يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اختبار في المختبر لتحلل LpxC بواسطة بروتياز مرتبط بالغشاء FtsH ومحول LapB من الإشريكية القولونية

164 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71092

⸱

يونيو 22, 2026

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تنظم الإشريكية القولونية تخليق الدهون المتعددة السكريات (LPS) بشكل أساسي من خلال التحكم في تحلل LpxC، وهو الdeacetillas الذي يحفز الخطوة الأولى الملتزمة في تخليق LPS. هدف هذا البروتوكول هو إنشاء اختبار تحلل كمي حساس في المختبر ل LpxC، باستخدام بروتياز AAA+ FtsH المعاد تشكيله وLapB المحول في البروتيوليبوزومات.

الملخص

يقدم هذا البروتوكول اختبارا حساسا وكميا لتحليل التحلل في المختبر ل LpxC باستخدام بروتياز AAA+ (ATPase المرتبط بأنشطة خلاوية متنوعة) المعاد تشكيله وLapB المحول في البروتيوليبوزومات. بروتياز AAA+ هي آلات جزيئية تعتمد على ATP تحافظ على توازن البروتين وتنظم العمليات الخلوية المتنوعة في السيتوبلازم أو عند أغشية الخلايا. مقارنة بنظيراتها السيتوبلازمية، لا تزال بروتيازات AAA+ المرتبطة بالغشاء ضعيفة التوصيف بسبب التحديات التقنية في إعادة تكوين وقياس نشاطها في المختبر. هنا، نستخدم نظام FtsH–LapB–LpxC كنموذج لتطوير اختبار تحلل قائم على الفلورة في البروتينات الأولية. يعاد تشكيل FtsH و LapB إلى بروتيوليبوسومات لمحاكاة بيئة الغشاء الأصلية، ويتم تصنيف LpxC بشكل تساهمي مع الصبغة الفلورية Atto488. يبدأ التحلل بدمج البروتيوليبوزومات مع LpxC وATP الموسومة وينتهي بحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA). يعرف الاختبار الناجح بزيادة زمنية تعتمد على الزمن في الفلورة في الجزء الفائق القابل للذوبان بعد ترسيب TCA، مما يتوافق مع إطلاق شظايا الببتيدات الفلورية الناتجة عن تحلل LpxC. تمكن هذه الإشارة من القياس المباشر لمعدلات التحلل الأولية تحت ظروف محددة. مقارنة باختبارات الرحلان الكهربائي التقليدية المعتمدة على كبريتات كبريت-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE)، توفر هذه الطريقة حساسية محسنة بشكل كبير وتمكن من التحليل الحركي الكمي. علاوة على ذلك، يسمح نظام البروتيوليبوسوم بدراسة منهجية لكيفية تأثير مكونات البروتين، مثل المحولات والمضادة للمحولات، بالإضافة إلى تركيب الدهون، على تحلل LpxC. على الرغم من تطويره لنظام FtsH–LapB–LpxC، فإن هذا الاختبار قابل للتكيف بسهولة مع بروتيازات AAA+ الأخرى المرتبطة بالغشاء والركائز، مما يوفر منصة عامة لدراسة التحلل البروتيولي المرتبط بالغشاء في المختبر.

المقدمة

بروتيازات AAA+ هي آلات جزيئية محفوظة تعتمد على ATP وتلعب أدوارا مركزية في مراقبة جودة البروتينات وتحلل البروتين التنظيمي 1,2. تحتوي هذه الأجهزة على حلقة سداسية من مجال AAA+ ATPases، تقوم بتحلل ATP، وتتعرف على الركائز وتفتحها وتنقل إلى مجال البروتيز المقصور للتحلل1. بينما تم توصيف بروتيازات AAA+ السيتوبلازمية مثل ClpXP3 وLon4 بشكل واسع باستخدام اختبارات مختبرية راسخة، لا تزال بروتيازات AAA+ المرتبطة بالغشاء غير مفهومة نسبيا. تعكس هذه الفجوة إلى حد كبير التحديات التقنية المرتبطة بإعادة تكوين بروتينات الغشاء في بيئات دهنية محددة وقياس نشاطها البروتيني في المختبر بشكل كمي. الهدف العام من هذه الطريقة هو إنشاء اختبارات كمية حساسة للتحقيق في النشاط البروتيولي للبروتيازات المرتبطة بالغشاء.

FtsH هو البروتياز الأساسي الوحيد من نوع AAA+ في الإشريكية القولونية ويعمل كنموذج أولي لبروتياز AAA+ المرتبط بالغشاء 5,6,7. يرتبط FtsH بالغشاء الداخلي بواسطة حلزونات عبر الغشاء N الطرفية، ويحلل مجموعة متنوعة من الركائز السيتوبلازمية والمرتبطة بالغشية، مما ينظم مراقبة جودة بروتين الغشاء، واستجابات الإجهاد، وتوازن الدهون 8,9,10,11. واحدة من أفضل ركائزها تميزا هي LpxC، وهو ديأسيتيلاز قابل للذوبان يحفز الخطوة الأولى في تخليق الليبوبوليسكاريد (LPS)12,13. يتطلب التحليل الفعال ل LpxC بواسطة FtsH بروتين الغشاء LapB، الذي يعمل كمحول للتعرف تحديدا على LpxC وتوصيله إلى البروتيز14، 15، 16، 17، 18.

على الرغم من أهميتها الفسيولوجية، إلا أن التحليل الكمي للبروتييوليز البوساطة بواسطة FtsH في المختبر كان محدودا، خاصة للركائز السيتوبلازمية مثل LpxC. تستخدم اختبارات التحلل التقليدية في المختبر FtsH المنقي في مزيجاتالمغسلة 13,19، والتي لا توفر بيئة الغشاء للبروتيز المثبت على الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تعتمد اختبارات التحلل على الكشف القائم على SDS–PAGE لاختفاء الركيزة13، والذي قد يكون مكثفا من العمل، منخفض الإنتاجية، وغير حساس بما فيه الكفاية للتحليلات الحركية. مؤخرا، تم استخدام FtsH المعاد تشكيله إلى خلايا ثنائية لدراسة تحلل ركائز الغشاء، كما ابتكرته مجموعةهيديوك هونغ 20؛ ومع ذلك، لا يزال هناك نظام مماثل لتحليل الركائز السيتوبلازمية مفقودا. هنا، نعتمد على إعادة تشكيل الخلية الثنائية لهيديوك هونغ لإعادة تكوين البروتيوليبوسومات لمحاكاة بيئة الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، فإن الركيزة القابلة للذوبان في الماء LpxC مصنفة بالفلورة، مما يتيح قياسا حساسا وكميا لحركية التحلل المعتمد على FtsH/LapB لل LpxC في المختبر.

يجب استخدام هذه الطريقة عندما يحتاج الباحثون إلى قياس كمية للبروتيولية التي توسطها FtsH للركائز القابلة للذوبان في الماء. يوفر عدة مزايا مقارنة بالأساليب الحالية. أولا، الكشف القائم على التألق للمنتجات البروتينية، بدلا من اختفاء الركيزة، يحسن بشكل كبير الحساسية والمدى الديناميكي، مما يسهل المقارنات الكمية لنشاط البروتيوليات. ثانيا، يحافظ استخدام البروتيوليبوزومات على السياق الغشائي المطلوب لوظيفة FtsH مع السماح بالتحكم الدقيق في تركيب البروتين والدهون18. وأخيرا، وعلى الرغم من تطويره باستخدام نظام FtsH–LapB–LpxC، فإن هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة مع بروتيازات AAA+ الأخرى المرتبطة بالغشاء وركائزها السيتوبلازمية التي تتطلب آليات تحلل مرتبطة بالغشاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. وضع علامة على LpxC باستخدام Atto488

  1. تحضير LpxC
    1. تعبير وتنقية بروتين LpxC كما تم الإبلاغ عنهسابقا 18. استبدل المخزن الخازن من LpxC المنقى من Tris إلى مخزن فوسفات 50 ملليمولر، pH 7.6 (6 ملليمولار NaH2PO4، 44 ملليمولار Na2HPO4، 150 ملليمولار NaCl) بترشيح هلام باستخدام عمود ترشيح هلام عالي الدقة (مثل عمود Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. تركيز LpxC باستخدام عمود الترشيح الفائق إلى تركيز نهائي لا يقل عن 5 ملغ/مل عند 4 درجات مئوية.
  2. تصنيف LpxC مع Atto488
    1. تخفيف 0.5 ملغ من LpxC في مخزن فوسفات 50 ملليمولر، بدرجة حموضة 7.6، إلى حجم نهائي يبلغ 225 ميكرولتر. أضف 25 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 1 مليون لضبط الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 8.3.
    2. قم بإذابة 0.24 ملغ من صبغة Atto488 التفاعلية في 20 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم بوزن 0.1 مليون لتحضير محلول مخزون (0.012 ملغ/ميكرولتر). تحضير محلول عمل عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من محلول المخزون مع 18 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم 0.1 م، مما ينتج تركيزا نهائيا 0.0012 ملغ/ميكرولتر.
    3. أضف فورا 4 ميكرولتر من محلول Atto488 العامل إلى محلول البروتين (يتوافق مع نسبة مولية LpxC: Atto488 بنسبة 3:1). لف الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضن الأنبوب عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين مع تحريك خفيف (18 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: يمكن تجميد كل من مخزن Atto488 والمحاليل العاملة في النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
  3. فصل LpxC–Atto488 عن الصبغة الحرة
    1. قم بتسوية عمود إزالة الملح PD-10 مع 10 مل من الماء فائق النقي، يليه 15 مل من مخزن فوسفات 50 ملليمول، بدرجة حموضة 7.6.
    2. ضع خليط تفاعل الملاحظات على العمود ودعه يدخل الراتنج بالكامل.
    3. الأنبوب يحتوي على 5 مل من مخزن فوسفات 50 ملليمول، درجة حموضة 7.6. يجب أن يصبح نطاقان مميزان يتوافقان مع LpxC–Atto488 (النطاق الأول) وصبغة Atto488 الحرة (النطاق الثاني) مرئيين. اجمع الكسور من النطاق الأول بحجم ~0.5 مل من أليكوت.
    4. تحليل الكسور المائلة بواسطة SDS-PAGE. تصور التألق تحت الإضاءة فوق البنفسجية قبل صبغ Coomassie Brilliant Blue (CBB).
    5. تجمع الكسور التي تحتوي على LpxC–Atto488 وتركز البروتين الموسوم إلى حوالي 2 ملغ/مل.
    6. تقدير كفاءة الوسم بقياس تركيز البروتين وتركيز Atto488 باستخدام مطياف ميكروحجم.
      ملاحظة: نسبة تركيز Atto488 (بالبيمول/ميكرولتر) إلى تركيز LpxC (بالملغرام/مل) في نطاق 2–5 تشير إلى مستوى وسم مناسب. وهذا يتوافق مع نسبة مولية بين Atto488 إلى LpxC تتراوح بين 1:15 إلى 1:6 بعد وضع العلامات.
    7. أليكووت LpxC–Atto488 في أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل، تجميد فوري في النيتروجين السائل، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. في هذه المرحلة، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      تحذير: النيتروجين السائل بارد جدا؛ تعامل معه بمعدات حماية مناسبة (قفازات تجميد، حماية للعين).

2. إعادة تشكيل FtsH/LapB إلى بروتيوليبوزومات

  1. تحضير الليبوسومات
    1. انقل 100 ملغ من 1-بالميتويل-2-أوليول-إس-جلسيرو-3-فوسفوكولين (POPC) في الكلوروفورم إلى أنبوب اختبار زجاجي. تبخر المذيب تحت تدفق لطيف من نيترويترون، ثم تجفيفه طوال الليل تحت التفريغ.
      ملاحظة: لدى مضخة التحول الخارجي للمرحلة تبلغ ~-2 درجة مئوية وتستخدم على نطاق واسع في الفيزياء الحيوية للأغشية، وتركيبات الليبوسومات، وأنظمة نماذج الخلايا.
      تحذير: يمكن أن يضر الكلوروفورم بالعينين والجلد والكبد والكلى والجهاز العصبي. يتطلب الأمر وجود معدات حماية مناسبة (قفازات، حماية للعين، قناع) أثناء التعامل. تعامل معه في غطاء محرك باستخدام حقنة زجاجية.
    2. أضف 1,315 ميكرولتر من المخزن A (20 ملليموتر Tris-HCl، pH 7.5، 100 مللي مولار NaCl) إلى فيلم POPC المجفف. أعد تعليق الدهون بالتناوب بين دقيقة واحدة من صوت حمام الماء ودقيقة واحدة من الدوامة عند أقصى سرعة ليصل إجمالي ~15 دقيقة، أو حتى تتبعثر تماما. (التركيز النهائي للدهون: 100 ملليمو).
      ملاحظة: لتحسين إعادة تعليق الدهون، قم بضبط عمق الغمر في أنبوب الاختبار الزجاجي في جهاز الحمام المائي لتعظيم التحريك. يمكن تخزين الدهون المعلقة عند -20 درجة مئوية. في هذه المرحلة، يمكن إيقاف البروتوكول لمدة تصل إلى شهر.
    3. قم بتقسيم تعليق الليبوسوم إلى أجزاء بسعة 200 ميكرولتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  2. بروز الليبوسومات
    1. قم بإذابة أليكوت ليبوسوم بسعة 200 ميكرولتر في حمام ماء عند درجة حرارة الغرفة وتخفيف المحلول المؤقت بمقدار 800 ميكرولتر من المخزن A إلى حجم نهائي يبلغ 1 مل.
    2. خضع الليبوزومات لثلاث دورات تجميد وإذابة عن طريق التناوب بين النيتروجين السائل وحمام الماء في درجة حرارة الغرفة.
    3. شطف الحقن، ودعامين للفلتر، وغشاء بولي كربونات بطول 200 نانومتر مع مخزن A. قم بتجميع البثق الصغير وطرد الليبوزومات 20 مرة.
      ملاحظة: يجب أن يبدو تعليق الليبوسوم شفافا بعد البثق.
    4. قسم تعليق الليبوسوم المبثق بحجم 1 مل إلى ثلاثة أنابيب (330 ميكرولتر لكل أنبوب) وتخفيف كل منها ب 600 ميكرولتر من المخزن A.
  3. معايرة تورم Triton X-100
    ملاحظة: ترايتون X-100 هو منظف منخفض التركيز الحرج للميسيل (CMC)، وقد أثبت نجاحه في العديد من الحالات21
    تحذير: ترايتون X-100 مادة كيميائية خطيرة، تسبب بشكل أساسي أضرارا شديدة للعين، وتهيج الجلد، وتأثيرات ضارة إذا ابتلعه. يتطلب الأمر وجود معدات حماية مناسبة (قفازات، حماية للعين) أثناء التعامل.
    1. جهز 10٪ (v/v) من Triton X-100 عن طريق خلط 100 ميكرولتر Triton X-100 مع 900 ميكرولتر من الماء فائق النقي، وحضنه في هزاز لإذابة Triton X-100 بالكامل.
    2. قس امتصاص الليبوزومات عند 540 نانومتر (A₅₄₀) باستخدام مقياس طياف.
    3. أضف 5 ميكرولتر من 10٪ ترايتون X-100 بشكل متسلسل، ثم اخلط بلطف بعد كل إضافة، وقم بقياس A₅₄₀. استمر في إضافة ترايتون X-100 حتى يصل A₅₄₀ إلى الحد الأقصى، ثم أضف ترايتون X-100 4–5 مرات إضافية حتى تنخفض الامتصاصات إلى حوالي 60٪ من القيمة القصوى.
    4. استنادا إلى منحنى المعايرة، قم بزيادة الليبوزومات بإضافة 35 ميكرولتر من 10٪ ترايتون X-100 واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع تحريك لطيف.
  4. إعادة تشكيل FtsH/LapB إلى ليبوزومات
    1. تعبير وتنقي بروتينات FtsH و LapB كما تم وصفه سابقا18.
    2. غسل ~2 جرام من مادة ماصة بوليسترين غير قطبية (مثل Bio-Beads SM-2) مرة واحدة بعشرة مجلدات من الميثانول، ومرة بعشرة مجلدات من الإيثانول، وعشر مرات بعشرة أجزاء من الماء فائق النقي. خزن الماص المغسول في المخزن A عند 4 درجات مئوية.
    3. لكل أنبوب من الليبوزومات المتورمة من Triton X-100، أضف 3 ميكرولتر من 500 ملليمولار تريس (2-كربوكسي إيثيل)فوسفين (TCEP)، و22.5 ميكروغرام من FtsH، و22.5 ميكروغرام من LapB. اضبط الحجم الكلي إلى 1 مل مع مخزن A واحتضن عند RT لمدة ساعة مع تحريك خفيف.
      ملاحظة: كانت نسب البروتين إلى الدهون من 1:20 إلى 1:200 (وزن/وزن) تستخدم بشكل روتيني خلال إعادة تشكيل البروتيوليبوزومات21. هنا، يستخدم نسبة 1:100.
    4. إزالة المنظف عن طريق الحضانة المتسلسلة باستخدام ممتص بوليسترين غير قطبي: 40 ملغ عند الريتيرين لمدة 0.5 ساعة، تليها 40 ملغ عند RT لمدة ساعة واحدة، ثم 40 ملغ عند 4 درجات مئوية خلال الليل، وأخيرا 40 ملغ عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
    5. يتم استخدام طرد مركزي لفترة وجيزة لإزالة البوليسترين غير القطبي الممتز عند 4 درجات مئوية (400 × جرام لمدة 3 ثوان). انقل المادة الفائقة إلى أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق. اغسل الممتص غير القطبي بالبوليسترين بسعة 1 مل من محلول A وامزج الغسيل مع السوبرناتانت. أضف مخزن مؤقت إضافي A إلى حجم نهائي ~6 مل.
      ملاحظة: من أجل السلامة، يجب أن تحتوي أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق على ما لا يقل عن 6 مل من السائل.
    6. توازن الأنابيب والطرد المركزي الفائق عند 250,000 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة في دوار بزاوية ثابتة (مثل MLA-80) مع بروتيوليبوزومات الحبيبات.
    7. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة البروتيوليبوسوم في 70 ميكرولتر من المخزن A مع 1 مللي مولار TCEP.
      ملاحظة: حجم البروتيوليبوسوم النهائي حوالي 100 ميكرولتر.
    8. قم بتجميد البروتيوليبوزومات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا لمدة تصل إلى شهر واحد.
  5. تحليل SDS-PAGE للبروتيوليبوزومات
    1. اخلط البروتيولبوزومات جيدا وامزج 5 ميكرولتر من العينة مع 5 ميكرولتر من 2× SDS (0.1 M Tris-HCl، pH 6.8، 5٪ SDS، 20٪ جليسرول، 0.01٪ بروموفينول أزرق، 200 ملليمولار DTT).
    2. تحميل عينات البروتيوليبوزوم بجانب 525 نانوغرام من FtsH (ما يعادل 0.06 ميكرومولار FtsH هيكسر في 20 ميكرولتر) على جل SDS-PAGE بنسبة 4–20٪.
    3. صبغ الجل ب CBB.
    4. قم بمسح الجل وقياس شدة النطاق ل FtsH لكل عينة. احسب حجم تعليق البروتيوليبوسوم المعادل 525 نانوغرام من FtsH.

3. التحلل الصناعي ل LpxC–Atto488

  1. إجراء اختبارات التحلل في المختبر في تفاعل بسعة 20 ميكرولتر يحتوي على بروتيوليبوزومات FtsH/LapB (التي تمثل 0.06 ميكرومولار FtsH) و0.5، 1، 2، 2.5، 5، 10، 20، 40 ميكرومولار LpxC-Atto488 في مخزن التحلل (50 ملليموتر تريس-أسيت، درجة حموضة 8.0، 10 ملليمولار ملغيوم-أسيتات، 5 ملليمولار ATP، 25 ميكرومولار زن-أسيتات، 80 ملليمولار NaCl، 1.4 ملليمولار β-ميركابتوإيثانول).
  2. لقياس كل تركيز من الركيزة، جهز تفاعلا بقوة 70 ميكرولتر.
    1. خذ جزءا من 20 ميكرولتر وقم بتبريده فورا بخلطه مع 48 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 5٪ (TCA) في أنابيب طرد مركزي دقيقة بحجم 1.5 مل (0 دقيقة). خذ الجزئين الثاني والثالث وقم بتبريدهما عند 10 و20 دقيقة على التوالي.
    2. بالتوازي، جهز تفاعلات تحكم مقابلة تفتقر إلى بروتيوليبوزومات للطرح الخلفي.
      ملاحظة: يوصى بإجراء ثلاث قياسات مكررة للحصول على نتائج موثوقة.
      تقليل التعرض للضوء عند التعامل مع LpxC–Atto488.
      تحذير: TCA مادة كيميائية شديدة التآكل تسبب حروقا شديدة في الجلد، وأضرارا دائمة في العين، وتهيجا تنفسيا شديدا عند الاستنشاق. تعامل مع الأمر باستخدام معدات الحماية المناسبة (قفازات، حماية للعين، قناع).
  3. حضن العينات على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لترسيب البروتينات، ثم الطرد المركزي عند 18,800 × جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  4. تحييد العينات بنقل 50 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب يحتوي على 60 ميكرولتر من 500 ملليمولر تريس-HCl، رقم الهيدروجينات 8.8. اخلط جيدا وانقل 100 ميكرولتر إلى صفيحة سوداء بسعة 96 بئر. قس التألق باستخدام قارئ لوحات مع إثارة عند 498 نانومتر وانبعاث عند 520 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتحسين حساسية اختبار التحلل الصناعي ، تم وسم الركيزة LpxC بصبغة فلورية Atto488. تتفاعل مجموعة إستر السوكسنيميديل في Atto488 بكفاءة مع المجموعات الأمينية الأولية ل LpxC تحت ظروف قلوية معتدلة. نظرا لأن مخزن تريس يحتوي على أمينات أولية تتداخل مع هذا التفاعل، فقد تم استبدال LpxC المنقى في مخزن تريس إلى مخزن الفوسفات عن طريق ترشيح هلام قبل وضع العلامات. لتفاعل الوسم، تم استخدام نسبة مولية LpxC إلى Atto488 بنسبة 3:1 لتحقيق وسم معتدل وتجنب الوسم الزائد (انظر النقاش). بعد إزالة الصبغة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوة الحرجة الأولى في هذا البروتوكول هي تصنيف Atto488 ل LpxC. يعد وضع العلامات المعتدل أمرا بالغ الأهمية لقياس نشاط التحلل في المختبرات بدقة. استنادا إلى تجاربنا في التحسين، فإن نسبة المولر بين LpxC إلى Atto488 بين 9:1 و3:1 هي الأمثل. يؤدي الإفراط في Atto488 إلى زيادة التصنيف، مما من المحتمل أن يؤثر على الحالة الأصلية ل LpxC. في ظل هذه الظروف، ينخفض الفرق في تحلل LpxC–Atto488 بواسطة FtsH وحده مقابل FtsH/LapB بشكل ملحوظ (البيانات غير موضحة). وعلى العكس، فإن عدم كفاية التسمية ين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

أجريت جميع الأبحاث في جامعة ييل. يحظى دبليو. إم. بدعم المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة تحت أرقام الجوائز R01GM137068 و RM1GM149406، ومن مؤسسة عائلة ريتشارد وسوزان سميث من خلال جائزة أوديسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEHome made
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Nonpolar polystyrene adsorbent 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Fixed-angle rotor 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944High-resolution gel filtration column 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

المراجع

  1. Sauer, R. T., Baker, T. A. Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction. Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).
  2. Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).
  3. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine. Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).
  4. Gur, E., Sauer, R. T. Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease. Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).
  5. Ogura, T., Wilkinson, A. J. Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function. Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).
  6. Tomoyasu, T., et al. The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression. J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).
  7. Tomoyasu, T., et al. Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).
  8. Ito, K., Akiyama, Y. Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).
  9. Chai-Danino, M., et al. Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH. bioRxiv. , (2023).
  10. Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics. Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).
  11. Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli. J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).
  12. Young, K., et al. The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase. J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).
  13. Ogura, T., et al. Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli. Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).
  14. Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein. J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).
  15. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).
  16. Nicolaes, V., et al. Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli. J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).
  17. Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).
  18. Shu, S., Mi, W. Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).
  19. Tomoyasu, T., et al. Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32). EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).
  20. Yang, Y. Q., et al. Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH. J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).
  21. Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  22. Asahara, Y., et al. FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues. J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).
  23. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA). Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بروتياز FtsHومحول LapBوإعادة تشكيل البروتوليبوزوماتوبروتياز +AAAومقايسة الفلورةوالتوازن البروتينيوالتحليل الحركي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.