مقالة منهجية

اختبار حماية الأميكاسين لقياس وتصور غزو خلايا الإشريكية القولونية

331 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71108

⸱

يوليو 3, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

مقاومة المضادات الحيوية بين سلالات الإشريكية القولونية الغازية الملحقة تشكل تحديات لتقييم الغزو البكتيري باستخدام اختبار الحماية التقليدي للجنتامسين. تم وصف طريقة محسنة لتقييم الغزو البكتيري كميا من خلال تعداد وحدات تكوين المستعمرات ونوعيا من خلال تصور الخلايا المصابة باستخدام المجهر الكونفوكالي المناعي الفلوري.

الملخص

غزو الخلايا الظهارية هو نمط ظاهري رئيسي للعديد من مسببات الأمراض المعوية، بما في ذلك السالمونيلا، الشجيلا، والفيبريو. مسببة أمراض غازية ناشئة هي الإشريكية القولونية الغازية اللاصقة (AIEC)، والتي ترتبط بمسببات مرض الأمعاء الالتهابية (IBD). تفتقر سلالات AIEC إلى عوامل الضراوة المرتبطة عادة بمسببات الأمراض الغازية الأخرى، مما يجعل التعرف الجيني أمرا صعبا. ونتيجة لذلك، يتم تصنيف سلالات AIEC بناء على قدرتها على غزو الخلايا الظهارية باستخدام اختبار حماية جنتاميسين الميداني. ومع ذلك، وبما أن سلالات AIEC غالبا ما تعزل من مرضى التهاب الأمعاء الالتهابي الذين يتلقون مضادات حيوية مختلفة كجزء من نظام علاجهم، فإن انتشار العزلات المقاومة للجنتاميسين جعل هذا الاختبار أقل موثوقية في تصنيف AIEC. لتجاوز هذه المشكلة، تم تطوير اختبار حماية بديل قائم على الأميكاسين لقياس وتصوير غزو خلايا AIEC. يستخدم هذا الاختبار الأميكاسين، وهو أمينوجليكوسيد شبه صناعي واسع الطيف يستهدف بفعالية السلالات المقاومة للأمينوجليكوسيدات الأخرى مع بقائها خارج الخلية لخلايا حقيقية النواة. وبالتالي، تقتل البكتيريا خارج الخلية أثناء العدوى بينما تكون البكتيريا داخل الخلية "محمية". يشكل هذا أساس اختبار كمي لمقارنة الغزو الناتج عن السلالات، ويقاس كنسبة مئوية الإصابة باستخدام وحدات تكوين المستعمرات (CFU) التي تم استعادتها بعد العدوى. يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار كمقياس نوعي للغزو عن طريق صبغ الخلايا الظهارية المصابة ومشاهدتها من خلال المجهر الكونفوكلي. تعمل هذه الطريقة كأداة تشخيصية لفحص مرضى التهاب الأمعاء الالتهابي للكشف عن AIEC، ويمكن تطبيقها أيضا على مسببات أمراض مقاومة للأدوية المتعددة لتقييم غزو الخلايا، وهو مؤشر على الضراوة والمرضية.

المقدمة

مرض الأمعاء الالتهابي (IBD)، الذي يشمل مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي، هو حالة التهابية مزمنة في الجهاز الهضمي تؤثر على ملايين الأشخاص حول العالم1. على الرغم من ارتفاع معدل الإصابة بمرض التهاب الأمعاء على مستوى العالم، إلا أن سببها الدقيق لا يزال غير واضح، بسبب التداخل المعقد بين العوامل الجينية والبيئية والميكروبية والمناعية 2,3. من السمات المميزة لمرض التهاب الأمعاء الالتهابي هي التركيب الميكروبي الميكروبي المعدل التغير في الأمعاء، والذي غالبا ما يكون مدفوعا بعوامل بيئية، مثل النظام الغذائي عالي السكر والدهون الشائعفي الدول الصناعية. غالبا ما تتميز الميكروبيوميات لدى مرضى التهاب الأمعاء بانخفاض التنوع الميكروبي، وتثريب بكتيريا جامابروتيوبكتيا الممرضة، ونقص فيرميكيوتس الواقية 6,7. في مرضى الأقراص المدمرة، يتم إثراء الإشريكية القولونية (E. coli) بميكروبيوم الأمعاء، وترتبط وتغزو الغشاء المخاطي في الأمعاء، وترتبط إيجابيا بمرض نشط وشديد8,9. هذا النمط المرضي الناشئ للإشريكية القولونية المرتبط ب CD يسمى الإشريكية القولونية الغازية الملتصقة (AIEC).

AIEC هي مسببات ممرضة انتهازية سالبة الجرام تستعمر الغشاء المخاطي اللفائفي لدى مرضى الأقراص المدمجة بمعدل أكبر من الأشخاص السليمين10. سلالات AIEC المعزولة من مرضى الأقراص المدمجة متنوعة جينيا، وغالبا ما تغطي جميع مجموعات الإشريكية القولونية التي تشمل الإشريكية القولونية11 الممرضة والممرضة. على عكس مسببات الأمراض مثل شيجيلا والسالمونيلا، التي تعتمد على استخدام أنظمة إفراز النوع الثالث لتسهيل غزو خلايا المضيف، تفتقر AIEC إلى هذه الأنظمة المحفوظة للضراوة12. لذلك، يعتمد فهمنا لضراوة AIEC إلى حد كبير على نمطا ظاهريا في المختبر، والذي يتميز بقدرته على الالتصاق بالخلايا الطهارية وغزوها والبقاء ضمن البلاعم10.

يتم غزو الخلايا الظهارية بواسطة AIEC بواسطة عوامل ضراوة متعددة، بما في ذلك الفيلوس من النوع الأول والفيمبريا القطبية الطويلة. يقع FimH عند طرف البيلوس من النوع الأول، ويتوسط الالتصاق ببقايا المانوز على مستقبل المضيف الشديد الجليكوزيل CEACAM613. هذا الارتباط يعزز دخول AIEC إلى الخلايا المعوية ويدعم تضاعفه داخل الخلية14. يلتزم AIEC أيضا بخلايا الميكروفولد (M)، وهي خلايا ظهارية متخصصة تقع فوق رقع باير من خلال التفاعلات بين الفيمبريا القطبية الطويلة وبروتين سطح الخلية M الجليكوبروتين 215,16. تمكن هذه الالتصاقات AIEC من الانتقال عبر الخلايا الM، والوصول إلى البلعم الأساسية، وتحفيز التعبير عن السيتوكينات الالتهابية مثل TNF-α، التي لا تعزز الالتهاب فحسب، بل تدعم أيضا تكاثر البكتيريا داخل البلاعم 17,18. يفترض أن هذه الآليات الممرضة تدوم الالتهاب المزمن في العائل، كما لوحظ في CD.

تعرف AIEC بنمط ظاهري في المختبر ، مما يجعل اختبار حماية الجنتاميسين ضروريا لتصنيف السلالات واكتشاف عوامل الضراوة8. يمكن أن يتعقد هذا النهج بسبب العزلات المقاومة للجنتاميسين، مما قد يؤدي إلى تصنيفها بشكل خاطئ كغازي11. لتجاوز هذه المشكلة، تم اختبار مضادات حيوية بديلة تقتل العزلات المقاومة للجنتاميسين دون اختراق أغشية خلايا المضيف. من خلال هذا النهج، تم تحديد الأميكاسين كبديل مناسب للجنتاميسين، مقدما فعالية مماثلة وتوافقا مع اختبارات الغزو القياسية، بالإضافة إلى سمية خلوية منخفضة، كما أظهر التلوين الأزرق التريبان في دراسات سابقة وتم التحقق منه هنا باستخدام اختبار إطلاق إنزيم اللاكتات للهيدروجيناز (الشكل التكميلي 1)11. الأميكاسين هو أمينوجليكوزيد شبه صناعي مشتق من الكاناميسين يثبط نمو البكتيريا عن طريق تعطيل تخليق البروتين.19. الأميكاسين فعال بشكل خاص ضد البكتيريا سالبة الجرام المقاومة للأدوية المتعددة، بما في ذلك أنواع Pseudomonas، Acinetobacter، والإشريكية 19. ومن الجدير بالذكر أن التعديلات الهيكلية على عمود كانامايسين الفقري تجعل الأميكاسين أقل عرضة للإنزيمات المعطلة للبكتيريا الأمينوجليكوزيدات19. وبالتالي، يمثل الأميكاسين بديلا قويا للجنتامسين لاستهداف البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة في اختبارات الغزو. تصف البروتوكولات التالية كيفية تقييم النمط الظاهري للغزو للإشريكية القولونية باستخدام كل من السلالة المرجعية NRG857c والعزلات السريرية باستخدام اختبار حماية الأميكاسين.

البروتوكول

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول طريقة لتقييم قدرة غزو سلالات AIEC إلى خلايا كاكو-2 الظهارية. تركيز الأميكاسين المستخدم في هذا البروتوكول (240 ميكروغرام/مل) يعادل 10× الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC)، كما تم تحديده باستخدام شرائط اختبار الأميكاسين MIC عبر لوحة تضم 32 عزلة سريرية ممثلة ل AIEC من 13 مريضا مصابا بمرض الأمعاء الالتهابي11. يجب على الباحثين تحديد MIC لعزلات AIEC الخاصة بهم قبل إجراء الفحص (انظر جدول المواد)، حيث يمكن أن تختلف حساسية المضادات الحيوية بين العزلات. يوضح القسم 1 اختبار حماية الأميكاسين لقياس نسبة الغزو، ويصف القسم 2 اختبار حماية الأميكاسين للمجهر الكونفوكلي.

1. اختبار حماية الأميكاسين لقياس نسبة الغزو المئوية

  1. طلاء الكولاجين لألواح 24 بئر
    1. قم بتخفيف 35.29 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي المعقم (انظر جدول المواد) في 30 مل من 1× PBS (انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل.
    2. 300 ميكرولتر من الكولاجين (انظر جدول المواد) في محلول 1× PBS مع محلول حمض الخليك.
    3. محلول Vortex لعشر ثوان لخلط جيدا.
    4. قم بتوزيع 250 ميكرولتر من محلول الكولاجين المخفف في كل بئر من صفيحة معقمة بزراعة أنسجة معالجة ب 24 بئرا.
      ملاحظة: محلول الكولاجين بسعة 30 مل يكفي لتغطية حوالي خمسة صفائح بسعة 24 بئرا.
    5. قم بإمالة اللوحة في جميع الاتجاهات لضمان أن المحلول غطى قاع كل بئر بشكل متساو.
    6. حضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للكولاجين بالالتصاق بالسطح البلاستيكي.
    7. بعد الانتهاء من الحضانة، استنشق محلول الكولاجين من كل بئر.
    8. أدخل 1 مل من 1× PBS في كل بئر لغسل الكولاجين المتبقي وسحب كل بئر. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين (ثلاث غسولات إجمالا).
    9. ضع ألواح جافة داخل خزانة أمان بيولوجية لضمان تبخر كل الرطوبة المرئية.
      ملاحظة: يمكن استخدام الألواح فورا لزراعة الخلايا أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة. عند تخزين اللوحات، أغلق المحيط الخارجي بغشاف باراميل معقم أو ضعها داخل كيس زيبلوك معقم.

  1. تحضير محاليل مخزون الأميكاسين
    1. يزن 240 ملغ من ثنائي كبريتات الأميكاسين (انظر جدول المواد) وينقل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    2. تأخذ 1 مل من الماء المعقم وتذيب الأميكاسين عن طريق الدوامة، مما ينتج تركيزا نهائيا يبلغ 240 ملغ/مل (1000× مخزون).
    3. اصنع 20 ميكرولتر من محلول الأميكاسين وخزنها عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يبقى الأميكاسين مستقرا عند -20 درجة مئوية لمدة 6–12 شهرا. جهز أليكوات للاستخدام الواحد لتقليل تكرار دورات التجميد والذوبان.
  2. تحضير خلايا كاكو-2
    1. إذابة خلايا كاكو-2 من المخزون المجمد
      1. تحضير وسط نمو كامل عن طريق إضافة وسط النسر المعدل من Dulbecco عالي الجلوكوز (DMEM، انظر جدول المواد) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS، انظر جدول المواد) و1٪ محلول مضاد حيوي-مضاد للفطريات (انظر جدول المواد).
      2. قم بتدفئة الوسط مسبقا في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      3. ضع القارورة المجمدة من خلايا Caco-2 في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وحضن الخلايا لمدة 1–2 دقيقة حتى تذوب الخلايا بالكامل.
      4. أخرج القارورة من حمام الماء ورش الجزء الخارجي منها بنسبة 70٪ إيثانول.
      5. داخل خزانة أمان بيولوجية، قم بتوصيل الخلايا إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 9 مل من وسط النمو الكامل.
      6. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في 5 مل من وسط النمو الكامل.
      8. نقل الخلايا إلى قارورة زراعة أنسجة بحجم 75 سم2 (T75) تحتوي على 10 مل من وسط نمو دافئ كامل.
      9. لف اللوحة ثلاث مرات لضمان توزيع الخلايا بشكل متساو عبر أسفل اللوحة.
      10. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصل الخلايا إلى ~90٪ من التقاء (6–7 أيام).
        ملاحظة: يتم تقدير التقاء الخلايا من خلال تقريب التصوير باستخدام المجهر الضوئي. استبدل الوسائط كل 3 أيام أثناء تعافي الخلايا.
    2. زرع خلايا Caco-2
      1. وسط نمو كامل قبل التدفئة و0.25٪ (مع الجهد الذهبي) تريبسين-إيدتا (انظر جدول المواد) في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
      2. بمجرد وصول خلايا Caco-2 إلى ~90٪ من التلاقط، استنشق وسط زراعة الخلايا وأضف 2 مل من تريبسين-EDTA. قم بإمالة القارورة للسماح لمحلول التربسين بتغطية السطح السفلي بالكامل للقارورة لضمان تعطيل جميع آثار FBS.
      3. استنشق محلول تريبسين-إيدتا وأضف 3 مل من تريبسين-إيدتا. حضن الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 5 –15 دقيقة. تخيل الخلايا باستخدام المجهر الضوئي في نقاط زمنية مختلفة خلال فترة الحضانة لملاحظة تدبير الخلية، مما يشير إلى انفصال الخلايا.
        ملاحظة: تجنب الاصطدام بجانب القارورة لتسهيل انفصال الخلايا لأن ذلك قد يسبب تكتلا للخلايا.
      4. قم بعمل 6 مل من وسط النمو الكامل لتعطيل محلول التربسين-إيدتا وخلطه عن طريق التوصيل بلطف لأعلى وأسفل لإعادة تعليق الخلايا.
      5. يتم تحويل الخلايا إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق إلى خلايا الحبيبات.
      6. استنشاق وسط وأعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط النمو الكامل.
      7. نقل 10 ميكرولتر من خلايا Caco-2 المعلقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل. أضف 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء (انظر جدول المواد) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل وامزج عدة مرات عن طريق التوصيل بأنابيب الأعلى والأسفل لأعلى ولأسفل.
      8. مطبعة 10 ميكرولتر من خليط كاكو-2/تريبان الأزرق إلى شريحة عداد الخلية (انظر جدول المواد). عدد عدد الخلايا الحية لحساب مدى بقاء الخلايا.
        ملاحظة: عند تعداد عدد خلايا Caco-2 الموجودة، يجب فقط النظر في عدد الخلايا الحية، وليس العدد الإجمالي للبذر.
      9. خليا بذور Caco-2 في صفيحة ب 24 بئر أو قارورة T75.
      10. لصفيحة ب 24 بئرا، اتبع الخطوات التالية:
        1. يتم زرع خلايا Caco-2 بتركيز 1 × 105 خلايا/مل باستخدام المعادلة أدناه:
          [(1 × 105 خلايا)(عدد الآبار التي تزرع + 2)] / [تركيز عدد الخلايا القابل للحياة (الخلايا/مل)] = الخلايا (مل)
        2. قم بإزالة حجم الخلايا المحسوبة أعلاه من خلايا Caco-2 المعلقة في الخطوة 3.2.6 إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. احسب حجم وسط النمو الكامل الذي يمكن إضافته إلى الخلايا باستخدام المعادلة أدناه:
          (عدد الآبار التي تزرع + 2 بئر) - الخلايا (مل) = الوسط (مل)
          ملاحظة: "+2 آبار" في الحساب تهدف إلى أخذ خطأ في التوصيل بالماصات في الاعتبار.
        3. تقوم ببيبت حجم الوسط المحسوب أعلاه إلى مخروط 15 مل يحتوي على خلايا Caco-2 وتخلط عن طريق التوصيل صعودا وهبوطا عدة مرات.
        4. بيبت 1 مل من خلايا Caco-2 في وسط نمو كامل (تركيز نهائي 1 ×10 5 خلايا/مل) في كل بئر من صفيحة 24 بئر مغطاة بالكولاجين.
        5. حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصل الخلايا إلى ~90٪ من التقاء (3–4 أيام).
      11. للحصول على قارورة T75، اتبع الخطوات أدناه:
        1. نقل 7.5 ×10 5 خلايا صالحة إلى قارورة T75 باستخدام المعادلة التالية:
          [(7.5 × 105 خلايا)] / [تركيز عدد الخلايا القابل للحياة (خلايا/مل)] = الخلايا (مل)
          ملاحظة: تم تحديد عدد الخلايا الحية التي يجب إضافتها إلى قارورة T75 بناء على إرشادات ATCC لزراعة خلايا Caco-2.
        2. أزل حجم الخلايا المحسوبة أعلاه وانتقل إلى قارورة T75. احسب حجم وسط النمو الكامل الذي يمكن إضافته إلى الخلايا باستخدام المعادلة أدناه:
          15 مل - حجم الخلايا المضافة إلى القارورة = الوسائط (mL)
        3. بيبت حجم الوسائط المحسوبة أعلاه إلى قارورة T75.
        4. حرك الطبق بلطف عدة مرات لتوزع الخلايا بشكل متساو عبر قاع القارورة. حضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونحتى تصل الخلايا إلى ~90٪ من التقاء (3–4 أيام).
  3. اختبار حماية الأميكاسين
    ملاحظة: تأكد من أن جميع وسائط زراعة الخلايا قد تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل بدء التجربة.
    1. تحضير البكتيريا
      1. باستخدام عصا خشبية معقمة أو رأس ماصة معقمة، قم بكشط البكتيريا بلطف من مخزون الجلسرول البكتيري المجمد المخزن عند -80 درجة مئوية وترك خيطا على لوحة أجار LB للمستعمرات الفردية. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      2. باستخدام عصا خشبية معقمة أو رأس ماصة معقمة، التقط مستعمرة واحدة من صفيحة الأجار وتلقح في 3 مل من مرق LB. حضن الزراعة عند 37 درجة مئوية مع هز عند 200 دورة في الدقيقة طوال الليل.
      3. قم بتخفيف بنسبة 1:10 للزراعة الليلية في مرق 1 مل رطل وقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) من الثقافة باستخدام مقياس طياف.
    2. حساب تعددية العدوى (MOI)
      1. انقل 100 ميكرولتر من الزراعة الليلية إلى أنبوب وطرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي بحرارة 6000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      2. استنشق المادة الفائقة بحذر حتى لا تزعج الحبيبات الداخلية. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل من السيروم ووسط خال من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات.
        ملاحظة: هذا تخفيف بنسبة 1:10 لزراعة البكتيريا خلال الليل. لحساب MOI، استخدم القيمة الخامOD 600 المحسوبة للزراعة الليلية المخففة في الخطوة 4.1.3، وليس قيمة OD600 المصححة لعامل التخفيف.
      3. احسب حجم التعليق البكتيري الذي يجب إضافته من الخطوة 4.2.2 لإصابة خلايا Caco-2 بمعدل MOI 10 باستخدام الحساب التالي:
        [1 وحدة OD/2.4 × 109 بكتيريا] × [10 بكتيريا/خلية] × [1 مل × OD 1:10] × 1 ×105 ×103 = الحجم (uL)
        ملاحظة: سجل الحجم المحسوب بعناية لكل عينة حيث ستستخدم هذه القيمة لاحقا لحساب اللقاح CFU/mL. هذا الحجم من التعليق البكتيري مخصص فقط لبئر واحد داخل صفيحة 24 بئرا.
      4. جهز وسط العدوى عن طريق نقل الحجم المحسوب لتعليق البكتيريا من الخطوة 4.2.3 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مل. أضف 1 مل من المصل ووسط خال من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات. اخلط بلطف عن طريق الرش صعودا وهبوطا عدة مرات.
    3. عدوى خلايا كاكو-2
      1. قم بإزالة صفيحة ال 24 بئر التي تحتوي على طبقات خلايا كاكو-2 الأحادية من الحاضنة واسحب الوسط بالكامل.
      2. بيبت 1 مل من المصل ووسط خال من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات لكل بئر وسحب لإزالة آثار وسط يحتوي على المصل. كرر هذه الخطوة مرة أخرى (غسلتان في المجموع).
        ملاحظة: قلل ضغط الفراغ عند الشفط لتجنب تعطيل طبقة الخلية الأحادية.
      3. بيبت 1 مل من وسط العدوى من الخطوة 4.2.4 إلى كل بئر من صفيحة 24 بئر تحتوي على خلايا Caco-2.
      4. قم بطرد مركزي في صفيحة 24 بئر عند 500 × جرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمزامنة الاتصال البكتيري مع الخلايا الظهارية.
      5. حضن صفيحة 24 بئر عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 3 ساعات للسماح بغزو البكتيريا.
      6. خلال فترة الحضانة، حدد CFU/mL للثقافة الليلية المخففة من الخطوة 4.2.2 عن طريق إجراء تخفيف تسلسلي بمقدار 10 مرات في PBS معقم 1× باستخدام صفيحة بئر 96.
        1. لتحضير كل تخفيف، انقل 200 ميكرولتر من الثقافة الليلية المخففة من الخطوة 4.2.2 إلى البئر الأول في اللوحة.
        2. مقطعة 20 ميكرولتر من الزراعة إلى الصف التالي التي تحتوي على 180 ميكرولتر من 1× PBS. اخلط عن طريق التوصيل بالضغط على الأنابيب لأعلى وأسفل 10 مرات. كرر ذلك حتى تصل التخفيفات إلى 10-6 باستخدام رأس ماصة جديد للنقل في كل مرة.
        3. ضع لوح 10 ميكرولتر من التخفيف النقطي على شكل ثلاث نسخ من 10-2 إلى 10-6 على ألواح أجار LB. دع البقع تمتص في الأجار تحت اللهب.
        4. تقوم بحضانة الألواح طوال الليل عند 27–30 درجة مئوية لمنع النمو الزائد للمستعمرات وضمان وجود مستعمرات فردية واضحة ومنفصلة.
          ملاحظة: الطلاء النقطي بثلاث نسخ يحسن دقة القياس ويتيح الكشف عبر مجموعة من تركيزات البكتيريا. انخفاض درجة حرارة الحضانة يبطئ نمو البكتيريا، مما يتيح تقديرا أكثر دقة لوحدة الزراعة الكربونية من عينات عالية التركيز.
      7. تحضير وسط يحتوي على مضادات حيوية بإضافة 240 ميكروغرام/مل أميكاسين إلى وسط مصل مسخن مسبقا ووسط خال من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات.
      8. بعد اكتمال العدوى التي تستمر 3 ساعات، استنشق الوسط من طبقات خلايا Caco-2 الأحادية. أضف 1 مل من المصل ووسط خال من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات إلى كل بئر. كرر هذه الخطوة مرة أخرى (غسلتان في المجموع).
      9. تدخين 1 مل من وسط يحتوي على أميكاسين بسعة 240 ميكروغرام/مل في كل بئر وتحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة ساعة واحدة للقضاء على البكتيريا خارج الخلية.
      10. استنشق الوسائط من كل بئر وأضف 1 مل من 1× PBS لغسل البكتيريا الملتصقة التي قتلتها الأميكسين. كرر هذه الخطوة مرة أخرى (غسلتان في المجموع).
      11. بيبت 200 ميكرولتر من 1٪ تريتون-X-100 (انظر جدول المواد) مخففة في 1× PBS في كل بئر. حضانة على هزاز الحجاج بسرعة 90 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق لتحليل الخلايا الطهارية.
      12. فصل الخلايا من صفيحة 24 بئر عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا تقريبا 30 مرة لكل بئر.
        ملاحظة: بما أن تغطية الصفائح بالكولاجين تحسن التصاق الخلايا، فمن المهم التأكد من انفصال الطبقة الأحادية عن الصفيحة. يمكن تأكيد ذلك بصريا من خلال مقارنة بئر مفلل مقارنة بئر غير مفلل وبئر بدون خلايا Caco-2، والتي ستبدو واضحة.
      13. إجراء تخفيف تسلسلي بمقدار 10 مرات لمحللات الخلايا في صفيحة بسعة 96 بئر باستخدام 1× PBS.
        ملاحظة: قم بتخفيفات تسلسلية حتى تخفيف 10-3 .
      14. لوحة بحجم 10 ميكرولتر من التخفيف النقطي في ثلاث نسخ، تتراوح من التخفيفات غير المخففة إلى 10-3 تخفيفات، على ألواح LB Agar الصغيرة. دع البقع تمتص في الأجار تحت اللهب. يحتضن الصفائح طوال الليل عند 27–30 درجة مئوية لمنع نمو المستعمرة وضمان وجود مستعمرات منفصلة وواضحة.
    4. حساب المستعمرات ونسبة الغزو
      1. بعد الحضانة الليلية، عد عدد المستعمرات في كل مخفف موضعي من الزراعة الليلية المخففة والليستات المسترجع. اختر تخفيفا يحتوي كل بقعة فيه على أكثر من 7 مستعمرات معزولة. استخدم نفس التخفيف عبر الثلاثيات لحساب متوسط عدد مستعمرات البكتيريا المستخرجة من ذلك التخفيف.
        ملاحظة: عد التخفيفات النقدية التي تحتوي على مستعمرات فردية معزولة جيدا وتجنب عد التخفيفات التي تحتوي على مستعمرات متلامسة.
      2. احسب الوحدة الخالية من الحصان/مل، ونسبة التدفق المئوية/الحصان، ونسبة الغزو باستخدام المعادلات التالية أدناه:
        اللقاح CFU (CFU/mL):
        لقاح CFU = (متوسط عدد المستعمرات)(عامل التخفيف)(حجم وسط العدوى (μL) × 100
        تم الاسترجاع من CFU (CFU/mL):
        تماسترجاع  CFU = (متوسط عدد المستعمرات) (عامل التخفيف) × 100
        نسبة الغزو (٪):
        الغزو (٪) = [(تم استرجاع CFU)/(لقاح CFU)] × 100

2. اختبار الحماية من الأميكاسين للمجهر الكونفوكلي

  1. تحضير أغطية مغلفة مطلية بالبولي-إل-ليسين المعقمة
    1. في خزانة الأمان البيولوجي، استخدم ملقط معقم لوضع أغطية مغلفة بالبولي-إل-ليسين (انظر جدول المواد) على منشفة ورقية منقوعة بنسبة 70٪ إيثانول.
    2. رش كلا الشريحتين من الغطاء ب 70٪ إيثانول، باستخدام ملقط معقم لقلب الغطاء إلى كل جانب.
    3. اترك أغطية الغطاء تجف تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة الأمان البيولوجي حتى تجف تماما.
  2. زرع خلايا Caco-2 في صفيحة ذات 6 آبار
    1. في خزانة أمان بيولوجية، ضع غطاء واحد مغلف بالبولي-إل-ليسين في كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار.
    2. كرر الخطوات 3.2.1–3.2.8 من قسم "زرع خلايا كاكو-2".
    3. زرع خلايا Caco-2 بتركيز 1 × 105 خلايا/مل في صفيحة ذات 6 آبار باستخدام المعادلة أدناه:
      [(1 ×10 5 خلايا)(عدد الآبار التي تزرع + 2)] / [تركيز عدد الخلايا القابل للحياة (الخلايا/مل)] × 2 = الخلايا (مل)
      ملاحظة: تضرب هذه القيمة في 2 لأخذ في الاعتبار إضافة 2 مل من الوسائط لكل بئر عند استخدام صفيحة ذات 6 آبار.
    4. أزل حجم الخلايا المحسوبة أعلاه إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. احسب حجم وسط النمو الكامل الذي يمكن إضافته إلى الخلايا باستخدام المعادلة أدناه:
       (عدد الآبار التي تزرع + 2 بئر) × 2 - الخلايا (mL) = الوسائط (mL)
    5. تقوم ببيبت حجم الوسط المحسوب أعلاه إلى مخروط 15 مل يحتوي على خلايا Caco-2 وتخلط عن طريق التوصيل صعودا وهبوطا عدة مرات.
    6. أضف 2 مل من خلايا Caco-2 في وسط نمو كامل إلى كل بئر من صفيحة الست آبار (التركيز النهائي 1 × 105 خلايا/مل).
    7. حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصل الخلايا إلى ~90٪ من التقاء (2–3 أيام).
  3. اختبار الحماية من الأميكاسين
    1. قم بإجراء اختبار حماية الأميكاسين كما هو مكتوب في القسم 1، الخطوات 4.1-4.3.10
  4. التلوين بالفلورة المناعية
    1. تثبيت ونفاذية خلايا Caco-2
      1. قم بتثبيت الخلايا بإضافة 1 مل من بارافورمالديهيد 4٪ مخفف في 1X PBS (انظر جدول المواد) إلى كل بئر. حضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      2. استنشق كل بئر وأضف 1 مل من 1× PBS لغسل الخلايا. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين (ثلاث غسلات إجمالا).
        ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا لعدة أيام في 1X PBS عند 4 درجات مئوية.
      3. أضف 1 مل من 0.1٪ تريتون-X-100 إلى كل بئر وحضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لنفخ الخلايا.
      4. استنشق محلول Triton-X-100 وإضافة 1 مل من 1× PBS لكل بئر. حضن الخلايا التي تحتوي على 1× PBS لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين (ثلاث غسلات إجمالا).
    2. الحجب وتلوين الأجسام المضادة
      1. لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة، حضر محلول حاجب باستخدام ألبومين مصل البقري 1٪ (BSA)، و22.52 ملغ/مل جليسين في 1× PBS + 0.1٪ Tween20 (انظر جدول المواد).
      2. أضف 1 مل من محلول الانسداد إلى كل بئر وحضنه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ خطوة الحجب عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة.
      3. محلول السحب الحاجز وحضن الخلايا التي تحتوي على الجسم المضاد الأولي لمضاد E. coli (انظر جدول المواد) مخفف (التخفيف الموصى به بنسبة 1:500) في محلول حجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الحضانة مع الجسم المضاد الأساسي عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة.
      4. استنشق محلول الأجسام المضادة الأولية وأضف 1 مل من 1× PBS + 0.1٪ في سن المراهقة. حضن الخلايا في 1× PBS + 0.1٪ Tween20 لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين (ثلاث غسلات إجمالا).
      5. حضن الخلايا التي تحتوي على الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب أليكسا فلور 488 (انظر جدول المواد) مخفف (موصى به بتخفيف بنسبة 1:1000) في محلول حجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لف اللوحة بورق الألمنيوم لحماية الفلوروفور من الضوء.
      6. استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوي وأضف 1 مل من 1× PBS + 0.1٪ Tween20. حضن الخلايا في 1× PBS + 0.1٪ Tween20 لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين (ثلاث غسلات إجمالا).
    3. التلوين المضاد وتركيب غطاء الغطاء
      1. لصبغ الحمض النووي للعائل والبكتيريا وأكتين المضيف، حضر مخففا مركبا باستخدام 10 ملغ/مل هوشت (تخفيفة موصى بها بنسبة 1:2000، انظر جدول المواد) ورودامين-فالويدين (تخفيف موصى به بنسبة 1:1000، انظر جدول المواد) في 1× PBS.
      2. أضف 1 مل من محلول الصبغة إلى كل بئر وحضن لمدة 10 دقائق.
      3. أزل محلول الصبغة وأضف 1 مل من 1× PBS إلى كل بئر. كرر هذه الخطوة مرة أخرى (غسلتان إجمالا).
      4. أضف 1 مل من 1× PBS واترك الخلايا مغمورة في المحلول.
      5. ضع قطرة واحدة من وسط التثبيت (انظر جدول المواد) على الشريحة الموسومة.
      6. ارفع غطاء الغطاء بعناية من لوحة الست آبار باستخدام إبرة مثنية وقلب الغطاء بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على الخلايا يواجه الشريحة التي تحتوي على وسط التثبيت.
      7. ضع غطاء الغطاء على وسط التثبيت. تأكد من توزيع وسائط التثبيت بشكل متساو على كامل غطاء الغطاء.
      8. حضن الزلاجات المثبتة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل في الظلام.
      9. أغلق حواف غطاء الغطاء باستخدام طلاء أظافر شفاف وخزن الشرائح عند 4 درجات مئوية في صندوق شرائح عند 4 درجات مئوية.
      10. صور العينات المركبة باستخدام القنوات المناسبة التي تتوافق مع الأصباغ/الفلوروفورات المستخدمة مع المجهر الكونفوكلي.

النتائج

لتقييم فعالية علاج الأميكاسين في القضاء على البكتيريا خارج الخلية ورؤية الغزو داخل الخلية، أجرينا تجارب عدوى باستخدام طبقات أحادية من خلايا Caco-2. كما هو موضح في الشكل 1، أدى العلاج إما بالجنتاميسين أو الأميكاسين بعد الإصابة بالإشريكية القولونية NRG857c (السيطرة الإيجابية) أو الإشريكية القولونية DH5α (السيطرة السلبية) إلى ملفات غزو مماثلة. تشير هذه النتائج إلى أن الأميكاسين فعال مثل جنتامسين في القضاء على البكتيريا خارج الخلية ويعكس بدقة عبء البكتيريا داخل الخلية، مما يدعم استخدامه كمضاد حيوي بديل لاختبارات الغزو. يعتبر نطاق التعافي من ~4-10٪ من NRG857c و<1٪ للإشريكية القولونية DH5α مقبولا لتفسير الأنماط الظاهرية للغزو بدقة بالنسبة للسلالات الطفرة أو العزلات السريرية الأخرى، بما يتوافق مع الملاحظات السابقة11. إذا كانت نسبة درجات الغزو للضوابط الإيجابية والسلبية خارج نطاق التعافي المتوقع، يجب تفسير النتائج بحذر، ويجب إعادة الاختبار.

لإثبات أن الأميكاسين يمكنه استهداف عزلات الإشريكية القولونية السريرية المقاومة للجنتاميسين بفعالية، أجريت اختبارات جنتاميسين وحماية الأميكاسين بالتوازي، وتم فحص ملفات الغزو للعزلات. كما هو موضح في الشكل 2، أدى علاج العزلات المقاومة للجنتاماسين بالجنتاميسين إلى قيم استرداد متغيرة للغاية، تتراوح بين 21.52٪ إلى 2788.50٪. على النقيض من ذلك، قلل العلاج بالأميكاسين بشكل كبير من التعافي في جميع العزلات، مما أبرز فعاليته وتمكين قياسات غزو أكثر دقة وموثوقية.

وأخيرا، لتقييم النمط الخلوي داخل الخلية ل AIEC أثناء الغزو، أصيبت خلايا Caco-2 بالإشريكية القولونية NRG857c. يظهر الشكل 3 صورة ممثلة لخلية Caco-2 مصابة مع بكتيريا (خضراء) مصبوغة بالتألق المناعي، وأكتين المضيف (الأحمر)، والحمض النووي (الأزرق) تم رؤيتها من خلال التلوين المضاد باستخدام الرودامين-فالويدين وهوشست على التوالي. بعد 4 ساعات من العدوى، لوحظ تكاثر NRG857c في السيتوبلازم، متمركزا بالقرب من النواة وداخل حدود الأكتين، مما يؤكد الطبيعة داخل الخلية لهذه البكتيريا.

figure-results-1
الشكل 1: إضافة جينتاميسين أو أميكاسين إلى خلايا Caco-2 المصابة بسلالة AIEC NRG857c تؤدي إلى ملفات غزو مماثلة. أصيبت طبقة أحادية من خلايا Caco-2 بسلالة AIEC NRG857c وE. coli DH5α بمعدل نمو 10. بعد 3 ساعات من العدوى، عولجت الخلايا لمدة ساعة واحدة بالجنتاميسين (100 ميكروغرام/مل) أو الأميكاسين (240 ميكروغرام/مل) للقضاء على البكتيريا خارج الخلية. ثم تم تحلل الخلايا بنسبة 1٪ من تريتون-X-100، وتم تخفيف التجانسات تسلسليا وتطليتها على LB Agar لتعداد CFU. تم التعبير عن الغزو كنسبة البكتيريا المستردة مقارنة باللقاح الأولي. تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة (n = 3)؛ تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري للمتوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: يستهدف أميكاسين بشكل فعال سلالات الإشريكية القولونية المقاومة للجنتاميسين. أصيبت طبقات خلايا Caco-2 أحادية الطبقات بسلالات الإشريكية القولونية التي تم عزلها من مرضى التهاب الأمعاء الالتهابي بمعدل نمو 10. بعد 3 ساعات من العدوى، عولجت الخلايا لمدة ساعة واحدة بجنتاميسين (100 ميكروغرام/مل) أو أميكاسين (240 ميكروغرام/مل) للقضاء على البكتيريا خارج الخلية. ثم تم تحلل الخلايا بنسبة 1٪ من تريتون-X-100، وتم تخفيف التجانسات تسلسليا وتطليتها على LB Agar لتعداد CFU. تم التعبير عن الغزو كنسبة البكتيريا المستردة مقارنة باللقاح الأولي. تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة (n = 3)؛ تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري للمتوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تصور غزو الخلايا الطهارية بواسطة الإشريكية القولونية. أصابت صور المجهرية الكونفوكالية التمثيلية لخلايا Caco-2 الإشريكية القولونية NRG857c. تم إصابة خلايا Caco-2 لمدة 3 ساعات تلتها حضانة لمدة ساعة واحدة بالأميكاسين (240 ميكروغرام/مل). تم صبغ الأكتين المضيف برودامين-فالودين (الأحمر)، وصبغ حمض المضيف والحمض النووي البكتيري بحمض هوشت (الأزرق). تم اكتشاف الإشريكية القولونية (الخضراء) باستخدام جسم مضاد أولي مضاد للأرانب من الإشريكية القولونية وجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب أليكسا فلور 488. تم التقاط الصور على هدف 63× مع تكبير 3× باستخدام مجهر لايكا الكونفوكلي. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: مخطط التدفق للدراسة. (أ)تم زراعة سلالات AIEC خلال الليل، وغسلها، وإضافتها إلى طبقات Caco-2 أحادية الطبقة بمعدل MOI يبلغ 10. بعد 3 ساعات من العدوى وساعة واحدة من علاج الأميكاسين، تم استرداد البكتيريا داخل الخلايا وقياسها عن طريق تغليف التخفيفات المتسلسلة في طبقات ثلاثية. (ب) تم تثبيت طبقات أحادية المصابة، وصبغها بالأجسام المضادة، وتصويرها باستخدام المجهر الفلوري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: علاج الأميكاسين يؤدي إلى سمية خلوية قليلة في الخلايا الظهارية. تمت معالجة خلايا كاكو-2 بجينتاميسين (100 ميكروغرام/مل) أو أميكاسين (240 ميكروغرام/مل) لمدة ساعة واحدة. تم تحديد سمية الخلايا بقياس إنزيم اللاكتات المنبعث من الهيدروجيناز في وسط الزراعة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري للمتوسط (n = 3). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

اختبار حماية الأميكاسين هو نهج معدل لتقييم غزو الإشريكية القولونية إلى الخلايا الظهارية. تعد هناك عدة خطوات حاسمة لنجاح هذا الاختبار، بما في ذلك طلاء الكولاجين على الصفائح، والحفاظ على سلامة الطبقة الأحادية، وتحليل الخلايا بكفاءة. خلايا Caco-2 هي خط خلوي ملتصق يمكن أن يلتصق بالبلاستيك المعالج بزراعة الأنسجة وتكوين طبقات أحادية20. ومع ذلك، أثناء العدوى، يمكن أن يؤثر استخدام وسائط خالية من المصل والغسل المتكرر على انفصال الخلايا، مما يؤدي إلى تمثيل ناقص للغزو البكتيري21. لحل هذه المشكلة، يمكن لتغطية الصفائح بمكونات مصفوفة خارج الخلية، مثل الكولاجين من النوع الرابع، أن يعزز التصاق الخلايا وتكوين طبقة أحادية مستقرة متلاطمة أثناء العدوى21. وهذا مهم لأن سلالة AIEC LF82 ثبت أنها تعطل الوصلات الضيقة أثناء الغزو، ويمكن أن يؤدي التكوين غير الكامل للطبقة الأحادية إلى تجاوز هذه الخطوة، مما يؤدي إلى نتائج منحازة22. أخيرا، التحلل الفعال للخلايا هو خطوة رئيسية أخرى تؤثر على تعافي البكتيريا، حيث يمكن أن يخفي التحلل غير الكامل الغازية، مما يربك نتائج الاختبارات23. لتجاوز ذلك، من المهم إعادة تعليق تحلل الخلية بشكل كامل بعد الحضانة باستخدام تريتون-X-100.

بالإضافة إلى التحديات التقنية التي قد تسهم في تباين اختبارات الغزو، أظهرت نسبة اللقاح التي تم التعافي منها بعد العدوى لسلالة AIEC LF82 تتراوح بين 0.61 و17.25٪8. يمكن أن يتأثر هذا التباين بغياب بعض الإشارات البيئية، مثل أملاح الصفراء، والمخاط، وغيرها من المستقلبات المعوية في هذا الاختبار الصناعي المعروف بمساهمتها في ضراوة AIEC 24,25,26. على وجه التحديد، أظهرت أملاح الصفراء أنها تحفز التعبير عن الفيمبريا القطبية الطويلة، مما يزيد من ارتباط AIEC وانتقالها عبر الخلايا الM27. ومن المعروف أن مسببات الأمراض الهضمية الأخرى، مثل فيبريو وشيغلا، تنظم أنظمة إفراز النوع الثالث لديها استجابة للصفراء لتتوسط غزو الخلايا الطهارية28,29. الزراعة الفرعية باستخدام أملاح الصفراء لتحفيز تعبير عوامل الضراوة أمر معتاد في بروتوكولات حماية الجنتاميسين للممرضات الأخرى، ونمو AIEC مع هذه الإشارات البيئية قد يثبت الغزو وينتج ملفات أكثر اتساقا30,31.

قيد آخر لهذا الاختبار هو أن غزو البكتيريا يقيم في نقطة زمنية واحدة، وهو أمر قياسي في المجال، لكنه على الأرجح يبسط عملية الغزوبشكل مفرط. الغزو البكتيري هو عملية ديناميكية تشمل الالتصاق، الاستيعاب، التكاثر داخل الخلية، والهروبمن الخلية المضيفة. نظرا لأن الجينات الجديدة التي تساهم في غزو AIEC كان من الصعب تحديدها، فقد يقلل استخدام اختبار نقطة زمنية واحدة عدد الجينات التي تساهم في هذه العملية12. لذلك، تم استخدام اختبارات الغزو الزمني لتقييم كيف تساهم الجينات المحددة في الغزو ولدراسة تكرار AIEC في خلايا I-407 وHep-2 8,33. بينما يعد استخدام اختبار غزو المسار الزمني ذا قيمة لتوصيف مساهمة الجينات الفردية في الغزو، إلا أنه يتطلب جهدا كبيرا، خاصة عند فحص العديد من العزلات السريرية. لهذا السبب، يستخدم نقطة زمنية واحدة لتقييم الغزو.

بالإضافة إلى ذلك، لم يتم توصيف نمط الحياة داخل الخلايا في AIEC بشكل جيد. تستخدم معظم الدراسات نسبة الغزو كمؤشر رئيسي للكشف عن التغيرات في وحدة العزل الكرسي لمختلف طفرات حذف عوامل الضرابة14,34. يمكن أن يوفر تصور الخلايا المضيفة المصاحبة الملوثة رؤى فريدة حول بيولوجيا AIEC لا تلاحظ عند استخدام تعداد CFU فقط35. لذلك، لتقييم شامل لدور الجينات المختلفة في غزو الخلايا، يجب إجراء مجهر مضاد مناعي للخلايا المصابة بالتزامن مع تعداد ال CFU. وهذا مهم لأنه قد يؤدي إلى تحديد جينات تعمل في البقاء والهروب من الإندوسوم، أو تستهدف الهيكل الخلوي للمضيف، أو تظهر اختلافات في عبء البكتيريا لكل خلية، والتي قد يتم تجاهلها باستخدام استعادة CFU فقط. من المهم ملاحظة أن استخدام بروتوكول التلوين المناعي الفلوري الموضح هنا للكشف عن البكتيريا داخل الخلية لا يميز بين البكتيريا الداخلية الحقيقية وتلك الملتصقة بسطح الخلية. نهج التلوين التفريقي، حيث يتم تصنيف البكتيريا خارج الخلية بجسم مضاد ثانوي مميز قبل النفاذية وصبغ البكتيريا داخل الخلايا بعد النفاذية، سيعالج هذا القيد ويمكن تطبيقه في دراسات مستقبلية لتمييز هذه المجموعات بشكل أكثر تحديدا36.

تكمن أهمية هذه الطريقة بشكل كبير في القدرة على فحص عزلات الإشريكية القولونية المقاومة للأدوية المتعددة من مرضى التهاب الأمعاء الذين يخضعون لعلاجات مضادة حيوية متنوعة11. يستخدم الجنتاميسين لعلاج المرضى الذين يعانون من التهاب الأمعاء المبكر ويمكن إعطاؤه لعلاج عدوى بكتيرية أخرى37. ظهور معزولات مقاومة للجنتاميسين سيمنع استخدام الاختبار القياسي، مما يجعل الأميكاسين بديلا أكثر موثوقيةلل11. استخدام البروتوكولات الموضحة في هذه الورقة سيسمح بتوصيف أكثر شمولا لبيولوجيا عدوى AIEC وسيساعد في تحديد جينات جديدة يمكن أن تسهم في الاختراق. تعد هذه الطرق مهمة في سياق أبحاث التسبب المرضي البكتيري وتفاعل المضيف مع الممرض، حيث تمكن من اكتشاف عوامل ضراوة جديدة، وتوصيف دورة حياة البكتيريا داخل الخلية، واستجواب مسارات المضيف المستهدفة أثناء العدوى. بالإضافة إلى ذلك، فهي قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة مسببات الأمراض الغازية الأخرى باستخدام نماذج خلايا ظهارية في المختبر .

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل مبادرة مسببات الأمراض الناشئة من معهد هوارد هيوز الطبي (K.O., J.N.)، ومنحة مؤسسة ويلش 1-561 (K.O.)، ومؤسسة ذات مرة (K.O.)، ومنحة NIH R35 GM134945 (K.O.)، ومنحة NIH NIDDK K08-DK-123316 (J.N.)، وجوائز بوروز ويلكوم لصندوق المهنة للعلماء الطبيين - 1020904 (J.N.) وNIH T32 AI007520 (سان فرانسيسكو).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
75 cm2 Tissue culture flaskFisher Scientific FB012937
Amikacin disulfate Research Products International A20540-25.0
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062
Anti-E.coli antibodyAbcamab137967
BioLite microwell plates - 6 wellFisher Scientific 12-556-004
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906
Collagen I, Rat tail, 100 mgCorning354236
Countess cell counting chamber slideInvitrogenC10312
DMEM, high glucoseGibco11965118
Fetal bovine serumCorning35-011-CV
Galcial acetic acidSigma-AldrichA6283
Glycine ultrapureUSBiologicalG8165
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Hoechst 33342, trihydrochloride trihydrateInvitrogenH3570
Liofilchem MTS amikacin [AK] 0.016-256 μg/mLFisher Scientific 22-777-704أشرطة اختبار MIC للأميكاسين
Paraformaldehyde solution, 4% in PBSFisher Scientific J19943.K2
PBS, 1xCorning21-040-CV
Poly-L-lysine coated sterile German glass coverslips for cell cultureNeuvitroNC1327375
ProLong gold antifade mountant InvitrogenP36934
Rhodamine-PhalloidinInvitrogenR415أحمر-برتقالي 540/565 نانومتر
Surface treated sterile tissue culture platesFisher Scientific FB012929ألواح 24-well
Triton X-100 (Electrophoresis)Fisher Scientific BP151-100
Trypan blueInvitrogenT10282
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Tween-20Fisher Scientific BP337-100

المراجع

  1. Bruner, L. P., White, A. M., Proksell, S. Inflammatory bowel disease. Prim Care. 50 (3), 411-427 (2023).
  2. Richard, N., Savoye, G., Leboutte, M., Amamou, A., Ghosh, S., et al. Crohn's disease: Why the ileum?. World J Gastroenterol. 29 (21), 3222-3240 (2023).
  3. Hracs, L., et al. Global evolution of inflammatory bowel disease across epidemiologic stages. Nature. 642 (8067), 458-466 (2025).
  4. Lewis, J. D., Abreu, M. T. Diet as a trigger or therapy for inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 398-414.e6 (2017).
  5. Khan, S., et al. Dietary simple sugars alter microbial ecology in the gut and promote colitis in mice. Sci Transl Med. 12 (567), (2020).
  6. Ma, X., et al. Gut microbiota in the early stage of Crohn's disease has unique characteristics. Gut Pathog. 14 (1), 46 (2022).
  7. Vester-Andersen, M. K., et al. Increased abundance of proteobacteria in aggressive Crohn's disease seven years after diagnosis. Sci Rep. 9 (1), 13473 (2019).
  8. Boudeau, J., Glasser, A. L., Masseret, E., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Invasive ability of an Escherichia coli strain isolated from the ileal mucosa of a patient with Crohn's disease. Infect Immun. 67 (9), 4499-4509 (1999).
  9. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  10. Barnich, N., et al. Adherent-invasive Escherichia coli in Crohn's disease: the 25th anniversary. Gut. , (2025).
  11. Kim, J., et al. Genetic and microbial analysis of invasiveness for Escherichia coli strains associated with inflammatory bowel disease. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 19 (4), 101451 (2025).
  12. Camprubi-Font, C., Martinez-Medina, M. Why the discovery of adherent-invasive Escherichia coli molecular markers is so challenging?. World J Biol Chem. 11 (1), 1-13 (2020).
  13. Barnich, N., et al. CEACAM6 acts as a receptor for adherent-invasive E. coli, supporting ileal mucosa colonization in Crohn disease. J Clin Invest. 117 (6), 1566-1574 (2007).
  14. Boudeau, J., Barnich, N., Darfeuille-Michaud, A. Type 1 pili-mediated adherence of Escherichia coli strain LF82 isolated from Crohn's disease is involved in bacterial invasion of intestinal epithelial cells. Mol Microbiol. 39 (5), 1272-1284 (2001).
  15. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  16. Chassaing, B., et al. Crohn disease--associated adherent-invasive E. coli bacteria target mouse and human Peyer's patches via long polar fimbriae. J Clin Invest. 121 (3), 966-975 (2011).
  17. Glasser, A. L., Boudeau, J., Barnich, N., Perruchot, M. H., Colombel, J. F., et al. Adherent invasive Escherichia coli strains from patients with Crohn's disease survive and replicate within macrophages without inducing host cell death. Infect Immun. 69 (9), 5529-5537 (2001).
  18. Bringer, M. A., Billard, E., Glasser, A. L., Colombel, J. F., Darfeuille-Michaud, A. Replication of Crohn's disease-associated AIEC within macrophages is dependent on TNF-alpha secretion. Lab Invest. 92 (3), 411-419 (2012).
  19. Ristuccia, A. M., Cunha, B. A. An overview of amikacin. Ther Drug Monit. 7 (1), 12-25 (1985).
  20. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  21. Vllasaliu, D., Falcone, F. H., Stolnik, S., Garnett, M. Basement membrane influences intestinal epithelial cell growth and presents a barrier to the movement of macromolecules. Exp Cell Res. 323 (1), 218-231 (2014).
  22. Wine, E., Ossa, J. C., Gray-Owen, S. D., Sherman, P. M. Adherent-invasive Escherichia coli, strain LF82 disrupts apical junctional complexes in polarized epithelia. BMC Microbiol. 9, 180 (2009).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  24. Delmas, J., et al. Metabolic adaptation of adherent-invasive Escherichia coli to exposure to bile salts. Sci Rep. 9 (1), 2175 (2019).
  25. Zhang, S., et al. Mucosal metabolites fuel the growth and virulence of E. coli linked to Crohn's disease. JCI Insight. 7 (10), (2022).
  26. Viennois, E., et al. Dietary emulsifiers directly impact adherent-invasive E. coli gene expression to drive chronic intestinal inflammation. Cell Rep. 33 (1), 108229 (2020).
  27. Chassaing, B., Etienne-Mesmin, L., Bonnet, R., Darfeuille-Michaud, A. Bile salts induce long polar fimbriae expression favouring Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli interaction with Peyer's patches. Environ Microbiol. 15 (2), 355-371 (2013).
  28. Gotoh, K., et al. Bile acid-induced virulence gene expression of Vibrio parahaemolyticus reveals a novel therapeutic potential for bile acid sequestrants. PLoS One. 5 (10), e13365 (2010).
  29. Bajunaid, W., et al. The T3SS of Shigella: Expression, structure, function, and role in vacuole escape. Microorganisms. 8 (12), (2020).
  30. Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial cell infection analyses with Shigella. J Vis Exp. (204), e66426 (2024).
  31. Chimalapati, S., Lafrance, A. E., Chen, L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus: Basic techniques for growth, genetic manipulation, and analysis of virulence factors. Curr Protoc Microbiol. 59 (1), e131 (2020).
  32. Rodrigues, E., Marzook, N. B., Pallett, M. A., Sateriale, A. Convergent mechanisms of epithelial cell structure manipulation by intestinal pathogens. PLoS Pathog. 21 (7), e1013367 (2025).
  33. Jaishankar, J., et al. A critical role for Vibrio parahaemolyticus LPS to mediate evasion of host immune response during infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (33), e2426547122 (2025).
  34. Cieza, R. J., Hu, J., Ross, B. N., Sbrana, E., Torres, A. G. The IbeA invasin of adherent-invasive Escherichia coli mediates interaction with intestinal epithelia and macrophages. Infect Immun. 83 (5), 1904-1918 (2015).
  35. Liu, H., Semino-Mora, C., Dubois, A. Mechanism of H. pylori intracellular entry: an in vitro study. Front Cell Infect Microbiol. 2, 13 (2012).
  36. Heesemann, J., Laufs, R. Double immunofluorescence microscopic technique for accurate differentiation of extracellularly and intracellularly located bacteria in cell culture. J Clin Microbiol. 22 (2), 168-175 (1985).
  37. Lev-Tzion, R., Ledder, O., Shteyer, E., Tan, M. L. N., Uhlig, H. H., et al. Oral vancomycin and gentamicin for treatment of very early onset inflammatory bowel disease. Digestion. 95 (4), 310-313 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

علم المناعة والعدوىالعدد 233العدد 233هذا الشهر في JoVEعددالإشريكية القولونية الملتصقة الغازيةمقايسة الغزو البكتيريخلايا الظهارة المعويةغزو الخلايا الظهاريةصبغ التألق المناعي
اختبار حماية الأميكاسين لقياس وتصور غزو خلايا الإشريكية القولونية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.