هنا، يعرض بروتوكول لتقييم الأوعية اللمفاوية السحائية للفئران (MLVs)، التي تلعب دورا مهما في الأمراض العصبية المتعددة. هدف هذا البروتوكول هو توفير طريقة متكاملة تمكن من التقييم الوظيفي لتصريف التتبع وتوصيف الشكل التفصيلي لشبكة MLVs الظهرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول متكامل لتقييم أمراض اللمفاوية السحائية: حقن ماجنا السيسترنا، تصوير العقد اللمفاوية، تشريح السحايا، والتلوين على كامل القاعدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ظهرت الأوعية اللمفاوية السحائية (MLVs) كمنظمات حاسمة لتوازن الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وقد تم ربط خلل الأوعية اللمفاوية السحائية باضطرابات عصبية مختلفة. لذلك، فإن تقييم شامل لشكل ووظيفة MLVs ضروري لفهم دورها في فسيولوجيا الجهاز العصبي المركزي ومرضها. يصف هذا البروتوكول طريقة متكاملة لتقييم الميكروفونات السطحية الخلفية في الفئران باستخدام أربع تقنيات رئيسية: حقن داخل الماجنا داخل السيسترنا (i.c.m.) لأجهزة تتبع فلورية، تصوير حي للعقد اللمفاوية العنقية (CLNs)، تشريح السحايا، والتلوين بالكامل. أولا، يتم توصيل إبرة 30 جيلون بالحقنة ومضخة التسريب عبر أنبوب بولي إيثيلين (PE). بعد تخدير الفأر، يكشف الجافة الأم عن طريق تشريح غير حاد لعضلات الرقبة، وتدخل إبرة الحقن في السيسترنا ماجنا (CM) لتوصيل التتبع إلى السائل الدماغي الشوكي (CSF) بتحكم دقيق. يمكن رؤية تصريف التتبع إلى شبكات CLN في الوقت الحقيقي، بينما يتيح تشريح السحايا اللاحق والتلوين الكامل تحليلا مورفولوجيا مفصلا لعضلات MLV الظهرية. يمكن إتمام العملية كاملة خلال 3 ساعات، وتشمل حقن الرحم الصناعي، وتروية الأنسجة، وعزل الجمجمة، ووضعها في محلول تثبيت. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لتوصيل الأدوية داخل الجمجمة أو دمجه مع التحليلات الجزيئية، حيث أن إجراء تشريح السحايا متوافق مع الأنسجة الطازجة غير المثبتة المناسبة لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين.
المقدمة
تقع الخلايا الدماغية داخل الجيوب الجافية وقادرة على نقل مكونات السائل النخاعي والخلايا المناعية من الجهاز العصبي المركزي إلى الجيوب الدماغية 1,2. لقد تحدى اكتشاف ال MLVs المفهوم التقليدي للجهاز العصبي المركزي "امتياز المناعة" وأصبح مركزا للبحثفي السنوات الأخيرة. أظهرت الدراسات أن ضعف وظيفة MLVs مرتبط ارتباطا وثيقا بأمراض مختلفة، بما في ذلك مرض الزهايمر، والتدهور المعرفي المرتبط بالعمر، وأورام الدماغ، وعدوى الجهاز العصبي المركزي 4,5,6,7. مع تقدم الأبحاث في هذا المجال، هناك حاجة متزايدة لطرق تجريبية متكاملة وقابلة للتكرار وموحدة جيدا.
تركز معظم البروتوكولات الحالية لأبحاث الأوعية اللمفاوية على الأوعية اللمفاوية الطرفية 8,9,10. في دراسات تتعلق ب MLVs، وصفت دراسة إجراء تقليصيا بسيطا يتيح الوصول المباشر إلى السائل الدماغي دون الإضرار بالجمجمة أو النسيج الدماغي. عند دمجها مع تقنيات التصوير، يمكن لهذه الطريقة تقييم وظيفة الجهاز الجلمفاوي وديناميكيات السائل النخاعي الشوكي بفعالية. ومع ذلك، لم يتم توثيق البروتوكولات التجريبية التفصيلية لدراسة وظيفة وشكل MLVs بشكل جيد.
يدمج البروتوكول الحالي التصوير الوظيفي مع التحليل الشكلي، مما يتيح الحصول المتزامن على بيانات دالة التصريف والشكل البنيوي من نفس الحيوان، مما يقلل عدد الحيوانات المستخدمة ويحسن قابلية المقارنة والاتساق في البيانات. بشكل عام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في الوكسولات الخلفية في نماذج الأمراض المختلفة، وكذلك لتقييم تأثيرات التدخلات الدوائية أو الجينية على الوراثة. يوفر البروتوكول أوصافا مفصلة للخطوات التشغيلية، والاحتياطات الرئيسية، وإرشادات استكشاف المشاكل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق تقنية حقن الرحم الصناعي الموصوفة في هذا البروتوكول بشكل مستقل لتوصيل الأدوية داخل الجمجمة، كما أن إجراء تشريح السحايا متوافق مع الأنسجة الطازجة لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين لاحقا، مما يوفر مرونة وقابلية للتوسع بشكل كبير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ إجراءات الفئران الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للبروتوكول الذي أقره لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة شنغهاي (رقم الموافقة). ECSHU 2023-099).
1. تحضير الأدوات الجراحية والمؤقتة
تحذير: ارتدى غطاء بخار كيميائي وارتد قفازات لتقليل المخاطر المحتملة عند التعامل مع PFA، وهو مادة معتدلة السمية ومسرطنة. يجب تنفيذ جميع العمليات التي تتضمن كحول الأيزواميل باستخدام غطاء بخار كيميائي بعيدا عن مصادر الإشعال، مع ارتداء قفازات وكمامة، لتقليل مخاطر التعرض.
- جهز أدوات جراحية، مثل زوج واحد من المقص المستقيم، وزوجين من الملقط المنحني ذو الأطراف الدقيقة، وزوجين من الملقط ذو الأطراف غير الحادة، وزوج واحد من المقصات الدقيقة، وزوج من الملقط الدقيق المستقيم ذو الأطراف الناعمة (غير المسننة).
ملاحظة: امسح الأدوات الجراحية بنسبة 75٪ إيثانول وابقها جافة قبل وبعد التجربة. - جهزوا المخزون.
- مرة واحدة في أرقام PBS.
- محلول إصلاح بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ (4٪ PFA).
- محلول حاجز (1x PBS يحتوي على 3٪ ألبومين مصل البقري (BSA)، 0.5٪ ترايتون X-100، و2٪ مصل أبقار جنيني).
- مخزن تخفيف الأجسام المضادة (1x PBS يحتوي على 3٪ BSA و0.5٪ Triton X-100).
- وسيط تركيب مضاد التلاشي.
ملاحظة: يمكن تخزين الكاشف المعد عند 4 درجات مئوية لمدة شهر.
- تحضير محلول تخدير 2,2,2-ثلاثي بروموإيثانول (أفرتين، 1.25٪، 50 مل)
- ازن 0.625 جرام من التريبروموإيثانول في أنبوب بسعة 2 مل، أضف 1.25 مل كحول إيزوأميل، واذيب تماما (هزاز 37 درجة مئوية).
- انقل محلول الكحول المذاب بالكامل من تريبروموإيثانول-إيزوأميل إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل، أضف 1x PBS ليصل الحجم الكلي إلى 50 مل، وامزج جيدا.
- قم بترشيح المحلول عبر فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر في خزانة أمان بيولوجي.
- حضر محلول أوفالوبمين، أليكسا فلور 647 مزدوج (OVA-647) (2 ملغ/مل). قم بإذابة 2 ملغ من OVA-647 في 1 مل من السائل الدماغي الشوكي الصناعي (aCSF).
2. تجميع إبرة الحقن وتوصيلها بمضخة الحقن الدقيق
- استخدم ملقط حاد لكسر إبرة 30 جالون والحفاظ على رأس11 (القطر الخارجي 0.30 مم، القطر الداخلي 0.15 مم، الطول 8 مم).
- استخدم أنبوب PE-10 بطول 30 سم (القطر الخارجي 0.64 مم، القطر الداخلي 0.28 مم) لتوصيل إبرة 30 جيلون المكسورة بإبرة الحقن الدقيق التي تحتوي على إبرة 30 جيلون (الشكل 1).
- قم بتركيب إبرة الحقن الدقيق، مع الأنبوب وإبرة 30 جيلون، على مضخة الحقن الدقيقة.
3. حقن الآي.سي.إم والتصوير الحي
تحذير: إذا تم إدخال الإبرة بعمق شديد واخترقت نسيج الدماغ الدماغي، فسيتم توصيل الحقن إلى نسيج الدماغ بدلا من حجرة السائل النخاعي، مما يؤثر على دقة النتيجة وقد يؤدي إلى وفاة الفئران. خلال الإجراء الجراحي، يتطلب الأمر مراقبة فسيولوجية مستمرة للفأر. يجب تقييم عمق التخدير كل 15 دقيقة باستخدام رد فعل قرص القدم لضمان بقاء الحيوان خاليا من الألم. يجب الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم وتأثيراته المرتبطة به على الوظيفة الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يجب تسجيل التنفس ومعدل ضربات القلب كل 30 دقيقة، مع تقييم من خلال مراقبة حركات الصدر ولمس قمة القلب. أثناء حقن الرحم القلبي، إذا تم إدخال الإبرة بعمق شديد وتسبب في نزيف، فهذا يشير إلى فشل الحقنة. أنهوا التجربة وأقتلوا الحيوان.
- وزن الفأر وأعط 200 ملغ/كغ من أفرتين عبر حقن داخل الصفاق لتخدير الفأر.
ملاحظة: يمكن استخدام مخدرات بديلة (مثل الكيتامين/الزيلزين). - ضع كريم إزالة الشعر على منطقة عنق الرحم لإزالة الشعر فوق العقد اللمفاوية عندما يتوقف رد فعل قرص الأصابع ويصبح التنفس بطيئا وثابتا.
- احلق منطقة الرقبة الظهرية.
- ضع الفأرة في إطار ستيريوتاكسي على وسادة تدفئة مع رأس المحرك مائل بزاوية 120° مع الصندوق الخلفي (الشكل 2A).
- نظف المنطقة بشكل متسلسل باستخدام البوفيدون-يودين و75٪ إيثانول.
- ضع مرهم العيون بإريثروميسين.
- قم بعمل شق منتصف في جلد الرقبة وافصل طبقات العضلات بشكل غير مباشر.
ملاحظة: باستخدام زوجين من الملقط ذو الأطراف غير الحادة، افصل طبقات العضلات لتقليل النزيف. - قم بتشريح العضلة باستخدام ملقط ذو أطراف دقيقة حتى يصبح الجافة الشفافة التي تغطي القشرة الدماغية مرئية (الشكل 2B، C).
ملاحظة: استخدم ملقط منحني ذو طرف رفيع لسحب العضلات والحفاظ على تعرض مستمر للعضلة البحرية. - تحت المجهر المجسم، استخدم ملقطا حادا لتثبيت الإبرة وإدخالها بزاوية 45° على مستوى الجورا ماتر بعمق يقارب 1–2 مم. ضع حافة الإبرة موازية لماتر الجافية بحيث تقع بالكامل تحت المادة الجافية (الشكل 2D).
ملاحظة: طبق قوة لطيفة بالإبرة لثقب الجافة. يشير الثقب الناجح إلى فقدان المقاومة بشكل ملموس، إلى جانب رؤية طرف الإبرة تحت الجاف الأم وتدفق السائل الشوكي الشوكي. - استخدم ورق ماص لتجفيف أي تسرب من السائل الدماغي الدماغي.
- اضبط مضخة الحقن الدقيقة لتعطي بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة. حقن 5 ميكرولتر من محلول OVA-647 (2 ملغ/مل) في CM4 (الشكل 2E).
- اترك الإبرة في مكانها لمدة دقيقتين لمنع التدفق العكسي.
- ضع قطرة واحدة من الغراء البيولوجي على السحايا.
- أغلق الشق الجراحي.
- قم بإجراء تصوير داخل الجسم الحي للفأر لمراقبة شدة الصبغة في شبكات CLN في نقاط زمنية مختلفة (30 دقيقة، 60 دقيقة). استخدم معايير التصوير التالية: زمن التعريض: 0.5 ثانية؛ مرشح الإثارة: 640 نانومتر؛ مرشح الانبعاث: 680 نانومتر.
4. عزل الجانب الظهري من جمجمة الفأر
ملاحظة: تأكد من غياب رد فعل قرص إصبع القدم وتوقف التنفس التلقائي قبل بدء تشريح الصدر.
- قم بقتل الفأر بجرعة زائدة من أفرتين (600 ملغ/كجم) وقم بتروية القلب باستخدام 20 مل 1x PBS أو محلول ملحي عادي.
- اقطع رأس الفأر لعزل الرأس.
- قم بعمل شق على طول منتصف الجمجمة لفتح فروة الرأس.
- استخدم موستاتات دموية منحنية لفصل فروة الرأس من الجانبين عن طريق سحب لطيف. بعد ذلك، أدخل العضلات المنحنية في الحفرة الحجاجية وقم بإزالة فروة الرأس المتبقية من المناطق الأنفية والفموية بعناية (الشكل 3A–C).
ملاحظة: تتيح هذه الطريقة فصل فروة الرأس بسرعة وكاملة. - قم بإزالة الفك السفلي مع الحفاظ على الجمجمة سليمة (الشكل 3D).
- قم بإزالة العظم من قاعدة الجمجمة لكشف الجانب البطني من الدماغ (الشكل 3E).
- استخرج الدماغ بعناية باستخدام ملقط حاد، متجنبا ملامسة الجاف الأم للعظام الجدارية (الشكل 3F).
- اغمر الجمجمة الظهرية بالكامل في 5 مل، 4٪ PFA وثبت لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية (الشكل 3G).
نقاط التوقف: تخزين الجماجم الثابتة على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع. قم بإزالة العينة من 4 درجات مئوية ودعها تعود إلى درجة حرارة الغرفة قبل تشريح السحايا.
5. تشريح السحايا من جمجمة الفأر
- اغسل الجمجمة الثابتة ب 5 مل 1x PBS، وكرر الغسيل ثلاث مرات (10 دقائق لكل مرة).
- ضع الجانب الظهري للجمجمة للأسفل في طبق بحجم 10 سم مملوء ب 1x PBS (الشكل 4A).
- استخدم طرف الملقط ذو الأطراف الدقيقة للإمساك أو الضغط على البولا الطبلية وإزالته من الجمجمة (الشكل 4B).
ملاحظة: إزالة الفقاعة الطبلية خطوة حاسمة لتجنب تمزق السحايا الناتج عن الالتصاق أثناء الانفصال عن الجمجمة. - قم بقص السطح البطني للجمجمة بمسافة حوالي 2 مم باستخدام المقص لتسويتها (الشكل 4C).
- استخدم ملقطا دقيقا، وهو نسيج أبيض شفاف بدقة متبقية من منطقة التقاء الجيوب الأنفية (COS) في السحايا (الشكل 4D).
ملاحظة: الإزالة غير الكاملة للأنسجة المتبقية هي سبب رئيسي للتصبغ غير النوعي في وضع العلامات المناعية. - استخدم ملقط دقيق لرفع حافة واحدة من السحايا بلطف من حافة الجمجمة، ثم رفع الحافة المقابلة (الشكل 4E، F).
- أمسك الحافة الشبيهة بالوعاء للسحيا واسحب لفصلها عن الجمجمة في منطقة COS (الشكل 4G).
- قم بإزالة عظم الفك العلوي بالمقص (الشكل 4H).
- أمسك الحافة الشبيهة بالوعاء مرة أخرى واسحب لفصل السحايا عن الجمجمة عند منطقة العظم الجبهية (الشكل 4I).
- ضع السحايا السليمة في صفيحة تحتوي على 1 مل 1x PBS بسعة 1 مل من PBS، جاهزة للتلوين.
ملاحظة: إذا تمزقت السحايا أثناء التشريح، خاصة عند التقاء الجيوب السهمية العلوية والجيوب المستعرضة، فقد لا تكون العينة مناسبة لمزيد من التحليل. إذا لوحظ تلوين خلفية غير محدد عالي، أضف خطوة تبريد بعد تثبيت PFA (مثل الحضانة بمحلول 0.1 M جلايسين لمدة 40 دقيقةو12) لتقليل الإشارة الخلفية أكثر.
6. الحجب، الأجسام المضادة الأولية، وتلوين الأجسام المضادة الثانوية
- استخدم ماصة بحجم 1 مل لاستنشاق 1x PBS بحيث تلتصق السحايا بأسفل صفيحة البئر.
- قم بحجب السحايا المثبتة بالكامل بمحلول حجب 200 ميكرولتر في صفيحة بسعة 24 بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: افرد السحايا بلطف بالكامل في محلول الانسداد باستخدام الملقط لضمان تعريض متساو. - استخدم ماصة لإزالة محلول الانسداد.
- حضن السحايا الكاملة ب 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة المضادة LYVE-1 (مؤشر الوعاء اللمفاوي13) المخففة عند تخفيف 1:200 (التركيز النهائي 1 ميكروغرام/مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- استخدم ماصة لإزالة محلول الأجسام المضادة.
- اغسله ثلاث مرات مع 1x PBS (10 دقائق لكل مرة).
- حضن السحايا الكاملة باستخدام DAPI (التركيز النهائي 1 ميكروغرام/مل) وIgG مضاد للفئران أليكسا فلور 488 (التركيز النهائي 2 ميكروغرام/مل) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بمقدار 1x PBS.
ملاحظة: احمها من الضوء أثناء حضانة الأجسام المضادة. - استخدم ماصة لإزالة محلول الأجسام المضادة.
- اغسله ثلاث مرات مع 1x PBS (10 دقائق لكل مرة).
7. التركيب والتصوير
- مطبعة 100 ميكرولتر من 1x PBS على مركز الشريحة.
- قم بتعويم وانشر السحايا الكاملة داخل القطرة (الشكل 5A).
- استنشق 1x PBS للسماح للنسيج بالالتصاق بشكل مسطح بالشريحة (الشكل 5B).
- ضع 20 ميكرولتر من وسط التثبيت على السحايا الكامل.
- ضع غطاء فوق النسيج (الشكل 5C).
- جفف الشرائح في الهواء عند درجة حرارة الغرفة واحتزنها عند 4 درجات مئوية.
نقاط التوقف: يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر. أزل الشريحة من 4 درجات مئوية ودعها تعود إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة أي تكثف من سطح الشريحة باستخدام ورق ماص. - استخدم عدسة موضوعية 20x لالتقاط صور MLV. اضبط القناة على FL Green بطول موجة انبعاث 518 نانومتر وزمن تعريض 100 مللي ثانية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد حقن ال IVA-647 بواسطة الأشعة القلبية، كشف التصوير الحي للحيوانات الصغيرة عن إشارات فلورية بيضاوية الشكل موزعة بشكل ثنائي في منطقة عنق الرحم (الشكل 6A). في الحقن الناجحة، كان المتتبع واضحا في شبكات الأشعة الخلفية بعد الحقن، مع ذروة شدة الفلورة عند حوالي 60 دقيقة (الشكل 6B). بالإضافة إلى ذلك، لوحظت إشارات فلورية في العقد اللمفاوية السطحية والعميقة المعزولة في الرقبة (الشكل 6C). يسمح التحل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول طريقة شاملة لتقييم وظيفة وشكل ال MLVs من خلال دمج حقن ال ICM، والتصوير الحي لشبكات CLN، وتشريح السحايا، والتلوين بالكامل. ميزة رئيسية لهذا النهج المتكامل مقارنة بالطرق التقليدية هي أنه يتيح تقييما متزامنا لوظيفة تصريف اللمفاوم وشكل الأوعية داخل نفس الحيوان، مما يلغي الحاجة إلى مجموعات منفصلة وبالتالي يقلل من التنوع التجريبي مع تحسين قابلية مقارنة البيانات. علاوة على ذلك، مقارنة بطرق التلوين المناعي التقليدية التي تتطلب التقسيم، يحافظ التلوين الكامل على البنية...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل بتمويل من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2023YFC2306500)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82502108)، ومؤسسة الصين للعلوم ما بعد الدكتوراه (2024M760542).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid) | Tocris | Cat# 3525 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution) | Invitrogen | Cat# A-21208 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | Cat# P0126 | |
| Blunt-tipped forceps | RWD Life Science | Cat# F12011-10 | |
| BSA | Beyotime | Cat# ST023 | |
| Coverslips | CITOTEST | Cat# 80312-3161 | |
| Curved sharp forceps | RWD Life Science | Cat# F11003-11 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat# D9542 | |
| Depilatory cream | Veet | N/A | |
| Dish-10 cm | Thermo Fisher Scientific | Cat# 150464 | |
| Disposable intravenous (IV) infusion needle | Zhejiang Kindly Medical Devices | N/A | |
| Ethanol-75% | Sinopharm Chemical Reagent | Cat# 80176961 | |
| Fetal Bovine Serum | Excell | Cat# FSD500 | |
| Filter-0.22 µm | Merck Millipore | Cat# SLGPR33RB | |
| Glass slides | CITOTEST | Cat# 80340-3610 | |
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent | Cat# 10003218 | |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | N/A | |
| Micro forceps | Shinva Medical Instrument | Cat# ZD372RB | |
| Micro scissors | Shinva Medical Instrument | Cat# ZO13056R | |
| Microinjection needle (25 µL) | Shanghai Gaoge Industry & Trade | N/A | |
| Microinjection pump | Voyage Power | Cat# QHZS-001A | |
| Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male | Cavens | N/A | |
| Needle-30G | Zhejiang Kindly Medical Devices | N/A | |
| Normal Saline | Beyotime | Cat# ST341 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Cat# O34784 | |
| Paraformaldehyde Fix Solution-4% | Beyotime | Cat# P0099 | |
| PE-10 tubing | Shanghai Qiujing Biochemical Reagent and Instrument | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (1x PBS) | Beyotime | Cat# ST447 | |
| Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution) | Santa Cruz | Cat# sc-65647 | |
| Stereomicroscope | Jonec | Cat# JSZ6 | |
| Stereotaxic frame | RWD Life Science | Cat# 68030 | |
| Straight scissors | RWD Life Science | Cat# S12007-10 | |
| Syringe-1-mL | Zhejiang Kindly Medical Devices | N/A | |
| Tissue Adhesive I | 3M Vetbond | Cat# 1469SB | |
| Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | Cat# T48402 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T8787 | |
| VS120 High-throughput fluorescence imaging system | Olympus | N/A |
المراجع
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212, 991-999 (2015).
- Sandrone, S., Moreno-Zambrano, D., Kipnis, J., Van Gijn, J. A (delayed) history of the brain lymphatic system. Nat Med. 25, 538-540 (2019).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and alzheimer's disease. Nature. 560, 185-191 (2018).
- Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
- Li, X., et al. Meningeal lymphatic vessels mediate neurotropic viral drainage from the central nervous system. Nat Neurosci. 25, 577-587 (2022).
- Rustenhoven, J., et al. Age-related alterations in meningeal immunity drive impaired cns lymphatic drainage. J Exp Med. 220, (2023).
- Kodama, T., Hatakeyama, Y., Kato, S., Mori, S. Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system. Biomed Opt Express. 6, 124-134 (2015).
- Banerjee, R., Knauer, L. A., Yang, Y. Protocol for in vivo and in vitro study of lymphatic valve formation driven by shear stress signaling pathway. STAR Protoc. 4, 102141 (2023).
- Akwii, R. G., et al. Murine dermal lymphatic endothelial cell isolation. J Vis Exp. (197), e65393 (2023).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378 (2018).
- Hsieh, Y. T., Chen, S. L. Visualization and analysis of neuromuscular junctions using immunofluorescence. Bio Protoc. 14, e5076 (2024).
- Banerji, S., et al. Lyve-1, a new homologue of the cd44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144, 789-801 (1999).
- Da Mesquita, S., et al. Meningeal lymphatics affect microglia responses and anti-abeta immunotherapy. Nature. 593, 255-260 (2021).
- Betsholtz, C., et al. Advances and controversies in meningeal biology. Nat Neurosci. 27, 2056-2072 (2024).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathol. 137, 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high eeg delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5, eaav5447 (2019).
- Lee, H., et al. The effect of body posture on brain glymphatic transport. J Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
