طريقة الأنثرون اللونية لقياس كمية الجليكوجين في كبد الفئران وعضلات الهيكل العظمي

Meng Zhu; Wenxian Chen; Yangyang Li; Zejian Liu; Yu Liu

doi:10.3791/71134

مقالة منهجية

طريقة الأنثرون اللونية لقياس كمية الجليكوجين في كبد الفئران وعضلات الهيكل العظمي

DOI:

10.3791/71134

⸱

يونيو 12, 2026

Meng Zhu^*¹^,² , Wenxian Chen^*¹^,² , Yangyang Li¹ , Zejian Liu² , Yu Liu¹

¹Department of Endocrinology, Sir Run Run Hospital, Nanjing Medical University, ²Jiangsu Key Laboratory of Molecular Targets and Intervention for Metabolic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nanjing Medical University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة أنثرون لقياس الجليكوجين في كبد الجرذان وعضلاته العظمية عبر حالات أيضية مختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجليكوجين هو احتياطي رئيسي للجلوكوز داخل الخلايا في الكبد والعضلات الهيكلية ويلعب دورا أساسيا في استقلاب الكربوهيدرات. الجليكوجين الكبدي ضروري للحفاظ على التوازن الجلايسيمي الجهازي، بينما يدعم الجليكوجين العضلي الهيكلي النشاط البدني وأداء التمارين. لذا فإن القياس الدقيق لجليكوجين الأنسجة أمر بالغ الأهمية للدراسات التي يتم فيها تنظيم أيض الجليكوجين ديناميكيا أو تغييره المرضي. هنا، نصف طريقة موثوقة وحساسة لقياس محتوى الجليكوجين في كبد الجرذان وعضلاته العظمية. يتكون البروتوكول من خطوات متتابعة، تشمل الهضم القلووي، إزالة البروتين، ترسيب الجليكوجين، غسل الكحول، وتطور اللون باستخدام كاشف الأنثرون. تظهر قابلية تطبيق هذه الطريقة في الفئران التي تعرضت لثلاث حالات فسيولوجية ذات صلة: التغذية العشوائية ، الصيام الليلي، وإعادة التغذية قصيرة الأمد. تلتقط هذه النماذج التجريبية الحالات الأيضية الرئيسية المرتبطة بتخزين الجليكوجين واستنزافه وإعادة التخليق. يوفر تحليل البقعة الغربية المتعامدة لإنزيمات الجليكوجين سينثاز وجليكوجين فوسفوريلاز الدعم الميكانيكي للتغيرات الأيضية الملحوظة. يتم إثبات تطبيق هذه الطريقة بشكل أكبر في الحيوانات التي عولجت بالإبينفرين لنمذجة انهيار الجليكوجين الحاد الناتج عن الإجهاد. بشكل عام، توفر هذه الطريقة نطاقا ديناميكيا واسعا وحساسية كافية لقياس جليكوجين الأنسجة عبر حالات فسيولوجية مختلفة بشكل ملحوظ. يوفر أداة موثوقة للتحقيق في استقلاب الجليكوجين في الجسم الحي، ويمكن تطبيقه أيضا على نماذج زراعة الخلايا في المختبر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجليكوجين هو عديد السكريات المتفرع للغاية يعمل كمخزن رئيسي للطاقة في العضلات الهيكلية والكبد لدى الثدييات، وبدرجة أقل في أعضاء أخرى مثل الدماغ والكلى والقلب والأنسجة الدهنية¹. أثناء التغذية، يخضع الجلوكوز الفائض للبلمرة أو تكوين الدهون الجديدة ، ويخزن على شكل جليكوجين أو دهون. ومع ذلك، أثناء الصيام أو الجهد البدني، يخضع الجليكوجين لتحلل إنزيمي، مما يضمن إمدادا مستمرا وسريعا من الجلوكوز لتلبية متطلبات الطاقة. هذه القدرة على التخزين للجليكوجين ضرورية للحفاظ على التوازن الجلايسيمي خلال دورات إعادة التغذية الفسيولوجية السريعة².

يتم تحفيز تخليق الجليكوجين بواسطة إنزيم الجليكوجين الصناعي (GYS)، الذي يوجد في شكلين من الأشكال الثديية: GYS1 وGYS2. يعبر GYS1 بشكل رئيسي عن العضلات الهيكلية، بينما GYS2 هو الشكل النظيري للكبد. يتم كبت النشاط التحفيزي ل GIS بواسطة الفسفرة في عدة مواقع، بما في ذلك Ser641، تحت ظروف الصيام، بينما يتم تحفيز نشاطه عند إزالة الفسفرة في ظروف التغذية. يتم تحفيز تحلل الجليكوجين بواسطة فوسفوريلز الجليكوجين. الشكل النفسي للكبد هو PYGL، ونظير العضلة هو PYGM. على عكس GYS، يتم تحفيز نشاطها التحفيزي عند الفسفرة عند Ser15 أثناء الصيام ويتم كبته عند إزالة الفسفرة بعد التغذية³.

يعد التنظيم الصحيح لاستقلاب الجليكوجين أمرا أساسيا للعديد من العمليات البيولوجية، وقد تم تحديد اختلال استقلاب الجليكوجين كعامل سبب في العديد من الأمراض. على وجه التحديد، يرتبط تغير أيض الجليكوجين الكبدي باضطرابات أيضية مختلفة، بما في ذلك أمراض تخزين الجليكوجين⁴، والسكري من النوع^{2 5}، ومرض الكبد الدهني المرتبط بخلل الأيض ^6,7، وضعف الاستجابة المضادة للتنظيم لانخفاض سكر الدم⁸. بالإضافة إلى ذلك، الجليكوجين في الدماغ ضروري لتكوين الذاكرة طويلة الأمد⁹، بينما جليكوجين العضلات العظمية هو منظم رئيسي لقدرة التحمل¹⁰. لذلك، فإن القياس الدقيق للجليكوجين في الأنسجة أمر بالغ الأهمية للدراسات التي يتم فيها تنظيم استقلاب الجليكوجين ديناميكيا أو تغييره المرضي، مما يمكن من التحقيق في آليات المرض وتقييم التدخلات المعدلة للجليكوجين.

تم الإبلاغ عن عدة طرق لقياس الجليكوجين، منها طريقة الأنثرون^11,12، طريقة الأميلوجلوكوزيداز¹³، طريقة حمض الفينول-الكبريتيك¹⁴، وطريقة مطيافية الرنين المغناطيسي النووي غير الغازية (MRS)¹⁵، مع وجود مزايا وقيود لكل طريقة بعض المزايا والقيود. هنا، نصف بروتوكولا مفصلا لطريقة الأنثرون لقياس الجليكوجين في كبد الجرذان وعضلاته العظمية (الشكل 1). يشمل هذا البروتوكول خطوات متسلسلة من الهضم القلووي، إزالة البروتين، ترسيب الجليكوجين، غسل الكحول، وتطور اللون باستخدام مادة الأنثرون. هذه الطريقة بسيطة واقتصادية وتتطلب أدوات متخصصة قليلة. لإثبات حساسيته وقابليته للتكرار، قمنا بحساب حد الكشف (LOD)، حد القياس (LOQ)، بالإضافة إلى معامل التباين داخل الاختبار وبين الاختبارات (CV٪)، باستخدام سلسلة من معايير الجليكوجين. لإثبات قابلية تطبيقه، تم تقييم مستويات الجليكوجين في الكبد والعضلات الهيكلية تحت ثلاث شروط فسيولوجية ذات صلة: التغذية المرضية، الصيام الليلي لمدة 16 ساعة، وإعادة التغذية قصيرة الأمد. بالإضافة إلى ذلك، تم عرض الطريقة باستخدام الحيوانات المعالجة بالإبينفرين لنمذجة تحلل الجليكوجين الحاد الناتج عن الإجهاد. تم إجراء تحليل البقعة الغربية المتعامدة للإنزيمات الرئيسية المشاركة في أيض الجليكوجين لتأكيد التغيرات الأيضية الملحوظة.

الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل قياس كمية الجليكوجين. تمثيل تخطيطي لسير العمل التجريبي لقياس كمية الجليكوجين في الكبد والعضلات الهيكلية. تشمل العملية جمع الأنسجة، الهضم القلوي، ترسيب البروتينات، عزل الجليكوجين، والكشف اللوني المعتمد على الأنثرو. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC؛ #1905019) في جامعة نانجينغ الطبية.

1. تحضير الكواشف

راجع جدول المواد لجميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة.
جهز جميع الحلول قبل بدء التجارب.
قم بقياس أحجام المحلول حسب الحاجة.
حضر محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بسعة 1 متر
1. وزن 40 جراما من حبيبات NaOH.
2. أضف حبيبات NaOH إلى 800 مل ماء مقطر.
3. حرك المحلول بقضيب زجاجي حتى لا تبقى جزيئات غير مذائبة عند قاعدة الوعاء.
4. انقل المحلول إلى قارورة حجمية بسعة 1 لتر.
5. ارفع الحجم إلى 1 لتر بالضبط باستخدام الماء المقطر.
6. تخزين المحلول في زجاجة مغلقة بإحكام عند درجة حرارة الغرفة (RT؛ 18°C–23°C).
  تحذير: NaOH يسبب التآكل. ارتد نظارات أمان، وقفازات، ومعطف مختبر. حبيبات NaOH التجارية ليست نقية 100٪ وتمتص الماء. تجنب التعرض المطول للحبيبات للهواء.
حضر محلول 20٪ من كلوريد الليثيوم (LiCl)
1. وزن 20 جرام من مسحوق LiCl اللامائي.
2. أضف مسحوق LiCl إلى 80 مل ماء مقطر.
3. حرك المحلول حتى لا تبقى جزيئات غير مذائبة عند قاعدة الوعاء.
4. انقل المحلول إلى قارورة حجمية بسعة 100 مل.
5. ارفع الحجم إلى 100 مل بالضبط باستخدام الماء المقطر.
6. خزن المحلول في زجاجة مغلقة بإحكام في RT.
  ملاحظة: يمكن أن يهيج LiCl الجلد والعينين والجهاز التنفسي. ارتد نظارات أمان، وقفازات، ومعطف مختبر. LiCl شديد الرطوبة (رطوبة عالية). قلل من التعرض للهواء لمنع امتصاص الماء.
تحضير محلول تفاعل الأنثرون
1. ضع 28 مل من الماء المقطر في كأس سعة 1 لتر.
2. أضف 72 مل من حمض الكبريتيك عالي النقاء المركز (98٪) إلى الماء.
3. دع الخليط يبرد حتى يصبح RT.
4. أضف 50 ملغ من الأنثرون إلى المحلول.
5. حرك حتى يذوب الأنثرون.
6. أضف 3 جرام ثيوريا إلى المحلول.
7. حرك حتى يذوب الثيوريا.
8. انقل المحلول إلى زجاجة ملفوفة بالكهرمان أو ورق الألمنيوم.
9. حفظ المحلول في ثلاجة (2°C–8°C) لمدة أسبوع كحد أقصى.
  تحذير: حمض الكبريتيك شديد التآكل، ويسبب حروقا كيميائية شديدة، ويتفاعل بعنف مع الماء. ارتد معطف مختبر، وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية، ودرع وجه. قم بجميع الخطوات باستخدام غطاء بخار كيميائي معتمد. التخفيف يولد حرارة شديدة. دائما أضف الحمض إلى الماء.
حضر 95٪ إيثانول يحتوي على 0.1٪ LiCl
1. أضف 95 مل إيثانول مطلق إلى زجاجة زجاجية.
2. أضف 4.5 مل ماء مقطر.
3. أضف 0.5 مل من محلول LiCl الأصلي 20٪.
4. اخلط جيدا.
حضر 80٪ ميثانول يحتوي على 0.1٪ LiCl
1. أضف 80 مل ميثانول مطلق إلى زجاجة زجاجية.
2. أضف 19.5 مل ماء مقطر.
3. أضف 0.5 مل من محلول LiCl الأصلي 20٪.
4. اخلط جيدا.
حضر محلول 100٪ (بدون ضبط) حمض ثلاثي كلوروأسيتيك (TCA)
1. وزنها 100 جرام مسحوق TCA.
2. أضف مسحوق TCA إلى 80 مل ماء مقطر.
3. حركه حتى يذوب.
4. انقل المحلول إلى قارورة حجمية بسعة 100 مل.
5. ارفع الحجم إلى 100 مل بالضبط باستخدام الماء المقطر.
6. خزن المحلول في زجاجة زجاجية مغلقة بإحكام في RT.
تحضير محلول حمض البنزويك المشبع
1. أضف 0.5 جرام بلورات حمض البنزويك إلى 100 مل ماء مقطر في كأس زجاجي بسعة 250 مل.
2. سخن الخليط إلى 90°C على صفيحة ساخنة مع تحريك مغناطيسي مستمر.
3. استمر في التسخين حتى لا تبقى جسيمات غير مذائبة عند قاعدة الوعاء.
4. دع الحل يبرد إلى RT.
5. استنشق المادة الشفافة الخالية من الجسيمات المرئية.
6. خزن المحلول في زجاجة زجاجية محكمة الإغلاق في RT.
إعداد معايير الجلوكوز
1. قم بإذابة مسحوق جلوكوز بسعة 50 ملغ في محلول حمض البنزويك المشبع بسعة 50 مل لتحضير محلول مخزون بسعة 1 ملغ/مل.
2. تحضير معايير الجلوكوز (0، 0.01، 0.02، 0.05، 0.1، 0.2، 0.5، و1 ملغ/مل) في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 مل عن طريق التخفيف التسلسلي بحمض البنزويك المشبع كما يلي.
  1. أضف 500 ميكرولتر من محلول مخزون 1 ملغ/مل إلى الأنبوب 1 لتحضير معيار 1 ملغ/مل.
  2. أضف 250 ميكرولتر من محلول المخزون و250 ميكرولتر من حمض البنزويك المشبع إلى الأنبوب 2 لتحضير معيار 0.5 ملغ/مل.
  3. أضف 200 ميكرولتر من محلول أنبوب 2 و300 ميكرولتر حمض البنزويك المشبع إلى الأنبوب 3 لتحضير معيار 0.2 ملغ/مل.
  4. أضف 250 ميكرولتر من محلول أنبوب 3 و250 ميكرولتر من حمض البنزويك المشبع إلى الأنبوب 4 لتحضير معيار 0.1 ملغ/مل.
  5. أضف 250 ميكرولتر من محلول أنبوب 4 و250 ميكرولتر حمض البنزويك المشبع إلى الأنبوب 5 لتحضير معيار 0.05 ملغ/مل.
  6. أضف 200 ميكرولتر من محلول أنبوب 5 و300 ميكرولتر من حمض البنزويك المشبع إلى الأنبوب 6 لتحضير معيار 0.02 ملغ/مل.
  7. أضف 250 ميكرولتر من محلول أنبوب 6 و250 ميكرولتر حمض البنزويك المشبع إلى الأنبوب 7 لتحضير معيار 0.01 ملغ/مل.
  8. أضف 500 ميكرولتر حمض البنزويك المشبع إلى أنبوب منفصل لتحضير الفراغ (0 ملغ/مل).
3. أغلق كل أنبوب ودوامة لفترة وجيزة لمدة 10 ثوان ليتم خلطها جيدا.

2. علاج الحيوانات

التربية العامة
1. ذكور فئران سبراج-داولي في المنزل (230–270 جم) في منشأة حيوانية تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض محددة (حالة صحية VAF/Plus، مختبرات تشارلز ريفر)، وتم اعتمادها خالية من مسببات الأمراض الشائعة مثل فيروس سينداي، ومايكوبلازما الرئوي، وفيروسات البارفو الخاصة بالفئران.
2. وفر نظاما غذائيا قياسيا للطعام ويسمح بالوصول المجاني إلى الماء.
3. حافظ على الحيوانات على دورة ضوئية وظلامية مدتها 12 ساعة (الأنوار تعمل الساعة 08:00 وأطفأ الأنوار الساعة 20:00).
4. حافظ على RT عند 22°C–23°C.
5. حافظ على الرطوبة النسبية بين 30٪–70٪.
الصيام الليلي
1. نقل الفئران إلى أقفاص السكن العادية.
2. أزل الطعام ووفر وصولا مجانيا للماء.
3. حافظ على الصيام لمدة 16 ساعة من الساعة 16:30 حتى 08:30 صباح اليوم التالي.
إعادة التغذية
1. قدم طعام الطعام العادي (200 جرام) للفئران الصائمة ليلا.
2. اسمح للحيوانات بالإطعام بحرية لمدة ساعتين.
تحدي الإبينفرين
1. حضر محلول هيدروكلوريد الإبينفرين.
  1. وزن مسحوق هيدروكلوريد الإبينفرين 5 ملغ باستخدام ميزان تحليلي معاير.
  2. انقل المسحوق إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل وأضف 10 مل محلول ملحي.
  3. أغلق الأنبوب واقلب 10 مرات لتحضير محلول مخزن بسعة 0.5 ملغ/مل.
2. حقن الفئران غير الصائمة داخل الصفاق بمحلول هيدروكلوريد الإبينفرين بحجم 1 مل/كغ من وزن الجسم (0.5 ملغ/كغ وزن الجسم)³.
  1. أمسك الحيوان في وضع الرأس للأسفل للسماح لمحتويات البطن بالتحرك من حيث الجمجمة.
  2. أدخل إبرة قياس 25 في الربع السفلي الأيمن من البطن بزاوية 45°.
  3. استنشق لتأكيد غياب الدم أو محتويات المعوية قبل الحقن.
3. حقن الحيوانات الضابطة داخل الصفاق بالمحلول الملحي بحجم 1 مل/كجم.
4. اجمع عينات دم من الأوردة الذيلية.
  1. أمسك الفأر لكشف الذيل.
  2. اضغط وسخن الذيل لمدة 10 ثوان لتسهيل تدفق الدم.
  3. قم بوخز وريد الذيل الجانبي على بعد 3 سم من الطرف باستخدام إبرة معقمة عيار 25.
  4. تخلص من أول قطرة دم باستخدام شاش نظيف لتجنب تلوث سائل الأنسجة.
  5. اجمع القطرة الثانية من الدم لقياس الجلوكوز.
5. قس مستوى السكر في الدم باستخدام مقياس الجلوكوز كل 15 دقيقة لمدة 60 دقيقة.
  1. قم بمعايرة جهاز قياس الجلوكوز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تحقق من دقة مقياس الجلوكومتر شهريا باستخدام حلول التحكم.
  3. خزن شرائط الاختبار في وعاءها الأصلي لمنع التعرض للرطوبة.
  4. استخدم شرائط اختبار فور إخراجه من الحاوية.
  5. أدخل شريط اختبار في جهاز قياس الجلوكومتر لتفعيل المقياس تلقائيا.
  6. اسمح لعينة الدم بالدخول إلى الشريط عن طريق التأثير الشعري.
  7. سجل قيمة جلوكوز الدم المعروضة.

3. حصاد الأنسجة

القتل الرحيم والتحضير
1. قتل الحيوانات بجرعة زائدة من الإيزوفلوران. ضع الحيوانات في غرفة تحفيز وعرضها ل5٪ إيزوفلوران يوصل في 100٪ أكسجين بمعدل 2 لتر/دقيقة لمدة لا تقل عن 3 دقائق.
2. تحقق من الوفاة بتأكيد توقف التنفس.
3. أكد فقدان رد فعل القرنية ورد فعل قرص إصبع القدم.
  1. المس القرنية بلطف باستخدام جهاز تطبيق معقم ذو طرف قطني للتأكد من غياب استجابة الرمش.
  2. اضغط بقوة على الحزام بين أصابع الكف الخلفية باستخدام ملقط حاد لتأكيد غياب الاستجابة الحركية.
4. ضع الجانب البطني للفأر للأعلى على صينية تشريح.
5. بلل جلد البطن بنسبة 75٪ إيثانول باستخدام زجاجة رش.
  ملاحظة: تقليل الوقت بين القتل الرحيم وحفظ الأنسجة لتقليل تحلل الجليكوجين الناتج عن نقص التروية بعد الوفاة.
تشريح الكبد
1. قم بعمل شق صغير في الجلد بطول حوالي 1 سم من الذيل من النتوء الزيفويدي.
2. مد الشق نحو عظمة القص.
3. افصل الجلد عن العضلة الأساسية.
4. قم بإجراء شق أفقي بطول 4 سم تقريبا 1 سم ذيلي من النتوء الخشبي ويمتد جانبيا نحو الهامش تحت الجانب الأيسر واليمنى لكشف تجويف البطن بالكامل.
5. حدد الكبد.
6. قم بإزالة الفص الوسيط الأيمن (الشكل 2A).
7. زن النسيج خلال دقيقة واحدة.
8. ضع المنديل في وعاء بلاستيك من البولي بروبيلين.
9. قم بتجميد النسيج في الثلج الجاف.
تشريح العضلات العظمية
1. استخدم عضلة الغادة كعينة تمثيلية لأنها تحتوي على مجموعة مختلطة من الألياف سريعة وبطيئة الارتعاش تعكس الخصائص الأيضية والانقباضية للطرف الخلفي¹⁶.
2. ضع الفأر على بطنه.
3. قم بعمل شق جلدي طولي على الجانب الخلفي للطرف الخلفي من الحفرة الماصبية إلى الحدبة الكظرية.
4. افصل الجلد.
5. تحديد وعكس عضلات البايسبس الفخذية وعضلة نصف الوتر.
  1. حدد عضلة البايسبس الفخذية بأنها العضلة الكبيرة الموضوعة جانبيا التي تغطي النصف العلوي من الفخذ الخلفي.
  2. حدد العضلة نصف الوترية على أنها العضلة الضيقة الشبيهة بالحزام التي تمتد وسطيا على طول الفخذ الخلفي وتدخلها بالقرب من الركبة.
6. كشف عضلة المعدة والقليل.
7. اقطع وتر أخيل عند إدخاله البعيد على الكالككان باستخدام مقص جراحي دقيق.
8. افصل عضلة السوليوس.
9. حرر الارتباط القريب لعضلة الهضم عند العضلات الإنسية والجانبية لعظم الفخذ.
10. قم بإزالة عضلة الهضمي بالكامل (الشكل 2B).
11. زن النسيج خلال دقيقة واحدة.
12. ضع المنديل في وعاء بلاستيك من البولي بروبيلين.
13. قم بتجميد النسيج في الثلج الجاف.

الشكل 2: إجراءات تشريح الأنسجة للكبد والعضلات الهيكلية. (أ) خطوات متسلسلة لكشف تجويف البطن وجمع أنسجة الكبد، بما في ذلك شق الجلد، وتمديد الشق، وفصل الجلد عن العضلة الأساسية، والبطن المستعرض. (ب) خطوات متسلسلة لعزل عضلة المعدة العقدية، بما في ذلك الشق الطولي، انعكاس العضلات الفوقية، تحديد البنى التشريحية، واستئصال العضلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. اختبار الجليكوجين اللوني

اليوم الأول: الهضم القلوي
1. أضف 0.4 جرام نسيج إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل. يسمح بتحمل ± 0.1 جرام لضمان معالجة سريعة وتقليل تدهور الأنسجة.
2. أضف 10 مل من محلول NaOH بقوة 1 M إلى الأنبوب.
3. قم بتقطيع النسيج باستخدام شفرات أو مقص معقمة حتى تصبح شظايا الأنسجة بحجم يقارب 1–2 مم.
4. ضع الأنبوب في حمام ماء عند 95°C ± 5°C.
5. احتضن لمدة 30 دقيقة.
6. قم بتدوير العينة بسرعة 2500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان كل 10 دقائق أثناء الحضانة.
7. أزل الأنبوب من حمام الماء.
8. دع العينة تبرد إلى RT.
تحضير التحليل للبيتين
1. نقل 1 مل من الليزات القلوية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة P1000 معايرة.
2. الطرد المركزي عند 8,000 × جرام لمدة 10 دقائق.
3. اجمع السوبرناتانت.
4. احتفظ بالمادة الفائقة لاختبار بروتين BCA.
إزالة البروتين بواسطة TCA
1. نقل 3 مل من الليزات القلوية إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
2. أضف 1 مل من محلول TCA بنسبة 100٪ (بدون عدة).
3. أضف 6 مل من الماء المقطر ليصل إلى الحجم الكلي إلى 10 مل.
4. قم بتدوير الخليط بسرعة 2,500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان.
5. ضع الأنبوب على الجليد (0°C–4°C).
6. حضانة الفيروس لمدة ساعة واحدة لترسيب البروتينات.
مجموعة الفائق الزائد منزوع البروتين
1. انقل 1 مل من الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
2. الطرد المركزي عند 8,000 × جرام لمدة 10 دقائق في RT.
3. احتفظ بالأمير الخارق.
ترسيب الجليكوجين
1. انقل 0.4 مل من المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
2. أضف 0.8 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ يحتوي على 0.1٪ LiCl.
3. قم بتدوير الخليط جيدا.
4. احتضن المعالج عند RT لمدة 16 ساعة.
اليوم الثاني: تكوين حبيبات الجليكوجين
1. قم بطرد العينة بحرارة 1,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند RT لإنتاج حبيبة جليكوجين بيضاء صلبة شبه شفافة (الشكل 3A و الشكل 3B).
2. تخلص من السوبرناتانت.
أول غسيل جليكوجين
1. أضف 1.5 مل من 80٪ ميثانول يحتوي على 0.1٪ LiCl إلى الحبيبة.
2. قم بعمل دوامة للعينة بسرعة 2,500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان.
الطرد المركزي بعد الغسل
1. الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT.
2. تخلص من السوبرناتانت.
غسل الجليكوجين الثاني
1. كرر خطوة الغسيل مرة واحدة.
2. قم بإزالة أي سائل متبقي عن طريق الشفط بعناية باستخدام ماصة P200 ذات طرف دقيق لضمان بقاء حبيبات الجليكوجين دون إزعاج.
ذوبان الجليكوجين
1. أضف 0.8 مل ماء مقطر إلى الحبيبة.
2. دوامة بسرعة 2500 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى محلول شفاف ومتجانس بدون جسيمات مرئية.
إعداد المعايير والعينات
1. جهز أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل لمعايير الجلوكوز، والعينات الفارغة، وغير المعروفة في ثلاث نسخ.
  ملاحظة: أضف كواشف إلى كل أنبوب وفقا للجدول 1.
2. أضف 50 ميكرولتر من كل معيار جلوكوز إلى الأنابيب المخصصة.
3. أضف 50 ميكرولتر ماء مقطر إلى الأنبوب الفارغ.
4. أضف عينة جليكوجين بسعة 50 ميكرولتر إلى كل أنبوب عينة غير معروف.
5. أضف محلول تفاعل الأنثرون بسعة 200 ميكرولتر إلى كل أنبوب.
تطور لون الأنثروشن وقياس الامتصاص
1. قم بتركيب جميع الأنابيب بشكل كامل.
2. ضع الأنابيب في حمام ماء عند 95°C ± 5°C.
3. حضن لمدة 15 دقيقة.
4. أزل الأنابيب واتركها تبرد حتى تصبح RT.
5. نقل 200 ميكرولتر من كل أنبوب إلى صفيحة بسعة 96 بئرا.
6. قس الامتصاص عند 620 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبليت (وضع النهاية، 25°C) مع تصحيح تلقائي لطول المسار حتى 1 سم.
7. يجب أن يكون معامل تحديد المنحنى المعياري (R²) هو ≥0.995، كما يحدده الانحدار الخطي، ليعتبر مقبولا.
8. أي معيار فردي أو عينة مكررة بنسبة CV٪ >20٪ بين القياسات الثلاثية يجب اعتبارها غير موثوقة وإعادة تشغيلها.

الشكل 3: عزل الجليكوجين وقياسه تحت حالات غذائية مختلفة. (أ) صورة تمثيلية لحبيبات الجليكوجين المتراكبة من عينات الكبد في ظروف مغذية وصيامة ومحسنة في ظروف مغذية. (ب) صورة تمثيلية لحبيبات الجليكوجين المترسبة من عينات عضلات الهيكل العظمي تحت ظروف تغذية وصيام وإعادة تصحيح. (ج) منحنى قياسي مولد من معايير الجلوكوز الذي يظهر العلاقة الخطية بين الامتصاص عند 620 نانومتر وتركيز الجلوكوز. (د) مستويات جلوكوز الدم في ظروف الطعام والصيام والرجاة. (ه) محتوى الجليكوجين الكبدي في ظروف المغذية، الصائمة، والمراجعة. (و) محتوى الجليكوجين في العضلات الهيكلية تحت ظروف التغذية والصيام والمراجعة. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 6 لكل مجموعة). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام التحليل العادي أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) مع تصحيح عدة مقارنات باستخدام طريقة بنجاميني-هوشبرغ. **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001، NS: غير مهم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المواد الكيميائية	0 ملغ/مل	0.01 ملغ/مل	0.02 ملغ/مل	0.05 ملغ/مل	0.1 ملغ/مل	0.2 ملغ/مل	0.5 ملغ/مل	1 ملغ/مل	فراغ	عينة غير معروفة
محلول الجلوكوز القياسي	50 ميكرولتر	50 ميكرولتر	50 ميكرولتر	50 ميكرولتر	50 ميكرولتر	50 ميكرولتر	50 ميكرولتر	50 ميكرولتر	–	–
الماء المقطر (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 ميكرولتر	–
عينة الجليكوجين	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 ميكرولتر
حل تفاعل الأنثرون	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر	200 ميكرولتر

الجدول 1: إعداد التفاعل لاختبار الجليكوجين اللوني. إعداد التفاعل لمعايير الجلوكوز، عينات الجليكوجين الفارغة وغير المعروفة المستخدمة في اختبار الأنثرون اللوني. تم دمج أحجام محددة من معايير الجلوكوز، أو الماء المقطر، أو عينات الجليكوجين مع محلول تفاعل الأنثرون قبل الحضانة وقياس الامتصاص.

5. حساب محتوى الجليكوجين في الأنسجة

ملاحظة: قم بتطبيع الجليكوجين المقاس إلى وزن رطب في الأنسجة أو كتلة بروتين كلية.

تحديد المنحنى القياسي والتركيز
1. استخدم قراءات الامتصاص من أنابيب الجلوكوز الثمانية القياسية.
2. اطرح القيم الفارغة من قراءات الامتصاص قبل رسمها مقابل تركيزات الجلوكوز.
3. ملاءمة منحنى انحدار خطي باستخدام الانحدار العادي لأصغر مربعات في Excel (الشكل 3C).
4. احسب تركيز الجلوكوز في كل عينة جليكوجين مجهولة (C_{غير معروف}) عن طريق استيفاء امتصاصها الفارغ والطرح على المنحنى الخطي القياسي باستخدام معادلة الانحدار التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1.3.
تطبيع الوزن الرطب في الأنسجة
1. احسب محتوى الجليكوجين باستخدام المعادلة التالية:
2. عرف C_{غير معروف} كتركيز الجلوكوز (mg/mL) في عينة الجليكوجين المجهولة التي تم تحديدها في الخطوة 5.1.4.
3. عرف 0.8 كحجم عينة الجليكوجين المذابة (mL) في الخطوة 4.10.1.
4. عرف 0.9 كعامل المستخدم لتحويل قيمة الجلوكوز إلى قيمة الجليكوجين.
5. عرف 2.5 كعامل التخفيف الذي تم إدخاله أثناء هطول الجليكوجين في الخطوة 4.5.
6. عرف 10 كعامل تخفيف يحسب 1 مل أليكوت المحلل من إجمالي خليط 10 مل المحضر في الخطوة 4.3.3.
7. عرف 10/3 كعامل تخفيف يحسب 3 مل أليكوت المستخدم من إجمالي الهضم القلوي بسعة 10 مل المعد في الخطوة 4.1.2.
التطبيع إلى كتلة البروتين الكلية
1. احسب محتوى الجليكوجين باستخدام المعادلة التالية:
2. عرف C_{غير معروف} كتركيز الجلوكوز (mg/mL) في عينة الجليكوجين المجهولة التي تم تحديدها في الخطوة 5.1.4.
3. عرف 0.8 كحجم عينة الجليكوجين المذابة (mL) في الخطوة 4.10.1.
4. عرف 0.9 كعامل المستخدم لتحويل قيمة الجلوكوز إلى قيمة الجليكوجين.
5. عرف 2.5 كعامل التخفيف الذي تم إدخاله أثناء هطول الجليكوجين في الخطوة 4.5.
6. عرف 10 كعامل تخفيف يحسب 1 مل أليكوت المحلل من إجمالي خليط 10 مل المحضر في الخطوة 4.3.3.
7. عرف 1/3 كعامل تصحيح يحسب 3 مل أليكوت المستخدم من الهضم القلوي في الخطوة 4.3.1.
8. عرف تركيز البروتين بأنه تركيز البروتين الكلي (mg/mL) في الهضم القلوي الذي يحدده اختبار BCA في الخطوة 4.2.4.

6. البقعة الغربية للإنزيمات الرئيسية التي تحفز أيض الجليكوجين

اعتبارات عامة
1. راجع البروتوكولات الموصوفة سابقا لإجراءات البقعة الغربية القياسية^17,18.
استخراج البروتين
1. وزني 75 ملغ من النسيج المجمد بالسعة. يسمح بتحمل ± 25 ملغ لضمان معالجة سريعة وتقليل ذوبان الأنسجة.
2. أضف 1 مل من محلول تحلل RIPA البارد (50 ملليمول تريس-HCl، رقم الهيدروجينيوم 7.4؛ 150 ملليمول NaCl؛ 1٪ ترايتون X-100؛ 0.5٪ دي أوكسيكولات الصوديوم؛ 0.1٪ SDS؛ و1 ملليمول EDTA) مع مكمل مع مثبطات البروتيز والفوسفاتاز.
3. قم بتجانس النسيج باستخدام جهاز تجانس يدوي للدوار والستاتور.
تحضير الليزات
1. الحضانة تتجانس على الجليد لمدة 30 دقيقة.
2. قم بتدوير العينات بسرعة 2500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان كل 10 دقائق أثناء الحضانة.
3. الطرد المركزي عند 10,000 × جرام باستخدام دوار بزاوية ثابتة لمدة 5 دقائق عند 4°C.
قياس البروتين
1. اجمع المادة الفائقة ككلية بروتين ليزات (ليزات البروتين).
2. قم بإجراء اختبار BCA لتحديد تركيز البروتين.
3. أعد معايير BSA ل 0، 0.025، 0.125، 0.25، 0.5، 0.75، و1 ملغ/مل مخففة في مخزن تحليل RIPA.
4. في صفيحة دقيقة بسعة 96 بئرا، يتم تحميل 20 ميكرولتر من كل عينة قياسية أو غير معروفة في آبار فردية.
5. أضف 200 ميكرولتر من مادة BCA العاملة (معد بخلط 50 جزءا من مادة A مع جزء واحد من مادة B) إلى كل بئر.
6. حضن لوحة التفاعل عند 37°C لمدة 30 دقيقة.
7. بعد التبريد إلى RT (18°C–23°C)، قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوح (وضع النهاية، 25°C) مع تصحيح تلقائي لطول المسار حتى 1 سم.
صفحة SDS
1. اخلط 15 ميكروغرام من البروتين مع مخزن تحميل SDS-PAGE.
2. سخن العينات على درجة حرارة 95°C لمدة 5 دقائق.
3. برد العينات على الثلج.
4. حمل العينات على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪.
5. حل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي في المخزن الكهربائي (25 ملليموتر تريس، 192 ملليمويل جليزين، و0.1٪ SDS).
6. شغل الجل بجهد ثابت 100 فولت حتى يصل مقدمة صبغة البروموفينول الزرقاء إلى أسفل الجل.
نقل البروتين وحجبه
1. نقل البروتينات إلى غشية نيتروسيلولوز أو غشية PVDF.
2. بالنسبة لأغشية النيتروسلولوز، قم بتسوية الغشاء في مخزن النقل (25 ملليمولار تريس، 192 ملليمولار جليزين، 20٪ ميثانول، درجة حموضة 8.3) لمدة 10 دقائق.
3. بالنسبة لأغشية PVDF، قم بتنشيط الغشاء بالغمر في 100٪ ميثانول لمدة 30 ثانية، ثم استقر في مخزن النقل لمدة 10 دقائق.
4. قم بتجميع ساندويتش النقل بالترتيب التالي: إسفنجة، ورق فلتر، جل، غشاء، ورق فلتر، إسفنجة.
5. إجراء نقل البروتين بتيار ثابت قدره 200 مللي أمبير لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
6. جهز 3٪ (بدون الوزن) BSA في TBST (20 mM Tris-HCl، pH 7.4؛ 150 mM NaCl؛ و0.1٪ Tween-20).
7. سد الغشاء عند RT لمدة ساعة مع تأرجح مستمر.
  ملاحظة: استخدم BSA بدلا من الحليب الخالي من الدسم عند اكتشاف البروتينات المفسفرة.
حضانة الأجسام المضادة الأولية
1. تحضير محلول الأجسام المضادة الأولي في حاجز العزل بتخفيف بنسبة 1:1,000.
2. حضن الغشاء بالجسم المضاد الأولي عند 4°C طوال الليل مع تأرجح مستمر.
الغسيل
1. اغسل الغشاء ب TBST.
2. كرر الغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل مرة.
حضانة الأجسام المضادة الثانوية
1. تحضير الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة مع HRP في حاجز حاجز عند تخفيف 1:10,000.
2. حضن الغشاء عند RT لمدة ساعة واحدة مع تأرجح مستمر.
الغسيل
1. اغسل الغشاء ب TBST.
2. كرر الغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل مرة.
كشف الإضاءة الكيميائية
1. تحضير ركيزة كيميائية مضيئة عن طريق خلط كميات متساوية من محاليل اللومينول/المحسن ومحاليل البيروكسيد المستقرة.
2. ضع الركيزة بحجم 0.1 مل/سم من مساحة سطح^{غشاء 2} واحتضن لمدة دقيقتين عند RT على هزاز مداري (100 دورة في الدقيقة).
3. التقاط الإشارات باستخدام جهاز تصوير كيميائي مضيء.
4. اختبر أوقات التعرض التي تتراوح بين 10 إلى 300 ثانية واختر تعريضا ضمن نطاق الكشف الخطي لكل بقعة.
5. تحقق من خطية الإشارة بتأكيد عدم وجود تشبع بكسل باستخدام البرنامج المدمج في الآلة.
تحليل الصور
1. تحليل شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 1.51، NIH).
2. حول الصور إلى تدرج رمادي 8-بت وطبق طرح الخلفية بنمط كرة متدحرجة بنصف قطر 50 بكسل.
3. حدد كل شريط باستخدام منطقة مستطيلة ذات أبعاد متطابقة وطرح الخلفية المحلية من مساحة فارغة مجاورة للحصول على قيم كثافة متكاملة خام.
صبغة البروتين الكلي
1. حضن الغشاء في محلول حبر هندي 0.1٪ في TBST عند RT لمدة ساعة مع تأرجح مستمر.
2. اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام TBST.
3. قم بقياس نطاقات ملونة متعددة كعناصر تحكم في التحميل لتطبيع إشارات التصويب المناعي.
  ملاحظة: استخدم صبغة البروتين الكامل بدلا من جينات التدبير المنزلي (HKGs)، حيث قد يختلف تعبير HKG تحت ظروف تجريبية مختلفة¹⁹.

7. حساسية وقابلية تكرار الطريقة

إعداد معايير الجليكوجين
1. حضر محلول جليكوجين بسعة 20 ملغ/مل في 1 مليون NaOH.
2. تحضير سلسلة من معايير الجليكوجين (0، 0.005، 0.01، 0.02، 0.05، 0.1، 0.2، 0.5، و1 ملغ/مل) في أنابيب الطرد المركزي بحجم 15 مل عن طريق تخفيف تدريجي بقوة 1 مليون نيل أوهرومزي كما هو موضح أدناه.
  1. تحضير الأنبوب 1 (1 ملغ/مل) بخلط محلول جليكوجين 500 ميكرولتر مع 9.5 مل من 1 ملر NaOH.
  2. تحضير الأنبوب 2 (0.5 ملغ/مل) عن طريق خلط محلول جليكوجين 250 ميكرولتر مع 9.75 مل من 1 M NaOH.
  3. تحضير أنبوب 3 (0.2 ملغ/مل) عن طريق خلط محلول مخزون الجليكوجين بسعة 100 ميكرولتر مع 9.9 مل من 1 ملم NaOH.
  4. تحضير الأنبوب 4 (0.1 ملغ/مل) بخلط محلول جليكوجين 50 ميكرولتر مع 9.95 مل من 1 مل.
  5. تحضير أنبوب 5 (0.05 ملغ/مل) عن طريق خلط محلول جليكوجين 25 ميكرولتر مع 9.975 مل من 1 M NaOH.
  6. تحضير أنبوب 6 (0.02 ملغ/مل) عن طريق خلط محلول جليكوجين بسعة 10 ميكرولتر مع 9.99 مل من 1 ملال NaOH.
  7. تحضير أنبوب 7 (0.01 ملغ/مل) عن طريق خلط 100 ميكرولتر من محلول الأنبوب 1 مع 9.9 مل من 1 M NaOH.
  8. تحضير أنبوب 8 (0.005 ملغ/مل) عن طريق خلط 50 ميكرولتر من محلول الأنبوب 1 مع 9.95 مل من 1 ملتار NaOH.
  9. جهز الفراغ (0 ملغ/مل) بإضافة 10 مل من 1 M NaOH إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
3. ضع كل أنبوب ودوامة عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان للخلط.
اختبار الألوان الأنثرويني
1. استخلاص الجليكوجين وإجراء اختبار الأنثرون اللوني وفقا للخطوات 4.1.4–4.12.6.
2. سجل قراءات امتصاص عند 620 نانومتر (A₆₂₀).
حساب تركيز الجليكوجين
1. قم بتوليد منحنى معيار الجلوكوز وحساب تركيز الجلوكوز في كل عينة معيارية (_معيار C) كما هو محدد في الخطوة 5.1.
2. احسب تركيز الجليكوجين في كل أنبوب قياسي باستخدام المعادلة التالية:
3. تعريف_معيار C بأنه تركيز الجلوكوز (mg/mL) الذي يتم تحديده في كل عينة قياسية.
4. عرف 0.8 كحجم عينة الجليكوجين (mL).
5. عرف 0.9 كعامل لتحويل قيمة الجلوكوز إلى قيمة الجليكوجين.
6. عرف 2.5 كعامل تخفيف.
7. عرف 10 كعامل تخفيف يحسب 1 مل أليكوت المحلل من إجمالي خليط 10 مل المحضر في الخطوة 4.3.3.
8. عرف 1/3 كعامل تصحيح يحسب 3 مل أليكوت المستخدم من الهضم القلوي في الخطوة 4.3.1.
9. كرر العملية كاملة ثلاث مرات إضافية خلال يوم واحد، ليصبح المجموع أربع جولات.
10. كرر الأربعة جولات على مدى أربعة أيام، ليصبح المجموع 16 نقطة.
حساب LOD وLOQ
1. ارسم جميع قراءات الامتصاص الستة عشر على المحور y مقابل كل تركيز قياسي للجليكوجين على المحور x.
2. احسب منحنى الانحدار الخطي وR². يعتبر الانحدار الخطي بقيمة R² من ≥0.995 مقبولا.
3. احسب LOD وLOQ باستخدام المعادلات التالية:
4. عرف σ كخطأ معياري للاستجابة (تقاطع y).
5. عرف S كميل منحنى الانحدار الخطي.
حساب نسبة CV٪ داخل الاختبار وبين الاختبارات
1. لكل معيار جليكوجين، احسب نسبة CV٪ داخل الاختبار للقيم المحسوبة من أربع عمليات في اليوم الأول باستخدام المعادلة التالية:
2. عرف s₁ كانحراف معياري للقيم عن الأربعة محاولات في اليوم الأول.
3. عرف كقيمة متوسطة من أربع جولات في اليوم الأول.
4. كرر هذا الحساب في اليوم الثاني، اليوم الثالث، واليوم الرابع للحصول على السجل_{الثانوي الثاني}،_الثالث،_{والرقم الرابع}.
5. احسب نسبة CV٪ النهائية داخل الاختبار باستخدام المعادلة التالية:
6. احسب نسبة CV٪ بين الاختبارات باستخدام المعادلة التالية:
7. يعرف s_inter كانحراف معياري ل CV₁ _{وCV 2} وCV₃ وCV₄.
8. عرف كالقيمة المتوسطة ل CV₁ _{وCV 2} وCV₃ وCV₄.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مستويات الجليكوجين في عضلات الكبد والهيكل العظمي تحت حالات غذائية مختلفة

انخفض الصيام الليلي بشكل ملحوظ مستويات جلوكوز الدم (متوسط ± الخطأ المعياري لمتوسط [SEM]) من 7.9 ± 0.4 ملمولار في الفئران التي تم تغذيتها بالإجازة إلى 5.4 ± 0.3 ملم. تمت استعادة مستويات الجلوكوز في الدم إلى 8.3 ± 0.1 ملليمول بعد ساعتين من إعادة التغذية (الشكل 3D). تماشيا مع هذه التغيرات، كانت مستويات الجليكوجين الكبدي (المتوسط ± المتوسط SEM) 45.05 ± 3.85 ملغ/غ في الأن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا المقال، نصف طريقة معدلة لقياس الألوان الأنثرون لقياس الجليكوجين في أنسجة الحيوانات. بالإضافة إلى الخطوات المتسلسلة التقليدية مثل حصاد الأنسجة، والهضم القلوي، وترسيب الجليكوجين، وغسل الكحول، وتطور اللون القائم على العرش، قمنا بدمج خطوة إزالة البروتين لتقليل التداخل الخلفي (الشكل 1). ثم طبقنا هذه الطريقة لتقييم التغيرات في محتوى الجليكوجين في الكبد وعضلة الهضمة تحت ظروف فسيولوجية مختلفة، مما أظهر قدرتها على اكتشاف التغيرات الفسيولوجية ذات الصلة في استقل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA0806103) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82270871).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	يستخدم في معالجة العينات وإعداد التفاعل
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	يستخدم في التعامل مع المحلولات والترسيب
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	مخزن لتنظيف الغشاء في البلوت الغربي
37 ^oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	تحضين لوحة BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	يستخدم في هضم الأنسجة واستخراجها
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	قياس الامتزاز على اللوحة
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	وزن المساحيق الكيميائية
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	كواشف لكشف الجليكوجين الملون
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	كشف إنزيم الجليكوجين سينثاز 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	كشف إنزيم الجليكوجين سينثاز 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	كشف الجليكوجين المفرزل
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	كشف فوسفوريليز الجليكوجين
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	كشف إنزيم فوسفوريليز الجليكوجين في الكبد
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	كشف إنزيم فوسفوريليز الجليكوجين في العضلات
BCA assay kit	Beyotime	P0012	تقدير البروتين
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	تحضير المحلول المشبع للمقاييس
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	ضغط الأصابع؛ تشريح الأنسجة
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	عامل سد في البلوت الغربي
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	كشف إشارات البلوت الغربي
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	تطوير الإشارة في البلوت الغربي
Distilled water	Beyotime	ST872	مذيب لتحضير الكواشف
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	تحريض تحلل الجليكوجين في الجسم
Ethanol	Macklin	E809065	ترسب الجليكوجين وغسله
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	تشريح الأنسجة
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	ترسيب العينات
Glucometer	i-SENS	CareSens N	قياس مستوى الجلوكوز في الدم
Glucometer	i-SENS	CareSens N	قياس مستوى الجلوكوز في الدم عبر الوريد
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	قياس مستوى الجلوكوز في الدم عبر الوريد
Glucose	Macklin	G6172	تحضير منحنى المعيار
Glycogen stock	Beyotime	D0812	تحضير مجموعة من مقاييس الجليكوجين
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	كشف الأجسام المضادة الأولية
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	تجانس الأنسجة
India ink	Sigma-Aldrich	198285	تلطيخ البروتين الكلي للتطبيع
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	تخدير الحيوان
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	تسخين العينات خلال التجارب
Lithium chloride	Macklin	767397	تعزيز ترسب الجليكوجين
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	خطوة غسل الجليكوجين
Microplate reader	BioTek	ELx800	قياس الامتزاز عند 620 نانومتر
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	غشاء نقل البروتين
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	تحضين كواشف التلألؤ الملون
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	نقل المحلول
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	إزالة السائل المتبقي
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	حفظ الفسفرة البروتينية
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	تخزين الأنسجة المستخرجة
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	منع تحلل البروتين
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	استخراج البروتين
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	فصل البروتين
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	مزج مع عينات البروتين قبل تحميلها في فتحات SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	الكهربائي SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	تخدير الحيوان
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	هضم الأنسجة واستخراج الجليكوجين
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	نموذج حيواني تجريبي
Spray bottle	Beyotime	TB6310	تطبيق الإيثانول 75٪ على فرو الحيوان لبلله وتعقيمه
Standard chow diet	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	نظام غذائي لصيانة القوارض
Surgical scissors	Shanghai Jinzhong	J22010	تشريح الأنسجة
Syringe (sterile) with 25-gauge needle	Beyotime	FS801	حقن داخل الصفاق وقرصة الوريد
Thiourea	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	T112512	تثبيت كواشف الأنثرون
Transfer buffer (10x)	Solarbio Life Sciences	D1060	نقل البروتين إلى الغشاء
Trichloroacetic acid	Shanghai Yuanye Bio-Technology	W11293

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Anthrone Method Glycogen Quantification Colorimetric Assay Alkaline Digestion Glycogen Precipitation Western Blot Glycogen Synthase Glycogen Phosphorylase

طريقة الأنثرون اللونية لقياس كمية الجليكوجين في كبد الفئران وعضلات الهيكل العظمي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة