اختبار قائم على الفلورة المناعية للكشف عن تركيزات RAD51 النووية كمؤشر لإصلاح إعادة التركيب المتماثل في خلايا سرطان المبيض

ملخص

تعد بؤر RAD51 النووية علامة على نشاط إعادة التركيب المتماثل (HR). تصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة للتألق المناعي للكشف عن هذه البؤر في الخلايا السرطانية، مما يمكن من تقييم وظيفة معدل ضربات القلب ودعم التحقيق قبل السريري في الاستجابات للعوامل الضارة بالحمض النووي.

الملخص

RAD51 هو بروتين مركزي في مسار إعادة التركيب المتماثل (HR) وهو ضروري لإصلاح كسور الحمض النووي ذات السلسلة المزدوجة (DSBs) بدقة. بعد تكوين DSB، ينتج استئصال نهاية الحمض النووي ركائز DNA أحادية السلسلة تسهل تجنيد وتجميع خيوط نوكليوبروتين RAD51 في مواقع التلف. تؤدي هذه العملية إلى تكوين بؤر نووية منفصلة ل RAD51، والتي تعمل كقراءة وظيفية مقبولة على نطاق واسع لنشاط معدل ضربات القلب وعلامة بديلة لكفاءة معدل ضربات القلب. نظرا لأن العيوب في معدل ضربات القلب شائعة في عدة أورام خبيثة، خاصة سرطانات المبيض والثدي، برز تقييم تكوين بؤر RAD51 كنهج مهم لتقييم قدرة إصلاح الحمض النووي والتنبؤ بالاستجابة للعلاجات الضارة بالحمض النووي، بما في ذلك مركبات البلاتين ومثبطات بوليمراز البولي (ADP-ريبوز) (PARP)، التي تتأثر فعاليتها بشكل كبير بحالة إصلاح نبض القلب. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا بسيطا وموثوقا وقابلا للتكرار قائما على التألق المناعي للكشف وقياس بؤر RAD51 النووية في خلايا سرطان المبيض المزروعة. تتضمن الطريقة تحفيز تلف الحمض النووي بواسطة الإشعاع المؤين (IR)، يليه التثبيت، وتلوين المناعة بالأجسام المضادة ضد RAD51 وγH2AX، والمجهر الكونفوكلي، والتحليل الكمي اليدوي لتركيزات RAD51/γH2AX المتمركزة بشكل مشترك. يمكن تطبيق البروتوكول في الظروف الأساسية أو بعد اضطرابات وراثية ودوائية لتحديد تأثيرها على وظيفة معدل ضربات القلب. تظهر النتائج الممثلة تحفيز قوي لتركيزات RAD51 في خلايا سرطان المبيض المتخصصة في معدل ضربات القلب بعد تلف الحمض النووي، في حين أن استنفاد RAD51 يقلل بشكل ملحوظ من تكوين البؤر رغم مستويات DSBs المتقاربة، مما يؤكد خصوصية الاختبار. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول اختبارا وظيفيا قويا وقابلا للتكرار لتقييم كفاءة الموارد البشرية، مع تطبيقات واسعة في أبحاث السرطان قبل السريرية وربما الترجمية.

المقدمة

تعد كسرات الحمض النووي ذات السلسلة المزدوجة (DSBs) من أشد أشكال تلف الحمض النووي لأن الإصلاح غير الدقيق قد يؤثر سلبا على استقرار الجينوم ويساهم في تطور الورم أو موت الخلايا ^1,2,3. لمواجهة هذه التهديدات، تستخدم الخلايا عدة مسارات إصلاح DNA، بما في ذلك إعادة التركيب المتماثل (HR)، والتي تعتبر الآلية الأكثر دقة لإصلاح^{DSBs 2,4,5}. على عكس مسارات الإصلاح المعرضة للأخطاء، يستخدم HR تسلسل DNA متماثل كقالب لاستعادة المعلومات الجينية في الموقع التالف. وبالتالي، يعمل معدل ضربات القلب بشكل رئيسي خلال مرحلتي S وG2 من دورة الخلية، عندما تتوفر الكروماتيدات الشقيقة لتكون بمثابة قوالب إصلاح^2،5. ومن الجدير بالذكر أن معدل القلبات ضروري لإصلاح الدوائر البدنية الدقيقة الناتجة عن مصادر داخلية مثل إجهاد التكرار، بالإضافة إلى الإصابات الخارجية بما في ذلك الإشعاع المؤين (IR) والعوامل الكيميائية الضارة بالحمض النووي^.

يعد RAD51 مؤثرا مركزيا لمسار معدل ضربات القلب ويلعب دورا حاسما في البحث عن التجانس وغزو الخيوط أثناء الإصلاح الوسيط بضربات القلب لأقراص DSB ^2,5. بعد تكوين DSB، تخضع نهايات الحمض النووي للاستئصال، وهي عملية تبدأ بواسطة مركب MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) والعوامل المرتبطة به تولد بروز DNA أحادي السلسلة بطول 3′. يتم تغطية هذه المناطق أحادية السلسلة في البداية ببروتين التكاثر A (RPA)، الذي يمنع تكوين البنية الثانوية ويثبت الوسيط ^4,5,6. ثم يتم تفعيل HR من خلال إجراءات منسقة من BRCA1 وPALB2 وBRCA2، والتي تسهل تجنيد وتحميل RAD51 على الحمض النووي المقطوع، مما يزيح RPA ويعزز تكوين خيوط البروتين النووي المحتوية على RAD51 ^4,5,6. بمجرد تجميعها، تبحث هذه الخيوط عن تسلسلات DNA متجانسة داخل الكروماتيد الشقيقة وتحفز تبادل الخيوط، مما يسهل الاستعادة الدقيقة للحمض النووي ^{التالف 4,5,6}. يظهر تراكم RAD51 في مواقع DSB بشكل مجهري كبؤر نووية مثقبة يمكن اكتشافها بواسطة التألق المناعي 7,8,9,10. نظرا لأن تكوين هذه البؤر يعكس نجاح تشغيل آلية HR، أصبح تحليل تركيزات RAD51 نهجا وظيفيا شائعا لتقييم قدرة HR وكفاءة إصلاح الحمض النووي في الخلايا^7،8،9،10. ومن المهم أن هذا الاختبار يقيس قدرة الخلايا على تنفيذ استجابة HR بعد تلف الحمض النووي بدلا من الاعتماد فقط على مستويات التعبير للجينات أو البروتينات المرتبطة بمعدل ضربات القلب.

تلاحظ عيوب في معدل ضربات القلب بشكل متكرر في السرطان، خاصة في الأورام التي تحمل تغييرات في BRCA1 أو BRCA2 أو RAD51 أو جينات أخرى تشارك في معدل ضربات القلب، وهي شائعة بشكل خاص في سرطانات المبيض والثدي 4,11,12,13,14. لنقص معدل ضربات القلب آثار علاجية مهمة، حيث يمنح حساسية متزايدة للعوامل الضارة بالحمض النووي مثل علاج البلاتين ومثبطات البولي (ADP-ريبوز) البولي (PARP) من خلال مبدأ الموت الصناعي 4,11,12,13,14,15 . وبالتالي، فإن الاختبارات الوظيفية الموثوقة لتقييم نشاط الموارد البشرية ضرورية لكل من الدراسات الميكانيكية والأبحاث الترجمية.

يصف هذا البروتوكول اختبارا قائما على الفلورة المناعية للكشف وقياس تركيز RAD51 النووي بعد تلف الحمض النووي في خلايا سرطان المبيض. يتضمن سير العمل استثناع DSBs للحمض النووي باستخدام الأشعة تحت الحمراء، يليه الكشف عن الفلورية المناعية ل RAD51 و γH2AX وقياس البؤر النووية المتزامنة باستخدام المجهر الكونفوكلي. يتم إثبات البروتوكول باستخدام خلايا OVCAR-8 المتخصصة في معدل ضربات القلب وخلايا ABT^R2 المقاومة لمثبطات PARP المكتسبة، ويوفر نهجا وظيفيا قابلا للتكرار لتقييم نشاط نبض القلب بعد تكوين DSB. على الرغم من أن تحليل بؤرة RAD51 يستخدم على نطاق واسع كمقياس وظيفي لنشاط معدل الضربات، إلا أن الطرق المتاحة غالبا ما تركز على بيئات تجريبية محددة وغالبا ما تفتقر إلى إرشادات مفصلة حول دمج تحفيز تلف الحمض النووي المضبوط، وتأكيد تكوين DBS للحمض النووي، وضوابط التحقق من الاختبارات، والقياس القياسي المعتمد على الصور. بالإضافة إلى ذلك، توفر الأساليب البديلة لتقييم وظيفة معدل ضربات القلب، بما في ذلك اختبارات الندوب الجينومية، والتواقيع الطفراتية، وتحليلات التعبير الجيني أو البروتيني، قياسات غير مباشرة لحالة معدل القلب، ولا تقيم بشكل مباشر القدرة الخلوية على تجنيد RAD51 إلى مواقع تلف الحمض النووي. الاختبارات القائمة على المراسلين مثل DR-GFP تقدم قياسات مباشرة لنشاط معدل ضربات القلب لكنها تتطلب هندسة وراثية مستقرة ولا يمكن تطبيقها بسهولة على العديد من النماذج التجريبية. لذلك، يجمع سير العمل الموضح هنا بين تلف الحمض النووي الناتج عن الأشعة تحت الحمراء مع تلوين فلوري مناعي مزدوج من RAD51/γH2AX للتحقق في الوقت نفسه من تكوين DSB وقياس تجنيد RAD51 إلى الكروماتين التالف. يوفر هذا النهج طريقة عملية وذات صلة بيولوجية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع للتقييم الوظيفي المباشر لكفاءة HR في الخلايا السرطانية المزروعة، مع دمج ضوابط الاختبار، وخطوات التحقق، وإجراءات قياس البؤر الموحدة.

البروتوكول

جميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد، بما في ذلك معلومات الشركة المصنعة، وأرقام الكتالوج، وتخفيف الأجسام المضادة. يظهر الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول.

ملاحظة: تستخدم خطوط خلايا سرطان المبيض OVCAR-8 وABT^R2 في هذا البروتوكول وقد تم وصفها سابقا^{ب 15، 16، 17، 18، 19، 20}. تم توفير خلايا OVCAR-8 بلطف من قبل الدكتور لاري كارنيتز (مايو كلينك)، الذي تلقاها في الأصل من الدكتور دومينيك سكوديرو (المعهد الوطني للسرطان، المعاهد الوطنية للصحة). تم توفير خلايا ABT^R2 بلطف من قبل الدكتور سكوت كوفمان (عيادة ^مايو). ABT^R2 هو مشتق مقاوم ل PARPi من BRCA2.- سلسلة خلايا سرطان المبيض PEO1 التي اكتسبت مقاومة من خلال استعادة تعبير BRCA2. نظرا لأن استعادة BRCA2 أعادت إعادة تحميل RAD51 ونشاط معدل ضربات القلب، فإن خلايا^{ABT R}2 تعمل كنموذج تمثيلي لكفاءة في معدل ضربات القلب. تم التحقق من هوية خط الخلية بناء على مصدر المصادر والخصائص المثبتة المذكورة في الأدبيات^{15، 16، 17، 18، 19، 20}. أجريت التجارب باستخدام خلايا منخفضة الممر (الممرات 3–12) التي تم الاحتفاظ بها في الزراعة لمدة لا تزيد عن شهر واحد بعد الإذابة. تم اختبار خطوط الخلايا بشكل روتيني للكشف عن تلوث الميكوبلازما كل 6 أشهر باستخدام مجموعة كشف الميكوبلازما، وتم تأكيد أن جميع الزرعات المستخدمة في هذه الدراسة خالية من الميكوبلازما.

تحذير: البارافورمالديهايد سام ويجب تحضيره والتعامل معه في غطاء بخار كيميائي معتمد مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. يجب التعامل مع خطوط الخلايا المشتقة من الإنسان وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية باستخدام ممارسات احتواء مناسبة. يجب التعامل مع ترايتون X-100، ووسائط التثبيت، وطلاء الأظافر وفقا لتوصيات السلامة من الشركة المصنعة. يجب أن تدار أشعة تحت الحمراء فقط من قبل أفراد مدربين ووفقا لسياسات السلامة من الإشعاع المؤسسية. التخلص من النفايات الكيميائية والبيولوجية والمرتبطة بالإشعاع وفقا للمتطلبات المؤسسية والتنظيمية المحلية.

1. زراعة الخلايا وصيانتها

1. خلايا الزراعة في وسط نمو معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI)-1640 مدعومة بمصل بقرية جنينية بنسبة 8٪ في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
   ملاحظة: تتوافق هذه الظروف مع تلك المستخدمة في دراساتنا السابقة على خلايا OVCAR-8 وABT^R2 15,16,17,18,19. في هذه الظروف، تظهر كلتا الخطين الخلويتين نموا قويا وأنماط استجابية لتلف الحمض النووي قابلة للتكرار.
2. إذا رغبت، قم بإجراء اضطرابات (مثل إسقاط/إخراج الجينات)، وفقا للظروف التجريبية المحسنة^15,17.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم تقديم إزالة الحمض النووي الريبي لجهاز RAD51 بواسطة siRNA. كمثال ممثل على اضطراب الجينات قبل تحليل التألق المناعي.
   1. جهز 5 × 10⁶ خلايا في وسط 180 ميكرولتر RPMI-1640 مع تغذية مصل أبقار جنيني بنسبة 8٪.
   2. أضف 20 ميكرولتر من محلول siRNA بسعة 20 ميكرومولار (2 ميكرومولار siRNA لكل نقل) وامزج بلطف.
      ملاحظة: استخدم siRNA التالي: siRNA لوسيفيراز التحكم غير المستهدف (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAGACAAAA-3′. تم شراء جميع siRNA من شركة هورايزن ديسكفري.
   3. انقل تعليق الخلية إلى كوفيت كهربائي بقطر 4 مم.
   4. الخلايا الكهروبية باستخدام جهاز BTX ECM 830 الكهربائي مع نبضتين بسرعة 10 مللي ثانية عند 280 فولت.
   5. انقل الخلايا إلى وسط نمو كامل وحضنها في ظروف زراعة قياسية في طبق بحجم 10 سم لمدة 24 ساعة.
   6. كرر عملية اقتراب الحمض النووي الريبي الريبي باستخدام نفس الظروف الموضحة في الخطوات 1.2.1–1.2.4.
   7. حضن الخلايا في ظروف الزراعة القياسية في طبق بحجم 15 سم لمدة 48 ساعة إضافية.
   8. زرع جزء من الخلايا لاختبار التألق المناعي كما هو موضح في الخطوة 2. احتفظ بالخلايا المتبقية للتحقق من RAD51 من الانهيار عن طريق الكشف المناعي.
   9. تحقق من إلغاء RAD51 عن طريق السحب المناعي
      1. خلايا التحليل في مخزن التحلل البارد الجليدي يحتوي على 50 ملليمولار من HEPES (درجة الحموضة 7.6)، 150 ملليمولار NaCl، 1 ململ EDTA، 1٪ ترايتون X-100، 10 ملليمولار NaF، 30 ملليمولار بيروفوسفات الصوديوم، 1 ملليمولار Na₃VO₄، 10 ملليمولار β-جليسروفوسفات، وكوكتيل مثبط بروتياز (قرص واحد لكل 10 مل من محلول التحلل).
      2. قم بتوضيح المحللات عن طريق الطرد المركزي عند 18,800 جرام × لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وحدد تركيز البروتين باستخدام اختبار بروتين مناسب.
      3. اخلط كمية مناسبة من بروتين ليزات مع 4× محلول عينات Laemmli لتحقيق تركيز نهائي 1×.
      4. أضف β-ميركابتوإيثانول إلى تركيز نهائي يبلغ 20٪، وسخن العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة قبل SDS-PAGE.
      5. فصل كميات متساوية من البروتين بواسطة SDS-PAGE ونقل البروتينات إلى غشاء مناسب لتحليل القطع المناعية.
      6. قم بإغلاق الغشاء بحليب 5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هز.
      7. اغسل الغشاء ثلاث مرات (5 دقائق لكل مرة) بمحلول ملحي مبلل ب 1× تريس-بافر مع Tween 20 (TBST) في درجة حرارة الغرفة مع الرج.
      8. حضن الغشاء بأجسام مضادة متعددة النسيلات لأنبوبة مضادة RAD51 (تخفيف 1:1,000) أو أجسام مضادة للأكتين (تخفيف 1:1000) عند 4 درجات مئوية لمدة 16–18 ساعة مع الرج.
      9. اغسل الغشاء ب 1× TBST (5 دقائق لكل واحدة) في درجة حرارة الغرفة مع هز.
      10. حضن الغشاء بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب أو مضاد للفأر مضاد IgG مضاد للفجل (HRP) (تخفيف 1:10,000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الرج.
      11. غسل الغشاء ب 1× TBST (5 دقائق لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة مع الرج، واكتشف الأشرطة المناعية النشطة باستخدام طريقة الكشف الكيميائي الدقيقة المناسبة، وتأكيد استنزاف RAD51 بالنسبة للخلايا التي تم نقلها بواسطة siRNA التحكم غير المستهدف.

2. بذر الخلايا

1. عندما تصل الخلايا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي (حوالي 70–80٪ من التلاقط)، استنشق وسط الزراعة وغسل الخلايا بلطف مرة واحدة بمحلول ملحي معقم بفوسفات (PBS) لإزالة المصل المتبقي.
2. أضف كمية كافية من محلول تريبسين–EDTA بنسبة 0.25٪ لتغطية طبقة الخلية الأحادية (مثلا، 1–2 مل لكل قارورة T175) وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 2–5 دقائق، مع مراقبة انفصال الخلية تحت المجهر.
3. بمجرد انفصال الخلايا، قم بتحييد التربسين فورا بإضافة حجم مماثل من وسط الزراعة الكامل يحتوي على FBS.
4. اجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل
5. تحديد مدى بقاء الخلية وتركيزها باستخدام استبعاد تريبان بلو ومقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي قبل البذر.
6. جهز تعليق خلية واحدة في وسط نمو كامل بتركيز 4 × 10⁴ خلايا/مل.
7. يتم زرع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من شريحة حجرة زجاجية ذات 8 آبار لتحقيق كثافة نهائية تبلغ 8,000 خلية لكل بئر.
8. حضن منزلقات الحجرة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بتثبيت الخلايا.
   ملاحظة: قد يختلف عدد الخلايا التي تزرع حسب نوع الخلية. جهز تعليق خلوي زائد يكفي لبئر إضافية واحدة على الأقل لأخذ الاعتبار تباين المنابيت. زرع كل حالة بشكل مكرر أو أكثر لضمان قابلية التكرار. إذا كان التعديل الدوائي لمعدل ضربات القلب مرغوبا مرغورا، يجب معالجة الخلايا بعد الالتصاق الليلي (12–16 ساعة بعد البذر). يجب تعديل كثافة البذر حسب الحاجة لضمان وصول الخلايا إلى نقطة التقاء مناسبة وقت العلاج والتحليل اللاحق، مع الأخذ في الاعتبار التأثيرات المتوقعة للعامل الدوائي على تكاثر الخلايا أو قابليتها للبقاء في الداخل. نظرا لأن معدل ضربات القلب يحدث بشكل رئيسي خلال مرحلتي S وG2 من دورة الخلية، حافظ على الزراعة في النمو اللوغاريتمي وتجنب التلاقي الزائد. بالنسبة للتجارب التي تتضمن علاجات قد تغير تقدم دورة الخلية، قد تجرى عمليات دمج EdU، أو تحليل محتوى الحمض النووي، أو قياسات أخرى لدورة الخلية لتسهيل تفسير نتائج تركيز RAD51. تضمين عناصر تحكم غير معالجة (–IR) ومشعة (+IR) في كل تجربة لإثبات تكوين بؤر RAD51 القاعدية وDNA الناتجة عن تلف الحمض النووي على التوالي. عند إجراء اضطرابات تتوسط بواسطة siRNA، تشمل حالات siRNA التحكم غير المستهدفة (مثل siLUC) وحالات siRNA الخاصة بالهدف (مثل siRAD51.). يوصى باستخدام ضوابط بدون أجسام مضادة أولية وبدون أجسام مضادة ثانوية أثناء تحسين الأجسام المضادة لتقييم التلوين غير النوعي والفلورة الخلفية.

3. استثناء تلف الحمض النووي بواسطة الأشعة تحت الحمراء

1. الخلايا المعرضة على الحجرة تنزلق للأشعة تحت الحمراء بجرعة 6 جيجاب²¹ لتحفيز DSBs من الحمض النووي.
2. أعد الشرائح فورا إلى حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
3. حضن الخلايا لمدة 6 ساعات بعد الأشعة تحت الحمراء.
   ملاحظة: تم تسليم الأشعة تحت الحمراء باستخدام جهاز RS-2000 Biological Irradiator يعمل بجهد 160 كيلوفولت و25.0 مللي أمبير (موضع الرف 5). تم إشعاع الخلايا في درجة حرارة الغرفة بجرعة واحدة من 6 جيج (حوالي 4.8 جيجين/دقيقة) وأعيدت فورا إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للاسترجاع. كان المشع يضبط بشكل روتيني وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، وجميع الإجراءات تجرى وفقا لإرشادات السلامة من الإشعاع المؤسسية. تم تأسيس فترة حضانة الأشعة تحت الحمراء لمدة 6 ساعات مسبقا^{15، 17، 22}. قد يختلف التوقيت الأمثل بين أنواع الخلايا ويجب تحسينه لكل خط خلوي.

4. التثبيت والنفاذية

1. استنشق وسط الزراعة بعناية من الآبار دون إزعاج الخلايا.
2. ثبت الخلايا باستخدام بارافورمالديهيد 3٪ الجاهز حديثا في 1× PBS لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. استنشق المثبت بلطف واغسل الآبار ثلاث مرات ب 500 ميكرولتر من 1× PBS لكل بئر.
4. نفي الخلايا بنسبة 0.2٪ ترايتون X-100 في 1× PBS لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1× PBS.
   ملاحظة: قم بخطوات التثبيت، والنفاذية، والغسل بلطف عن طريق إضافة وإزالة المحاليل على طول جدار كل بئر لتقليل انفصال الخلايا. ما لم يذكر خلاف ذلك، استخدم 500 ميكرولتر من 1× PBS لكل غسلة.

5. الحجب

1. جهز محلول حاجب عن طريق إذابة 5٪ (بدون ضبط) ألبومين مصل البقري (BSA) في 1× PBS.
2. حضن الخلايا في محلول حاجز لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتقليل ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

6. حضانة الأجسام المضادة الأولية

1. أزل محلول الانسداد واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1× PBS.
2. جهز الأجسام المضادة الأولية عند التخفيف المناسب في محلول الحظر. تستخدم أجسام مضادة متعددة النسيلة لأنتو-RAD51 (1:1000) ومضادة للفوسفو-هيستون H2AX (γH2AX) (1:1000) وحيدة النسيلة للفأر، حيث يعمل γH2AX كعلامة على^{DSBs 23,24}.
3. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف إلى كل بئر.
4. حضن السلايدات في درجة حرارة الغرفة لمدة 16–18 ساعة في غرفة رطبة لمنع التبخر.
   ملاحظة: يمكن دمج الجسمين المضادة الرئيسيين في نفس المحلول للتلوين المتزامن.

7. حضانة الأجسام المضادة الثانوية

1. جهز الأجسام المضادة الثانوية عند التخفيف المناسب في محلول الانسداد. يستخدم IgG مضاد للماعز المقترن 488 من أليكسا فلور 488 (1:350) للكشف عن RAD51، ويستخدم أليكسا فلور 594 المضاد للفأر IgG (1:350) للكشف عن γH2AX.
2. استنشق محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1× PBS.
3. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى كل بئر.
4. حضانة منزلقات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   ملاحظة: يمكن دمج الجسمين المضادين الثانويين للكشف المتزامن. من هذا القسم فصاعدا، قم بأداء جميع الخطوات في مساحة محمية بالضوء لتقليل التبييض الضوئي.

8. التلوين النووي المضاد والتركيب

1. جهز محلول Hoechst 33342 بتخفيف بنسبة 1:1,000 في 1× PBS لصبغ النوى.
2. استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل الخلايا مرة واحدة ب 1× PBS.
3. حضن الخلايا بمحلول Hoechst 33342 مخفف لمدة 90 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
4. استنشق محلول Hoechst 33342 واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1× PBS.
5. قم بإزالة 1× PBS وافصل الغرفة العلوية عن شرائح الزجاج، وأضف حوالي 25 ميكرولتر من تركيب مضاد التصبغ إلى كل بئر.
6. ضع أغطية زجاجية فوق الخلايا المثبتة، لضمان تلامس متساو مع المثبت.
7. أزل فقاعات الهواء بلطف وأغلق الحواف بطلاء الأظافر.
   ملاحظة: يوفر التلوين النووي المضاد مرجعا للنوى، مما يسهل تحديد الموقع الدقيق وقياس تركيزات RAD51 وγH2AX النووية.

9. التصوير والقياس الكمية لتركيزات RAD51 في DSBs

1. شرائح الصور فورا أو تخزينها عند 4 درجات مئوية في صندوق شرائح في الظلام حتى التحليل.
   ملاحظة: لتقليل احتمال تدهور الإشارة والتبييض الضوئي، التقط الصور في أقرب وقت ممكن، ويفضل خلال أسبوع واحد من التركيب.
2. التقاط الصور باستخدام مجهر كونفوكال مع خطوط ليزر ومجموعات مرشح مناسبة: Hoechst 33342 (405 نانومتر) للنوى، Alexa Fluor 488 (488 نانومتر) ل RAD51، وأليكسا فلور 594 (561/594 نانومتر) ل γH2AX.
3. إجراء التصوير الكونفوكلي باستخدام هدف عالي التكبير مناسب لتحليل البنى تحت الخلية.
4. قم بقياس تركيزات RAD51 يدويا عن طريق عد البؤر النووية المنفصلة التي تتزامن مع γH2AX؛ استبعد البؤر غير المتمركزة مع γH2AX.
   ملاحظة: التحقق من أداء الأجسام المضادة قبل التحليل الكمي من خلال تأكيد تركيز RAD51 وγH2AX النووي الناتج عن IR في الخلايا الضابطة وتقليل إشارة RAD51 بعد معالجة siRNA ب RAD51. قم بقياس تركيزات RAD51 النووية المنفصلة فقط التي تتشارك مع γH2AX في النوى ذات الشكل السليم وأنماط التلوين الواضحة؛ استبعد التلوين المنتشر أو غير النووي، وإشارات RAD51 غير الموضعية، والخلايا المتداخلة أو متعددة الأنوية، والخلايا الانقسامية، والخلايا المايتوتيكية. حافظ على إعدادات تصوير متطابقة داخل كل تجربة وطبق معايير تقييم يدوية متسقة على جميع الحالات. تحليل ~50 نواة لكل حالة من عدة مجالات رؤية لكل نسخة بيولوجية وإجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة على الأقل. أبلغ عن عدد البؤر المتمركزة المشتركة RAD51/γH2AX لكل نواة باستخدام تحليل إحصائي مناسب.

10. التحليل الإحصائي

1. قم بقياس البؤر المشتركة RAD51/γH2AX من حوالي 50 نواة لكل حالة.
2. قدم البيانات كمتوسط ± SD من ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة على الأقل.
3. إجراء مقارنات إحصائية باستخدام اختبار إحصائي مناسب (مثل اختبار Student t غير ثنائي الطرفين للمقارنات بين مجموعتين أو تحليل ANOVA أحادي الاتجاه للمقارنات متعددة المجموعات)
4. اعتبر الصفحة < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
5. قم بإجراء تحليلات إحصائية وتوليد الرسوم البيانية باستخدام GraphPad Prism (الإصدار 10.6.1).

النتائج

يحفز الأشعة تحت الحمراء تكوين بؤر RAD51 عند DSBs للحمض النووي في خلايا OVCAR-8
لتقييم نشاط معدل ضربات القلب بشكل وظيفي، تم فحص تكوين بؤر RAD51 في خلايا سرطان المبيض OVCAR-8 المتخصصة في معدل ضربات القلب بعد تحفيز DSBs للحمض النووي بواسطة IR. لتحديد خصوصية الاختبار وتأكيد أن البؤر المرصودة تمثل أحداث ضربات قلب معتمدة على RAD51 الحقيقية، تم نقل الخلايا إما بسيRNA لوسيفيراز التحكم غير المستهدف (siLUC) أو siRNA مستهدف RAD51 (siRAD51).

المناقشة

يوفر الكشف القائم على الفلورية المناعية لتركيزات RAD51 النووية الموصوفة هنا نهجا موثوقا ووظيفيا لتقييم نشاط معدل ضربات القلب في خلايا سرطان المبيض المزروعة. على عكس التحليلات الجينومية أو النسخية التي تستنتج حالة معدل ضربات القلب بشكل غير مباشر، فإن تكوين بؤر RAD51 يعكس مباشرة قدرة الخلية على تجنيد وتجميع آليات نبض القلب الأساسية في مواقع DSBs للحمض النووي. وبالتالي، يعمل هذا الاختبار كقراءة حساسة لكفاءة معدل ضربات القلب بعد تلف الحمض النووي، وهو مناسب جدا للدراسات الميكانيكية التي تبحث ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Home-made	NA	Resolving gel for SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Home-made	NA	Stacking geL for SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Used to detach adherent cells during routine passaging and prior to cell seeding.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Diluted to 1× and used for washing steps, blocking solution, antibody dilutions, fixation, and permeabilization.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Home-made	NA	Run to proteins sample in the gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Home-made	NA	Transfter the protein from gel to membrane
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	buffer
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	For SDS-PAGE
ABTR2 cells	Mayo clinic	NA	acquired PARPi-resistant ovarian cancer cell lines
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.	Home-made	NA	Cell lysis buffer
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Molecular biology as a polymerization for gels an oxidizing agent used as a free-radical initiator
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Primary antibody used to detect γH2AX foci. Used at 1:1000 dilution
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Primary antibody used to detect RAD51 nuclear foci as a marker of homologous recombination activity. Used at 1:1000 dilution
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	Used to prepare blocking solution (5% BSA in PBS) to reduce non-specific antibody binding during immunofluorescence staining.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Imaging system
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	Immunofluorescence imaging, γH2AX foci analysis, RAD51 foci quantification, protein co-localization, and 3D image acquisition
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Automated Cell Counter
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Placed over mounted samples to protect stained cells and enable high-resolution imaging.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Electroporation system suitable for applications for gene delivery in mammalian cells
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Added to RPMI-1640 (as 8%) to support cell growth and viability.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Buffer
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Secondary antibody used to detect γH2AX primary antibody. Used at 1:350 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Secondary antibody used to detect RAD51 primary antibody. Used at 1:350 dilution
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	Statistical analysis, graph generation, and data visualization.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	PH maiantance buffer in the pH 7.2-7.6 range
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	was used for nuclear staining
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Secondary antibody used for detection of mouse (β-actin) primary antibody in Western blotting.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Secondary antibody used for detection of rabbit primary antibody (RAD51) in Western blotting.
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	Blocking reagent
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Sample Buffer
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	Used to routinely confirm that cell cultures are free of mycoplasma contamination.
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl	Home-made	NA	Resolving gel for SDS-PAGE
Mouse monoclonal Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8226	Primary antibody used to detect β-actin as a loading control in Western blot analyses.
Non-targeting control luciferase siRNA (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′	Horizon Discovery	NA	working concentration 20 nmol
Nunc Lab Tek II, 8-chamber slide W/cover RS Glass slide sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	Used for seeding and culturing cells for immunofluorescence staining and confocal imaging.
OVCAR-8 cells	National Cancer Institute, (NIH)	NA	Ovarian cancer cell lines
Paraformaldehyde 16% Aqueous Solution EM Grade	Electron microscopy sciences	15710-S	Diluted to 3