فعالية التشخيص لجهاز miR-362-3p في البلازما مع الموجات فوق الصوتية دوبلر في تشخيص سرطان الثدي

ملخص

معدل تشخيص سرطان الثدي منخفض نسبيا. تم استخدام طريقة الجدول الرباعي لتحليل القيمة التشخيصية ل miR-362-3p مع دوبلر الموجات فوق الصوتية لسرطان الثدي. وقد عزز الجمع بين دوبلر الموجات فوق الصوتية وmiR-362-3p فعالية التشخيص بشكل فعال، مما وفر طريقة واعدة لتشخيص سرطان الثدي.

الملخص

سرطان الثدي هو ثاني أكثر الورم الخبيث شيوعا في العالم، ويهدد حياة النساء بشكل خطير ويفرض عبئا اقتصاديا هائلا. تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف قيمة miR-362-3p مع الموجات فوق الصوتية دوبلر في تشخيص سرطان الثدي. تم تضمين ما مجموعه 182 مريضا بسرطان الثدي و147 مريضا بمرض ثدي حميد في هذه الدراسة. تم قياس مستويات miR-362-3p في البلازما لدى المرضى باستخدام تفاعل بوليميراز الفلوري الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR). تم استخدام اختبار كاي-تربيع لتحليل الفروق في معايير الموجات فوق الصوتية دوبلر بين مجموعتي المرضى. تم استخدام منحنى خاصية مشغل المستقبل (ROC) لتقييم الفعالية التشخيصية لمؤشر miR-362-3p، ومؤشر المقاومة (RI)، ومؤشر النبض (PI). تم تحليل كفاءة تشخيص الموجات فوق الصوتية دوبلر مع البلازما miR-362-3p في سرطان الثدي من خلال طريقة الجدول الرباعي. انخفضت مستويات miR-362-3p بشكل ملحوظ لدى مرضى سرطان الثدي. كانت هناك فروق كبيرة في معايير الموجات فوق الصوتية ثنائية الأبعاد. miR-362-3p، RI، وPI لها قيمة تشخيصية لسرطان الثدي. كانت القيمة التشخيصية المجمعة للعوامل الثلاثة أعلى. أدى الموجات فوق الصوتية مع miR-362-3p إلى تحسين الحساسية والدقة والقيمة التنبؤية السلبية بشكل ملحوظ في تشخيص سرطان الثدي. يمكن أن يعزز الموجات فوق الصوتية دوبلر مع miR-362-3p كفاءة تشخيص سرطان الثدي، مما قد يوفر أداة تشخيصية غير جراحية ومساعدة محتملة لسرطان الثدي.

المقدمة

وفقا لإحصائيات الوكالة الدولية لأبحاث السرطان، تجاوز معدل الإصابة بسرطان الثدي معدل سرطان الرئة في عام 2020^. سرطان الثدي هو ورم خبيث يحدث بشكل شائع ويعد سببا رئيسيا للوفاة المرتبطة بالسرطان لدى النساء على مستوى^{العالم.} التشخيص المبكر لسرطان الثدي مفيد لتشخيص المرضى. خزعة الأنسجة هي المعيار الذهبي لتشخيص سرطان الثدي. ومع ذلك، هذا نوع من التشخيص الغازي، ولا ينطبق على مرضى سرطان الثدي في مراحله المبكرة².

الموجات فوق الصوتية دوبلر هي تقنية تصوير شائعة الاستخدام لفحص سرطان الثدي والتشخيص المساعد³. يمكن لدوبلر تقييم حجم العقيدات وإشارات تدفق الدم وحالة انتشار العقد^{اللمفاوية} بدقة. الموجات فوق الصوتية دوبلر للثدي، بفضل مزاياها مثل عدم وجود إشعاع مؤين، والسلامة، وعدم الجراحة، بالإضافة إلى القدرة على الفحوصات المتكررة، أصبحت واحدة من أكثر تقنيات التصوير استخداما في فحص وتشخيص سرطان الثدي⁵. ومع ذلك، فإن الموجات فوق الصوتية دوبلر عرضة للتداخل مع خلفية الأنسجة عند اكتشاف سرطانات الثدي ذات الكثافة المنخفضة أو الحجم الصغير، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في حساسية التشخيص وصعب تلبية الاحتياجات السريرية للتشخيص^{المبكر 6}. لذلك، من الضروري تطوير مؤشرات بلازما حيوية يمكنها تجاوز قيود تقنية الموجات فوق الصوتية دوبلر. إذا كان الجمع بين الطريقتين يمكن أن يعزز حساسية التشخيص لسرطان الثدي، فسيكون له قيمة سريرية كبيرة وأهمية عملية.

الميكروRNA (miRNAs) هي فئة من جزيئات RNA غير المشفرة بطول يتراوح بين 20 إلى 24 نيوكليوتيدا ^7,8. واحدة من خصائص الميكرو الريبي النووي هي درجة عالية من الحفظ خلال عملية التطور. ال miRNA له توزيع واسع في الأنسجة، لا يعبر عنه فقط في خلايا الأنسجة البشرية المختلفة، بل يمكن أن يوجد أيضا بشكل مستقر في سوائل الجسم متعددة مثل الدم واللعاب^. توفر هذه الخصائص التوزيعية مزايا لتطوير علامات تشخيصية غير جراحية. وظيفيا، يقوم الميكرو الريبي الريبي (miRNA) بتحليل mRNA من خلال الارتباط التكميلي بالمناطق غير المترجمة (UTR^{) الثلاثية، ويشارك} في سلسلة من العمليات المرضية والفسيولوجية الرئيسية مثل الاستجابات الالتهابية الخلوية، والإجهاد التأكسدي، والموت المبرمج، والتكاثر والتمايز¹². أكدت عدد كبير من الدراسات أن التغيرات غير الطبيعية في ملفات تعبير ال miRNA كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا بحدوث وتطور سرطان الثدي^13,14. يمكن أن يؤدي اختلال تنظيم تعبير ال miRNA إلى تعزيز التحول الخبيث لخلايا ظهارة الثدي من خلال تنظيم شبكات التعبير للجينات المسرطمة أو جينات مثبطات الأورام. miR-362-3p هو عامل نموذجي يعيق تقدم الورم. وجدت عدة تقارير أن miR-362-3p يثبط تقدم سرطان الثدي 15,16,17. أفاد أسيري وآخرون أن انخفاض التعبير عن miR-362-3p كان مرتبطا ارتباطا وثيقا بتوقعات ضعيفة وقصر البقاء على قيد الحياة العام لدى مرضى سرطان الثدي¹⁵. ميكانيكيا، مارس miR-362-3p تأثيرا مضادا للأورام في سرطان الثدي من خلال استهداف هيليكاز DEAD-box 5 (DDX5) لتعزيز تكاثر خلايا السرطان وغزوها وهجرتها^. بالإضافة إلى ذلك، وجد الفريق بقيادة كانغ أن miR-362-3p تم تخفيض تنظيمه بشكل كبير في أنسجة سرطان الثدي، وقد يكون التنظيم المستهدف لتعبير miR-362-3p استراتيجية علاجية جديدة محتملة لإدارة سرطان الثدي¹⁷. ومع ذلك، لم يصدر تقرير حول ما إذا كان miR-362-3p يمكن أن يكون علامة تشخيصية مبكرة لسرطان الثدي.

قامت هذه الدراسة بقياس مستوى تعبير miR-362-3p في البلازما وحللت في الوقت نفسه معلمات الصورة الأساسية لجهاز دوبلر الموجات فوق الصوتية لدى مرضى سرطان الثدي. استكشفت الدراسة بشكل شامل القيمة المجمعة للتطبيق لمستويات تعبير miR-362-3p في البلازما ومعلمات صورة دوبلر بالموجات فوق الصوتية، وأظهرت بوضوح فعالية هذا النهج التشخيصي المشترك في فحص سرطان الثدي وفي التشخيص التفريقي بين أمراض الثدي الحميدة والخبيثة.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي. تم منح الموافقة من لجنة الأخلاقيات في مستشفى شاندونغ الثاني للطب، كلية الطب السريري، جامعة شاندونغ الطبية الثانية (رقم الموافقة: wyfy-2023-ky-124). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين في الدراسة. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. المشاركون التجريبيون

تم إجراء حساب حجم العينة باستخدام برنامج G*Power 3.1 بناء على اختبار t مستقل للعينة. تم تحديد حجم تأثير متوسط (d كوهين = 0.5، يستخدم على نطاق واسع في الدراسات الرصدية السريرية)، واختبار ذو ذيل α = 0.05، والقدرة (1 − β) = 0.95. أشارت الحسابات إلى أن ما لا يقل عن 105 مشاركين مطلوبون لكل مجموعة. وأخيرا، تم تسجيل 182 مريضا بسرطان الثدي و147 مريضا يعانون من آفات ثدي حميدة، وتجاوز حجم العينة الفعلي لكلتا المجموعتين الحد الأدنى المطلوب بكثير، مما ضمن قوة إحصائية كافية لدعم استنتاجات الدراسة والتحكم في خطر خطأ النوع الثاني ضمن نطاق مقبول. تم تسجيل جميع المشاركين بشكل صارم ومتتابع وفقا لمعايير الإدراج والاستبعاد الموحدة.

من عام 2023 إلى 2024، تم تسجيل جميع المرضى في المستشفى التابع لجامعة شاندونغ الطبية الثانية، كلية الطب السريري، جامعة شاندونغ الطبية الثانية. آفات حميدة: تم تأكيد الآفات غير الخبيثة من قبل علم الأمراض. سرطان الثدي: تم تأكيد الأورام الخبيثة من قبل علم الأمراض. تم جمع عينات دم وريدي من جميع المشاركين بعد الصيام الليلي. تم مضاد تخثر عينات الدم الوريدي وطردها المركزي لفصل البلازما، مع الالتزام الصارم بالإجراءات القياسية، ثم نقلت إلى درجة حرارة −80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد، والذي استخدم لاحقا لاستخراج الميكرو الريبي الريبي. تم تقييد جميع عينات البلازما بشكل صارم على دورتين لا تزيد عن دورتين من التجميد والذوبان قبل استخراج الحمض النووي الريبي لمنع تحلل الميكرو الريبي. تم إبلاغ جميع المرضى بالكامل ببروتوكول الدراسة وقدموا موافقة مكتوبة مستنيرة طوعا قبل التسجيل.

معايير الإدراج لمرضى سرطان الثدي: (1) المرضى الذين تم تأكيد سرطان الثدي الأولي لديهم مرضيا. (2) عدم وجود علاج جراحي قبل التسجيل. (3) لم يتلق العلاج الإشعاعي أو العلاج الكيميائي قبل جمع العينات.

معايير الإدراج لمرضى أمراض الثدي الحميدة: (1) آفات ثدي حميدة مؤكدة مرضيا. (2) بدون أي أورام خبيثة جهازية أخرى أو آفات ما قبل سرطانية. (3) غير حامل وغير مرضع. (4) لا توجد عدوى حادة شديدة أو مرض التهابي مزمن.

معايير الاستبعاد لمرضى سرطان الثدي وآفات الثدي الحميدة: (1) عدوى الثدي الشديدة أو مرض حاد حرج. (2) خلل شديد في وظائف الكبد أو الكلى، أو أمراض مناعة ذاتية. (3) المرضى الذين تلقوا العلاج الهرموني خلال 6 أشهر.

2. فحص دوبلر بالموجات فوق الصوتية

تم فحص ثدي المريضة الثنائي بشكل شامل في أربعة أرباع باستخدام الموجات فوق الصوتية دوبلر. تم استخدام المسح بالموجات فوق الصوتية ثنائية الأبعاد لتسجيل ميزات الآفة، بما في ذلك الحدود، الشكل، الصدى الداخلي، موجات الصدى الخلفية، ونسبة العرض إلى الارتفاع للآفة. تم تطبيق تصوير تدفق دوبلر اللون لتقييم معايير تدفق الدم للآفة، بما في ذلك مؤشر المقاومة (RI)، ومؤشر النبض (PI)، وأقصى سرعة تدفق دم (V_max). تم تصنيف إشارات تدفق الدم وفقا لنظام تصنيف تم الإبلاغ عنه سابقا¹⁸: الدرجة 0: لا يوجد إشارة تدفق دم؛ الدرجة الأولى: إشارة تدفق دم قليلة؛ الدرجة الثانية: طول إشارة تدفق الدم يتجاوز نصف قطر الآفة؛ الدرجة الثالثة: إشارة تدفق الدم الوفيرة.

3. تعريف إيجابي لتشخيص سرطان الثدي بالموجات فوق الصوتية

وشملت هذه الحدود (1) الحدود الغامضة؛ (2) الشكل غير المنتظم؛ (3) صدى داخلي غير متساو؛ (4) صدى خلفي ضعيف؛ (5) نسبة العرض إلى الارتفاع >1؛ (6) RI > 0.70؛ (7) المؤشر > 1.50؛ (8) أقصى معدل تدفق دم (Vmax)> 18.00 سم/ث؛ (9) إشارة تدفق الدم ≥ الدرجة الثانية. أي آفة تستوفي أيا من المعايير المشبوهة أعلاه تصنف كإيجابية للموجات فوق الصوتية، بينما تصنف تلك التي لا تحتوي على علامات مشبوهة على أنها سلبية بالموجات فوق الصوتية.

4. تفاعل بوليميراز الفلوري الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)

تم استخراج الميكرو الريبي البلازما باستخدام مجموعة استخراج الميكرو الريبي المتخصصة (miRNA). تم استخدام عينات RNA المستخرجة بنجاح لتخليق cDNA باستخدام مجموعات النسخ العكسي المتخصصة للmiRNA. شروط تفاعل النسخ العكسي ل miR-362-3p: كان الحجم الكلي لهذا التفاعل 20 ميكرولتر. كانت عملية تفاعل PCR كما يلي: (1) تم حضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، (2) تم تنفيذ تفاعل النسخ العكسي لمدة 50 دقيقة عند 42 درجة مئوية، (3) تم تعطيل الإنزيم لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. تم تخزين المنتج عند 4 درجات مئوية. شروط تفاعل qPCR: كان الحجم الكلي لنظام التفاعل 20 ميكرولتر. تم تنفيذ شروط التضخيم كما يلي: (1) تم تفكيك cDNA مسبقا، وتم تفعيل بوليميراز الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. (2) تمتد خيوط الحمض النووي بشكل متلدين وتمتد لمدة 30 ثانية عند 60 درجة مئوية. تم تنفيذ الخطوتين السابقتين لمدة 40 دورة إجمالا. تم حساب التعبير النسبي للجين بواسطة الصيغة 2^-(ΔΔCt). تم معايرة التعبير النسبي miR-362-3p بواسطة U6. ولتبرير استخدام U6 كعنصر تحكم داخلي، تم تقييم استقرار U6 باستخدام خوارزمية BestKeeper في مجموعة البلازما. كان معامل التباين (CV) لقيم U6 Ct عبر جميع العينات أقل من 2٪، مما يشير إلى استقرار تعبير عالي. لذلك، تم التحقق من صحة U6 واختياره كجين مرجعي لتطبيع تعبير miR-362-3p في هذه الدراسة. تم توفير تسلسل المراحل النهائية للبادئات بواسطة الطقم. كانت تسلسلات التمهيد كما يلي:

miR-362-3p: GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6: CTCGCTCGGCAGCACATATACT.

5. منحنى خاصية تشغيل المستقبل (ROC)

تم استخدام مؤشر يودن لتحديد القيمة القطعية المثلى ل miR-362-3p في تشخيص سرطان الثدي من خلال حساب قيم الحساسية والنوعية لمنحنى ROC. تم بناء النموذج التشخيصي المدمج باستخدام الانحدار اللوجستي الثنائي في SPSS، مع إدخال miR-362-3p وRI وPI كمتغيرات مستقلة. تم تضمين المتغيرات في طريقة Enter لتوليد القيمة الاحتمالية المتوقعة للتشخيص المجمع لكل مشارك. صيغة احتمالية التنبؤ (PRE): . تم رسم منحنيات ROC بناء على PRE. تم استخدام اختبار ديلونغ لمقارنة الفروقات في قيم المساحة تحت المنحنى (AUC) بين منحنيات ال ROC المختلفة.

6. تعريف معايير النتائج

كان المعامل الأساسي للنتيجة هو الفعالية التشخيصية العامة للنموذج المدمج للبلازما miR-362-3p ودوبلر الموجات فوق الصوتية لسرطان الثدي، مع التشخيص المرضي كمعيار ذهبي. شملت معايير النتائج الثانوية الأداء التشخيصي لجهاز دوبلر بالموجات فوق الصوتية وحده وmiR-362-3p في البلازما فقط.

7. إحصائيات البيانات

تم تحليل مستويات تعبير miR-362-3p ومنحنيات ROC في مجموعتي المرضى باستخدام برامج إحصائية ورسوم بيانية. تم استخدام اختبار t لمقارنة الفروق في المتغيرات المستمرة بين المجموعتين. تم تحليل اختبار كاي تربيع وطريقة الجدول الرباعي باستخدام SPSS 26.0. استخدم اختبار كاي-تربيع لتقييم الفروق الإحصائية للمتغيرات الفئوية؛ اعتبر التركيبة ذات المؤشرين (miR-362-3P + الموجات فوق الصوتية دوبلر) التحليل الأساسي، حيث تمثل استنتاجا تشخيصيا نوعيا روتينيا في الممارسة السريرية؛ إذا كانت هناك أي ميزات مشبوهة مشتقة من تصنيف نظام تقارير وبيانات تصوير الثدي (BI-RADS)، يتم تعريف الآفة على أنها إيجابية؛ تم استخدام طريقة الجدول الرباعي لحساب النوعية، والقيمة التنبؤية الإيجابية، والقيمة التنبؤية السلبية، ودقة التشخيص المشترك لدوبلر الموجات فوق الصوتية وmiR-362-3p. شملت نتائج التشخيص بين الموجات فوق الصوتية دوبلر وmiR-362-3p الإيجابية الحقيقية (أ)، والإيجابية الكاذبة (ب)، والسلبية الكاذبة (ج)، والسلبية الحقيقية (د). صيغة الحساب: الحساسية = a / (a + c); الخصوصية = d / (d + b); القيمة التنبؤية الإيجابية = a / (a + b); القيمة التنبؤية السلبية = d / (d + c); الدقة = (a + d) / (a + b + c + d). تم إجراء الطرق التشخيصية الثلاث (miR-362-3p، الموجات فوق الصوتية، والتشخيص المجمع) باستخدام اختبار بيرسون^{χ 2} لجداول الطوارئ في R×C. اعتبر P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تم انخفاض مستوى miR-362-3p بشكل ملحوظ لدى مرضى سرطان الثدي

تمت مقارنة المعلومات الأساسية السريرية والخصائص المرضية السريرية ل 182 مريضا بسرطان الثدي و147 مريضا لديهم آفات حميدة في الثدي. تم تلخيص البيانات التفصيلية في الجدول 1. تم استخدام RT-qPCR لقياس مستويات miR-362-3p في البلازما لدى مجموعتين من المرضى. أظهرت النتائج أن التعبير المتداول عن miR-362-3p لدى مرضى سرطان الثدي كان أقل بكثير من ذلك لدى مرضى أمراض الثدي الحميدة (

المناقشة

سرطان الثدي هو أحد أكثر أنواع الأورام الخبيثة شيوعا، وأصبح قضية صحية عامة رئيسية تهدد^{صحة الإنسان}. معدلات الإصابة والوفاة المرتفعة لا تسبب فقط صدمات نفسية شديدة لعائلات المرضى، بل تجلب أيضا عبئا هائلا على المجتمع والاقتصاد. معظم مرضى سرطان الثدي قد عانوا بالفعل من غزو موضعي أو انتشار بعيد وقت التشخيص^21,22. هذا يزيد بشكل كبير من صعوبة العلاج ويقلل من معدل البقاء على قيد الح...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	الولايات المتحدة الأمريكية	367861	لجمع الدم الوريدي وإعداد البلازما لتحليل miRNA.
نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي CFX96 Touch	Bio-Rad Laboratories	1855195	جهاز PCR 6 قنوات فوري للكمية الفلوريزية بسعة 96 بئرًا، يستخدم التوصيل بالليف البصري وتصوير CCD البارد، مع جمع التزامني للفلورسنت في كل بئر بدون تأخير. يمتد النطاق الديناميكي إلى 10 درجات من القدر، وهو متوافق مع كل من qPCR التقليدي وتحليل منحنى الانصهار عالي الدقة (HRM). يدعم البرنامج تصدير تنسيق RDML، وهو متوافق مع كل من الاختبارات البحثية والسريرية، ويستخدم بشكل شائع في تجارب مثل تقدير تعبير الجينات، وتحديد الأنماط الفردانية لـ SNP، وتحليل الميثيل.
أنابيب PCR Kirgen 0.1 مل (أو أنابيب PCR بـ 8 شرائط)، معقمة	شانغهاي، الصين	KG0811	يستخدم لتحضير إجراءات qPCR وتنفيذها.
أنابيب ميكروسنتريفوج Kirgen 1.5 مل، معقمة	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	يستخدم لتخزين العينات، وتحضير الكواشف، والطرد المركزي أثناء استخراج miRNA والترجمة العكسية.
مجموعة عزل miRNA miRcute (العمود الغزلاني)	بكين، الصين	DP501	لعزل وتنقية إجمالي RNA بما في ذلك miRNA من عينات البلازما البشرية، باستخدام تقنية مستندة إلى العمود الغزلاني.
مجموعة miRcute Plus miRNA للشفرة الأولى من cDNA	بكين، الصين	KR211	للترجمة العكسية لـ miRNA المنقى إلى الشفرة الأولى من cDNA عبر طريقة ذيل poly(A).
مجموعة miRcute Plus miRNA لـ qPCR (SYBR Green)	بكين، الصين	FP411	لاكتشاف PCR الكمي في الوقت الحقيقي لـ miRNA باستخدام الكيمياء المستندة إلى SYBR Green I.
لوحة لوحات Roche LightCycler 480 متعددة الآبار 96، بيضاء	مانهايم، ألمانيا	4729692001	يستخدم لتجارب PCR الكمي في الوقت الحقيقي على أداة Roche LightCycler 480.
مسبار Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP الخطي	Siemens Healthineers	10041226	مسبار صفوف خطي عالي التردد، بتردد يتراوح بين 5–14 ميغاهرتز، مصمم خصيصًا لفحص الأعضاء السطحية مثل الثدي والغدة الدرقية. يتميز بالدقة العالية وتباين الأنسجة الممتاز، ويدعم التصوير بالاستطالة والمسح الضوئي التلقائي لحجم الثدي.
نظام الموجات فوق الصوتية Siemens Acuson S2000/S3000/S1000	Siemens Healthineers	/	يدعم نظام تصوير الموجات فوق الصوتية بالألوان دوبلر في الوقت الحقيقي وظائف التصوير ثلاثي الأبعاد/رباعي الأبعاد والتصوير بالاستطالة، ويستخدم على نطاق واسع في عدة أقسام مثل البطن، والقلب والأوعية الدموية، وأمراض النساء والتوليد، والثدي.
الدورق الحراري Veriti 96-Well	Thermo Fisher Scientific	4375786	جهاز PCR تدرجي بـ 96 قناة، يدعم تحسين درجة الحرارة التدرجية؛ لديه دقة عالية في التحكم في درجة الحرارة؛ يستخدم لتخليق cDNA والتكبير التقليدي لـ PCR.