مقالة منهجية

سير عمل فعال من حيث التكلفة للفلورة المناعية أحادية ومتعددة الألوان في المزارع الخلوية ثنائية الأبعاد الملتصقة على شرائح زجاجية غطائية

68 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71114

⸱

سبتمبر 1, 2026

 , 
1Laboratório de Vetores Virais (LVV), Centro de Investigação Translacional em Oncologia (CTO)/LIM24, Centro de Estudos e Tecnologias Convergentes para Oncologia de Precisão (C2PO), Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (FMUSP)

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول سير عمل فعال من حيث التكلفة لإجراء التألق المناعي (IF) الأحادي والمتعدد لزراعات الخلايا ثنائية الأبعاد الملتصقة، مما يقلل من التكاليف التجريبية من خلال استخدام شرائح غطاء زجاجية غير مكلفة، وأطباق قياسية ذات 24 بئراً، وظروف صبغ ذات أحجام منخفضة تقلل من استهلاك الأجسام المضادة، مع توفير نهج تمثيلي لتحديد تموضع البروتين باستخدام مجهر الفلورسنت القياسي.

الملخص

يُعد مجهر التألق المناعي (IF) تقنية واسعة الاستخدام لتصوير تموضع البروتين والتوزيع المشترك بدقة الخلية الواحدة مع الحفاظ على المورفولوجيا الخلوية والتنظيم تحت الخلوي. يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم سير عمل عملي وفعال من حيث التكلفة للتلوين المناعي أحادي ومتعدد الألوان للمزارع الخلوية الملتصقة ثنائية الأبعاد (2D) باستخدام مواد مختبرية قياسية. تعتمد هذه الطريقة على زراعة الخلايا على أغطية زجاجية رخيصة الثمن توضع في أطباق تقليدية ذات 24 بئراً، وتنفذ التعددية من خلال فصل الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية، واستخدام فلوروفورات متمايزة طيفياً، وظروف ضبط قوية، بما في ذلك ضوابط عدم وجود جسم مضاد أولي، وعدم وجود جسم مضاد، والتلوين الفردي، وضوابط التداخل (crosstalk) لضمان إمكانية تفسير نتائج التألق المناعي المتعدد. وتُستخدم خطوات تلوين ذات أحجام منخفضة لتقليل استهلاك الكواشف والأجسام المضادة دون المساس بجودة الإشارة. يتجنب سير العمل هذا الحاجة إلى أطباق أو غرف تصوير متخصصة، وهو متوافق مع مجهر التألق واسع المجال أو المجهر البؤري الاعتيادي. وبشكل عام، يوفر هذا البروتوكول سير عمل ميسراً وعملياً للتألق المناعي للتقييم التمثيلي لتموضع البروتين والتوزيع المشترك في المزارع الخلوية الملتصقة. ويتطلب التكيف مع أنواع أخرى من الخلايا أو مجموعات الأجسام المضادة تحسيناً خاصاً بالهدف، بما في ذلك التحقق من صحة الأجسام المضادة، وظروف التثبيت والنفاذية، واختيار الفلوروفور، والتوافق مع المجهر ومجموعات المرشحات.

المقدمة

يُستخدم مجهر التألق المناعي (IF) على نطاق واسع لتصور التموضع تحت الخلوي، والوفرة النسبية، والتموضع المشترك للبروتينات في الخلايا المثبتة، وبذلك يتم ربط العلامات الجزيئية بالمورفولوجيا الخلوية والسياق تحت الخلوي1,2. وبخلاف القراءات الإجمالية (مثل لطخة مناعية) أو فحوصات الخلية الواحدة التفكيكية (مثل قياس التدفق الخلوي)، يحافظ التألق المناعي على التنظيم المكاني الخلوي ويكون مفيداً بشكل خاص لتقييم التباين المظهري من خلية إلى أخرى والتغيرات في توزيع البروتين تحت الخلوي بدقة الخلية الواحدة3,4,5. ونظراً لأن التساؤلات التجريبية تتطلب بشكل متزايد تقييماً متزامناً لعلامات متعددة، فإن التألق المناعي المتعدد (multiplex IF) يتيح الكشف المتزامن عن هدفين أو أكثر داخل العينة نفسها، وعادة ما يتم ذلك عن طريق دمج أجسام مضادة أولية تم إنتاجها في أنواع مضيفة مختلفة مع فلوروفورات متميزة طيفياً6 (الشكل 1)، باستخدام استراتيجيات كشف مباشرة و/أو غير مباشرة (الشكل 2). ومع ذلك، فإن تعدد الإشارات يفرض تحديات تقنية رئيسية، خاصة التفاعل المتصالب للأجسام المضادة والتداخل الطيفي، والتي قد تؤثر على إمكانية التفسير ما لم يتم معالجتها من خلال تصميم دقيق للوحة الأجسام المضادة وظروف ضبط صارمة7,8.

الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير سير عمل عملي ومنخفض التكلفة، قابل للتطبيق على نطاق واسع مع الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها بواسطة التألق المناعي، ومحسن للتصوير الروتيني للمزارع الخلوية الملتصقة ثنائية الأبعاد (2D). يتم تنفيذ تعدد الإشارات (Multiplexing) من خلال الفصل بين الأنواع المضيفة، واستخدام فلوروفورات متميزة طيفيًا، ومجموعات ضابطة للتحقق من مستويات الخلفية وأداء التلوين9,10. ومن خلال استخدام أغطية زجاجية بقطر 12 mm في أطباق قياسية مكونة من 24 بئرًا بدلاً من الشرائح ذات الغرف المتخصصة، يتجنب سير العمل هذا استخدام مستهلكات مخصصة وعالية التكلفة لصالح مواد متوفرة بشكل قياسي في معظم مختبرات زراعة الخلايا. كما يستخدم سير العمل كمية أقل بكثير من محلول التلوين لكل وحدة مساحة نمو (150 µL لـ ≈1.13 cm2، أو ≈133 µL/cm2) مقارنة بتنسيقات الأغطية الزجاجية ذات الغرف المماثلة11,12، والتي تتطلب عادةً 300–500 µL/cm2، مما يمثل انخفاضًا بنحو 2 إلى 4 أضعاف في استهلاك الأجسام المضادة والكواشف لكل وحدة مساحة. وبناءً على ذلك، يدعم البروتوكول التقييم النوعي لتعدد الأهداف لتحديد تموضع العلامات وتوزيعها المشترك باستخدام المجاهر التقليدية ذات المجال الواسع أو المجاهر البؤرية (confocal)، إلى جانب صبغات التباين للهيكل الخلوي والنواة. هذا سير العمل مخصص للتألق المناعي (IF) التقليدي للخلايا المثبتة بناءً على الفصل بين الأنواع المضيفة والتمييز الطيفي، وليس مصممًا لنهج تعدد الإشارات التكرارية أو عالية الأبعاد.

البروتوكول

لم تتضمن هذه الدراسة مشاركين بشريين أو حيوانات تجارب. أُجريت جميع التجارب باستخدام خط خلايا D17 لسرطان العظام لدى الكلاب، وهو خط خلايا معتمد تم الحصول عليه من بنك خلايا عام (Banco de Células do Rio de Janeiro، رقم الكتالوج 0276). وبناءً على ذلك، لم تكن هناك حاجة للحصول على موافقة أخلاقية.

1. صيانة الخطوط الخلوية

  1. يتم الحفاظ على الخلايا الملتصقة تحت ظروف الزرع القياسية (37 °C، و5% CO₂، في حاضنة رطبة) باستخدام الوسط الكامل المناسب لسلالة الخلايا المستخدمة.
    ملاحظة: كمثال تمثيلي، يتم الحفاظ على خلايا D17 من الساركوما العظمية الكلبية (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], رقم الكتالوج 0276) في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) المدعم بـ 10% مصل جنين البقر (FBS) و1% مضاد حيوي ومضاد للفطريات، ويتم استزراعها فرعياً عند وصول نسبة التلاقي إلى 70–80% باستخدام trypsin-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)، وتُستخدم ضمن نطاق ممرات مُعتمد (على سبيل المثال، الممرات 5–20).
  2. يتم التأكد من خلو الخلايا من الميكوبلازما قبل البدء بالتجارب باستخدام مقايسة معتمدة للكشف عن الميكوبلازما.

2. تحضير الطبق ذو الـ 24 بئراً وأغطية الشرائح الزجاجية

ملاحظة: يجب تنظيف أسطح أغطية الشرائح عن طريق غمرها في ethanol بتركيز 70% (لمدة 5 min، وتكرر العملية 3×) قبل التعقيم بأي من الطريقتين الموضحتين أدناه؛ وبعد التعقيم، يجب تخزين أغطية الشرائح في حاوية مغلقة في درجة حرارة الغرفة حتى وقت الاستخدام.

  1. ضع أغطية زجاجية دائرية نظيفة بقطر 12 مم في طبق بتري زجاجي (أو حامل أغطية زجاجية) وعقمها باستخدام الموصدة. قم أيضاً بتعقيم زوج من الملاقط المعدنية دقيقة الطرف باستخدام الموصدة.
  2. بديل: نظّف أغطية الشرائح والملاقط باستخدام إيثانول بتركيز 70%، واتركها لتجف في الهواء، ثم قم بتطهير السطح عن طريق التعريض للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة داخل كابينة السلامة البيولوجية قبل الاستخدام. تُحفظ أغطية الشرائح المعقمة في وعاء مغلق في درجة حرارة الغرفة حتى وقت الاستخدام.
  3. في كابينة السلامة البيولوجية، استخدم ملقطاً معقماً لنقل غطاء شريحة معقم واحد إلى كل بئر مخصص للمجموعات التجريبية في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً.
  4. اختياري: تُطلى أغطية الشرائح بطبقات محفزة للالتصاق وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة أو الإرشادات المختبرية المعتمدة، إذا كان ذلك مطلوباً لنوع الخلايا المستخدم.
    ملاحظة: تظهر خيارات الطلاء (poly-L-lysine، أو الكولاجين من النوع الأول collagen I، أو الفبرونكتين fibronectin) وتركيزاتها التشغيلية في الـ جدول الموادتعد أغطية الشرائح المعقمة وغير المطلية كافية لمعظم الخطوط الخلوية الملتصقة التي تُزرع على الزجاج؛ وقد تكون مكونات الطلاء مستضدية، لذا يجب ألا يتفاعل الطلاء المختار بشكل متصالب مع أي من الأجسام المضادة الموجودة في اللوحة.
  5. إذا كانت الشرائح الغطائية مغلفة، يتم سحب محلول التغليف الزائد، وشطفها مرة واحدة بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم، وترك الشرائح الغطائية لتجف في الهواء داخل كبينة السلامة البيولوجية قبل استزراع الخلايا.

3. المجموعات التجريبية

  1. تضمين مجموعة من الضوابط المناسبة لتصميم التعددية (multiplex).
    ملاحظة: يكشف ضابط "بدون أجسام مضادة" (غياب الأجسام المضادة الأولية والثانوية) عن التألق الذاتي الجوهري، بينما يقيم ضابط "بدون جسم مضاد أولي" (مزيج الأجسام المضادة الثانوية بدون أي جسم مضاد أولي) الارتباط غير النوعي للأجسام الثانوية والخلفية عبر جميع القنوات في وقت واحد؛ وبما أن هذا البروتوكول يستخدم أجساماً مضادة ثانوية متميزة طيفياً بشكل صارم، فإن هذا الضابط الفردي يقيم كل جسم مضاد ثانوي بشكل مستقل ضمن قناته الخاصة، مما يحقق الغرض ذاته الذي يحققه ضابط "الأجسام الثانوية فقط" لكل فلوروفور. أما ضوابط الصبغ الفردي، والتي يتم فيها تطبيق كل زوج من (الأجسام الأولية-الثانوية) بشكل منفصل، فهي تتحقق من أداء كل جسم مضاد قبل الدمج المتعدد، وتسمح، من خلال المقارنة مع حالة التعددية، بتقييم التداخل الطيفي (spectral crosstalk) لكل زوج من الفلوروفورات. ويُستخدم، كلما كان ذلك ممكناً، ضابط إيجابي يعبر عن المستضد المستهدف لتأكيد أداء المقايسة.

4. استزراع الخلايا (الزراعة) على شرائح التغطية

  1. داخل كابينة السلامة البيولوجية، قم بفصل الخلايا باستخدام التريبسين (أو أي طريقة تفكيك أخرى مناسبة)، ثم قم بمعادلتها وإعادة تعليقها في وسط زراعة كامل.
  2. قم بعد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي أو مقياس كرات الدم (hemocytometer).
  3. خفف الخلايا لتصل إلى 6 × 104–1 × 105 cells/mL.
  4. أضف 0.5 mL من معلق الخلايا لكل بئر (العدد النهائي: 3 × 104–5 × 104 cells/well).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن استخدام طرف ماصة معقم لضمان استقرار غطاء الشرائح بشكل مسطح في قاع البئر برفق، مع تجنب حدوث أي خدوش.
  5. قم بحضن الخلايا تحت الظروف القياسية (37 °C، 5% CO₂) حتى تلتصق الخلايا وتصل إلى درجة التلاقي المطلوبة أو الوصول إلى النقطة الزمنية التجريبية المحددة.

5. معالجة الخلايا (اختياري)

  1. حدد توقيت المعالجة وفقاً للتصميم التجريبي. قد تشمل المعالجة العلاج الدوائي، أو التحفيز بالسيتوكينات، أو التلاعب الجيني لتحفيز أو تثبيط تعبير الجين المستهدف، أو أي تدخلات تجريبية أخرى حسب الاقتضاء.
  2. ضع علامات على الآبار لتمييز مجموعات الضبط والمجموعات المعالجة.
  3. قم بالتحضين للفترات الزمنية المطلوبة؛ وتجنب وصول الخلايا إلى درجة عالية من التلاقي (over-confluency)، حيث أن النمو المفرط يزيد من الضجيج الخلفي ويؤثر سلباً على المورفولوجيا.
    ملحوظة: يجب أن تكون الخلايا ملتصقة بغطاء الشريحة قبل التثبيت، إلا إذا كان التصميم يتطلب التثبيت فوراً بعد استزراع الخلايا.
  4. بالنسبة للأهداف التي تُفرز بسرعة (مثل السيتوكينات)، أضف brefeldin A (BFA) إلى وسط الزرع بتركيز نهائي يتراوح بين 1–10 µg/mL (شائعاً 5 µg/mL)، وحضنها لمدة 4–6 h عند 37 °C و 5% CO₂ قبل التثبيت.
  5. أزل الوسط الذي يحتوي على BFA وانتقل فوراً إلى خطوة التثبيت.

6. صبغ التألق المناعي

ملاحظة: بدءاً من مرحلة التثبيت، لا تطلب التقنية المعقمة؛ حيث يمكن إجراء الصبغ على طاولة العمل، مع استخدام خزانة استنشاق الغازات الكيميائية عند التعامل مع أي كاشف يحمل علامة تحذير (CAUTION). يجب ألا تجف العينات في أي مرحلة؛ وعند السحب، تُترك طبقة رقيقة من المنظم، ويُضاف المحلول التالي على الفور.

  1. التثبيت (اختر واحداً):
    ملاحظة: يتم اختيار المثبت وفقاً لموقع الهدف وحساسية الحاتمة (انظر المناقشة): يناسب البارافورمالدهيد (PFA) (فورمالدهيد مُحضّر من بارافورمالدهيد) معظم الأهداف وهو متوافق مع الفالويدين؛ بينما قد يساعد الميثانول في بعض الحواتم النووية أو المفسفرة ولكنه يضعف صبغ F-actin.
    1. التثبيت بواسطة PFA (موصى به لمعظم الأهداف):
      1. قم بشفط الوسط واغسل بلطف مرة واحدة باستخدام محلول ملحي منظم بالترس (TBS) (0.5 mL/well).
      2. أضف 4% PFA في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) (0.5 mL/well) واحضن العينات لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C).
      3. قم بشفط PFA واغسل 3× باستخدام TBS (قم بالشفط فوراً؛ ولا تترك الآبار تجف).
        ملاحظة: تحذير: مادة PFA سامة ومسرطنة محتملة. تعامل مع محاليل PFA في خزانة أبخرة كيميائية معتمدة مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والقفازات، وواقي العينين). تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد، وتخلص من النفايات وفقاً لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.
  2. بدلاً من ذلك، التثبيت بالميثانول (مفيد لبعض المستضدات النووية وحواتم مفسفرة معينة):
    1. برد الميثانول 100% مسبقاً حتى تصل درجة حرارته إلى −20 °C.
    2. أضف الميثانول المبرد جداً مباشرة إلى الخلايا (0.5 mL/well) واحضنها لمدة 5 min عند −20 °C.
    3. اغسل 3× باستخدام TBS (قم بالشفط فوراً؛ ولا تترك الآبار تجف).
      ملاحظة: بعد التثبيت بالميثانول، قد لا تكون هناك حاجة لنفاذية إضافية، ويجب تحسين ذلك لكل جسم مضاد/حاتمة. يمكن أن يؤدي التثبيت بالميثانول إلى تلف حواتم الغشاء وإضعاف صبغ الفالويدين المقترن بالفلوروفور/F-actin. تحذير: الميثانول مادة سامة ومتطايرة وسريعة الاشتعال للغاية. تعامل معه في منطقة جيدة التهوية أو خزانة أبخرة كيميائية؛ وارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة؛ وأبعده عن اللهب المكشوف ومصادر الحرارة. نقطة توقف اختيارية: بعد التثبيت، تُحفظ العينات عند 4 °C في PBS يحتوي على تركيز منخفض من المثبت (مثلاً PBS + 0.1% PFA) لمدة تصل إلى أسبوع واحد؛ وتحقق من توقيت التخزين لكل مستضد.
  3. إخماد الألدهيد (اختياري)
    1. احضن العينات مع 50 mM glycine في TBS (0.5 mL/well) لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C).
    2. اغسل 3× باستخدام TBS + 0.05% polysorbate 20.
      ملاحظة: يعمل الجلايسين على تحييد مجموعات الألدهيد الحرة المتبقية بعد التثبيت بـ PFA، مما يقلل من التألق الذاتي المرتبط بالتثبيت ويحسن خصوصية صبغ الأجسام المضادة.
  4. النفاذية
    1. في حال استهداف بروتينات الغشاء، تخطَّ خطوة النفاذية وانتقل إلى الخطوة 6.5.1.
    2. في حال استهداف بروتينات داخل خلوية أو نووية، قم بإجراء النفاذية باستخدام 0.1–0.3% من منظف غير أيوني في TBS (0.5 mL/well) لمدة 5–10 min في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C).
    3. اغسل 3× باستخدام TBS + 0.05% polysorbate 20 (TBST).
      ملاحظة: يتم تحسين تركيز ووقت المنظف غير الأيوني Octylphenol ethoxylate وفقاً للهدف؛ ويتم الحكم على الكفاية من خلال الإشارة في الحيز الصحيح، والحفاظ على المورفولوجيا، ووضوح F-actin، وانخفاض الخلفية (انظر المناقشة). في حال استخدام saponin، يتم الحفاظ عليه في جميع محاليل الأجسام المضادة ومحاليل الغسيل اللاحقة. تحذير: المنظف غير الأيوني Octylphenol ethoxylate ضار في حال استنشاقه أو ملامسته للجلد وقد يسبب تهيج العينين. تعامل معه باستخدام القفازات وتجنب تكوين الرذاذ.
  5. الحجب
    1. أضف 0.5 mL/well من محلول الحجب (5% bovine serum albumin (BSA) في TBS) واحضنها لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C).
    2. قم بشفط محلول الحجب.
    3. انتقل مباشرة إلى حضن الجسم المضاد الأولي (لا تغسل).
  6. حضن الجسم المضاد الأولي
    ملاحظة: يتم تحديد تخفيفات الأجسام المضادة الأولية والثانوية تجريبياً عن طريق المعايرة (انظر المناقشة).
    1. قم بتحضير مجموعات الأجسام المضادة الأولية المفردة أو المتعددة في محلول ملحي منظم بالترس يحتوي على 0.05% polysorbate 20 و 1% BSA (TBST-BSA 1%)، باستخدام تركيزات أجسام مضادة محسنة مسبقاً لكل هدف.
    2. بالنسبة للفلورة المناعية المتعددة، ادمج جميع الأجسام المضادة الأولية غير المقترنة الموجهة ضد مستضدات متميزة من أنواع مضيفة مختلفة (مثلاً mouse anti-interferon-β (IFN-β) + rabbit anti-p14ARF + goat anti-actin) في كوكتيل واحد من الأجسام المضادة.
    3. أضف 150 µL لكل بئر، مع التأكد من تغطية الشريحة الزجاجية بالكامل بمحلول الجسم المضاد.
      ملاحظة: لمنع التبخر عند الأحجام المنخفضة، يتم حضن الصفيحة في غرفة مرطبة (مثلاً صندوق مغلق به منديل مبلل).
    4. احضن العينات لمدة 1.5 h في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C) أو 12–16 h عند 4 °C.
    5. اغسل 3× باستخدام TBST لمدة 3 min لكل غسلة في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C)، وقم بالشفط فوراً بعد كل غسلة.
  7. حضن الجسم المضاد الثانوي (والأولية المقترنة مباشرة، عند الاقتضاء)
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعداً، تُحفظ العينات محمية من الضوء لمنع التبييض الضوئي. تُستخدم فلوروفورات متميزة طيفياً عبر الأجسام المضادة الثانوية وأي أجسام أولية مقترنة مباشرة لتقليل التداخل (crosstalk)، وتُستخدم أجسام مضادة ثانوية متخصصة للأنواع وممتزة بشدة لتقليل الارتباط بالأجسام المضادة الأولية غير المتوافقة. يتم تناول تصميم مجموعة الفلوروفورات، بما في ذلك العلامات النووية والهيكلية الخلوية، وتوافق استثارة/انبعاث المجهر في قسم المناقشة.
    1. خفف الأجسام المضادة الثانوية في محلول TBST-BSA 1% باستخدام تركيزات محسنة مسبقاً. بالنسبة للكشف المتعدد، ادمج جميع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة للأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية المستخدمة (جسم مضاد ثانوي واحد لكل نوع مضيف) في كوكتيل واحد.
    2. أضف 150 µL لكل بئر، مع التأكد من تغطية الشريحة الزجاجية بالكامل.
    3. احضنها لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C).
      ملاحظة: إذا كانت المجموعة تتضمن جسماً مضاداً أولياً واحداً أو أكثر مقترناً مباشرة، فأضفها مع كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية ومدد فترة الحضن إلى 1.5 h في درجة حرارة الغرفة (حوالي 25 °C).
    4. اغسل 3× باستخدام TBST لمدة 3 min لكل غسلة في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C)، مع الشفط فوراً بعد كل غسلة.

7. صبغ النواة المقابل وصبغ خيوط الأكتين f-actin

  1. أضف صبغة نووية مضادة هي Hoechst 33342 (بنسبة 1:5000) مخففة في محلول TBS، واتركها لتحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (≈25 °C)، مع الحماية من الضوء. وإذا كان سيتم وسم الـ F-actin باستخدام الفالويدين (phalloidin) بدلاً من جسم مضاد مضاد للأكتين (anti-actin antibody)، فيُضاف الفالويدين (1:400) إلى المحلول نفسه.
  2. غسلة 3× بواسطة TBST، مع شفط السائل فوراً بعد كل غسلة (مع مراعاة عدم ترك الآبار تجف).
  3. أضف 0.5 مل من محلول TBS إلى كل بئر للحفاظ على غمر الشرائح الغطائية حتى استعادتها أو تثبيتها.

8. استعادة غطاء الشريحة وتثبيت الشريحة

  1. بينما تظل شرائح التغطية مغمورة في TBS، أدخل طرف إبرة دقيقة أو مشرط تحت حافة شريحة التغطية وارفعها بلطف إلى الأعلى حتى يرتفع أحد الجوانب جزئياً. وباستخدام ملقط دقيق، أمسك شريحة التغطية وأخرجها من البئر.
    ملاحظة: قد يؤدي إزالة شريحة التغطية وهي غير مغمورة إلى التصاقها بشدة بقعر البئر بسبب التوتر السطحي، مما يزيد من خطر كسرها.
  2. أثناء إمساك شريحة التغطية بالملقط، قم بسحب فائض TBS بعناية من الحواف باستخدام جهاز شفط فراغي أو ورق ماص. تجنب لمس السطح المغطى بالخلايا.
    ملاحظة: يجب تجنب وجود سائل متبقٍ زائد، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تخفيف وسط التثبيت وإضعاف وضوح الصورة وتباينها.
  3. ضع شريحة التغطية بحيث يكون جانب الخلايا للأسفل على شريحة زجاجية نظيفة تحتوي على قطرة صغيرة (≈3 µL) من وسط التثبيت.
    ملاحظة: يمكن استخدام وسط تجاري ذاتي التصلب مضاد للتلاشي أو وسط محضر منزلياً يعتمد على 80% glycerol/Phosphate-buffered saline (PBS)؛ يتم ختم التثبيتات القائمة على glycerol بطلاء أظافر شفاف، ويتم اختيار الأوساط الخالية من صبغة النواة بعد الصبغ المقابل. تتوفر إرشادات حول حدود التخزين واستقرار الفلوروفور في قسم المناقشة.
  4. اترك الشرائح لتتصلب أفقياً لمدة ≈24 h، مع حمايتها من الضوء، قبل البدء في التقاط الصور.

النتائج

يدعم هذا البروتوكول صبغ التألق المناعي الأحادي والمتعدد للخلايا الورمية الكلبية الملتصقة والمستزرعة على غطاءات زجاجية، مما يسمح بالتصور المتزامن للمؤشرات النووية والسيتوبلازمية ومؤشرات الهيكل الخلوي مع الحفاظ على المورفولوجيا الخلوية. وتظهر النتائج التمثيلية في الشكل 3.

في التجارب الناجحة، أظهرت خلايا D17 لسرطان العظم لدى الكلاب، والتي تم تعديلها وراثياً للتعبير عن canine p14ARF و canine IFN-β (القسم 5.1)، إشارات فلورية قوية ومناسبة مكانياً مع خلفية منخفضة وأدنى حد من الصبغ غير النوعي. وبالنسبة للخلايا التي تعبر عن p14ARF (الشكل 3A)، كشف التألق المناعي عن تموضع نووي سائد، وهو ما يتفق مع التوزيع المعروف لـ p14ARF داخل الخلية. وقد أتاح استخدام عملية النفاذية بمنظف غير أيوني من octylphenol ethoxylate بتركيز 0.3% وصولاً فعالاً للأجسام المضادة إلى الحواتم النووية مع الحفاظ على مورفولوجيا النواة وسلامة الهيكل الخلوي، وهو ما تم تأكيده من خلال الصبغ النووي المقابل الواضح وبنى الأكتين التي تم تصويرها باستخدام جسم مضاد للأكتين (فلوروفور باعث للون البرتقالي).

بالنسبة للخلايا التي تعبر عن IFN-β (الشكل 3أوتمت ملاحظة إشارة سيتوبلازمية بعد الحضن مع BFA لحظر إفراز البروتين، مما سمح بالتراكم داخل الخلايا والكشف عن هذا السيتوكين الذائب. وفي ظل هذه الظروف، كان النفاذ الخلوي المعتدل كافياً للسماح باختراق الأجسام المضادة دون استخلاص مفرط للمحتويات السيتوبلازمية. وقد تميز التلوين الناجح بفلورة سيتوبلازمية تتراوح بين النقطية والمنتشرة، مع حد أدنى من التداخل الإشاري مع النواة، والحفاظ على بنية الأكتين.

لُوحظت نتائج غير مثالية عندما لم يتم تحسين المعلمات الرئيسية بشكل صحيح. فقد أدى عدم كفاية النفاذية إلى ضعف أو غياب إشارة p14ARF النووية، كما هو موضح في حالة عدم النفاذية (0% من المنظف غير الأيوني octylphenol ethoxylate؛ الشكل 3B والشكل التكميلي 1). وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تؤدي النفاذية المفرطة (≥0.5% من المنظف غير الأيوني octylphenol ethoxylate أو فترات تحضين ممتدة) إلى فقدان جزئي لصبغ الهيكل الخلوي، وزيادة الفلورة الخلفية، وتضرر المورفولوجيا الخلوية. وفي التجارب التي تضمنت بروتينات يتم إفرازها بسرعة (مثل IFN-β)، أدى حذف BFA تكراراً إلى ظهور إشارة داخل خلوية أضعف، مما يعكس الإفراز السريع بدلاً من فشل البروتوكول.

أظهرت ضوابط الصبغ المنفرد (الشكل التكميلي 2) إشارة فقط في القناة المقابلة لكل هدف، مما يدعم خصوصية صبغ التألق المناعي الملحوظ. أما ظروف الضابط السلبي، بما في ذلك ضوابط عدم استخدام الجسم المضاد الأولي وعدم استخدام أي جسم مضاد (الشكل التكميلي 2)، فقد أظهرت صبغ النواة المتوقع، مع إشارة ضئيلة في القنوات المعتمدة على الأجسام المضادة، مما يشير إلى انخفاض التألق الذاتي والحد الأدنى من الارتباط غير النوعي للجسم المضاد الثانوي.

تُظهر هذه النتائج التمثيلية مجتمعة أن البروتوكول يدعم الكشف عن البروتينات ذات التموضعات تحت خلوية متميزة عندما يتم مواءمة التثبيت، وقوة النفاذية، والاستراتيجيات المحددة المعتمدة على الهدف (مثل حجب الإفراز) مع البيولوجيا المستهدفة. يؤدي التحسين المناسب إلى فلورة قوية ومحددة مع خلفية منخفضة ومورفولوجيا خلوية محفوظة، بينما تؤدي الظروف غير المثالية إلى إشارات أضعف أو أكثر ضجيجاً وبنية خلوية متغيرة.

مخطط انسيابي لعملية التصبيغ المناعي في المزرعة الخلوية؛ التثبيت، وحضن الأجسام المضادة، وإعداد المجهر.

الشكل 1: مخطط تدفقي عام لسير عمل التألق المناعي الأحادي والمتعدد.الخطوات الرئيسية بدءاً من الحفاظ على المزارع الخلوية وصولاً إلى الحصول على الصور، بما في ذلك نقطتا اتخاذ القرار اللتان تتطلبان اختياراً يعتمد على الهدف: طريقة التثبيت (PFA مقابل الميثانول) والنفاذية (بناءً على التموضع تحت الخلوي للهدف). يشار إلى المعالجة التجريبية الاختيارية، بما في ذلك المعالجة المسبقة بـ brefeldin A (BFA) للأهداف التي تُفرز بسرعة، كفرع يسبق عملية التثبيت. أما الخطوات الاختيارية التي لم تُعرض من أجل الوضوح (مثل إخماد الألدهيد) فقد وُصفت في البروتوكول الكامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط الكشف المباشر وغير المباشر: طرق ارتباط الأجسام المضادة؛ تحليل مرتبط بالفلوروفور.

الشكل 2: تمثيل تخطيطي لاستراتيجيات الكشف الفلوري القائم على الأجسام المضادة. يستخدم الكشف المباشر أجساماً مضادة أولية مقترنة بفلوروفور، بينما يستخدم الكشف غير المباشر أجساماً مضادة أولية غير مقترنة مقترنة بأجسام مضادة ثانوية مرتبطة بفلوروفور، وهي الاستراتيجية المعتمدة في هذا البروتوكول. بالنسبة لتطبيقات تعدد الإرسال، يتطلب الكشف غير المباشر أجساماً مضادة أولية غير مقترنة تم إنتاجها في أنواع مضيفة مختلفة، مما يسمح لكل جسم مضاد ثانوي بالتعرف بشكل انتقائي على الجسم المضاد الأولي المقابل له دون حدوث تفاعل تبادلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

صورة مجهرية لخلايا مصبوغة، تحليل نمط التألق، تصور البنية الخلوية.

الشكل 3: التألق المناعي المتعدد لخلايا D17 من الساركوما العظمية لدى الكلاب. تم استزراع خلايا D17 (5 × 104) على شرائح زجاجية غطائية في أطباق ذات 24 بئراً، وثُبتت باستخدام 4% بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق عند 25 °C. خضعت الخلايا للتألق المناعي المتعدد باستخدام الأجسام المضادة الأولية anti-p14ARF (بنسبة 1:200؛ فلوروفورات باعثة للون الأخضر)، وanti-actin (بنسبة 1:200؛ فلوروفورات باعثة للون البرتقالي)، وanti-interferon-β (IFN-β) (بنسبة 1:200؛ فلوروفورات باعثة للون الأحمر البعيد)، مع استخدام الأجسام المضادة الثانوية المقابلة بنسبة 1:500. تم صبغ النوى صبغة تباينية. وقبل الكشف عن IFN-β، عولجت الخلايا بـ BFA (بتركيز 5 µg/mL، لمدة 4 س) لمنع إفراز البروتين. (A) تم نفاذ الخلايا باستخدام 0.3% من منظف غير أيوني لمدة 10 دقائق عند 25 °C. (B) خلايا تمت معالجتها بدون نفاذ (0% منظف غير أيوني). صور تمثيلية من مكررات بيولوجية مستقلة عددها 2، كل منها أُجري في مكررات تقنية عددها 2. تظهر في هذا الشكل القنوات المدمجة فقط؛ بينما تتوفر القنوات الفردية في الشكل التكميلي 1. يمكن ملاحظة اختلافات في الوسم بين الظروف، خاصة بالنسبة لـ p14ARF (A؛ الأسهم)، وهو هدف داخل النواة، حيث غابت إشارته في المجموعة غير المنفذة (B). تم الحصول على اللوحتين A و B ومعالجتهما باستخدام إعدادات متطابقة (الجدول التكميلي 1). تظهر الضوابط السلبية وضوابط الصبغ المنفرد المقابلة لهذه اللوحة في الشكل التكميلي 2. شريط المقياس: 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: قنوات الفلورة الفردية المقابلة للشكل 3، مرتبة حسب الواسم مع الخلايا المنفذة (العمود الأيسر) والخلايا غير المنفذة (العمود الأيمن). الظروف المعروضة جنباً إلى جنب: Hoechst 33342 (A, B)، وp14ARF (C, D؛ فلوروفورات باعثة للون الأخضر)، والأكتين (E, F؛ فلوروفور باعث للون البرتقالي)، وIFN-β (G, H؛ فلوروفورات باعثة للون الأحمر البعيد)، إلى جانب اللوحات المدمجة المقابلة (I, J)، والتي تطابق الشكل 3A والشكل 3B على التوالي. تشير الأسهم إلى صبغ نووي نموذجي لـ p14ARF؛ وتشير القطع الناقصة إلى صبغ نموذجي للأكتين (E) وIFN-β (G) على التوالي. يظهر فقدان إشارة p14ARF النووية، إلى جانب وسم غير مثالي لـ IFN-β والأكتين، في الظروف غير المنفذة. تعكس الإشارة المتبقية الملحوظة في (D؛ النجمة) التداخل الطيفي من الفلوروفورات الموجودة معاً، وهو ما تم تأكيده من خلال غيابها في ضوابط الصبغ الفردي والضوابط التي استخدمت الأجسام المضادة الثانوية فقط (الشكل التكميلي 2). شريط المقياس: 100 µm. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: ضوابط التألق المناعي المدمجة المقابلة للوحة المتعددة في الشكل 3. تظهر القنوات الفردية (Hoechst 33342، والفلوروفورات الباعثة للون الأخضر، والفلوروفور الباعث للون البرتقالي، والفلوروفورات الباعثة للون الأحمر البعيد) لكل مجموعة ضابطة إلى جانب الصورة المدمجة (العمود الخامس). (أ-هـ) ضابط خلو الأجسام المضادة: خلايا تمت معالجتها بدون أجسام مضادة أولية أو ثانوية. (و-ي) ضابط الأجسام المضادة الثانوية فقط: خلايا تم تحضينها مع مزيج الأجسام المضادة الثانوية في غياب الأجسام المضادة الأولية. (ك-س) ضابط الصبغ الفردي لـ p14ARF (الفلوروفورات الباعثة للون الأخضر). (ع-ت) ضابط الصبغ الفردي للأكتين (الفلوروفور الباعث للون البرتقالي). (ث-ج) ضابط الصبغ الفردي لـ IFN-β (الفلوروفورات الباعثة للون الأحمر البعيد). كانت إعدادات الالتقاط والمعالجة متطابقة مع تلك المستخدمة في الشكل 3 (الجدول التكميلي 1). شريط المقياس: 100 µm. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: مواصفات مكعبات مرشحات الفلوريسنت وترتيب الالتقاط. تم التقاط الصور بالتتابع باستخدام مجهر فلوريسنت واسع المجال مقلوب (40×/0.80 objective) باستخدام مكعبات المرشحات المدرجة أدناه، وبالترتيب الموضح، لكل مجال تم تصويره في الشكل 3، والشكل التكميلي 1، والشكل التكميلي 2. تم التقاط الصور كمسطحات بصرية مفردة (بدون تكديس محور z).تم ضبط كثافة الإثارة باستخدام تحكم كثافة الفلوريسنت عند المستويات المحددة، مع تثبيت حجاب المجال للضوء الساقط عند الموضع 6 لجميع القنوات. كانت إعدادات الكاميرا (رقمنة 8-بت، تنسيق 3072×2048، غاما 1.0) وإعداد حدة رقمية ثابتة متطابقة لجميع القنوات واللوحات، بما في ذلك الصور الضابطة في الشكل التكميلي 2. تم تطبيق تعديل خطي واحد للسطوع/التباين بشكل متطابق على جميع القنوات واللوحات للعرض. تم تصدير الصور بصيغة TIFF. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الفنية الشائعة في سير عمل التألق المناعي. المشكلات الشائعة، والأسباب المحتملة، والإجراءات التصحيحية المتبعة عبر البروتوكول.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تعد عدة خطوات حاسمة لضمان الأداء المتسق لسير عمل التألق المناعي القائم على غطاء الشرائح هذا. تُجرى جميع الإجراءات داخل البيئة المحصورة لبئر زراعة مكون من 24 بئراً، مما يسهل عملية التداول، ويحد من التعامل مع العينات، ويتيح تغطية كاملة لغطاء الشرائح باستخدام أحجام منخفضة من الكواشف، وبالتالي تقليل استهلاك الأجسام المضادة في كل تجربة. ونظرًا لأن هذه المحاليل ذات الأحجام المنخفضة عرضة للتبخر، يفضل إجراء عمليات التحضين في غرفة رطبة، ويجب عدم السماح للعينات بالجفاف مطلقاً؛ إذ يؤدي الجفاف ولو لفترة وجيزة إلى زيادة التألق الخلفي وتدهور المورفولوجيا الخلوية. عند السحب، تترك طبقة رقيقة من المحلول المنظم على غطاء الشرائح، ويُضاف المحلول التالي على الفور.

تعد كثافة استزراع الخلايا المناسبة ودرجة الالتحام الخلوية المنضبطة وقت التثبيت أمرين أساسيين للحد من الخلفية والحفاظ على المورفولوجيا، حيث يؤدي النمو المفرط إلى زيادة الخلفية ويخل بالبنية الخلوية. وبالمثل، يلزم التحكم الدقيق في وقت ودرجة حرارة الحضن طوال العملية، لأن كليهما يؤثر على كفاءة التثبيت، وارتباط الأجسام المضادة، وإشارة الخلفية5,13. وعند تذبذب الظروف المحيطة، فإن استخدام حاضنة مضبوطة درجة الحرارة أو فرن تجفيف مضبوط على 25 °C، مع توحيد توقيت الحضن عبر المكررات، يعزز من إمكانية تكرار النتائج.

تعد عملية التثبيت الخطوة الحاسمة الأولى، حيث تحدد مدى الحفاظ على المستضدات والبنية الخلوية5، ويتم اختيار المثبت بناءً على موقع الهدف وحساسية الحاتمة. يُوصى باستخدام PFA لمعظم الأهداف المرتبطة بالغشاء، والسيتوبلازمية، والنووية، وأهداف الهيكل الخلوي، لأنه يحافظ على البنية، ويصون توزيع المستضدات، ومتوافق مع صبغ F-actin القائم على phalloidin. قد يُفضل الميثانول لبعض المستضدات النووية التي يصعب اكتشافها بعد التثبيت بالربط التشابكي، خاصة الحاتمات المفسفرة أو الحاتمات الحساسة للألدهيد، ولكنه يسبب خللاً في سلامة الغشاء، ويستخلص البروتينات الذائبة، ويضعف صبغ phalloidin/F-actin؛ لذا يجب التحقق من التوافق لكل هدف 13,14,15,16. أما بالنسبة للسيتوكينات الذائبة والبروتينات الأخرى المفرزة بسرعة، فإن التثبيت بـ PFA مقترناً بالمعالجة المسبقة بـ BFA يحافظ على الإشارة داخل الخلايا قبل التثبيت: حيث يقوم BFA بحظر نقل البروتين من الشبكة الإندوبلازمية إلى جهاز جولجي، مما يعزز التراكم داخل الخلايا للبروتينات المفرزة ويسمح باكتشافها عن طريق التألق المناعي. وعندما يلزم اكتشاف أهداف ذات متطلبات تثبيت متضاربة في وقت واحد، يتطلب الأمر تحسيناً تجريبياً. وقد أُفيد بأن الجليوكسال، وهو ألدهيد ثنائي صغير، يعد بديلاً لـ PFA، مع ربط تشابكي أسرع، وحفاظ أفضل على المستضدات، وتوافق مع التألق المناعي والمجهر فائق الدقة؛ وليس لدينا خبرة مباشرة في التثبيت بالجليوكسال ونعرضه كخيار مدعوم بالأدبيات العلمية17,18.

بعد التثبيت، تتيح عملية النفاذية المناسبة وصول الأجسام المضادة إلى الحواتم (epitopes) داخل الخلوية والنووية مع الحفاظ على السلامة البنيوية5. وعادةً ما تؤدي النفاذية غير الكافية إلى إشارة ضعيفة أو غائبة رغم سلامة المورفولوجيا، مما يشير إلى وصول مقيد للأجسام المضادة، بينما تؤدي النفاذية المفرطة إلى استخلاص البروتينات القابلة للذوبان، وتعطيل الأغشية، وفقدان صبغ الهيكل الخلوي، وزيادة الخلفية. وبناءً على ذلك، يتم تحسين نوع المنظف وتركيزه ووقت الحضن وفقاً للهدف المراد دراسته. ويمكن الحكم على كفاية النفاذية من خلال أربعة معايير: (1) ظهور إشارة محددة في الحيز دون الخلوي المتوقع؛ (2) الحفاظ على المورفولوجيا، مع وضوح الحدود النووية والسيتوبلازمية التي يتم الكشف عنها بواسطة Hoechst 33342 و phalloidin على التوالي؛ (3) صبغ واضح لـ F-actin، حيث أن الإشارة المنتشرة أو المفقودة للهيكل الخلوي تشير إلى نفاذية مفرطة؛ (4) انخفاض الخلفية في الضوابط السلبية. وإذا لم تتحقق هذه المعايير، يتم تعديل تركيز المنظف غير الأيوني octylphenol ethoxylate و/أو وقت الحضن تجريبياً. وعند دمج المستضدات المرتبطة بالغشاء والمستضدات داخل الخلوية في لوحة واحدة، فإن الظروف الأكثر اعتدالاً (تركيز منظف أقل، وقت حضن أقصر) تحافظ على حواتم الغشاء مع السماح بالوصول إلى داخل الخلية، ويكون من المفيد إجراء سلسلة زمنية تبدأ من 5 min وتزداد تدريجياً. أما في حال استخدام saponin بدلاً من ذلك، فيجب الحفاظ عليه في جميع المحاليل المنظمة اللاحقة للأجسام المضادة ومحاليل الغسل، لأن تأثيره المنفذ قابل للعكس.

يتم تحديد تركيزات الأجسام المضادة تجريبياً عن طريق المعايرة بدلاً من اعتماد التوصيات العامة. ويتمثل النهج العملي في إجراء سلسلة تخفيفات متتالية تشمل ما لا يقل عن 3-4 تركيزات أعلى وأقل من التخفيف المقترح من قبل الشركة المصنعة (على سبيل المثال، 1:50 و1:100 و1:200 و1:400 لتخفيف موصى به بنسبة 1:200)، وتُطبق على شرائح غطاء مكررة تحت ظروف متطابقة. ويتم تقييم كل تخفيف بناءً على شدة الإشارة النوعية في الحيز المتوقع؛ ونسبة الإشارة إلى الخلفية، من خلال مقارنة العينات المصبوغة مع التحكم المقابل الخالي من الجسم المضاد الأولي، ومقارنة خلفية الجسم المضاد الثانوي مع التحكم الخالي من الأجسام المضادة؛ والحفاظ على المورفولوجيا. ويتم اختيار أدنى تركيز يعطي إشارة قوية ونوعية مع الحد الأدنى من الخلفية. وعادةً ما يتم الحد من الخلفية العالية المستمرة عن طريق مزيد من المعايرة، أو إطالة فترة الحجب، أو زيادة صرامة الغسيل، بينما قد تعكس الإشارة الضعيفة تثبيتاً مفرطاً، أو تركيزاً غير مثالي للجسم المضاد، أو فشل الجسم المضاد الأولي في التعرف على الحاتمة المستهدفة، أو عدم تطابق بين الجسم المضاد الثانوي والنوع المضيف للجسم المضاد الأولي (على سبيل المثال، استخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب مع جسم مضاد أولي مضيفه الفأر)، أو فقدان إشارة الفلوروفور بسبب تحلل الجسم المضاد الثانوي الناتج عن انتهاء الصلاحية أو التخزين غير السليم، وخاصة التعرض المتكرر للضوء. وإذا كانت الإشارة غائبة في جميع التخفيفات، فمن المفيد تمديد فترة تحضين الجسم المضاد الأولي أو تحويلها إلى التحضين طوال الليل عند 4 °C، والتأكد من تعبير المستضد في الخط الخلوي، والتحقق من توافق الجسم المضاد مع ظروف التثبيت والنفاذية، وفحص التشغيلة والتخزين وتاريخ انتهاء صلاحية الأجسام المضادة الأولية والثانوية، والتأكد من أن المجهر يحتوي على مرشحات إثارة وانبعاث مناسبة للفلوروفور، وفي حال استمرار المشكلة، يتم اختبار مستنسخ بديل. وعند تحضير المحاليل العاملة، يكون حجم الخليط المطلوب هو عدد الآبار مضروباً في 150 µL بالإضافة إلى زيادة بنسبة 10% تقريباً لتعويض الفاقد أثناء السحب بالماصة؛ ويكون حجم المخزون من كل جسم مضاد مساوياً لهذا المجموع مقسوماً على عامل التخفيف الخاص به (على سبيل المثال، 825 µL ÷ 200 = 4.13 µL لتخفيف 1:200)، ويتم إكمال المتبقي باستخدام TBST–BSA 1%. وتُطبق الحسابات نفسها على خليط الأجسام المضادة الثانوية، مع استبدال عامل التخفيف المقابل.

يعتمد أداء تعدد الإرسال (Multiplexing) في النهاية على تصميم لوحة الفلوروفورات. يجب تنسيق الفلوروفورات المخصصة للأهداف الأولية، والصبغة النووية المقابلة، وعلامة الهيكل الخلوي لتجنب التداخل الطيفي أو تكرار الإشارة، كما يجب أن يدعم نظام التصوير استثارة وكشف كل فلوروفور مختار9,10؛ وتتوفر نطاقات الاستثارة والانبعاث لكل مكعب مرشح في الجدول التكميلي 1، مما يسمح بالمقارنة المباشرة للتوافق الطيفي عبر اللوحة. ويُنصح المستخدمون الذين يقومون بتكييف هذه اللوحة مع فلوروفورات أخرى باختيار تركيبات ذات أدنى تداخل في القنوات المتجاورة قدر الإمكان، والتحقق من عدم وجود تداخل (crosstalk) في ضوابط الصبغ المنفرد قبل دمج الأهداف، كما تم القيام به هنا. وقد لوحظت إشارة متبقية تعزى إلى الفلوروفورات الموجودة معاً في جميع القنوات المكتسبة في لوحة تعدد الإرسال (الشكل التكميلي 1)، ولكنها كانت غائبة في ضوابط الصبغ المنفرد والضوابط التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية فقط (الشكل التكميلي 2)، مما يشير إلى وجود تداخل طيفي ناتج عن مجموعات المرشحات واسعة النطاق المستخدمة في الاكتساب بالمجال الواسع (ويمكن تقليل ذلك احتماليةً باستخدام الاستثارة القائمة على الليزر في المجهر البؤري). ونظراً للفصل المكاني بين التموضع النوي لـ p14ARF والتوزيع الخيطي/السيتوبلازمي لـ actin و IFN-β، فإن هذا التداخل لا يؤثر على تفسير تموضع p14ARF في لوحة تعدد الإرسال. يعتمد سير العمل هذا على تعدد الإرسال التقليدي القائم على الفلوروفورات، حيث يكون عدد الأهداف التي يمكن تمييزها في وقت واحد مقيداً بأنواع المضيف المتاحة للأجسام المضادة والفلوروفورات المتميزة طيفياً. ويمكن تحقيق تعدد إرسال من رتب أعلى من خلال الفلورة المناعية الدورية أو التصوير الطيفي، اللذين يسمحان بالصبغ/التبييض التكراري أو الفصل الخطي للفلوروفورات المتداخلة على التوالي، ولكن هذه الطرق تتطلب معدات وبرمجيات متخصصة لم يتم تناولها هنا19,20.

يؤثر وسط التثبيت على كل من جودة الصورة واستدامة الإشارة. يمكن استخدام وسط تجاري ذاتي التصلب ومضاد للتلاشي، أو كبديل مُحضّر منزلياً، استخدام 80% glycerol في PBS (بدون مضاد للتلاشي وبدون تصلب ذاتي)؛ يتم ختم الوسائط القائمة على glycerol المُحضرة منزلياً بطلاء أظافر شفاف لمنع الجفاف وحركة غطاء الشريحة، ويتم اختيار الوسائط التي لا تحتوي على صبغات نووية بمجرد إجراء الصبغ النووي المقابل. يفضل التقاط الصور فوراً بعد التصلب. في حال تعذر التصوير الفوري، يمكن تخزين الشرائح المتصلبة في صندوق مظلم عند 4 °C لمدة تتراوح من 2 إلى 4 أسابيع أو عند −20 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر، مع الأخذ في الاعتبار أن الفلوروفورات شديدة الحساسية للضوء (مثل الفلوروفورات التي تبعث لوناً أخضر) تفقد إشارتها بمرور الوقت حتى في ظل ظروف التخزين المثلى. تعمل الوسائط التجارية المضادة للتلاشي على إطالة استقرار الفلوروفورات بشكل كبير مقارنة بالوسائط القائمة على glycerol المُحضرة منزلياً؛ وعند استخدام الأخيرة، يُوصى بشدة بالتقاط الصور خلال 24–48 h. يتوافق طلاء الأظافر الشفاف مع معظم الفلوروفورات ولا يؤثر بشكل ملحوظ على حفظ الإشارة، شريطة السماح بالتصلب في الظلام لمدة 30 min على الأقل قبل التخزين.

بدءاً من خطوة التثبيت، لم تعد التقنية المعقمة مطلوبة، ويمكن إجراء عملية الصبغ على طاولة المختبر، مع تخصيص خزانة استخلاص كيميائية معتمدة لأي كاشف يحمل علامة تحذير (CAUTION). يتم التعامل مع D17 وسلالات الخلايا الورمية الأخرى وفقاً لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية للمواد من مجموعة المخاطر 1 أو 2، حسبما ينطبق. يتم تطهير جميع المواد التي تلامس الخلايا المستنبتة، والشرائح الغطائية، والرؤوس، والوسط، والنفايات السائلة قبل التخلص منها: حيث يتم إبطال مفعول النفايات السائلة باستخدام المبيض بتركيز نهائي قدره 10% لمدة 30 min على الأقل، وتُلقى النفايات الصلبة في حاويات النفايات البيولوجية المناسبة. يتم فصل النفايات الكيميائية التي تحتوي على PFA، أو الميثانول، أو المنظف غير الأيوني octylphenol ethoxylate والتخلص منها وفقاً للوائح السلامة الكيميائية المؤسسية.

على الرغم من تصميمه ليكون مفيداً على نطاق واسع، إلا أن هذا سير العمل يُعتبر الأكثر ملاءمة للتكييف بناءً على الهدف بدلاً من كونه إجراءً صارماً وعالمياً؛ حيث يعتمد التطبيق الناجح على فهم الباحث لموقع كل مستضد، وقابليته للذوبان، وإمكانية الوصول إلى الحاتمة، ومدى حساسيته للتثبيت والنفاذية. ويجب التأكيد على تحديدين. أولاً، تقييم الصبغ هنا نوعي، ويعتمد على المقارنة مع الضوابط السلبية والموقع تحت الخلوي المتوقع، بدلاً من التكميم الرسمي لنسبة الإشارة إلى الخلفية؛ وبناءً على ذلك، فإن الاتساق المذكور هنا يعكس صبغاً نوعياً قابلاً للتكرار عبر شرائح التغطية المكررة وظروف الضبط، وليس أداءً مُثبتاً كمياً. ويتوفر دليل موحد لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها يلخص المشكلات الشائعة، والأسباب المحتملة، والإجراءات التصحيحية في Supplementary Table 2. ويمكن للمختبرات التي تتطلب قراءات كمية استخدام برامج تحليل الصور مفتوحة المصدر لقياس متوسط الكثافة، وطرح الخلفية، والتكميم القائم على منطقة الاهتمام (ROI)، وتحديد ملف الكثافة21. ثانياً، البيانات التمثيلية مستمدة من خط ورمي كلبي ملتصق واحد (D17)، لذا فإن التوسع ليشمل أنواعاً خلوية أو أنواعاً أخرى أو تركيبات مستضدية سيتطلب إعادة تحسين شروط التثبيت والنفاذية وظروف الأجسام المضادة بما يتناسب مع كل هدف.

باختصار، يوفر هذا البروتوكول سير عمل مرناً ومنخفض التكلفة للتألق المناعي أحادي ومتعدد الأهداف في المزارع ثنائية الأبعاد الملتصقة، حيث يجمع بين الاستهلاك المنخفض للكواشف وأداء صبغ متسق باستخدام معدات مختبرية قياسية، مع السماح بتعديلات مدروسة تعتمد على الهدف المراد فحصه.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح المالية.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) من خلال المنحة 2023/01697-7 (JL) والمنحة 2022/15913-0 (BES). كما تم تلقي الدعم من المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq)، بما في ذلك المنحة 401811/2024-7 (BES) والزمالة 310497/2021-3 (BES).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق زراعة الأنسجة ذات 24 بئرًاCorning3524استزراع وتلوين الشريحة الغطائية
مضاد حيوي - مضاد للفطرياتGibco15240062تُستخدم لمنع التلوث البكتيري والفطري في المزارع الخلوية.
محلول تخفيف الأجسام المضادة (TBST-BSA 1%)حُضّر داخلياً—لتحضير 10 مل: 2 مل من محلول الحجب BSA بتركيز 5% + 5 µL تويين-20 (Tween-20) + 7.995 مل من محلول TBS بتركيز 1x (المحلول العامل) للوصول إلى حجم نهائي قدره 10 مل (التركيب النهائي: 1% BSA، و0.05% تويين-20 في محلول TBS؛ الرقم الهيدروجيني pH 7.6). يُحضّر المحلول حديثاً؛ وفي حال تخزينه، يُحفظ في درجة حرارة 4 °C تُحفظ بعيداً عن التلوث وتُستخدم خلال أسبوع واحد.
محلول الحجبأُعِدَّ داخلياً—لتحضير 10 مل: يُذاب 0.5 جم من BSA في 10 مل من TBS 1x (1 مل من محلول TBS 10x المخزون + 9 مل من الماء المقطر)؛ الرقم الهيدروجيني 7.6. تحضين لمدة 30 دقيقة عند 25 °C؛ تُحضّر طازجة.
(5% BSA في TBS)
بريفيلدين أ (Brefeldin A)Sigma-AldrichB76515 µg/mL؛ معالجة مسبقة لمدة ٤ ساعات لمنع إفراز البروتين قبل الكشف عن السيتوكينات.
ألبومين المصل البقري (BSA)Sigma-AldrichA79065% في محلول TBS للغلق؛ 1% في محلول TBS + 0.05% Tween-20 كمخفف للأجسام المضادة.
كاشف قائم على الكولاجين (طلاء الغطاء الساتر، اختياري)Corning 354231كولاجين من النوع الأول مشتق من أدمة البقر؛ مُخفف إلى 50 µg/mL في 0.01 عياري من حمض الهيدروكلوريك (HCl)؛ طُبقت عند 5–10 µg/cm² (≈100 µL/well)؛ ثم تُحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (≈25°C)؛ ثم يتم سحب السائل والشطف بمحلول PBS قبل استزراع الخلايا.
أغطية شرائح، زجاجية، دائرية، 12 ممزجاج نيتل (Knittel Glass)100013ركيزة لاستزراع الخلايا الملتصقة والتصبيغ.
خط خلايا ساركوما العظام لدى الكلاب D17بنك الخلاياéحبار ريو دي جانيرو276نموذج خلوي ممثل؛ يُحفظ في وسط DMEM مضاف إليه 10% من مصل جنين البقر (FBS) ومضاد حيوي ومضاد للفطريات؛ يُحفظ في 37 °C، 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2).
(BCRJ)
ماء منزوع الأيونات/مقطرتم تحضيره داخلياً—تحضير المحلول المنظم.
وسط DMEM (وسط إيجل المعدل من قبل دولبيكو)Gibco12100-046وسط غذائي كامل لاستنبات الخلايا.
إيثانولSupelco1.00983تطهير شرائح التغطية والملاقط.
مصل جنين البقرSigma-AldrichF7524مُكمّل في وسط الزرع الخلوي.
مصل الجنين البقري (FBS)
فيبرونكتينGibco33016015بروتين سكري للمصفوفة خارج الخلوية؛ مُخفف بتركيز 0.0125 ملغ/مل في وسط استزراع الخلايا؛ يُطبق عند 100 µL/well وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (≈25°C) قبل استزراع الخلايا.
ملقط معدني دقيق الرأسمتنوعة—طريقة التعامل مع أغطية الشرائح.
المجهر الفلوريLeica MicrosystemsDMi8مجهر الفلورسنس للمجال الواسع DMi8 (من شركة Leica Microsystems)، وعدسة HC PL FLUOTAR 40×عدسة شيئية DRY بفتحة عددية 0.80؛ متوافقة مع الفلوروفورات الموجودة في اللوحة (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
شرائح المجهر الزجاجيةشريحة حيوية—تثبيت الشرائح الغطائية المصبوغة للتصوير.
حامل أطباق بتري زجاجية أو حامل شرائح تغطيةمتنوعة—تعقيم أغطية الشرائح بالموصدة (Autoclave) وتخزينها.
جليسينSigma-Aldrich8.16E+09لتحضير 10 مل من محلول بتركيز 50 ميلي مولار: يتم إذابة 37.5 ملجم من الجلايسين في 10 مل من محلول TBS 1x؛ الرقم الهيدروجيني 7.6. لمدة 5 دقائق عند 25 °C؛ خطوة اختيارية لإخماد الألدهيد بعد التثبيت وقبل النفاذية؛ تُحضّر طازجة.
Hoechst 33342InvitrogenH3570لتحضير 10 مل من المحلول العامل: يُخفف المحلول المركز بنسبة 1: 5000 في محلول TBS. صبغة مضادة للنواة؛ تُحضن في مكان محمي من الضوء؛ تُحضّر طازجة.
غرفة مرطبةمتنوعة/مُحضَّرة داخلياً—لتحضين الأجسام المضادة؛ أو بدلاً من ذلك، يتم تجميعها من صندوق بلاستيكي محكم الإغلاق يحتوي على ورق ماص مبلل.
إيميج جي (ImageJ)مفتوح المصدر (NIH)—تُستخدم لتحليل الصور بعد عملية الاستحواذ.
برمجيات الحصول على الصورLeica Microsystems LAS X 3.7.3تُستخدم لالتقاط الصور على مجهر Leica DMi8.
الميثانولMerck1.06009تثبيت بديل (المستضدات النووية/الحواتم المفسفرة)؛ مبردة مسبقاً إلى −20 °C، تحضين لمدة 5 دقائق؛ قد يؤثر سلباً على صبغ الفالويدين/أكتين-F.
وسط التثبيتSigma-AldrichG2289لتحضير 10 مل: 8 مل من الجلسرين + 2 مل من المحلول الملحي الموقوت (PBS)، بأس هيدروجيني 7.6، تخلط جيداً. لا يتمتع بخصائص مضادة للتلاشي ولا يتصلب ذاتياً. تُغلق حواف غطاء الشريحة بطلاء الأظافر لمنع الجفاف أو الإزاحة، وتُخزن الشرائح في 4 °C يُحفظ بعيداً عن الضوء، وتُؤخذ الصور على الفور لتقليل التبييض الضوئي.
(قائم على الجلسرول)
وسط التثبيت (ProLongغشاء التراصف (TM) زجاج)InvitrogenP36984يحتوي على كواشف مضادة للتلاشي، ويتصلب ذاتياً (يتصلب) خلال 24 ساعة تقريباً في درجة حرارة الغرفة، مع الحماية من الضوء، مما يشكل تثبيتاً دائماً (لا يتطلب الختم بطلاء الأظافر). تُحفظ الشرائح عند درجة حرارة 2–8 °C، مع الحماية من الضوء حتى عملية التصوير.
NaClSigma-AldrichS9888المكون الأيوني لمحلول TBS المنظم؛ يحافظ على الأسمولية الفسيولوجية للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا والأنسجة خلال خطوات الغسيل وحضانة الأجسام المضادة.
إبرة (عيار دقيق، على سبيل المثال 25–27G)متنوعة—يُستخدم كرافعة لرفع/فصل غطاء الشريحة بلطف عن قاع البئر دون إتلاف الطبقة الخلوية الأحادية.
بارافورمالدهيد (PFA)Sigma-Aldrich158127لتحضير 10 مل: يُذاب 0.4 جم من مسحوق البارافورمالدهيد في 8 مل من محلول PBS، ثم يُسخن إلى 60 درجة مئوية–65 °C مع إضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 1 عياري حتى يصبح المحلول رائقاً، ثم يُبرّد، ويُضبط الرقم الهيدروجيني (pH) عند 7.4، ويُكمل الحجم إلى 10 مل باستخدام محلول PBS؛ ثم يُرشح عبر 0.2 µm يُفلتر قبل الاستخدام. يُحضّر طازجاً أو يتم تقسيمه إلى حصص (aliquots) وتخزينه في −20 °C، مع تجنب تكرار دورات التجميد والإذابة.
فالويدين، مقترن بفلوروفور.Invitrogenبناءً على الفلورة المختارة.لتحضير 10 مل من المحلول العامل: يتم تخفيف المحلول المخزون بنسبة 1:400 في محلول TBS، برقم هيدروجيني (pH) 7.6، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ملصق بديل للهيكل الخلوي/أكتين-F؛ يُحضّر حديثاً ويُحفظ بعيداً عن الضوء.
محلول ملحي منظم بالفوسفاتSigma-AldrichP4474-1Lمحلول منظم من الفوسفات متساوي التوتر (الرقم الهيدروجيني 7.4)؛ يحافظ على الأسموزية الفسيولوجية للحفاظ على المورفولوجيا الخلوية أثناء خطوات التثبيت والغسيل.
(المحلول الملحي المنظم بالفوسفات)
بولي-ل-لايسين (طلاء غطاء الشريحة، اختياري)Sigma-AldrichP8920كاشف طلاء بوليكاتيوني اصطناعي يعزز الالتصاق الخلوي الكهروستاتيكي؛ يستخدم بتركيز 0.1 ملجم/مل في ماء مقطر؛ بحجم كافٍ لتغطية سطح الشريحة الغطائية؛ يحضن لمدة 30 دقيقة عند 25 °C قبل استزراع الخلايا.
الأجسام المضادة الأولية، مضاد الأكتين (مضيف الماعز)Santa Cruz BiotechnologySC-1615جسم مضاد للأكتين؛ متعدد النسيلة، غير مقترن، يتم الكشف عنه بواسطة جسم مضاد ثانوي مضاد للماعز. يُستخدم بتخفيف تشغيلي بنسبة 1:200.
جسم مضاد أولي، مضاد لـ IFN-β (المضيف الفأر)Aviva Systems BiologyOAPB00536مضاد الإنترفيرون-β جسم مضاد؛ متعدد النسائل، غير مقترن، يتم الكشف عنه باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر. استخدم بتخفيف عملي بنسبة 1:200.
الجسم المضاد الأولي، مضاد p14ARF (المضيف أرنب)CalbiochemPC409جسم مضاد لـ p14ARF؛ متعدد النسائل، غير مقترن، ويتم الكشف عنه باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب. تم إيقاف إنتاج هذا المنتج، وسيتطلب الأمر التحقق من كفاءة جسم مضاد جديد في حال التخطيط للعمل على هذا الهدف. يُستخدم بتخفيف تشغيلي بنسبة 1:200.
جسم مضاد ثانوي، مضاد للأرانب، مقترن بـ Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA32731TRجسم مضاد مضاد للأرنب مقترن بـ AF488. يُستخدم بتخفيف تشغيلي بنسبة 1:500.
جسم مضاد ثانوي، مضاد للماعز، مقترن بـ Alexa Fluor 555Thermo Fischer Scientific A-21432جسم مضاد مضاد للماعز مقترن بـ AF555. يُستخدم بتخفيف تشغيلي بنسبة 1:500.
جسم مضاد ثانوي، مضاد للفأر، مقترن بـ Alexa Fluor 647Thermo Fischer ScientificA-21235جسم مضاد مضاد للفأر مقترن بـ AF647. يُستخدم بتخفيف عملي بنسبة 1:500.
محلول ملحي منظم بالتريس (TBS)، مخزون بتركيز 10xحُضِّر داخلياً—لتحضير 100 مل: أذب 6.06 جم من Tris base و8.77 جم من NaCl في 80 مل من الماء المقطر؛ واضبط الرقم الهيدروجيني (pH) إلى 7.6 باستخدام HCl المركز؛ ثم أكمل الحجم النهائي إلى 100 مل؛ وعقمه باستخدام الموصدة (autoclave). خفف المحلول بنسبة 1:10 في الماء المقطر لتحضير المحلول العامل (TBS 1x) (التركيز النهائي: 50 ملي مولار Tris، و150 ملي مولار NaCl، ورقم هيدروجيني 7.6)؛ ويُحفظ في درجة حرارة الغرفة أو 4 °C لمدة تصل إلى 3 أشهر.
TBST (محلول TBS + 0.05% Tween-20)تم تحضيره داخلياً—لتحضير 10 مل: 1 مل من محلول TBS المركز (10x) + 8.995 مل من الماء المقطر + 5 µL تويين-20 (Tween-20) بنسبة (0.05% حجم/حجم)؛ الرقم الهيدروجيني pH 7.6. محلول غسيل يُستخدم بين خطوات الصبغ؛ يُحضّر حديثاً، ويُستخدم في غضون أسبوع واحد تقريباً عند 4 °C.
تريس قاعدة (Tris Base)Sigma-Aldrich252859عامل تنظيم يستخدم لتحضير المحلول المخزون من TBS؛ يحافظ على استقرار الأس الهيدروجيني ضمن النطاق الفسيولوجي (pH 7.6) لمحاليل الغسيل والتخفيف المستخدمة في التألق المناعي.
Triton X-100 (منظف غير أيوني من إيثوكسيلات أوكتيل فينول)Sigma-AldrichX100لـ 10 مل: 10 µL Triton X-100 في 9.99 مل من محلول TBS 1x لتحضير Triton X-100 بتركيز 0.1%؛ 30 µL في 9.97 مل من محلول TBS بتركيز 1x من أجل TX100 بنسبة 0.3% (يعتمد ذلك على الهدف؛ حيث تتطلب الأهداف النووية تركيزات أعلى).
تريبسين-إيديتات (Trypsin-EDTA)Gibco25200056تُستخدم لفصل الخلايا.
Tween-20Sigma-AldrichP9416تُستخدم في المحلول الملحي المنظم ثلاثي القيمة (TBS) لتحضير محلول الغسيل المنظم (TBST) ومخفف الأجسام المضادة (TBST-BSA 1%).

المراجع

  1. Yoshida SR, Maity BK, Chong S. Visualizing protein localizations in fixed cells: caveats and the underlying mechanisms. J Phys Chem B. 2023;127:4165-73.
  2. Stadler C, et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nat Methods. 2013;10:315-23.
  3. Sule RO, Rivera G, Gomes AV. Western blotting (immunoblotting): history, theory, uses, protocol and problems. Biotechniques. 2023;75:99-114.
  4. Han Y, Gu Y, Zhang AC, Lo YH. Review: imaging technologies for flow cytometry. Lab Chip. 2016;16:4639-47.
  5. Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH. An introduction to performing immunofluorescence staining. In: Yong WH, editor. Biobanking: methods and protocols. New York: Humana Press; 2019. p. 299-311.
  6. Francisco-Cruz A, Parra ER, Tetzlaff MT, Wistuba II. Multiplex immunofluorescence assays. In: Thurin M, Cesano A, Marincola FM, editors. Biomarkers for immunotherapy of cancer: methods and protocols. New York: Humana Press; 2020. p. 467-95.
  7. Harms PW, et al. Multiplex immunohistochemistry and immunofluorescence: a practical update for pathologists. Mod Pathol. 2023;36:100197. doi:10.1016/j.modpat.2023.100197.
  8. Paul I, White C, Turcinovic I, Emili A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. FEBS J. 2021;288:6990-7001.
  9. Radtke AJ, et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 2022;17:378-401.
  10. Gupta V, et al. Protocol for antibody optimization and panel design in high-dimensional multiplexed immunofluorescence imaging. STAR Protoc. 2025;6:104236. doi:10.1016/j.xpro.2025.104236.
  11. ibidi GmbH. µ-Slide 8 Well: instruction manual. Version 4.6. Gräfelfing: ibidi GmbH; 2026:https://ibidi.com/img/cms/downloads/in/IN_8082X_8well.pdf
  12. Thermo Fisher Scientific. Coating Nunc Lab-Tek and Lab-Tek II chamber slides and chambered coverglasses [protocol]. Waltham, MA: Thermo Fisher Scientific; 2017:https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LCD/Instructions/ECM-Coating-Protocol-for-Lab-Tek-and-Lab-Tek-II.pdf
  13. Schnell U, Dijk F, Sjollema KA, Giepmans BNG. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 2012;9:152-8.
  14. Piña R, et al. Ten approaches that improve immunostaining: a review of the latest advances for the optimization of immunofluorescence. Int J Mol Sci. 2022;23:1426. doi:10.3390/ijms23031426.
  15. Lopata A, et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Sci Rep. 2018;8:6572. doi:10.1038/s41598-018-24953-4.
  16. Yamanushi TT, et al. Comparison of formaldehyde and methanol fixatives used in the detection of ion channel proteins in isolated rat ventricular myocytes by immunofluorescence labeling and confocal microscopy. Folia Morphol (Warsz). 2015;74:258-61.
  17. Richter KN, et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. EMBO J. 2018;37:139-59.
  18. Konno K, Yamasaki M, Miyazaki T, Watanabe M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problems in neuroscience research. Sci Adv. 2023;9:eadf7084. doi:10.1126/sciadv.adf7084.
  19. Lin JR, et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. Elife. 2018;7:e31657. doi:10.7554/eLife.31657.
  20. Goltsev Y, et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 2018;174:968–81.e15.
  21. Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9:676-82.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المجهر الفلوري المناعيتموضع البروتينالمزارع الخلوية الملتصقةالمجهر الفلوريالتحقق من صحة الأجسام المضادةاختيار الفلوروفورالمجهر البؤريالمجهر واسع المجال

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.