تطوير بروتوكول إعادة تشكيل حويصلات COPII خالية من الخلايا للتحقيق في فرز STING في نظام HEK-293 القائم على الخلايا

ملخص

يصف هذا البروتوكول نظاما محسنا خاليا من الخلايا لإعادة تشكيل دمج STING في حويصلات COPII، مما يتيح التحليل الكيميائي الحيوي المنظم لفرز البضائع أثناء تصدير ER.

الملخص

مسار cGAS–STING هو مكون مركزي في المناعة الفطرية. عند التفعيل، يتم تعبئة بروتين STING المقيم في الشبكة الإندوبلازمية (ER) داخل حويصلات COPII ونقلها إلى جهاز جولجي لبدء الإشارات في المراحل التالية. على الرغم من أهمية هذه العملية، لا تزال الآليات الجزيئية التي تحكم فرز STING إلى حويصلات COPII غير مفهومة بشكل كامل. هنا، يتم تقديم سير عمل محسن لإعادة تشكيل حويصلات COPII في المختبر ، لتسهيل التحليل المتحكم به لاختيار الحمولة. يتم وصف طريقة قابلة للتوسع لتحضير سيتوسول عالي التركيز (30–40 ملغ/مل) من خلايا تعليق HEK-293F، إلى جانب إجراء بسيط لتوليد خلايا HEK-293T شبه منفاذة كمصدر غشائي محدد. مقارنة بالأنظمة التقليدية المعتمدة على الخلايا الملتصقة، يحسن هذا النهج قابلية التوسع، ويقلل التكلفة، ويعزز قابلية التكرار. باستخدام STING كنموذج شحنة، يتم التحقق من تبرم حويصلات COPII ودمج البضائع بواسطة تحليل البقعة الغربية، بكفاءة تغليف أساسية تقارب 20٪ تحت ظروف محددة. يسمح هذا النظام بالتلاعب المنظم بالمعايير الكيميائية الحيوية، بما في ذلك تحفيز النيوكليوتيدات، لتقييم تأثيرها على دمج الحمولة. يوفر هذا البروتوكول منصة قوية وقابلة للتكيف للتحقيق في فرز البضائع التي يتوسط بها COPII ويمكن توسيعه لدراسة بروتينات عابرة للأغشية إضافية والعوامل التنظيمية المشاركة في تصدير ER.

المقدمة

يعمل مسار الإشارة cGAS-STING كآلية أساسية للجهاز المناعي الفطري، حيث يستشعر الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) السيتوسولي لبدء استجابة مضادة للفيروسات. عند اكتشاف dsDNA، ينتج إنزيم cGAS ثنائي النيوكليوتيد الدوري cGAMP، الذي يعمل كرسول ثان يرتبط ب STING ^1,2. والأهم من ذلك، أن STING يعيش كخبير غير نشط في الشبكة الإندوبلازمية (ER) تحت ظروف الحالة المستقرة³. يتطلب تفعيله انتقالا سريعا ومنظما للغاية من جهاز ER إلى جهاز جولجي. في جولجي يقوم STING بتجنيد وتنشيط الكينازات اللاحقة TBK1 وIRF3، مما يؤدي إلى إنتاج الإنترفيرونات من النوع الأول والسيتوكينات الالتهابية⁴.

يتم التوسط في نقل STING بواسطة الحويصلات المغطاة ب COPII، وهي الوسيلة العالمية لتصدير البروتين من ER⁵. تجميع طبقة COPII — التي تتكون من GTPase Sar1 الصغير، ومجمع Sec23/24 الداخلي للطبقة، ومجمع الطبقة الخارجية Sec13/31 — مسؤول عن تشوه غشاء ER إلى حوويصلات وتجنيد^{الشحنات 6,7} بشكل انتقائي. يتم فرز Sec22b إلى حويصلات COPII عبر حبات هيكلية معترف بها بواسطة مركب Sec23/24 من COPII⁸. تشمل الحمولة الأخرى عائلة p24 وعلامة ERGIC-53، وكلاهما يعتمد على نمط φC ثنائي الهيدروفوبيك في الطرف C لفرز⁹. على النقيض من ذلك، تبقى بعض البروتينات المرتبطة ب ER، مثل الريبوفورين I (RPN1)، محصورة في ER وتعمل كعلامات على بنى ER سليمة، لأنها لا تنتقل عبر حويصلات COPII¹⁰. وبالتالي، في تجارب إعادة تكوين حويصلات COPII الخالية من الخلية، غالبا ما يعتبر Sec22b و p24 حمولة COPII، بينما يعمل الريبوفورين كعلامة لمراقبة تلوث ER في تحضيرات الحويصل. بينما الآلية العامة لنقل COPII موصوفة جيدا، تظل الإشارات الجزيئية المحددة التي تحفز الاحتجاز الانتقائي لتقنية STING المنشطة في هذه الحويصلات بعيدة المنال. فهم آليات الفرز هذه أمر حيوي، حيث يرتبط اختلال تنظيم نقل STING بأمراض مناعية ذاتية والتهابية ذاتية مختلفة، مثل اعتلال الأوعية الدموية المرتبط بSTING مع بداية الطفولة (SAVI) ومتلازمة COPA¹¹. ومع ذلك، لا يزال دراسة هذه الأحداث العابرة والديناميكية للغاية في الخلايا السليمة تحديا تقنيا.

لمعالجة هذه التحديات، تم تطوير نظام إعادة تشكيل محسن خال من الخلايا لفحص المتطلبات الجزيئية لفرز البضائع بوساطة COPI. بينما كانت اختبارات التبرعم في المختبرات منذ زمن طويل عنصرا أساسيا في بيولوجيا الخلية¹²، فإن اعتمادها الواسع غالبا ما يكون محدودا بسبب التكلفة العالية والتعقيد لتحضير مكونات عالية الجودة. في هذه الدراسة، تم تقديم سير عمل مبسط يستخدم خلايا تعليق HEK-293F كمصدر اقتصادي لخلايا السيتوسول النشطة وخلايا HEK-293T شبه المنفاذة كمانح غشائي قوي. يتم توضيح سير العمل العام لنظام إعادة تشكيل حويصلات COPII الخالي من الخلايا في الشكل 1. في هذا النظام، استخدم Sec22b كتحكم إيجابي لتأكيد دمج الحمولة في الحويصلات، بينما استخدم RPN1 كتحكم سلبي لمراقبة واستبعاد تلوث أغشية ER. باستخدام STING كحمولة إثبات المفهوم، أظهرت هذه الدراسة أن النظام يمثل بفعالية الجوانب الكيميائية الحيوية الأساسية لفرز STING. وفرت هذه المنصة أداة متعددة الاستخدامات وقابلة للتوسع لتحديد العوامل السيتوسولية وإشارات الغشاء التي تحكم فرز STING، مع تطبيقات محتملة لدراسة مجموعة واسعة من مسارات النقل الحويصلي الأخرى.

البروتوكول

تم الحصول على خطوط الخلايا HEK-293F (RRID: CVCL_6642) وHEK-293T (RRID: CVCL_0063) من مركز موارد الخلايا في كلية بكين الطبية المتحدة. تم التحقق من صحة كلا الخطين الخلويتين من خلال تحليل التكرار القصير (STR) وتأكد أنهما خاليان من تلوث الميكوبلازما. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

لم يشارك أي من البشر أو الحيوانات الفقارية في هذه الدراسة. لذلك، لم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقية. تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.

1. تحضير سيتوسول خلية HEK-293F

1. بذور خلايا HEK-293F بكثافة 1 × 10⁶ خلايا/مل في وسط زراعة ثدييات محدد بحجم 100 مل مع مكمل بنسبة 1٪ بنسلين–ستريبتومايسين. زرع الخلايا في قارورة مخروطية بحجم 500 مل.
2. حضن زراعة التعليق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة هز لمدة 60 ساعة.
3. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. حدد الرقم الكلي للخلية باستخدام عداد خلوي آلي.
4. اغسل حبيبات الخلية بمحلول ملحي بارد بسعة 50 مل من المحلول البارد البارد بالفوسفات (PBS). الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. أعد تعليق حبيبة الخلية في حجم متساو من عازل B88 البارد جدا (20 ملليموتر HEPES، درجة الحموضة 7.3؛ 250 ملليمولار سوربيتول؛ 150 ملليمولار أسيتات البوتاسيوم؛ 5 ملليمولار أسيتات المغنيسيوم).
6. قم بتحليل الخلايا على الجليد عن طريق تمرير التعليق عبر حقنة 5 مل مزودة بإبرة قياس 22 لأكثر من 100 ضربة.
7. افحص تحلل الخلايا بواسطة المجهر الضوئي. إزالة حطام الخلايا بالطرد المركزي عند 20,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. انقل المادة الفائقة إلى أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق. الطرد المركزي عند 100,000 × جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
   تحذير: تأكد من توازن أنابيب الطرد المركزي الفائق بشكل صحيح لمنع تلف المعدات ومخاطر السلامة.
9. اجمع السوبرناتانت الواضح. تركيز العينة باستخدام جهاز الترشيح الفائق بوزن جزيئي بقدرة 3 كيلو دالتون (MWCO) عند 4000 × جرام عند 4 درجات مئوية.
10. قس تركيز البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينكونينيك (BCA). اضبط التركيز إلى 30–40 ملغ/مل.
    تحذير: تعامل مع النيتروجين السائل باستخدام معدات الحماية المناسبة لتجنب الإصابة المبردة.
11. عليكوت السيتوسول. قم بتجميد الأليكوات في النيتروجين السائل وتخزينه عند −80 درجة مئوية (الشكل 2A)
    تحذير: تجنب أكثر من دورتين من التجميد-الذوبان. تخزين السعرات عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. تحضير خلايا HEK-293T شبه المنفاذة

1. خلايا HEK-293T الصفائح التي تعبر عن STING بشري كامل الطول بكثافة 3 × 10^و6 خلايا لكل طبق بطول 15 سم في 15 مل DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين. الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
2. احصد الخلايا عند تقارب 60٪ تقريبا.
3. استنشق الوسط واغسل الخلايا مرتين بزيت 10 مل من PBS مثلج.
4. أضف 2 مل من 0.25٪ تريبسين–EDTA. حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 2–3 دقائق لفصل الخلايا.
5. أضف 200 ميكرولتر من مثبط تربسين فول الصويا (1 ملغ/مل) لإيقاف التريبسين. أعد تعليق الخلايا في مخزن KHM بارد بحجم 10 مل (20 ملليموتر HEPES، رقم الهيدروجيني 7.2؛ 110 ملليمولار أسيتات البوتاسيوم؛ 2 ملليمول أسيتات المغنيسيوم).
6. قم بإزالة الخلايا بالطرد المركزي بحرارة 250 × جرام لمدة 3 دقائق. تخلص من السوبرناتانت.
   تحذير: ديجيتونين سام. أمسك بغطاء بخار مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
7. أعد تعليق الخلايا في مخزن KHM بارد بحجم 6 مل. أضف محلول ديجيتونين بسعة 6 ميكرولتر (40 ملغ/مل في DMSO).
8. اخلط بلطف عن طريق الانقلاب. حضن الزراعة على الثلج لمدة 5 دقائق.
9. أضف 8 مل من مخزن KHM لتخفيف الديجتونين. الطرد المركزي عند 250 × جرام لمدة 3 دقائق لجمع الخلايا المنفاذة.
10. أعد تعليق الحبيبة في 14 مل من محلول HEPES البارد المثلج (50 ملليموتر HEPES، رقم الهيدروجيني 7.3؛ 90 ملمومول أسيتات البوتاسيوم). احتضن الزراعة على الثلج لمدة 10 دقائق.
11. الطرد المركزي عند 250 × جرام لمدة 3 دقائق. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل بارد كالجليد KHM· مخزن Cl (20 مللي مولار HEPES، درجة حموضة 7.3؛ 110 مللي مولار KCl؛ 2 مللي مولار MgCl₂).
12. الطرد المركزي عند 10,000 × جرام لمدة 15 ثانية. تخلص من السوبرناتانت.
13. أعد تعليق الرصاصة في 50 ميكرولتر KHM· مخزن Cl. قس تركيز البروتين باستخدام اختبار BCA واضبط إلى 5–7 ملغ/مل.

3. تجربة إعادة تشكيل حويصلات COPII خالية من الخلايا

1. جهز جميع المواد المذكورة في جدول المواد. عليكوت وخزن عند −80 درجة مئوية.
2. حضر خليط تفاعل بسعة 50 ميكرولتر يحتوي على 110 مللي مولار KCl و20 مللي مولار HEPES (pH 7.2)، و2 ملليمولار MgCl₂، وكوكتيل مثبط للبروتياز (1×)، و0.2 مللي مولار GTP، ونظام تجديد ATP (40 ملليمول كرياتين فوسفات، 0.2 ملغ/ملليتر كرياتين فوسفوكيناز، 1 ملليمول ATP).
3. أضف cGAMP إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر. حضن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. أضف 50 ميكروغرام خلية HEK-293T شبه منفاذة. اخلط بلطف.
5. أضف 80 ميكروغرام من HEK-293F سيتوسول لبدء تكوين الحويصلات. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
6. ضع التفاعل على الثلج لإنهاء البرعم. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
7. اجمع المادة الفائقة التي تحتوي على الحويصلات. احتفظ بالحبيبات التي تحتوي على العضيات.
8. تقوم بالطرد المركزي فوق الطرد المركزي على حرارة 100,000 جرام × لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبة الحويصلة في مخزن تحميل البروتين بسعة 30 ميكرولتر.
9. خذ عينات حرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي عند 20,000 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الرواسب.
10. قم بإجراء SDS-PAGE ونقل البروتينات إلى أغشية PVDF. افحص باستخدام الأجسام المضادة ضد Sec22b وSTING وRPN1.

النتائج

أثناء تحضير سيتوسول خلية HEK-293F، تم تقييم معلمين لتقييم جودة السيتوسول. تم زراعة خلايا HEK-293F بكثافة عالية، مما أنتج مستخلصات سيتوسولية بتركيزات عالية من البروتين. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم مدى اضطراب الخلايا بعد التحلل القائم على الحقنة بواسطة المجهر الضوئي، مما أكد فعالية تحلل الخلايا في الظروف المطبقة (الشكل 2B).

لتوليد خلايا HEK-293T شبه المنفاذة، تم جمع المزارع عند تقارب يقارب 60٪. في هذه المرحلة، بدت العضيات داخل الخلية...

المناقشة

لقد وضع إعادة تشكيل التفاعلات الكيميائية الحيوية الأساسية في المختبر الأساس لأنظمة خالية من الخلايا، والتي كانت أساسية في العديد من الاكتشافات التاريخية. تشمل هذه الاكتشافات تحديد cGAS كحساس حمض نووي سيتوسولي^14,15، وتوضيح دور السيتوكروم ج في الاستماتة المبرمجة، واكتشاف أول ديميثيل هيستوني، JHDM1^16,17. تعد هذه الأساليب الكيميائية الحيوية المحددة قوية بشكل خاص في ت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محاقن معقمة بسعة 5 مل	ويغو	V526273	يستخدم في تحليل الخلايا الميكانيكية
أدينوسين 5&برايم;-ثلاثي الفوسفات (ATP)	MCE	HY-B2176	مخزون 100 ملليمول من الماء، درجة حموضة 7.3، مخزن عند &-ناقص؛ 80 & درجة؛ C
أدوبي إليستريتور	شركة أدوبي سيستمز إنكوربوريتد	SCR_010279	يستخدم لإنشاء الرسوم التوضيحية المفاهيمية والمخططات التخطيطية
نظام تجديد ATP (10×)	—	—	خليط يجدد الطاقة يحتوي على الكرياتين فوسفات، وإنزيم الكرياتين، وATP
مجموعة اختبار بروتين BCA	ثيرمو فيشر	23227	اختبار البروتين اللوني
بيورياندر	بيورياندر	SCR_018361	يستخدم لإنشاء الرسوم التوضيحية المفاهيمية والمخططات التخطيطية
BSA	الأصل المختلط	BN20815	مادة الكاشف الحاجب
حاضنة اهتزاز ثاني أكسيد الكربون	تشي تشو	ZCZY-CS8	يحافظ على درجة الحرارة، وثاني أكسيد الكربون<تحت >2، وتحريك لزراعة التعليق
حاضنة CO2	ثيرمو فيشر	3110	يحافظ على درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون<تحت >2 لزراعة الصبغة
المجهر التقليدي	أوليمبوس	CX43	يستخدم لتقييم تحلل الخلية والشكل الشكلي
كيناز الكرياتين	روش	CKRO	مخزون 20 ملغ/مل في مخزن مؤقت، مخزن عند &-ناقص؛ 80 & درجة؛ C
فوسفات الكرياتين	روش	CRPHO-RO	مكون من نظام تجديد ATP
الطرد المركزي المكتبي	إبندورف	5810R	يستخدم في الطرد المركزي منخفض السرعة
ديجيتونين	سيغما	D5628	مخزون 40 ملغ/مل في DMSO، مخزن عند &ناقص؛ 20 ودرجة مئوية؛ C
DMEM	كورنينغ	10-013-CMR	وسط نمو خلايا HEK-293T
دي-سوربيتول	سانغون	A100691	محلول مخزون بسعة 1 متر في الماء، مخزن عند 4 &غر؛ C
كاشف كشف ECL	الأصل المختلط	BN16009	ركيزة كيميائية مضيئة
خزان الرحلان الكهربائي	بيو-راد	1658001	جهاز SDS-PAGE
مصل البقر الجنيني (FBS)	كورنينغ	35-015-CV	مكمل المصل
الدوار ذو الزاوية الثابتة (TFT 80.2)	ثيرمو فيشر	54456	الدوار للطرد المركزي الفائق
خلايا فريستايل 293-F	ثيرمو فيشر	R79007	يستخدم في تحضير السيتوسول
مضاد الفأر للماعز IgG (H+L)	إنفيتروجين	31430	الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع HRP
IgG مضاد للأرانب من الماعز (H+L)	إنفيتروجين	31460	الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع HRP
منشور جراف باد	برنامج جراف باد	SCR_002798	يستخدم لإجراء التحليل الإحصائي (تحليل التحليل السطحي أحادي الاتجاه) وتوليد الرسم البياني الشريطي الكمي في الشكل 4D.
جوانوزين 5&برايم;-ثلاثي الفوسفات (GTP)	MCE	HY-113225	مخزون 10 مللي مولار من المياه، pH 7.3، مخزن عند &-ناقص؛ 80 & درجة؛ C
خلايا HEK-293T التي تعبر عن اللدغة البشرية	—	—	تم إنشاؤه داخليا؛ يستخدم كمصدر غشاء
مخزن HEPES (1 M، pH 7.3)	بيوتايم	C0215	مكون المخزن لتحضير المحلول
نظام التصوير	بيو-راد	12003153	يستخدم لاكتشاف الإشارة
أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدرات	أبحاث هامبتون	HR2-561	مكون المخزن المؤقت لتحضير B88
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم	أبحاث هامبتون	HR2-559	مكون المخزن المؤقت
الطرد المركزي الدقيق	إبندورف	5420R	يستخدم في الطرد المركزي متوسط السرعة
الطرد المركزي الدقيق	إبندورف	5420	يستخدم للطرد المركزي الروتيني
مطياف الفوتومتر النانودروبي	ثيرمو فيشر	840-317400	يستخدم في قياس كمية البروتين
OPM-CD Trans293 متوسط	OPM	P82019	وسط خال من المصل لزراعة تعليق HEK-293F
البنسلين – ستربتوميسين (100 مرة؛)	سيرفيسبيو	G4003	مكمل مضاد حيوي لزراعة الخلايا
فلوريد الفينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)	سانغون	A610425	مثبط البروتيز
مثبطات الفوسفاتاز	اللابليد	C0104	منع إزالة الفسفرة البروتينية
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	سيرفيسبيو	G4202	المخزن لغسل الخلايا
أسيتات البوتاسيوم	سيغما	236497	محلول مخزون بسعة 1 متر في الماء، مخزن عند 4 &غر؛ C
مصدر الطاقة	بيو-راد	1645052	يوفر جهدا للرحلان الكهربائي
كوكتيل مثبط البروتياز خال من EDTA	روش	4693132001	خليط مثبط البروتيز واسع الطيف
غشاء PVDF	ميليبور	ISEQ00010	الغشاء للطلاء الغربي
الأجسام المضادة RPN1 (mAb الأرنب)	أبكام	ab197888	علامة الطوارئ
جل SDS-PAGE (4– 20%)	—	—	يستخدم لفصل البروتينات
مخزن تحميل SDS-PAGE (5×)	سولاربيولوجيا	P1040	مخزن تحضير عينات البروتين
الأجسام المضادة Sec22b (mAb الأرنب)	أبكام	ab181076	علامة الشحن COPII
مثبط التربسين الصويا (SBTI)	سيغما	T9128	مخزون 1 ملغ/مل في PBS، مخزن عند &-ناقص؛ 20 ودرجة مئوية؛ C
الأجسام المضادة STING (mAb الأرنب)	CST	13647	الجسم المضاد الأولي
مخزن TBST	سيرفيسبيو	G0004	غسل المخزن لإزالة القطع المناعية
دورة حرارية	بيو-راد	186-1096	يستخدم في التدفئة والحضانة
حمام معدني حراري	DLAB	5062102100	يحافظ على درجة حرارة ثابتة
خلية النقل	بيو-راد	1703930	يستخدم لنقل البروتين
تريبسين-إيدتا (0.25٪)	سيرفيسبيو	G4011	يستخدم في فصل الخلايا
الطرد المركزي فوق الفائق	ثيرمو فيشر	75000100	يستخدم في الطرد المركزي عالي السرعة
أنابيب الطرد المركزي الفائق (2 مل)	ثيرمو فيشر	54460	أنابيب متوافقة مع الطرد المركزي الفائق
أنبوب الترشيح الفائق (4 مل، 10 كيلو دالتون MWCO)	ميليبور	UFC8010	يستخدم لتركيز السيتوسول