نماذج الأورام القابلة للزرع ذات الصلة سريريا لدراسة سرطان المبيض المنتشر والاستجابة العلاجية لدى الفئران

Megha J. Pandya; Fatimah Alfaran; Ayokunnumi Ogunsanya; Swethakumar Basavarajaiah; Achuth Padmanabhan

doi:10.3791/71138

مقالة منهجية

نماذج الأورام القابلة للزرع ذات الصلة سريريا لدراسة سرطان المبيض المنتشر والاستجابة العلاجية لدى الفئران

DOI:

10.3791/71138

⸱

مايو 19, 2026

Megha J. Pandya^*¹ , Fatimah Alfaran^*¹ , Ayokunnumi Ogunsanya^*¹ , Swethakumar Basavarajaiah¹ , Achuth Padmanabhan¹^,²

¹Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County, ²University of Maryland Greenebaum Comprehensive Cancer Center

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لوضع نماذج الأورام داخل الصفاق وداخل الجبان لدراسة تقدم سرطان المبيض، والانتشار، والاستجابة العلاجية. علاوة على ذلك، نشرح كيفية استخدام التصوير غير الغازي القائم على اللوسيفيراز في هذه النماذج لمراقبة تقدم الورم في الفأر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان المبيض المنتشر هو أورام نسائية قاتلة للغاية تفتقر إلى خيارات علاج فعالة. تطوير طرق علاجية قابلة للترجمة سريريا لمرضى سرطان المبيض يعتمد على فهم العوامل التي تدفع انتشار سرطان المبيض. بينما تظهر معظم الأورام الصلبة انتشارا دمويا، تنتشر خلايا سرطان المبيض بشكل رئيسي عبر الطريق داخل الصفاق. تتضمن هذه العملية فصل وتفكيك الخلايا السرطانية من الورم الأولي إلى تجويف الصفاق، والتي تكتسب بعد ذلك خصائص تمكنها من مقاومة الأنويكس وتكوين تجمعات متعددة الخلايا. ثم تلتصق هذه التجمعات الخلوية بطانة الميزوثليال في الصفاق وتغزو العضلة، مكونة آفات نقلية. تعد النماذج ذات الصلة سريريا في الجسم الحي ضرورية لفهم كيفية تأثير العوامل الخلوية والبيئة الدقيقة للورم على الخطوات المختلفة في العملية النقيلية، ولاختبار استراتيجيات علاجية جديدة. نموذجان لأورام الفأر القابلة للزرع يستخدمان على نطاق واسع لدراسة انتشار سرطان المبيض والاستجابة العلاجية هما نموذجا داخل الصفاق وداخل الجهارة. في هذا التقرير، نستعرض المنهجية خطوة بخطوة لإنشاء هذه النماذج ونسلط الضوء على مزاياها وقيودها. بالإضافة إلى ذلك، نشرح كيفية استخدام التصوير المضيء الحيوي لمراقبة تقدم الورم بشكل غير جراحي باستخدام هذه النماذج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا للعوامل التي تدفع تقدم سرطان المبيض، يظل سرطان المبيض ثاني أكثر الأورام الخبيثة فتكا في الولايات المتحدة¹. بسبب غياب الأعراض الواضحة وغياب مؤشرات تشخيصية مبكرة موثوقة، أكثر من 70 بالمئة من مرضى سرطان المبيض لديهم مرض نقيلي متقدم عند التشخيص ^2,3. العلاجات الحالية ليست فعالة في علاج سرطان المبيض المنتشر، وبالتالي تبقى معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات للمرضى المصابين بمرض متقدم أقل من 30 بالمئة⁴. سبب رئيسي لعدم النجاح العلاجي هو ظهور مقاومة كيميائية⁵. لذلك، هناك حاجة ملحة لتحديد العوامل التي تدفع انتشار سرطان المبيض ومقاومة الكيماوي. سيعد معالجة هذه الفجوة المعرفية أمرا بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية لاستهداف هذا المرض. لتحقيق هذه الأهداف، نحتاج إلى نماذج في الجسم الحي تحاكي بدقة الخطوات الرئيسية لتقدم سرطان المبيض.

بينما ساهمت خطوط خلايا سرطان المبيض والنماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر بشكل كبير في فهمنا للعوامل التي تؤثر على النقائل والاستجابة العلاجية، إلا أن لهذه النماذج عدة قيود ^6,7,8. على سبيل المثال، هذه النماذج لا تأخذ في الاعتبار الخلايا غير السرطانية المختلفة التي تشكل جزءا من البيئة الدقيقة للورم، ولا تلتقط التفاعلات المعقدة التي تحدث داخل البيئة الدقيقة للورم ^6,7,8. علاوة على ذلك، من الصعب جدا دراسة العوامل الجهازية وتأثيرها على تقدم الورم واستجابة الأدوية باستخدام النماذج المختبرية ^6,7,8. تسلط هذه القيود في النماذج المخبرية الضوء على الحاجة إلى نماذج في الجسم الحي تحاكي بدقة الخطوات المختلفة في انتشار سرطان المبيض، بما في ذلك التفاعلات المعقدة مع أنواع الخلايا الأخرى والعوامل داخل بيئتها الدقيقة.

توفر نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEMMs) منصة في الجسم الحي حيث تنشأ الأورام تلقائيا في بيئة دقيقة طبيعية مع جهاز مناعي سليم⁹. ومع ذلك، فهي تستغرق وقتا طويلا، وتحديا، ومكلفة في إنتاج^{وصيانة 10}. معظم الوجبات الجيمية لسرطان المبيض لديها فترة تأخير طويلة في تطور الأورام، مما يجعل العمل معها يستغرق وقتا طويلا ومكلفا، حتى بعد أن تكون قد تم إنتاجها¹⁰ سنوات. توفر النماذج القابلة للزرع، مثل نماذج الزينوغرافت والطيور الفضائية، توازنا جيدا بين الأهمية البيولوجية وسهولة التجريب، وغالبا ما تكون أقل تكلفة في التصنيع من نماذج^{GEMMs 11}. بالإضافة إلى انخفاض الكمون مقارنة ب GEMMs، فإن سهولة تعديل خلايا الورم وراثيا في المختبر تجعل هذه النماذج مناسبة وملائمة لدراسة كيفية تأثير العوامل الجينية المختلفة على تقدم الورم¹⁰. وبفضل هذه الفوائد، ظهرت نماذج الأورام القابلة للزرع كأدوات قيمة لكل من البحث الأساسي والانتقالي في سرطان المبيض.

في هذا التقرير، نصف البروتوكول لإنشاء نموذجين مختلفين لأورام الفأر القابلة للزرع يستخدمان على نطاق واسع لدراسة سرطان المبيض النقيلي: (1) النموذج داخل الصفاق و(2) النموذج الأورثوتوبي أو الورم الداخلي. يمكن تأسيس كلا النموذجين كنماذج زينوغرافت أو طراز ألوغرافت. في النموذج داخل الصفاق، تحقن خلايا السرطان في تجويف الصفاق للفئران. إدخال خلايا سرطان المبيض إلى المساحة داخل الصفاق يعكس مرحلة انتشار سرطان المبيض حيث تطرح خلايا سرطان المبيض النقيلي من الورم الأولي إلى تجويف الصفاق. مماثل للعملية النقلية في البشر، ستحتاج هذه الخلايا السرطانية المزروعة إلى التكيف مع البيئة الدقيقة البريتونية المعادية، والارتباط وغزو الطبقة المتوسطة التي تغطي تجويف الصفاق، وتكوين آفات نقائية على الأعضاء والأنسجة داخل الصفاق مثل العضلة المعدنية، والمضاري، والكبد، والحجاب الحاجز. اعتمادا على خط الخلايا السرطانية المستخدم لتوليد النموذج داخل الصفاق، يمكن أن تصاحب الأورام النقائية النشيلة، كما لوحظ في المرض في المراحل المتأخرة لدى البشر. لذا، تم استخدام النموذج داخل الصفاق على نطاق واسع لفهم العوامل التي تدفع انتشار سرطان المبيض وتطورها إلى مرحلة متأخرة من المرض¹². هذه النماذج مفيدة أيضا لتحديد فعالية استراتيجيات علاجية جديدة لسرطان المبيض المنتشر¹². في النموذج داخل الجبنة أو النموذج الأورثوتوبي، تزرع خلايا السرطان في الجراحة، وهي بنية غشائية تحيط بمبيض الفأر. يحاكي هذا النموذج المراحل المبكرة من تكون الأورام في المبيض والانتشار. في هذه المرحلة، لا تزال خلايا السرطان محصورة في قناة فالوب والمبيض. ومن هذه المواقع ترسل خلايا السرطان إلى التجويف البريتوني، مما يؤدي في النهاية إلى انتصابات إلى أعضاء أخرى. لذلك، فإن نموذج الجراء مفيد في دراسة المراحل المبكرة من تكون الأورام في المبيض وكذلك الأحداث التي تؤدي إلى انتشارهم عبر التجويف البريتوني¹².

لذا، بينما يعد كل من النموذجين داخل الصفاق وداخل الجبن أدوات ممتازة لدراسة انتشار سرطان المبيض والاستجابة العلاجية، إلا أنهما يختلقان في المرحلة المحددة على طول العملية النقلية التي يقلدانها. بينما يمكن لنماذج الجبن الجروي تقليد تطور سرطان المبيض من المراحل المبكرة إلى المراحل اللاحقة في عملية النقيح، إلا أنه بسبب الكمون المرتبط بهذه العملية، تستخدم عادة لدراسة الأحداث المبكرة في انتشار سرطان المبيض. بالنسبة للدراسات التي تركز على المراحل المتأخرة من انتشار سرطان المبيض، يكون النموذج داخل الصفاق أكثر ملاءمة. علاوة على ذلك، فإن نموذج الجهارة داخل الجهارة أكثر تحديا تقنيا مقارنة بالنموذج داخل الجبنة¹². يتطلب إنشاء نموذج الجراعة الوصول إلى جناح جراحي مجهز بمعدات جراحة دقيقة تسمح بحقن الخلايا السرطانية بدقة في الجرافة المبيضية. قدرة الخلايا السرطانية على تكوين الأورام ("معدل الأخذ" أو "معدل الزرع") عادة ما تكون أقل في نماذج الجبن مقارنة بالنماذج داخل الصفاق. علاوة على ذلك، وبما أنه لا يمكن ملاحظة الأورام بسهولة بعد الحقن التقويمي أو داخل الصفاق، تستخدم عادة تقنية تصوير بيولوجي متوهج غير جراحية لمراقبة تقدم الورم. لذلك، يتطلب كل من النماذج داخل الصفاق وداخل الجباء معدات إضافية تسمح بالتصوير غير الجراحي للأورام¹². في النهاية، الأهداف التجريبية، وتوفر الموارد، ومجموعة المهارات التقنية ستحدد اختيار النموذج لكل دراسة.

يصف هذا التقرير البروتوكول خطوة بخطوة لإنشاء نماذج زراعة الفئران داخل الصفاق وداخل الجرعة باستخدام خطوط خلايا سرطان المبيض البشرية. يمكن إنشاء هذه النماذج عن طريق زرع الخلايا في سلالات فئران ضعيفة المناعة مثل NSG (NOD.Cg-Prkdc،^scid، Il2rg، ^tm1Wjl/SzJ) أو Foxn1 العاري (B6. Cg-Foxn1 nu/J). يمكن تكييف نفس الطريقة لتوليد نماذج ألوغرافت (تركيبية). أثناء إنشاء نماذج الطيور الوثوية، تزرع خلايا سرطان المبيض في فئران مناعية من نفس الخلفية الجينية. نظرا لأن نماذج الطيور المجهورة تطور باستخدام فئران مناعية كفؤة، فهي مفيدة لدراسة كيفية تنظيم العوامل المختلفة للبيئة الدقيقة لورم المبيض، ودور الجهاز المناعي في تقدم سرطان المبيض، وفعالية العلاج المناعي. بالإضافة إلى تأسيس نماذج الفئران الزينوغرافت داخل الصفاق وداخل البورة، يصف هذا التقرير أيضا كيفية استخدام التصوير المضيء الحيوي لمراقبة تقدم الورم بشكل غير جراحي في هذه النماذج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة ماريلاند، مقاطعة بالتيمور (الباحث الرئيسي - أتشوث بادمانابان؛ رقم البروتوكول - 1947). القائمة الكاملة للمواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول وأرقام فهرسها متوفرة في جدول المواد.

1. تحضير خطوط خلايا سرطان المبيض للزراعة في الفأر

ملاحظة: لجميع النماذج في الجسم الحي الموضحة في هذا البروتوكول، يجب تجهيز خلايا سرطان المبيض للزرع في الفأر. يجب تحضير خلايا سرطان المبيض في غطاء زراعة نسيج بتدفق الطبقات كما هو موضح أدناه في درجة حرارة الغرفة ما لم يتم تحديدها:

نمي خلايا سرطان المبيض عند درجة حرارة 37 ^درجةمئوية في حاضنة_CO2 مغطاة بالماء وتحافظ على 5٪_CO2 باستخدام وسائط قياسية كما هو موصى بها في الأدبيات. إذا كان الرغبة في التصوير الصناعي غير الجراحي للورم، يجب هندسة خلايا سرطان المبيض لتسمح للتعبير المستقر عن اللوسيفيراز قبل الزراعة.
عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪–85٪ من التقاء البعض، قم بجمعها في ظروف عقيمة، كما هو موضح أدناه:
1. استنشاق وسط من لوحة زراعة الأنسجة.
2. اغسل الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام محلول ملحي معقم 1X فوسفات مخزز (PBS) بدون كالسيوم أو مغنيسيوم. وجود الكالسيوم والمغنيسيوم في PBS يمكن أن يتداخل مع نشاط التريبسين ويعزز التصاق الخلايا. استنشق PBS من لوحة زراعة الأنسجة.
3. أضف 0.05٪ من تريبسين-إيدتا إلى صفيحة زراعة الأنسجة. كمية التربسين المستخدمة تعتمد على حجم صفيحة زراعة الأنسجة وخط الخلايا الذي يتم العمل عليه. بالنسبة لمعظم خطوط الخلايا التي تنمو على صفيحة بحجم 100 مم، استخدم 1 مل من 0.05٪ تريبسين-إيدتا. بالنسبة لخطوط خلايا سرطان المبيض الملتصقة بقوة مثل OVCA420، يوصى بتناول 1 مل من تريبسين-إيدتا بنسبة 0.25٪.
4. انقل اللوح مع الخلايا إلى الحاضنة المغطاة بماء 37 ^درجةمئوية باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 المستخدمة في زراعة الأنسجة، وحضن لمدة 1–5 دقائق. سيعتمد الوقت الدقيق للحضانة المطلوب على خط الخلية. بعض خطوط الخلايا، مثل TYK-Nu وHEYA8، تنفصل بسرعة كبيرة (1–2 دقيقة)، بينما تستغرق أخرى، مثل OVCA420، وقتا أطول (4–5 دقائق).
5. بمجرد فصل الخلايا، أضف وسط يحتوي على FBS لإيقاف عمل التربسين. أضف 6 مل من وسط يحتوي على FBS لكل 1 مل من التربسين. قم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل لإزالة الخلايا من لوحة زراعة الأنسجة وتفكيكها إلى تعليق خلية واحدة.
  ملاحظة: عند النظر إليها تحت مجهر مقلوب ذو مجال ساطع، ستظهر الخلايا المنفصلة مستديرة (بدلا من أن تكون مسطحة/ممدودة) وتطفو بحرية بدلا من أن تكون ملتصقة بأسفل الصفيحة.
6. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي وجهاز طرد مركزي بقوة 400 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. قم بإزالة الفائق الذي يحتوي على التربسين وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسائط جديدة تحتوي على FBS.
عد الخلايا باستخدام صبغة قابلية للحياة مثل تريبان بلو ومقياس الدم الخلوي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام عداد خلية تلقائي لعد الخلايا.
إعادة تكوين الخلايا في حجم محدد من PBS معقم 1X (pH 7.4) بحيث يتم تحقيق التركيز المطلوب للخلايا لكل وحدة حجم. العدد الموصى به من الخلايا للحقن لخطوط خلايا سرطان المبيض البشرية المستخدم بشكل شائع موضح في الجدول 1¹³.
ملاحظة: الحد الأقصى للحجم الذي يمكن حقنه بأمان في الفئران يعتمد على النموذج. بالنسبة للنموذج داخل الصفاق، الحد الأقصى الموصى به هو 500 ميكرولتر (انظر القسم 2.1). بالنسبة لنموذج الورع داخل الورقة، الحد الأقصى للحجم الموصى به هو 5 ميكرولتر (انظر القسم 2.2).
احتفظ بتعليق الخلية على الثلج حتى يحين وقت حقنه في الفئران. حقن الخلايا في الفئران في أسرع وقت ممكن، ويفضل خلال 30–45 دقيقة من تحضير الخلايا.

2. إنشاء نماذج سرطان المبيض القابلة للزرع في الفأر

تأسيس النموذج داخل الصفاق لسرطان المبيض
ملاحظة: في هذه العملية، يتم حقن خلايا سرطان المبيض التي تعبر عن اللوسيفيراز بشكل مستقر في تجويف الصفاق لأنثى فأر بالغة. استخدام خلايا تعبر عن اللوسيفيراز بشكل مستقر سيمكن من المراقبة الطولية وغير الجراحية لتقدم الورم باستخدام نظام التصوير داخل الجسم الحي (IVIS).
1. جهز الخلايا كما هو موضح في القسم 1. أعد تعليق الخلايا بلطف باستخدام ميكروبيبت بسعة 1000 ميكرولتر وتأكد من بقاء الخلايا منفصلة.
  ملاحظة: عدم إزالة الكتل سيؤدي إلى انسداد الإبر.
2. اسحب 500 ميكرولتر من تعليق الخلية داخل حقنة بحجم 1 مل وربط إبرة بحجم 21G × 1 بوصة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الحقنة.
  ملاحظة: الحد الأقصى للحجم الذي يمكن حقنه داخل الصفاق في أنثى فأر بالغة (25–30 جم) هو 500 ميكرولتر. لذلك، أعد تعليق الخلايا في حجم بحيث يكون العدد المطلوب من الخلايا في حجم أقصى يبلغ 500 ميكرولتر. العدد الموصى به من الخلايا للحقن لخطوط خلايا سرطان المبيض البشرية المستخدم بشكل شائع موضح في الجدول 1¹³.
  ملاحظة: إذا كان وزن الفأر بين 20–25 جم، ينصح بحقن حجم أصغر (أقل من 400 ميكرولتر).
3. أخرج الحيوان من القفص وضعه على سطح خشن أو سلكي لتقييده.
4. قيد الفأر بلمس الجلد الفضفاض عند قاعدة الرقبة بلطف باستخدام اليد غير المسيطرة كما هو موضح في الشكل 1A.
5. ارفع الفأر بلطف وادره بحيث يكون جانبه السفلي للأعلى. ثبت ذيل الحيوان بأصابعه كما هو موضح في الشكل 1B.
6. ارسم خطا وهيا عبر منتصف البطن. لتحديد موقع الحقن، تخيل مثلثا بين الخط الأوسط والحلمتين في الربع السفلي الأيمن. تأكد من أن موقع الحقن في وسط هذا المثلث الوهمي. راجع الشكل 1B.
7. اميل رأس الفأر قليلا نحو الأرض، مما يجعله أقل من الطرف الخلفي. تقييد الفأر في هذا الوضع يساعد محتويات البطن على تحريك الجمجمة. وهذا يقلل من خطر اختراق الأعضاء الداخلية أثناء الحقن.
8. استخدم مسحة كحول معقمة لتنظيف منطقة الحقن.
9. باستخدام اليد المسيطرة، أدخل الإبرة في موقع الحقن بزاوية 45° أو أقل. ادفع فقط 0.5 بوصة ولا يزيد عن نصف طول الإبرة. تأكد من أن الإبرة تبقى مستقرة، لأن الحركة في تجويف البطن قد تسبب إصابة للأعضاء الداخلية.
10. وزع الخلايا بمعدل بطيء وثابت إلى تجويف بطن الفأر.
11. اسحب الإبرة من الفأرة بنفس زاوية الإدخال. ضع فورا مقياس معقم فوق موقع الحقن لمنع أي تسرب أو تسرب.
12. تخلص من الإبرة والحقنة في الحاوية المناسبة للأدوات الحادة.
13. قبل وضع الفأر في القفص، ضع علامات الأذن عليه بطريقة مفضلة. سيسمح وضع العلامات على الأذن بتحديد هوية الفأر المحقون لاحقا.
تأسيس نموذج الجبن لسرطان المبيض
ملاحظة: في نموذج الجهارة، يتم حقن خلايا سرطان المبيض التي تعبر عن اللوسيفيراز بشكل مستقر مباشرة في الجراب المبيض لأنثى فأر بالغة. بورصة هي كيس غشائي يحيط بمبيض الفوار. سيسمح التعبير المستقر من اللوسيفيراز في خلايا سرطان المبيض بالمراقبة الطولية غير الجراحية لتطور الورم باستخدام IVIS.
1. اليوم الأول – تجهيز المعدات والفأر لجراحة زراعة الجرعة داخل الحاوية
  1. استخدم الأدوات اللازمة للجراحة باستخدام المعقم الصناعي. قائمة الآلات هي (الشكل 2A):
    مقص ذو طرف دقيق، ملقط دقيق منحني بطول 5 إنش، حامل إبرة مايو-هيغر، ملقط دقيق لصانعي المجوهرات، طرف دقيق، أدوات لتشريح الملقط ذو النقاط الدقيقة
  2. أعط مسكنات الألم قبل العملية من الكاربروفين (15 ملغ/كغ) كل 24 ساعة عن طريق الحقن تحت الجلد في الفأر.
    ملاحظة: أعط الكاربروفين المسكن تحت الجلد كل 24 ساعة، بدءا من يوم واحد قبل الجراحة ويستمر لمدة 3 أيام بعد الجراحة.
2. اليوم الثاني – زراعة خلايا سرطان المبيض داخل الجراثيم في فأر
  1. جهز خلايا سرطان المبيض للحقن كما هو موضح في القسم الأول. أقصى حجم يمكن حقنه بأمان داخل الورش هو 5 ميكرولتر. لذلك، من الأفضل أن تكون الخلايا بتركيز 10^{إلى 4} خلايا/ميكرولتر. هذا سيسمح بزراعة 5 ×^{10 خلايا بأربع} خلايا.
    ملاحظة: العدد الموصى به من الخلايا للحقن لخطوط خلايا سرطان المبيض البشرية المستخدم بشكل شائع موضح في الجدول 1¹³.
  2. احتفظ بالخلايا على الثلاجة حتى الاستخدام. بعد الحصاد، ينصح بحقن الخلايا في أسرع وقت ممكن، ويفضل خلال 30–45 دقيقة.
  3. تحفز التخدير بوضع الفأر في غرفة إيزوفلوران بمعدل تدفق إيزوفلوران 4 بالمئة ومعدل تدفق أكسجين 3.5 لتر/دقيقة. تأكد من تخدير الفأر بفحص عدم التثبيت وغياب رد فعل قرص إصبع القدم.
  4. انقل الفأر المخدر إلى ستارة جراحية معقمة موضوعة فوق وسادة تسخين للقوارض محفوظة عند 37 درجة مئوية. ضع مخروط أنف بسرعة وحافظ على التخدير بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران و98.5٪ أكسجين. تأكد من تخدير الفأر بتأكيد غياب رد فعل قرص إصبع القدم.
  5. تأكد من بقاء الفأر مخدرا طوال العملية من خلال التأكد من غياب رد فعل القرص الصغير كل 15 دقيقة. راقب معدل تنفس الفأر أثناء التخدير لضمان بطئه وسلسته. إذا تغير معدل التنفس، قم بتعديل جرعة الأيزوفلوران. إذا كان الفأر يعاني من صعوبة في التنفس أو اللهاث، قلل الجرعة. وعلى العكس، إذا أظهر الفأر زيادة في معدل التنفس، قم بزيادة جرعة الأيزوفلوران قليلا.
    ملاحظة: تجنب إبقاء الفأر تحت التخدير لأكثر من 40 دقيقة. لتحقيق ذلك، من المهم أن تكون فعالا وسريعا أثناء العملية الجراحية.
  6. ضع الفأر بحيث يكون الجانب الذي ستزرع فيه خلايا سرطان المبيض داخل الورط، مواجها للأعلى كما هو موضح في الشكل 2B.
  7. ضع مرهم العين على كلتا عيني الفأر لحمايتهما من الجفاف (جفاف القرنية).
  8. إذا كان الفأر لديه فرو، احلق الشعر في النصف السفلي من الفأر على الجانب المواجه للأعلى. نظف المنطقة المحلوقة بشكل صحيح وضع الفأرة على وسادة معقمة جديدة. إذا كنت أعمل مع Foxn1 عارية (B6. Cg-Foxn1 nu/J) سلالة الفأر، تجاوز هذه الخطوة.
  9. استخدم غطاء جراحي معقم لتغطية الفأر بطريقة لا يظهر إلا النصف السفلي من جسم الفأر.
  10. اغسل يديك جيدا بالصابون قبل بدء الجراحة وارتد زوجا جديدا من القفازات الجراحية المعقمة. تجنب لمس أي مناطق أو أشياء غير معقمة بعد ارتداء قفازات جراحية.
  11. استخدم أداة تطبيق قطنية معقمة لوضع سائل البيتادين في موقع الجراحة بحركة دائرية باتجاه عقارب الساعة من الداخل إلى الخارج. بعد ذلك، استخدم مسحة كحولية معقمة لتنظيف نفس المنطقة بطريقة مشابهة. كرر هذا الإجراء مرتين إضافيتين.
    ملاحظة: لا تلمس الأشياء أو المناطق غير المعقمة أثناء العملية الجراحية. استبدل القفازات فورا إذا حدث ملامسة لسطح غير معقم. ينصح بشدة بوجود شخص آخر لمساعدتك أثناء إجراء الحقن داخل الجبن. يمكن لهذا الشخص المساعدة في التعامل مع الأشياء غير المعقمة أثناء الجراحة.
  12. انتظر دقيقة واحدة حتى يجف الكحول.
  13. حدد الموقع الذي يقع تقريبا 1.5 سم فوق الساق الخلفية و5 مم من قفص الصدري للفأر، كما هو موضح في الشكل 2B. ارفع الجلد في هذا الموقع باستخدام الملقط المنحني، ثم قم بعمل شق عمودي بقطر 5 مم باستخدام مقص ذو طرف دقيق.
    ملاحظة: قبل إجراء الشق، تأكد من أن الفأر تحت تأثير التخدير بالكامل من خلال تأكيد غياب رد فعل قرص إصبع القدم.
  14. أمسك الجلد من جانب واحد باستخدام ملقط دقيق وقم بعمل شق في النسيج تحت الجلد في نفس الموقع.
  15. في هذه المرحلة، تصبح الطبقة الصفاقية تحت النسيج تحت الجلد مرئية. استخدم ملقط رفيع الطرف منحني ومسنن لتثبيت طبقة الصفاق، وقم بعمل شق بطول حوالي 2.5 مم باستخدام مقص ذو طرف دقيق.
  16. أمسك جانب شريحة شق الصفاق باستخدام الملقط المسنن وحدد موقع وسادة الدهون في المبيض باستخدام ملقط دقيق. يقع المبيض تحت وسادة الدهون.
  17. اسحب بلطف جزءا صغيرا من وسادة دهون المبيض مع المبيض عبر الشق.
  18. استخدم الملقط التشريح لتثبيت وسادة الدهون بحيث يكون المبيض مواجها للأعلى وغير متحرك.
    ملاحظة: لا تمسك المبيض بالملاقط. استخدم دائما ملقطا مسنن لتثبيت وسادة الدهون لأن النسيج زلق.
  19. اطلب من الشخص المساعد تجهيز الحقنة التي تحتوي على تعليق الخلية. يوصى باستخدام حقنة أنسولين بسعة 0.3 مل.
  20. أدخلي الإبرة بلطف بحيث يكون الحافة مواجها للأعلى داخل الجرافة المبيضة من نقطة التقاء قناة فالوب والمبيض. تأكد من أن الحافة كاملة تدخل البورسة قبل الضغط على المكبس.
    ملاحظة: كن حذرا من ثقب الجراب في الطرف المقابل لموقع الإدخال.
  21. ادفع المكبس بلطف وانقل محتويات الحقنة إلى الجراب المبيض. أزل الإبرة بسرعة.
  22. تورم الجراب المحيط بالمبيض يشير إلى تطعيم ناجح للخلايا.
  23. انتظري 5 ثوان ثم أعيدي المبيض بلطف إلى التجويف البريتوني.
  24. أغلق الصفاق باستخدام خيط أحادي الخيط القابل للامتصاص 6-0 مع خياطة جراحية بسيطة أو اثنتين متقطعتين.
  25. أغلق الشق الجلدي باستخدام خيط أحادي الخيط القابل للامتصاص 6-0 باستخدام خياطة جراحية بسيطة متحركة. تأكد من عدم وجود نزيف من موقع الشق.
  26. ضع مرهم مضاد حيوي ثلاثي (باسيتراسين، نيومايسين، وبوليميكسين ب) في موقع الجرح بعد إغلاقه.
  27. أعط الفأر كاربروفين 15 ملغ/كغ تحت الجلد لتخفيف الألم.
  28. ضع علامة أذن على الفأرة باستخدام طريقة مفضلة. سيسمح وضع العلامات على الأذن بتحديد هوية الفأر المحقون لاحقا.
  29. انقل الفأر إلى قفص جديد. ضع هذا القفص مع نصفه على وسادة تدفئة لمدة لا تقل عن 60 دقيقة. تأكد من أن تأثير التخدير قد زال تماما بحلول هذا الوقت، وأن الفأر مستيقظ ونشط.
    ملاحظة: الفئران عرضة لانخفاض حرارة الجسم تحت التخدير. لذا، من المهم توفير حرارة خارجية لتنظيم درجة حرارة الجسم.
  30. افحص الفئران بعد 4-5 ساعات من الجراحة بحثا عن أي علامات نزيف من موقع الجرح أو أي انزعاج آخر.
  31. أعط الفئران كاربروفين 15 ملغ/كغ تحت الجلد كل 24 ساعة خلال الأيام الثلاثة القادمة.
  32. إذا كانت الخلايا الملقحة معدلة وراثيا للتعبير عن لوسيفيراز، يمكن قياس عبء الورم باستخدام IVIS من اليوم الأول بعد الحقن كما هو موضح في القسم 3.

3. التصوير غير الجراحي لورم الفأر باستخدام نظام التصوير داخل الجسم الحي (IVIS)

هدف مهم في عدة دراسات تستخدم نماذج الأورام القابلة للزرع الموضحة في هذا التقرير هو الحصول على بيانات طولية حول تقدم الورم. بينما يمكن تقدير حجم الأورام تحت الجلد باستخدام كاليبر فيرنييه، إلا أن هذا ليس خيارا مناسبا للأورام المكونة باستخدام نماذج داخل الصفاق وداخل الجاف. لتجاوز هذا التحدي وتحديد عبء الأورام داخل الصفاق، تستخدم معظم المختبرات التصوير الحيوي غير الجراحي القائم على اللوسيفيراز. ولتمكين ذلك، يتم تصميم خلايا السرطان المزروعة للتعبير المستقر عن لوسيفيراز، الذي ينتج تلألؤا حيويا عند إعطاء الركيزة، D-لوسيفيرين. يتم اكتشاف التوهج الحيوي بشكل غير جراحي باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS). ثم يتم قياس هذه الإشارة لتتبع عبء الورم وكشف معلومات عن النقائل وفعالية العلاج الدوائي. فيما يلي، نصف بروتوكول تتبع عبء الورم عبر التصوير الحيوي غير الغازي القائم على اللوسيفيراز باستخدام IVIS في الفئران.

تحضير ركيزة D-لوسيفيرين
1. تحضير محلول D-luciferin بسعة 15 ملغ/مل في 1X PBS (pH 7.4) تحت ظروف معقمة.
2. تعقيم المحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
3. لف المحلول بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء حتى الاستخدام.
تهيئة جهاز تصوير IVIS لالتقاط الصور
1. افتح برنامج "الصورة الحية" على الكمبيوتر المتصل بجهاز تصوير IVIS وسجل الدخول.
2. يحتاج المصور إلى تهيئة لالتقاط الصورة. يتم ذلك كما يلي:
  1. عند تسجيل الدخول، ستفتح نافذة في لوحة تحكم IVIS كما هو موضح في الشكل 3A.
  2. انقر على زر "التهيئة" الموجود في الجانب السفلي الأيمن من النافذة (الشكل 3A). سيستغرق النظام بضع دقائق ليتم تهيئة الجهاز.
    ملاحظة: في البداية، يتحول شريط درجة الحرارة في أسفل النافذة إلى اللون الأحمر، مما يشير إلى أن كاميرا التصوير في طور الوصول إلى درجة الحرارة المستهدفة -90 درجة مئوية (الشكل 3B).
  3. عندما تصل كاميرا التصوير إلى درجة الحرارة المستهدفة (-90 درجة مئوية)، سيتحول شريط درجة الحرارة إلى اللون الأخضر، وتظهر حالة النظام "جاهز للاستخدام" (الشكل 3C). الآن جهاز التصوير جاهز لتصوير الفأرة.
    ملاحظة: يمكن تعديل وقت التعريض، والتثبيت، والتوقف السريع حسب متطلبات المستخدم.
تحضير الفأر لتصوير IVIS
قبل تصوير الفأر، يجب حقن D-luciferin داخل الصفاق.
1. أخرج الفأرة من القفص وضعها على سطح خشن أو سلكي. امسك الفئران بلطف لتقييدها كما هو موضح في القسم 2.1.
2. ارفع الفأرة وقم بتقلبها بحيث يكون جانبها البطني متجها للأعلى.
  ملاحظة: إذا تم تقييد الفأرة بشكل صحيح، ستمتد جميع الأرجل الأربع للخارج عند التقاطها كما هو موضح في الشكل 1B. أمسك ذيله بين الأصابع كإجراء إضافي للتقييد أثناء العملية.
3. استخدم مسحة كحولية معقمة لتنظيف موقع الحقن كما هو موضح في بروتوكول الحقن داخل الصفاق في القسم 2.1.
4. استخدم حقنة TB بسعة 1 مل وإبرة بطول 30 جرام ونصف بوصة لحقن كمية مناسبة من D-لوسيفيرين داخل الصفاق من المحلول الأصلي لتحقيق جرعة نهائية تبلغ 150 ملغ/كجم من D-لوسيفيرين.
  ملاحظة: راجع بروتوكول الحقن داخل الصفاق في القسم 2.1 للحصول على تعليمات حول كيفية إجراء الحقن داخل الصفاق. إذا كنت تستخدم فئران C57BL/6 (لنماذج الطواف الاصطناعية التركيبية)، ينصح بشدة بإزالة الفراء قبل إجراء تصوير التلألؤ الحيوي باستخدام IVIS. الفراء الأسود والجلد المصبوغ يخففان الضوء بشكل كبير، مما يقلل من شدة الإشارة.
5. أعد الفأر برفق إلى القفص. يجب تحديد وقت الانتظار الدقيق ووقت التعرض بشكل تجريبي. يمكن تحديد ذلك كما يلي.
  1. قم بتخدير الفأر فورا بعد حقن D-لوسيفيرين وصوره كما هو موضح في القسم 3.4 كل دقيقتين لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: عند إجراء هذه التجربة لأول مرة، ينصح بتحديد كيف تتغير إشارة اللوسيفيراز مع مرور الوقت بعد إعطاء D-لوسيفيرين. سيساعد ذلك في تحديد الوقت الأنسب لتصوير الفأر بعد إعطاء D-لوسيفيرين في التجارب اللاحقة. يمكن أن تختلف إشارة الإضاءة الحيوية حسب عدة عوامل، منها خط الخلية، ونموذج الزرع الغريب للفأر، ومستوى تعبير اللوسيفيراز، وغيرها.
  2. في كل فاصل خذ دفعات من 5 و10 و15 ثانية.
  3. استخدم هذه البيانات لرسم منحنى قياسي. استنادا إلى المنحنى، اختر وقت الانتظار والتعرض الذي تصل فيه الإشارة إلى هضبة مع الحفاظ على أعلى شدة.
    ملاحظة: عادة ما يكون هذا الوقت بين 5–10 دقائق لكنه قد يختلف حسب الطراز.
التصوير غير الجراحي لأورام الفئران باستخدام IVIS
1. بعد فترة الانتظار، ضع الفأر في غرفة إيزوفلوران بمعدل إيزوفلوران 4٪ ومعدل تدفق أكسجين 3.5.
2. تأكد من أن الفأر مخدر بفحص عدم وجود رد فعل ضغط على إصبع القدم.
3. ضع الفأر على المسرح داخل جهاز تصوير IVIS وادخل أنفه داخل مخروط الأنف للحفاظ على التخدير أثناء التصوير. تأكد من بقائها ضمن الخطوط المحددة لتركيز الكاميرا وأغلق باب المصور.
  ملاحظة: سيكون هناك خمسة مواقع على المسرح داخل الصورة. كل وضعية تحتوي أيضا على مخاريط أنف تخدير خاصة بها. هذا يسمح بتصوير 5 فئران في نفس الوقت. اعتمادا على عدد الفأرات التي يجب تصويرها، قم بضبط مجال رؤية الكاميرا في صندوق لوحة التحكم من "D" (المجال الأوسع) إلى "A" (تركيز ضيق). يمكن وضع الفأر في أي مكان على المسرح بشرط أن تبقى أنوفه داخل مخاريط الأنف المخدرة طوال مدة التصوير. يوصى بتصوير الفئران بشكل تسلسلي أولا على جانبيها الظهري ثم على الجوانب البطنية.
4. قم بضبط زمن التعريض وانقر على "اكتساب" في لوحة التحكم (الشكل 3C).
  ملاحظة: تأكد من أن الإضاءة المضيئة، والصورة، والتراكب "مفعلة" في لوحة التحكم.
  بمجرد التقاط الصورة، ستظهر صورة الفأرة التي تحمل إشارة لوسيفيراز على الشاشة.
5. افتح جهاز التصوير وأدر الفأرة بحيث يكون الجانب السفلي مواجها للأعلى واضغط على "اقتباس" بعد إغلاق باب المصور.
  ملاحظة: تأكد من أن أنف الفأر داخل مخروط الأنف لضمان الحفاظ على التخدير أثناء التصوير.
6. بمجرد التقاط الصور الظهرية والبطنية، افتح باب التصوير وأعد الفأر إلى قفصه.
7. انتظر من 5 إلى 10 دقائق لضمان استعادة الفأر للوعي.
تحليل صورة IVIS لتحديد عبء الورم في الفأر
1. تعديل مقياس ألوان الصور
  1. احفظ الصور الخام في المجلد المناسب بالنقر على "ملف" ثم "حفظ باسم".
    ملاحظة: يقوم المصور تلقائيا بضبط مقياس الألوان بناء على شدة الإشارة. ينصح بالحفاظ على ثابت مقياس الألوان عبر جميع الصور الملتقطة خلال التجربة. يمكن أيضا تعديل مقياس الألوان لاحقا عن طريق فتح الصورة الخام باستخدام هذا البرنامج.
  2. للتعديل اليدوي، تظهر نافذة أخرى من لوحة الأدوات في الزاوية اليمنى العليا من الشاشة (الشكل ثلاثي الأبعاد)، اذهب إلى "تعديل الصورة" ثم اختر "يدوي" للمقياس. أدخل الحد الأدنى والأعلى المطلوب لقيمة المقياس وانقر على "إدخال" (الشكل 3E).
    ملاحظة: عند تعديل مقياس اللون لصورة تم الحصول عليها سابقا، افتح أولا ملف الصورة الخام المحفوظ infoclick.txt من المجلد المناسب باستخدام "الملف" متبوعا ب "فتح".
    3.5.1.3. حفظ هذه الصورة بشكل منفصل عن الصورة الخام في المجلد المناسب.
2. تحليل عبء الورم في الفأر
  ملاحظة: للقياس الكمي لحمل الورم، يمكنك قياس شدة الإشارة لكل فأر عبر الصور الملتقطة طوال الفترة. يمكنك وضع هذه القيم في Excel أو GraphPad Prism للتحليل الإحصائي ولتوليد رسوم بيانية خطية لتقدم الورم.
  1. افتح ملف infoclick.txt الخام المحفوظ من المجلد المعني.
  2. اذهب إلى قسم ROI (منطقة الاهتمام) في نافذة لوحة الأدوات التي تظهر في الزاوية العلوية اليمنى (الشكل 3F).
  3. ارسم منطقة العائد على الاستثمار في كل فأرة يدويا أو تلقائيا بمساعدة وظيفة "الرسم" باستخدام أي شكل يناسبك. للقيام بذلك يدويا، حافظ على اتساق المنطقة لجميع الصور عبر جميع الفأرات التي يتم مقارنتها.
    ملاحظة: بالنسبة للتطعيم داخل الصفاق، فإن اختيار العائد يدويا للصدر والبطن بالكامل على الصورة البطنية للفأر هو الأنسب. بالنسبة للتطعيم داخل الجبنة، يكون اختيار العائد يدويا للعائد على الرؤية في منطقة الصورة الظهرية مع الإشارة هو الأفضل.
    ملاحظة: اختيار العائد التلقائي سيحدد فقط المناطق ذات كثافة الإشارة العالية للصورة.
  4. انقر على "قياس العائد على الاستثمار" (الشكل 3F). سيفتح هذا نافذة أخرى تحتوي على بيانات عن إجمالي ومتوسط العد لكل عائد استثمار مختار.
  5. احفظ هذا الملف في المجلد المناسب حتى يمكن الوصول إليه لاحقا. استخدم هذه البيانات لرسم الرسم البياني إما ب MS Excel أو GraphPad Prism.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر البيانات الممثلة من نموذج سرطان المبيض داخل الصفاق باستخدام خلايا OVCAR8 الموسومة باللوسيفيراز في فئران فوكس إن 1 العارية ذات المناعة الضعيفة في الشكل 4. مكن التعبير المستقر عن اللوسيفيراز في هذه الخلايا من المراقبة الطولية لتقدم الورم من خلال التصوير الحيوي غير الجراحي باستخدام جهاز تصوير IVIS كما هو موضح في القسم الثالث. أدى حقن 5 ملايين خلية OVCAR8-لوسيفيراز داخل الصفاق في فئران Foxn1 العارية إلى تكوين أورام منتشرة في تجويف الصفاق بنسبة 100٪ (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على محاكاة التفاعلات المعقدة بين خلايا الورم، والبيئة الدقيقة، والعوامل الجهازية تجعل نماذج الفئران مصدرا ممتازا لدراسة تقدم سرطان المبيض¹². بالإضافة إلى تطوير فهمنا للعوامل التي تدفع تقدم سرطان المبيض وانتشاره، تلعب نماذج الفئران في الجسم الحي دورا مهما في التقييم قبل السريري للجزيئات الصغيرة واستراتيجيات العلاج لسرطان المبيض المنتشر^12,15. نظرا لهذه المزايا، تم تطوير عدة نماذج فئران في الجسم الحي ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يقدمون إفصاحات ليبلغوا عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حظي A.P. بدعم من وزارة الدفاع (HT9425-23-1-0351 و HT9425-23-1-0232)، والمعاهد الوطنية للصحة (R03CA282712)، وأموال من تحالف سرطان المبيض في سينسيناتي الكبرى (PRIV0201 و PRIV0219)، ومنحة البحث المؤسسي من الجمعية الأمريكية للسرطان من UMGCCC – IRG-18-160-16. كما حظيت A.P بدعم من منح من جامعة ماريلاند، بالتيمور، معهد البحوث السريرية والترجمية (ICTR)، الذي يمول جزئيا من جائزة العلوم السريرية التحويلية (CTSA) من المركز الوطني لتقدم العلوم الترجمية (NCATS) في UM1TR004926. كما تم دعم هذا المقال من خلال تمويل من المعهد الوطني للسرطان - منحة دعم مراكز السرطان (CCSG) – P30CA134274. حظي A.O. بدعم جزئي من منحة المعاهد الوطنية للصحة T32 GM158458.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
فلتر معقم بمحقنة 0.22 أم، 33 مم	فيشر ساينتيفك	09-720-004
حقنة TB بسعة 1 مل	BD	309659
21G، إبرة 1 بوصة	BD	305167
30G، وfrac12; إبرة البوصة	BD	305106
ملقط دقيق منحني بطول 5 إنش	فيشر ساينتيفك	1631
غرزة أحادية الخيط 6-0 قابلة للامتصاص	ماكسون<سوب>TM	6532-11
مسحة كحول (70٪ كحول إيزوبروليل)	شركة دوكال	80003156
بيتادين (محلول يود بنسبة 1٪)	منتجات بوردو	367618150085
كاربروفين إنجي، 50 ملغ/مل	ليفافين	RXLEVA50-20INJ
الطرد المركزي	إبندورف	5702
د-لوسيفيرين	مختبرات سيد	MB000102-R70170
تشريح ملقط الصائغ الدقيق، طرف دقيق	فيشر ساينتيفك	08-953E
مرهم العين	ميدفيت	11897
مقص ذو طرف رفيع	فيشر ساينتيفك	8940
وسادة التدفئة	شعاع الشمس	731-500
أدوات لتشريح الملقط ذو النقاط الدقيقة	فيشر ساينتيفك	S08096
حقنة الأنسولين 3/10 مل	BD	328438
الإيزوفوران	فلوريسو	فلوريزو250
IVIS	بيركين إلمر	IVISLMIII
مايو- حامل الإبرة المستقيمة هيغر	فيشر ساينتيفك	08-966
PBS معقم 1X، بدون الكالسيوم والمغنيسيوم	كورنينغ	21-040-CV
أدوات تطبيق رؤوس القطن المعقم	ماكيسون	24-106-1S
مقياس العقم	كيندال	3033
وسادة/منشفة/ستائر معقمة غير مغطاة بالرياح	هنري-شاين	100-9687
مرهم المضاد الحيوي الثلاثي	الكرة الأرضية	4006-4SL
تريبسين-إيدتا (0.25٪)، فينول أحمر	جيبكو	25200-056

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

نماذج الأورام القابلة للزرع ذات الصلة سريريا لدراسة سرطان المبيض المنتشر والاستجابة العلاجية لدى الفئران

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة