما يقدم رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء تسمم الحمل ويقترح استراتيجية علاجية محتملة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسة تعاني من عدة قيود؛ أولاً، استُمدت النتائج الوظيفية بشكل أساسي من خط الخلايا الأرومية الغاذية المخلدة HTR-8/SVneo، مما يستوجب التحقق من ذلك في الخلايا الأرومية الغاذية الأولية. ثانياً، لم يتم التحقق من تعبير بروتين SASH1 في أنسجة مشيمة مرضى تسمم الحمل سريرياً بواسطة الكيمياء النسيجية المناعية، مما يحد من التفسير الانتقالي للنتائج وهو أمر يجب معالجته في الدراسات المستقبلية. ثالثاً، أظهر مصنف SVM-RFE دقة متوسطة في التحقق المتقاطع (~0.6)، مما يعكس عدم التجانس المتأصل في مجموعة البيانات؛ لذا ستكون هناك حاجة إلى مجموعات مستقلة أكبر لتطوير نماذج تشخيصية أكثر قوة. رابعاً، لا تزال الآلية الجزيئية الدقيقة التي تثبط بها P-EXOS تعبير SASH1 غير واضحة. خامساً، لوحظت حزم تلوين غير محددة في الكشف عن SASH1 بواسطة لطخة ويسترن، والتي قد تكون ناتجة عن عدم مثالية خصوصية الجسم المضاد. إن الجسم المضاد المستخدم في هذه التجربة هو جسم مضاد متعدد النسائل، والذي يظهر عموماً خصوصية أقل في الكشف المناعي مقارنة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة. ومع ذلك، فإن هذه الحزم غير المحددة لا تؤثر على نتائج بروتين SASH1 أو استنتاجات هذه الدراسة. هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تتضمن تجارب in vivo، وتحليل العينات السريرية، وتوصيف حمولة الإكسوسومات لمزيد من التوضيح للدور الوظيفي لمحور P-EXOS-SASH1 في تسمم الحمل وتقييم إمكاناته الانتقالية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط RPMI-1640	Gibco	11875085
مصل جنين البقر (FBS)	Gibco	16140071
مصل FBS منزوع الإكسوسومات	System Biosciences	EXO-FBS-50A-1
بنسلين/ستربتومايسين	Thermo Fisher Scientific, CN	15140122
كاشف ترانسفكشن Lipofectamine 3000 (مع كاشف P3000)	Thermo Fisher Scientific, CN	L3000150
وسط Opti-MEM منخفض المصل	Thermo Fisher Scientific, CN	31985070
بلازميد SASH1 shRNA (HuSH)	origene	TL301836
بلازميد تعبير SASH1 ORF	origene	RC218866
ناقل فارغ ضابط	origene	PS100001
طقم النسخ العكسي	Thermo Fisher Scientific, CN	4368814
مزيج PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific, CN	A46110
بادئات SASH1	Sangon Biotech	مصنعة حسب الطلب
بادئات β-actin	Sangon Biotech	مصنعة حسب الطلب
منظم تحلل الخلايا	Beyotime	P0013B
مقياس الطيف الضوئي NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, CN	NanoDrop Ultra
غشاء PVDF	Thermo Fisher Scientific, CN	88518
جسم مضاد Anti-SASH1	ABclonal	A15248
جسم مضاد Anti-β-actin	Abcam	ab6276
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للأرانب/الفئران مقترن بـ HRP	Beyotime	A0208
برنامج ImageJ	NIH (ملكية عامة)	ImageJ
طقم PKH67 لربط الخلايا الفلوري الأخضر (يشمل المذيب C)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	MINI67
ألبومين مصل البقر (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	10711454001
DAPI	Beyotime	C1002
مجهر مسح ليزري بؤري (CLSM)	Leica	Leica TCS SP8
طقم Quantikine ELISA لـ Human IL-6	R&D Systems	D6050B
طقم DuoSet ELISA لـ Human IL-1β/IL-1F2	R&D Systems	DY201
طقم Quantikine ELISA لـ Human TNF-α	R&D Systems	DTA00D
قارئ الأطباق الدقيقة	Thermo Scientific	Multiskan FC
طقم كشف موت الخلايا في الموقع (طقم مقايسة TUNEL)	Roche	11684795910
Triton X-100	Beyotime	P0096
بارافورمالدهيد (4%)	Beyotime	P0099
مجهر فلوري	Olympus	BX53
جهاز طرد مركزي مبرد (سعة 12,000 × g)	Eppendorf	Eppendorf 5430 R
جهاز طرد مركزي فائق (سعة 120,000 × g)	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
برنامج R	The R Foundation	v4.2.1
GraphPad Prism	GraphPad Software	v10.0
Seurat (حزمة R)	Satija Lab (مفتوحة المصدر)	v4.0.4
Harmony (حزمة R، لتصحيح الدفعة)	مفتوحة المصدر	v1.2.0
Scrublet (حزمة Python، لكشف المزدوجات)	مفتوحة المصدر	v0.2.3
clustree (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v0.5.1
glmnet (حزمة R، LASSO)	مفتوحة المصدر	v4.1.8
e1071 (حزمة R، SVM-RFE)	مفتوحة المصدر	v1.7-14
xgboost (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v1.7.7.1
randomForest (حزمة R، Boruta)	مفتوحة المصدر	v4.7-1.1
قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
قاعدة بيانات STRING	string-db.org	https://www.string-db.org/
Metascape	metascape.org	https://metascape.org/
برنامج Cytoscape	Cytoscape Consortium	v3.10.4
ggplot2 (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v3.5.1
limma (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v3.58.1
pheatmap (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v1.0.12
ClusterProfiler (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v4.8.3
DOSE (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v3.28.2
ggpubr (حزمة R)	مفتوحة المصدر	v0.6.0