يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تخفف الإكسوزومات المشتقة من المشيمة من موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج والتقدم الالتهابي الناجم عن نقص الأكسجة عبر SASH1

56 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71083

⸱

أغسطس 18, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, The Fourth Hospital of Shijiazhuang

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تم تحديد البروتين 1 المحتوي على نطاقي SAM وSH3 (SASH1) كمنظم رئيسي لموت الخلايا المبرمج في الخلايا الأرومية الغاذية والالتهابات في حالة تسمم الحمل (PE). وتعمل الإكسوسومات المشتقة من المشيمة (P-EXOS) على تخفيف الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة عن طريق تثبيط تعبير SASH1. وتكشف هذه النتائج عن آلية جديدة تكمن وراء إمراضية تسمم الحمل، وتشير إلى أن SASH1 قد يمثل هدفًا علاجيًا محتملًا.

الملخص

يُعد SASH1 بروتيناً مهايئاً للإشارات يشارك في نمو الخلايا، وموت الخلايا المبرمج، والتنظيم المناعي، وقد تزايدت دراسته في الخلايا الورمية والمناعية. وتشير الأدلة الناشئة إلى أن SASH1 يلعب دوراً هاماً في الاستجابات الالتهابية والتوازن الخلوي، وهي عمليات ترتبط ارتباطاً وثيقاً بتطور تسمم الحمل (PE). هدفت هذه الدراسة إلى تحديد ما إذا كان SASH1 يساهم في موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج والاستجابات الالتهابية في حالات تسمم الحمل، وما إذا كانت P-EXOS تظهر تأثيرات وقائية من خلال تنظيم SASH1. في هذه الدراسة، تم تحليل ثلاث مجموعات بيانات ترانسكريبتومية مرتبطة بتسمم الحمل (GSE75010 وGSE10588 وGSE60438) لتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المشتركة، متبوعة بتحليلات إثراء الوجود الجيني (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG). كما تم تطبيق خوارزميات التعلم الآلي لغربلة الجينات المرشحة الرئيسية، واستُخدمت بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتوصيف التباين الخلوي في أنسجة المشيمة وتحديد أنماط التعبير الخاصة بكل نوع من الخلايا. تم تحديد SASH1 كجين مرشح متوافق، وكان تعبيره مرتفعاً بشكل ملحوظ في الخلايا الأرومية الغاذية من عينات تسمم الحمل. In vitro، تم إنشاء نموذج لخلايا أرومية غاذية من نوع HTR-8/SVneo معالجة بنقص الأكسجة، مدمجاً مع تثبيط SASH1، والإفراط في تعبير SASH1، والزراعة المشتركة مع P-EXOS. وأظهرت التجارب الوظيفية أن تثبيط SASH1 أدى إلى كبح موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة بشكل كبير وقلل من إفراز السيتوكينات المحفزة للالتهابات، بما في ذلك IL-6 وIL-1β وTNF-α، بينما أدى الإفراط في تعبير SASH1 إلى تعزيز موت الخلايا المبرمج والاستجابات الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك، قلل العلاج بـ P-EXOS بشكل ملحوظ من تعبير SASH1 على مستويي mRNA والبروتين وخفف من إصابة الخلايا الأرومية الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجة، بينما أدى الإفراط في تعبير SASH1 إلى إلغاء هذه التأثيرات الوقائية إلى حد كبير. وبناءً على ذلك، تشير هذه النتائج إلى أن SASH1 يلعب دوراً حاسماً في موت الخلايا الأرومية الغاذية المبرمج والاستجابات الالتهابية في تسمم الحمل. وقد تخفف P-EXOS من إصابة الخلايا الأرومية الغاذية الناجمة عن نقص الأكسجة عن طريق تثبيط تعبير SASH1، مما يوفر رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية والأهداف العلاجية المحتملة لتسمم الحمل.

المقدمة

تُعد تسمم الحمل (PE) اضطراباً متعدد الأنظمة خاصاً بفترة الحمل، يحدث عادةً بعد الأسبوع العشرين من الحمل، ويتميز سريرياً بارتفاع ضغط الدم، وبيلة البروتين، واختلال وظائف أعضاء متعددة. ولا يزال هذا الاضطراب سبباً رئيسياً للمراضة والوفيات لدى الأمهات وحديثي الولادة في جميع أنحاء العالم1. وعلى الرغم من التقدم المستمر في الإدارة السريرية، إلا أن العلاج الجذري لتسمم الحمل لا يزال يتمثل في ولادة المشيمة، مما يؤكد عدم الفهم الكامل لمسارات إمراضه والحاجة الملحة لتحديد آليات جزيئية وخلوية جديدة، بالإضافة إلى أهداف علاجية محتملة2,3.

يعد الغزو الكافي للأرومة الغاذية وتعزيز التطور الطبيعي للمشيمة آليتين حاسمتين تكمنان وراء نشوء مسببات مرض PE4. فخلال الحمل الطبيعي، تغزو خلايا الأرومة الغاذية الساقط الرحمي وتعيد تشكيل الشرايين الحلزونية لإنشاء دورة دموية منخفضة المقاومة وعالية السعة. ويؤدي ضعف غزو وهجرة خلايا الأرومة الغاذية إلى انخفاض تروية المشيمة، مما يؤدي إلى بيئة مستمرة من نقص الأكسجة والإجهاد التأكسدي. يؤثر نقص الأكسجة بشكل مباشر على الموت الخلوي المبرمج، كما يؤدي الإطلاق غير الطبيعي للوسائط المحفزة للالتهاب إلى اختلال التوازن في الواجهة بين الأم والجنين، مما يؤدي إلى تفاقم خلل وظائف المشيمة5. كما يعتبر الالتهاب محركاً هاماً لمرض PE؛ حيث وجد أن مستويات IL-17 وIL-6 وTNF-α مرتفعة بشكل ملحوظ في مشيمة والدم المحيطي للمرضى المصابين بـ PE6. ويعزز نقص الأكسجة والالتهاب بعضهما البعض، مما يشكل حلقة مفرغة تضخم الالتهاب الجهازي، وتسبب تلفاً في البطانة الغشائية، وتساهم في حدوث تشوهات مشيمية. ولا تزال الشبكات الجزيئية الأساسية التي تحكم الموت الخلوي المبرمج للأرومة الغاذية والاستجابات الالتهابية غير معروفة إلى حد كبير.

يعتبر SASH1 عضواً في عائلة SLy/SASH1 من البروتينات السقالية داخل الخلوية التي تعمل كمحول إشارات7. وقد تم توصيف SASH1 بشكل أساسي ككابح للأورام يثبط الانتقال الظهاري الميزنكيمي (EMT)، وهجرة الخلايا، والغزو من خلال التفاعلات مع شركاء الإشارات مثل CRKL ومسار PI3K-Akt-mTOR8,9. وإلى جانب أدواره في كبح الأورام، تشير الأدلة الناشئة إلى أن SASH1 يشارك في إشارات الالتهاب والتنظيم المناعي7. ومع ذلك، لم يتم استقصاء تعبير ووظيفة SASH1 في المشيمة، لا سيما في سياق بيولوجيا الخلايا أرومية الساق (trophoblast) وما قبل تسمم الحمل (PE).

برزت الإكسوسومات كوسائط خلوية مهمة وتتم دراستها بشكل متزايد في سياق الحمل10. تقوم الإكسوسومات بنقل حمولات مختلفة من المواد النشطة بيولوجياً، بما في ذلك البروتينات والليبيدات والحمض النووي الريبي غير المشفر، لتعديل وظيفة الخلية المستقبلة. وتشير الأدلة المتزايدة إلى أن P-EXOS تلعب دوراً حاسماً في التنظيم المناعي أثناء الحمل، وأن نشاطها وحمولتها يتغيران بشكل ملحوظ في حالات PE، مما قد يؤدي إلى تكثيف الحالة الالتهابية11. كما ارتبطت الإكسوسومات بتنظيم الإجهاد التأكسدي12 وتكون الأوعية الدموية13، مما قد يمارس تأثيرات مفيدة في المضاعفات المرتبطة بالحمل. ومع ذلك، لا تزال أهدافها الجزيئية وآليات عملها في حالات PE غير مفهومة بشكل كامل.

تم افتراض أن SASH1 يكون مختلاً في مشيمة ما قبل الارتعاج (PE) ويعمل كمحرك رئيسي لموت الخلايا المبرمج في الأرومة الغاذية والاستجابات الالتهابية، وأن P-EXOS قد تمارس تأثيرات وقائية ضد إصابة الأرومة الغاذية من خلال تعديل تعبير SASH1. ولاختبار هذه الفرضية، تم دمج مجموعات بيانات نسخية متعددة لمرض ما قبل الارتعاج وبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية مع تعلم آلي متعدد الخوارزميات لتحديد الجينات المرشحة الرئيسية. وباستخدام نموذج خلايا الأرومة الغاذية HTR-8/SVneo المعالجة بنقص الأكسجة وتجارب التدخل القائمة على الإكسوسومات، تم استقصاء الدور الوظيفي لـ SASH1 في خلل وظيفة الأرومة الغاذية والقدرة العلاجية لـ P-EXOS في حالات ما قبل الارتعاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شيجياتشوانغ الرابع (رقم الموافقة 20200031). تم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من جميع المتبرعين بأنسجة المشيمة قبل جمع العينات. أُجريت جميع الإجراءات التي شملت مشاركين بشريين وفقاً لإعلان هلسنكي. تتوفر قائمة كاملة بالكواشف والمستهلكات والمعدات والبرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

جمع البيانات

تم الحصول على بيانات RNA-seq من قاعدة بيانات GEO. تضمنت مجموعات البيانات GSE75010، والتي تحتوي على بيانات التعبير الجيني من 157 مشيمة مصابة بـ PE و173 مشيمة غير مصابة بـ PE (العدد = 330). وتحتوي GSE10588 على بيانات التعبير الجيني من 26 مشيمة طبيعية و17 مشيمة مصابة بـ PE شديد (العدد = 43). بينما تحتوي GSE60438 على بيانات توصيف الترانسكريبتوم للغشاء الساقط القاعدي (decidua basalis) من مريضات مصابات بما قبل الإرجاج والحوامل ذوات الضغط الطبيعي (العدد = 125). كما تم الحصول على بيانات ترانسكريبتوم الخلية الواحدة من مجموعة بيانات GEO رقم GSE183338، والتي تتضمن عينات من النواة الواحدة من الزغابات الكوريونية/الواجهة الأمومية الجنينية في حالات الحمل المصابة بـ PE والحمل الصحي.

تحليل الجينات المعبّر عنها تفاضلياً (DEGs)

تم أولاً معالجة وتطبيع مجموعات البيانات GSE75010 وGSE10588 وGSE60438 المتعلقة بالجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) المرتبطة بـ PE. بعد ذلك، أُجري تحليل تفاضلي باستخدام حزمة "limma" 14 في لغة R بناءً على معلومات تجميع العينات. تم اختيار الجينات التي كانت قيمة p < 0.05 وقيمة |log2FC| > 0.5. تم إنشاء مخططات البركان (Volcano plots) للجينات ذات التعبير التفاضلي باستخدام حزمة ggplot2 في لغة R. كما رُسمت الخرائط الحرارية لأعلى 20 جيناً من الجينات ذات التعبير التفاضلي باستخدام حزمة pheatmap في لغة R. لاحقاً، تم إيجاد التقاطع بين الجينات ذات التعبير التفاضلي المختارة من مجموعات البيانات الثلاث، وبُنيت شبكة تفاعل بروتين-بروتين (PPI) للجينات المرشحة باستخدام منصة STRING الإلكترونية، بدرجة تفاعل ≥0.15. تم تحديد أعلى 20 جيناً محورياً (hub genes) من شبكة PPI هذه بناءً على درجة اتصالها، وصُنفت باستخدام برنامج Cytoscape. وتم تصور نتائج شبكة PPI باستخدام برنامج Cytoscape أو منصة STRING.

تحليل الإثراء

تَم إجراء تحليل إثراء الجينات باستخدام حزمتي ClusterProfiler وDOSE بالاشتراك مع موقع Metascape الإلكتروني. وتم الحصول على قواعد البيانات من GO وKEGG. أُجري تحليل الإثراء باستخدام دالة “EnrichGO”. واعتُبرت المسارات التي كانت قيمة p < 0.05 مُثرية بشكل معنوي. وتم تمثيل نتائج الإثراء بصرياً باستخدام حزمتي “ggplot2” و“ggpubr”.

تعلم الآلة

لتحديد الجينات المعبّر عنها تفاضلياً (DEGs) التي تتسم بالمتانة والأهمية البيولوجية المرتبطة بمرض ما قبل الارتعاج (PE)، تم إجراء تحليل لاختيار الميزات باستخدام تعلم الآلة متعدد النماذج، وذلك بناءً على مجموعة بيانات النسخ المتوفرة علناً GSE60438 (المنصة: GPL6884). تحتوي مجموعة البيانات هذه على ملفات تعريف التعبير الجيني لعينات من الساقط الأساسي (decidua basalis) التي جُمعت من حالات حمل مصابة بما قبل الارتعاج وحالات حمل ذات ضغط دم طبيعي أثناء العملية القيصرية. تم توحيد الجينات المعبّر عنها تفاضلياً التي تم ترشيحها مسبقاً، واستُخدمت مصفوفة التعبير، جنباً إلى جنب مع معلومات التصنيف السريري المقابلة، كمدخلات لأربعة خوارزميات متميزة لتعلم الآلة من أجل تقليل انحياز النموذج وتعزيز استقرار اختيار الميزات.

تم تطبيق الخوارزميات الأربع في وقت واحد، دون ترتيب محدد. أُجري تحليل LASSO باستخدام حزمة "glmnet" لإجراء تحليل الانحدار واختيار الجينات ذات الميزات الهامة. تمت إضافة حد تنظيم L1 إلى دالة الخسارة، مما يؤدي إلى تقليص معاملات الميزات الأقل أهمية إلى الصفر، وبذلك يتم تحقيق اختيار الميزات. نُفذت خوارزمية SVM-RFE باستخدام حزمة "e1071" لبناء آلة ناقلات الدعم مع حذف الميزات المتكرر. تم تدريب مصنف أولاً باستخدام SVM، ثم أُزيلت الميزات الأقل إفادة بشكل تكراري بناءً على أوزان الميزات، مما أدى إلى الحصول على مجموعة فرعية مثلى من الميزات. طُبقت خوارزمية XGBoost باستخدام حزمة "xgboost" لبناء أشجار قرار متعددة؛ حيث قامت كل شجرة بملاءمة المتبقيات من الشجرة السابقة، وجُمعت المخرجات المرجحة للحصول على التنبؤ النهائي. أُجري تحليل Boruta باستخدام حزمة "randomForest"، حيث تم إنشاء ميزات ظلية تنافست مع الميزات الحقيقية في تدريب الغابة العشوائية، وتم الاحتفاظ بالميزات التي كانت قيم أهميتها أعلى بكثير من الضوضاء العشوائية.

تحليل بيانات النسخ transcriptome للخلية الواحدة

تم الحصول على بيانات النسخ transcriptome أحادية الخلية من قاعدة بيانات GEO، واستُرجعت مصفوفة العد الخام من GSE183338. استُوردت مصفوفة العد باستخدام دالة “Read10X” من حزمة Seurat وحُوّلت إلى تنسيق dgCMatrix. دُمجت الكائنات الفردية في كائن تجميعي واحد باستخدام دالة “merge”، وجُعلت تسميات الخلايا فريدة باستخدام “RenameCells”. تم ترشيح الخلايا منخفضة الجودة بناءً على المعايير التالية: إزالة الجينات التي تم التعبير عنها في أقل من ثلاث خلايا، واستبعاد الخلايا التي تعبر عن أقل من 200 جين. خضعت الخلايا التي اجتازت مراقبة الجودة لعملية التسوية (normalization) وتم تحديد الجينات عالية التباين. طُبقت تسوية القياس الشاملة باستخدام “LogNormalize” (معامل القياس = 10,000)، واختيرت الجينات عالية التباين (n = 2,000) باستخدام “FindVariableFeatures”، وتم قياس البيانات باستخدام “ScaleData”. أُجري تحليل المكونات الرئيسية على الميزات عالية التباين، وتم الاحتفاظ بأعلى 30 مكوناً رئيسياً. صُححت تأثيرات الدفعة (batch effects) بين العينات باستخدام طريقة Harmony. تم تصور الخلايا وتقليل أبعادها باستخدام UMAP. أُنشئت رسوم الجيران الأقرب المشتركة باستخدام “FindNeighbors” و“FindClusters” بناءً على خوارزمية Louvain. تم تحسين معامل الدقة في “FindClusters” بين 0.1 و1. تم تصور شجرة التجميع باستخدام دالة “clustree”، واختيرت دقة 0.9 لتحديد تجمعات الخلايا. أُزيلت الثنائيات (doublets) المحتملة باستخدام خوارزمية Scrublet. تم توصيف تجمعات الخلايا من خلال تحديد الجينات المرجعية ذات التعبير التفاضلي باستخدام دالة “FindAllMarkers”. طُبق اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب (Wilcoxon rank sum test) غير المعلمي مع تصحيح بونفيروني. عُينت هويات الخلايا بناءً على المؤشرات السطحية، والمؤلفات العلمية ذات الصلة، وقاعدة بيانات تصنيف الخلايا15.

زراعة الخلايا

تم استزراع خط خلايا الأرومة الغاذية HTR-8/SVneo في وسط RPMI-1640 مضاف إليه 10% من مصل الجنين البقري و1% من البنسلين/ستربتوميسين. تم تهيئة ظروف نقص الأكسجة عن طريق استزراع الخلايا عند 1% O₂ و5% CO₂ و94% N₂ لمدة 24 h؛ بينما تم الحفاظ على ضوابط سويّة الأكسجة عند 20% O₂ و5% CO₂16. يجب تنفيذ جميع إجراءات استزراع الخلايا داخل كابينة سلامة حيوية من الفئة الثانية (Class II biosafety cabinet) باستخدام تقنية تعقيمية. كما يجب التخلص من أوساط الاستزراع وكواشف عفن الخلايا ونفايات الخلايا وفقاً لإرشادات السلامة الحيوية المؤسسية.

ترانسفكشن الخلايا

تم تخليق بلازميدات تحتوي على sh-SASH1 وsh-NC وOE-SASH1 وOE-NC. وزعت خلايا HTR-8/SVneo بكثافة 5 × 105 خلية لكل بئر في أطباق ذات ستة آبار. بعد ذلك، تم نقل 2 µg من بلازميد sh-SASH1 أو sh-NC أو OE-SASH1 أو OE-NC لكل بئر إلى الخلايا باستخدام كاشف نقل وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وباختصار، تم تخفيف DNA البلازميد وكاشف P3000 في وسط Opti-MEM، ومزجهما مع Lipofectamine 3000 المخفف بشكل منفصل في Opti-MEM، ثم حضن الخليط لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة، وأضيف إلى الخلايا عندما وصلت درجة تلاقيها إلى 70–80%. وبعد ثمان وأربعين ساعة من عملية النقل، تم تقييم تعبير SASH1 عن طريق RT-qPCR واللطخة الغربية (Western blot). وتظهر تسلسلات الهدف لـ shRNA المستخدمة لتثبيط SASH1 في الجدول التكميلي 1.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي

تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من خلايا HTR-8/SVneo وتحويله عكسياً إلى cDNA باستخدام مجموعة أدوات النسخ العكسي عند 42 °C لمدة 30 min، تلاها 85 °C لمدة 5 min. وأُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) باستخدام مزيج SYBR Green الرئيسي وفقاً لظروف الدورات التالية: 95 °C لمدة 10 min، تلاها 40 دورة من 95 °C لمدة 15 s و60 °C لمدة 1 min. وحُسب التعبير النسبي لـ mRNA باستخدام طريقة ΔΔCt، مع اعتبار β-actin مرجعاً داخلياً. تسلسلات البادئات المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في الجدول التكميلي 2.

مقايسة لطخة ويسترن

تم استخلاص البروتين الكلي من خلايا HTR-8/SVneo باستخدام محلول التحلل (lysis buffer). جُمعت نواتج تحلل الخلايا، وحُضنت على الثلج، ثم طُردت مركزياً عند 12,000 × g لمدة 30 min عند 4 °C لإزالة الحطام غير القابل للذوبان. حُدد تركيز البروتين باستخدام جهاز المطياف الضوئي (spectrophotometer). وفُصلت كميات متساوية من البروتين (50 µg) عن طريق الفصل الكهربائي لهلام SDS-PAGE، ثم نُقلت لاحقاً إلى أغشية PVDF. عولجت الأغشية بـ 5% من الحليب الخالي من الدسم لغلق مواقع الارتباط غير المحددة (blocked)، وحُضنت مع الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 °C. وبعد الغسل، حُضنت الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المناظرة، وتم تصور حزم البروتين باستخدام نظام كشف التألق الكيميائي المُعزز (enhanced chemiluminescence detection system).

للكشف عن البروتين، شملت الأجسام المضادة الأولية anti-SASH1 و β-actin. كما استُخدمت أجسام مضادة ثانوية مناسبة مقترنة بإنزيم بيروكسيديز الفجل (HRP)، وهي goat anti-rabbit و goat anti-mouse. واستُخدم β-actin كضابط تحميل داخلي لضمان تساوي كميات البروتين المحملة. وقد تم قياس كثافة حزم البروتين وتقديرها كميًا باستخدام برنامج ImageJ.

عزل P-EXOS

تم عزل P-EXOS من نسيج الزغابات المشيمية الذي تم الحصول عليه من مشيمات مكتملة النمو لنساء أصحاء خضعن لعملية قيصرية اختيارية. غُسل نسيج الزغابات المشيمية جيداً بـ PBS معقم، ثم قُطع إلى شظايا بحجم 1 mm3 تقريباً، وزُرع في وسط RPMI-1640 مضاف إليه 10% FBS منزوع الإكسوزومات عند 37 °C في 5% CO2 لمدة 48 h. خضع الوسط المكيف لطرد مركزي تفاضلي على النحو التالي: 300 × g لمدة 10 min لإزالة الخلايا وبقايا الأنسجة؛ و2,000 × g لمدة 20 min لإزالة بقايا الخلايا؛ و10,000 × g لمدة 30 min لإزالة الحويصلات الدقيقة، وكل ذلك عند 4 °C. ثم تم إجراء طرد مركزي فائق للمادة الطافية الناتجة عند 120,000 × g لمدة 70 min عند 4 °C لترسيب الإكسوزومات. غُسلت الرواسب مرة واحدة بـ PBS وأعيد إخضاعها للطرد المركزي الفائق عند 120,000 × g لمدة 70 min عند 4 °C. وأخيراً، أُعيد تعليق الرواسب النهائية في PBS. تم توصيف الإكسوزومات المعزولة عن طريق تحليل Western blot للكشف عن علامات الإكسوزومات (PLAP و CD63 و TSG101، مع استخدام GM130 كضابط سلبي) وفُحصت كذلك بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ للملاحظة المورفولوجية.

تجربة الامتصاص الخلوي لـ P-EXOS

لتأكيد الامتصاص الخلوي لـ P-EXOS، تم وسم الإكسوسومات فلوريسنتياً باستخدام صبغة الغشاء المحبة للدهون PKH67 وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وباختصار، تم تحضين P-EXOS مع PKH67 (4 µM) في Diluent C لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة، ثم أوقف التفاعل بإضافة حجم مساوٍ من ألبومين المصل البقري (BSA) بتركيز 1%. أعيد عزل الإكسوسومات الموسمة عن طريق الطرد المركزي الفائق (120,000 × g، 70 min، 4 °C) لإزالة الصبغة غير المرتبطة. ثم أضيفت P-EXOS الموسمة بـ PKH67 (50 µg/mL) إلى خلايا HTR-8/SVneo وحُضنت معاً لمدة 24 h تحت ظروف طبيعية أو ظروف نقص الأكسجة (1% O₂). غُسلت الخلايا لاحقاً ثلاث مرات باستخدام PBS، وثُبتت باستخدام بارافورمالدهيد بتركيز 4% لمدة 15 min، وصُبغت النوى بصبغة DAPI (1 µg/mL). تم تصوير الامتصاص الخلوي للإكسوسومات الموسمة بـ PKH67 باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر (CLSM؛ إثارة 490 nm، انبعاث 502 nm). أما بالنسبة لتجارب الزراعة المشتركة الوظيفية، فقد عولجت خلايا HTR-8/SVneo بـ P-EXOS بتركيز 50 µg/mL (ما يعادل البروتين) في وسط RPMI-1640 كامل مضاف إليه 10% FBS خالية من الإكسوسومات تحت ظروف نقص الأكسجة (1% O₂) لمدة 24 h.

المقايسة الامتصاصية المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)

تم جمع السوائل الطافية من المزارع الخلوية، وقياس مستويات IL-6 و IL-1β و TNF-α باستخدام أطقم ELISA الخاصة بـ IL-6 و IL-1β و TNF-α على التوالي، وفقاً لتعليمات الشركات المصنعة. تم قياس الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة، وحُسبت التركيزات الفعلية من منحنيات القياس المعيارية.

وسم نهايات القطوع بـ dUTP بوساطة إنزيم TdT (تقنية TUNEL)

تم الكشف عن الخلايا المبرمجة (Apoptotic cells) باستخدام مجموعة أدوات مقايسة TUNEL وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وباختصار، تم تثبيت الخلايا باستخدام 4% paraformaldehyde لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة، ثم جعل غشاؤها نفاذاً باستخدام 0.1% Triton X-100 في PBS لمدة 5 min على الثلج، وحُضنت مع خليط تفاعل TUNEL لمدة 60 min عند 37 °C في الظلام. تمت صبغ الأنوية صبغاً مضاداً باستخدام DAPI، ووُثقت الخلايا الموجبة لـ TUNEL باستخدام مجهر فلوري، وتم قياسها كمياً عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ TUNEL في خمسة حقول مختارة عشوائياً على الأقل لكل عينة.

التحليل الإحصائي

تم تحليل جميع البيانات باستخدام برنامج R وبرنامج GraphPad Prism. عُرضت المتغيرات المستمرة في شكل المتوسط ±الانحراف المعياري (SD). أُجريت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t لـ Student، بينما أُجريت المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) متبوعاً باختبار Tukey للمقارنات البعدية. وقُيمت الدلالة الإحصائية للمتغيرات الفئوية باستخدام اختبار مربع كاي (Chi-square test) أو اختبار فيشر الدقيق (Fisher’s exact test). وما لم ينص على خلاف ذلك، حُسبت الارتباطات بين الجزيئات باستخدام تحليل ارتباط سبيرمان. نُفذت تجارب توصيف الإكسوزومات باستخدام P-EXOS المعزولة من ثلاثة متبرعين مستقلين بالمشيمة. وأُجريت التجارب القائمة على الخلايا في ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، تمثل تجارب مستقلة أُجريت في مناسبات منفصلة باستخدام خلايا HTR-8/SVneo من ممرات مختلفة، مع استخدام P-EXOS المعزولة من متبرع مشيمي مختلف في كل مكرر. واعتُبرت القيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التحليل الترانسكريبتومي للمرضى الأصحاء والمرضى المصابين بتسمم الحمل

لتحليل الاختلافات في التعبير الجيني بين المجموعة الطبيعية (Normal) والمرضى المصابين بما قبل تسمم الحمل (PE)، تم تحليل التعبير التفاضلي باستخدام حزمة limma البرمجية في لغة R على مجموعات البيانات المدمجة. تم تحديد ما مجموعه 89 من الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) (p < 0.05 و |log2FC| > 0.5)، منها 69 جينًا زاد تعبيرها و20 جينًا انخفض تعبيرها في مجموعة البيانات GSE75010 (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، تم تحديد SASH1 كجين رئيسي مختل التنظيم في تسمم الحمل (PE) من خلال تحليل ترانسكريبتومي متكامل، وتسلسل الخلية الواحدة، وتعلم الآلة متعدد الخوارزميات، وهو نهج ذو أهمية خاصة نظرًا لعدم توفر علاجات مستهدفة لتسمم الحمل17. وقد ثبت أن SASH1 يزداد تعبيره بشكل ملحوظ في الخلايا الأرومية الغاذية المعرضة لنقص الأكسجة، ويرتفع تحديداً في قسم الخلايا الأرومية الغاذية في مشيمات المصابات بتسمم الحمل بدقة على مستوى الخلية الواحدة. ومن خلال تجارب فقدان واكتساب الوظيفة، تم إثبات أن SASH1 ضروري وكافٍ لت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب في المصالح في هذه الدراسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من قبل البرنامج الرئيسي لأبحاث العلوم الطبية التابع للجنة الصحة في مقاطعة خبي، الصين (رقم 20210075).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسط RPMI-1640Gibco11875085
مصل جنين البقر (FBS)Gibco16140071
مصل FBS منزوع الإكسوسوماتSystem BiosciencesEXO-FBS-50A-1
بنسلين/ستربتومايسينThermo Fisher Scientific, CN15140122
كاشف ترانسفكشن Lipofectamine 3000 (مع كاشف P3000)Thermo Fisher Scientific, CNL3000150
وسط Opti-MEM منخفض المصلThermo Fisher Scientific, CN31985070
بلازميد SASH1 shRNA (HuSH)origeneTL301836
بلازميد تعبير SASH1 ORForigeneRC218866
ناقل فارغ ضابطorigenePS100001
طقم النسخ العكسيThermo Fisher Scientific, CN4368814
مزيج PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific, CNA46110
بادئات SASH1Sangon Biotechمصنعة حسب الطلب
بادئات β-actinSangon Biotechمصنعة حسب الطلب
منظم تحلل الخلاياBeyotimeP0013B
مقياس الطيف الضوئي NanoDropThermo Fisher Scientific, CNNanoDrop Ultra
غشاء PVDFThermo Fisher Scientific, CN88518
جسم مضاد Anti-SASH1ABclonalA15248
جسم مضاد Anti-β-actinAbcamab6276
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للأرانب/الفئران مقترن بـ HRPBeyotimeA0208
برنامج ImageJNIH (ملكية عامة)ImageJ
طقم PKH67 لربط الخلايا الفلوري الأخضر (يشمل المذيب C)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CNMINI67
ألبومين مصل البقر (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN10711454001
DAPIBeyotimeC1002
مجهر مسح ليزري بؤري (CLSM)LeicaLeica TCS SP8
طقم Quantikine ELISA لـ Human IL-6R&D SystemsD6050B
طقم DuoSet ELISA لـ Human IL-1β/IL-1F2R&D SystemsDY201
طقم Quantikine ELISA لـ Human TNF-αR&D SystemsDTA00D
قارئ الأطباق الدقيقةThermo ScientificMultiskan FC
طقم كشف موت الخلايا في الموقع (طقم مقايسة TUNEL)Roche11684795910
Triton X-100BeyotimeP0096
بارافورمالدهيد (4%)BeyotimeP0099
مجهر فلوريOlympusBX53
جهاز طرد مركزي مبرد (سعة 12,000 × g)EppendorfEppendorf 5430 R
جهاز طرد مركزي فائق (سعة 120,000 × g)Beckman CoulterOptima MAX-XP
برنامج RThe R Foundationv4.2.1
GraphPad PrismGraphPad Softwarev10.0
Seurat (حزمة R)Satija Lab (مفتوحة المصدر)v4.0.4
Harmony (حزمة R، لتصحيح الدفعة)مفتوحة المصدرv1.2.0
Scrublet (حزمة Python، لكشف المزدوجات)مفتوحة المصدرv0.2.3
clustree (حزمة R)مفتوحة المصدرv0.5.1
glmnet (حزمة R، LASSO)مفتوحة المصدرv4.1.8
e1071 (حزمة R، SVM-RFE)مفتوحة المصدرv1.7-14
xgboost (حزمة R)مفتوحة المصدرv1.7.7.1
randomForest (حزمة R، Boruta)مفتوحة المصدرv4.7-1.1
قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
قاعدة بيانات STRINGstring-db.orghttps://www.string-db.org/
Metascapemetascape.orghttps://metascape.org/
برنامج CytoscapeCytoscape Consortiumv3.10.4
ggplot2 (حزمة R)مفتوحة المصدرv3.5.1
limma (حزمة R)مفتوحة المصدرv3.58.1
pheatmap (حزمة R)مفتوحة المصدرv1.0.12
ClusterProfiler (حزمة R)مفتوحة المصدرv4.8.3
DOSE (حزمة R)مفتوحة المصدرv3.28.2
ggpubr (حزمة R)مفتوحة المصدرv0.6.0

المراجع

  1. Malik A, Jee B, Gupta SK. Preeclampsia: Disease biology and burden, its management strategies with reference to India. Pregnancy Hypertens. 2019;15:23-31.
  2. Vitoratos N, Hassiakos D, Iavazzo C. Molecular mechanisms of preeclampsia. J Pregnancy. 2012;2012:298343.
  3. Battarbee AN, et al. Chronic hypertension in pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2020;222(6):532-41.
  4. Torres-Torres J, et al. A Narrative Review on the Pathophysiology of Preeclampsia. Int J Mol Sci. 2024;25(14).
  5. Xu Y, et al. DOCK1 deficiency drives placental trophoblast cell dysfunction by influencing inflammation and oxidative stress, hallmarks of preeclampsia. Hypertens Res. 2024;47(12):3434-46.
  6. Harmon AC, et al. The role of inflammation in the pathology of preeclampsia. Clin Sci (Lond). 2016;130(6):409-19.
  7. Jaufmann J, et al. The emerging and diverse roles of the SLy/SASH1-protein family in health and disease: Overview of three multifunctional proteins. Faseb J. 2021;35(4):e21470.
  8. Li S, et al. The downregulation of SASH1 expression promotes breast cancer occurrence and invasion, accompanied by the activation of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Sci Rep. 2024;14(1):21914.
  9. Franke FC, et al. The Tumor Suppressor SASH1 Interacts With the Signal Adaptor CRKL to Inhibit Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019;7(1):33-53.
  10. Zhang J, et al. Extracellular vesicles in normal pregnancy and pregnancy-related diseases. J Cell Mol Med. 2020;24(8):4377-88.
  11. David M, Maharaj N. The immune-modulatory dynamics of exosomes in preeclampsia. Arch Gynecol Obstet. 2025;311(6):1477-87.
  12. Gu M, et al. Preeclampsia impedes fetal kidney development by delivering placenta-derived exosomes to glomerular endothelial cells. Cell Commun Signal. 2023;21(1):336.
  13. Jiang X, et al. Downregulated miR-199a-3p in Preeclamptic Placenta-derived Exosomes from Cord Blood Hinders VEGF-induced Fetal Glomerular Dysplasia Through Inhibiting Akt1(S473) Phosphorylation via Targeting PHLPP2. Stem Cell Rev Rep. 2025;21(8):2693-710.
  14. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  15. Wang X, et al. High expression of THY1 in gallbladder fibroblasts promotes the formation and progression of gallstones. Research Square [Preprint]. 2025. Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-7276422/v1. doi:10.21203/rs.3.rs-7276422/v1.
  16. Sha M, et al. Extracellular vesicles derived from hypoxic HTR-8/SVneo trophoblast inhibit endothelial cell functions through the miR-150-3p /CHPF pathway. Placenta. 2023;138:21-32.
  17. Ma'ayeh M, Costantine MM. Prevention of preeclampsia. Semin Fetal Neonatal Med. 2020;25(5):101123.
  18. Mandalà M. Oxidative Stress and Inflammation in Uterine-Vascular Adaptation During Pregnancy. Antioxidants (Basel). 2025;14(9).
  19. Lu Y, et al. NETs exacerbate placental inflammation and injury through high mobility group protein B1 during preeclampsia. Placenta. 2025;159:131-9.
  20. Raghupathy R. Cytokines as key players in the pathophysiology of preeclampsia. Med Princ Pract. 2013;22 Suppl 1(Suppl 1):8-19.
  21. Esfandyari S, et al. Exosomes as Biomarkers for Female Reproductive Diseases Diagnosis and Therapy. Int J Mol Sci. 2021;22(4).
  22. Pillay P, Moodley K, Moodley J, Mackraj I. Placenta-derived exosomes: potential biomarkers of preeclampsia. Int J Nanomedicine. 2017;12:8009-23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنظيم SASH1الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجةالاستجابات الالتهابيةآليات تسمم الحملتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخليةتحليل التعبير الجينيالسيتوكينات المحفزة للالتهاباتالفحص باستخدام التعلم الآلي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.