في هذه الدراسة، ومن خلال مقارنة نتائج الكشف عن 24 معلقاً بكتيرياً مستنبطاً من Helicobacter pylori (H. pylori) تم الحصول عليها باستخدام طرق الكشف عن المستضد وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (digital PCR)، قمنا بتحليل الارتباطات بينهما لبحث أهميتها في توصيف المواد المرجعية لبكتيريا H. pylori والتقييم التشخيصي in vitro.
مقالة بحثية
ارتباط عيار مستضد H. pylori مع القياس الكمي بتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي: تقييم تحليلي للعزلات المستزرعة والمثبطة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لا يزال توحيد معايير تشخيص جرثومة المعدة Helicobacter pylori (H. pylori) يشكل تحدياً عبر فحوصات الكشف غير المتجانسة. تكتشف طريقة الكروماتوغرافيا المناعية المستقيمة (Immunochromatography) المستضدات النوعية لـ H. pylori ولكنها تعطي نتائج نوعية فقط، وهي عرضة للتداخل من البروتينات البكتيرية الذائبة غير المستهدفة عبر الارتباط غير النوعي أو التثبيط التنافسي. وفي المقابل، يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR) التحديد الكمي الدقيق لنسخ الحمض النووي الجينومي، مما يسمح بتحديد البكتيريا الحية وغير الحية على حد سواء. قارنت هذه الدراسة بين عيارات نقطة النهاية المشتقة من الكروماتوغرافيا المناعية (قيم شبه كمية تم حسابها كمقلوب لأعلى تخفيف تسلسلي بمقدار ضعفين يمكن اكتشافه) وأعداد نسخ الحمض النووي المحددة كمياً بواسطة dPCR. خضعت أربعة وعشرون معلقاً بكتيرياً من H. pylori، تم استنباتها لمدة 72 h عند 37 °C على أغار بروسيلا (Brucella agar) مدعم بـ 5% دم أغنام منزوع الفيبرين تحت ظروف هوائية دقيقة (85% N2، 10% CO2، 5% O2)، لاختبار المستضدات وقياس dPCR بالتوازي. تم تطبيق معامل ارتباط بيرسون والانحدار الخطي للتقييم الإحصائي. لاحظنا وجود ارتباط إيجابي معنوي بين عيار المستضد وعدد النسخ الجينومية (r = 0.536, n = 24, P = 0.007). ومع ذلك، أظهر معامل التحديد المنخفض (R2 = 0.287) قدرة تنبؤية محدودة، حيث مثل عيار المستضد 29% فقط من التباين المقاس بواسطة dPCR، ولا يمكنه دعم التنبؤ القوي للعينة الواحدة. قد تنشأ ملفات التعارض المتمثلة في ارتفاع dPCR وانخفاض العيار من بقايا بكتيرية غير حية أو حمض نووي جينومي حر. تقوم الفحوصات القائمة على المستضدات وتلك القائمة على الحمض النووي بقياس تحاليل مرتبطة بيولوجياً ولكنها غير قابلة للتبادل. ويُقترح استخدام توصيف متعدد المعايير يجمع بين الوحدات المكونة للمستعمرات، وعيارات المستضدات، وأعداد النسخ الجينومية لتطوير المواد المرجعية والتحقق من صحة الفحوصات التشخيصية. يسلط هذا العمل الضوء على الحاجة إلى إرشادات توافقية نوعية لـ H. pylori لحل التناقضات التشخيصية.
المقدمة
Helicobacter pylori (H. pylori) هي عصوية سالبة الغرام محبة للهواء القليل تستعمر عادةً الجهاز الهضمي البشري، وتحديداً في غار المعدة. وهي المسبب الرئيسي للالتهاب المزمن في المعدة، والقرحات الهضمية، وسرطان المعدة1,2. وتحدث عدوى H. pylori بين البشر بشكل أساسي عبر المسارات الفموية-الفموية أو البرازية-الفموية، وهي منتشرة عالمياً، مع تباين معدلات الإصابة عبر المناطق المختلفة. ففي الدول المتقدمة، يقترب معدل الإصابة من 50%، بينما قد يصل في بعض الدول النامية إلى 80%3. وفي عام 1994، صنفت منظمة الصحة العالمية (WHO) بكتيريا H. pylori كعامل مسرطن من المجموعة 1 لسرطان المعدة4. وتؤدي عوامل الضراوة الرئيسية مثل CagA (المستضد المرتبط بالسم الخلوي أ) و VacA (السم الخلوي المسبب للفجوات أ) إلى حدوث التهاب مزمن وتلف في الظهارة، مما يساهم في الآليات الإمراضية التي تدعم تصنيفها كعامل مسرطن من المجموعة 1. وفي عام 2018، بلغ عدد حالات السرطان المنسوبة إلى عدوى H. pylori نحو 810,000 حالة، وهو رقم يتجاوز مجموع حالات سرطان عنق الرحم وسرطان الكبد الناتجة عن فيروس الورم الحليمي البشري (HPV)، وفيروس التهاب الكبد B (HBV)، وفيروس التهاب الكبد C (HCV)5. وتبرز هذه الإحصائية خطر الإصابة بالسرطان الكبير الذي تشكله H. pylori، والتي قد تؤدي، في حال تركها دون علاج، إلى سرطان المعدة باحتمالية تقريبية تتراوح بين 1%–3% وفقاً لبعض الأبحاث. إن الانتشار العالمي المرتفع لعدوى H. pylori يجعل من الدقة في التحديد الكمي—وليس مجرد الكشف—أولوية للصحة العامة، حيث يمكن للتقييم الدقيق للحمل البكتيري أن يوجه قرارات العلاج ويساعد في تجنب علاجات الاستئصال غير الضرورية أو الفاشلة. وبناءً على ذلك، فإن الكشف الدقيق والتحديد الكمي لبكتيريا H. pylori يكتسبان أهمية كبيرة في الدراسات الوبائية، واختيار خطط العلاج، وتقييم الفعالية العلاجية.
نظراً للعبء الكبير لمرض السرطان الناتج عن H. pylori، فإن الكشف الدقيق والتقدير الكمي يعدان أمرين بالغَي الأهمية للمراقبة الوبائية، واختيار العلاج، والمتابعة العلاجية. وتشمل الطرق غير الباضعة الحالية اختبار المستضد في البراز (SAT)، واختبار نفخ اليوريا، والمقاييس الجزيئية. وبينما يوفر تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR) دقة عالية وتقديراً كمياً مطلقاً، إلا أن تطبيقه السريري مقيد بالتكلفة المرتفعة، والتعقيد التقني، ومتطلبات الأجهزة مقارنة باختبار SAT. وهذا التفاوت هو السبب في ضرورة دراسة الارتباط بين الطريقتين، بهدف تحسين توحيد معايير اختبار SAT باستخدام dPCR كمرجع كمي.
يمكن لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR)، وهي تقنية ناشئة للتقدير الكمي المطلق، الكشف مباشرة عن العدد المطلق لنسخ الجينات المستهدفة دون الاعتماد على منحنى قياسي. وفي أبحاث جرثومة H. pylori، استُخدمت تقنية dPCR للتقدير الكمي البكتيري في الغشاء المخاطي للمعدة، واللعاب، وعينات البراز6,7.
في تطوير كواشف التشخيص in vitro وتقييم جودتها وتنظيمها، يعد تحضير ومعايرة المواد المرجعية أمراً أساسياً لضمان دقة النتائج وقابليتها للمقارنة وتتبعها. وبالنسبة لكواشف التشخيص البكتيرية in vitro (مثل كواشف الكشف عن مستضدات/أجسام مضادة لبكتيريا H. pylori)، غالباً ما يجب أن تحتوي المواد المرجعية على سلالات أو عينات سريرية ذات تركيزات أو وحدات نشاط محددة بدقة. وتتمثل الطريقة التقليدية للتقدير الكمي البكتيري في وحدات تشكيل المستعمرات (CFU/mL)، والتي تعكس مباشرة عدد البكتيريا الحية ذات القدرة على التكاثر، وتُستخدم بشكل متكرر لتحديد قيمة المواد البكتيرية القياسية، وتقييم حساسية الكواشف، والمقارنة المنهجية8. ورغم أن CFU لا تزال مستخدمة على نطاق واسع، إلا أن لها قيوداً واضحة من حيث وقت الكشف، واستهلاك المواد، وتكاليف العمالة9.
مع التوسع في استخدام تقنيات التشخيص in vitro، أصبحت الطرق الجزيئية مثل dPCR تتيح الآن تقدير كمية الممرضات بدقة وحساسية أعلى. وفي الوقت ذاته، يتزايد تطبيق الطرق المناعية مثل معايرة المستضدات في الممارسة السريرية. ومع ذلك، في العمليات التطبيقية، تكون معظم العزلات السريرية التي يتم جمعها أو العينات القياسية التي يتم تحضيرها عبارة عن عينات مثبطة أو عينات محفوظة لفترات طويلة، مما يجعل من الصعب أو المستحيل إجراء استزراع بكتيري حي وحساب وحدات تكوين المستعمرات CFU10. وعند تحضير المواد المرجعية، يجب إجراء عملية التثبيط تلبيةً لمتطلبات السلامة البيولوجية ولضمان الاستقرار طويل الأمد للمواد. وبناءً على ذلك، تصبح الطرق الكمية القائمة على المستضدات أو الأحماض النووية وسائل أساسية لتحديد القيمة8,11.
يؤدي هذا إلى سؤال عملي يتعلق بالارتباط والتكافؤ بين هذين النهجين الكميين المتميزين: عند استخدام الكشف عن المستضد والـ dPCR لتقييم المواد القياسية، هل توجد علاقة مستقرة وقابلة للقياس بين نتائج هاتين الطريقتين؟ أظهرت التجارب الأولية التي استخدمت مجموعة محدودة من عينات H. pylori المثبطة ارتباطاً إيجابياً متسقاً بين شدة الإشارة في المقايسات المناعية الكروماتوغرافية وأعداد نسخ الـ DNA التي تم قياسها كمياً عبر الـ dPCR. وقد افترضنا وجود ارتباط إيجابي كبير ومتسق بين عيار مستضد H. pylori، مقاساً بالمقايسات المناعية الكروماتوغرافية، وأعداد نسخ الـ DNA، مقاسة كمياً بواسطة الـ dPCR، في عينات بكتيرية مثبطة. وإذا وجد مثل هذا الارتباط، فإنه سيمكن من تحويل النتائج النوعية القائمة على المستضد إلى ما يعادلها كمياً من الأحماض النووية. سيوفر هذا أساساً هاماً لتقييم أداء الكواشف، ووضع المعايير، وتعيين المواد المرجعية، وتفسير نتائج الاختبارات السريرية عندما تكون المزرعة التقليدية غير ممكنة.
في الوقت الحالي، تعد الأبحاث المتعلقة بالعلاقة بين نتائج مستضد H. pylori ومحتوى الحمض النووي غير كافية، وهناك نقص في البيانات المنهجية لدعم أعمال المراجعة والتنظيم والتوحيد القياسي. ولاختبار هذه الفرضية، أجرت هذه الدراسة اختبارات متوازية على 24 معلقاً بكتيرياً مستزرعاً من H. pylori لتحليل الارتباط بشكل منهجي بين عيار المستضد الذي تم الكشف عنه بطريقة الكروماتوغرافيا المناعية الغروانية ونتيجة الكمية المطلقة لـ dPCR. وبناءً على نتائجنا، قدمنا آراء مرجعية حول تقييم أداء كواشف الكشف عن H. pylori وتعيين قيم المواد القياسية.
البروتوكول
تم عزل جميع عزلات Helicobacter pylori المشمولة في هذه الدراسة في الأصل من خزعات معدية وعينات براز بشرية بواسطة المستشفى التابع الخامس لجامعة Zhengzhou، والذي وفر معلقات بكتيرية مجهولة الهوية ومعالجة بالكامل لتجاربنا in vitro. وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الأصلية (جمع العينات السريرية، وعزل البكتيريا، والحفظ بالتجميد الأولي) من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى التابع الخامس لجامعة Zhengzhou (رقم الموافقة الأخلاقية: KY2026080). كما تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين قبل جمع العينات، والتزمت جميع الإجراءات بدقة بإعلان هلسنكي والمبادئ التوجيهية الوطنية ذات الصلة بأخلاقيات البحوث الطبية الحيوية. وقد قام المستشفى المصدر بإزالة جميع المعلومات التي تحدد هوية المرضى بشكل دائم قبل نقل العينات، ولا يمكن استنتاج هوية أي مريض فردي من المواد التجريبية أو النتائج الواردة في هذه الدراسة.
لا تتطلب الدراسة الحالية موافقة أخلاقية مستقلة إضافية أو موافقة مستنيرة. تشتمل جميع التجارب فقط على مقاييس in vitro باستخدام معلقات بكتيرية مجهولة الهوية، دون الوصول إلى العينات البشرية الأصلية، أو السجلات السريرية للمرضى، أو المعلومات الشخصية الخاصة. ووفقاً للوائح أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية الوطنية، فإن الأبحاث غير التدخلية in vitro التي تستخدم عزلات ميكروبية مجهولة الهوية تماماً تستوفي معايير الإعفاء الأخلاقي. كما أن الموافقة الأخلاقية الأصلية الصادرة عن المستشفى الخامس التابع لجامعة Zhengzhou تغطي بالفعل جميع التطبيقات الأكاديمية الثانوية المشروعة لهذه السلالات مجهولة الهوية، وهو ما تم تأكيده رسمياً من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية.
أُجريت جميع تجارب H. pylori in vitro في مختبرات حاصلة على شهادة سلامة بيولوجية سارية (المستوى الثاني للسلامة البيولوجية، BSL-2، سجل السلامة البيولوجية للمختبرات التابع للجنة الصحة في منطقة دونغتشينغ ببكين [2020] رقم 059)، وذلك باتباع إجراءات التشغيل القياسية المؤسسية واستيفاء جميع متطلبات المراجعة والتصريح الخاصة بالسلامة البيولوجية. ويشمل اعتماد السلامة البيولوجية لهذه الدراسة جميع الإجراءات التي تتضمن مواد H. pylori المعطلة حرارياً، بما في ذلك العمل مع المواد التي لم يتم تعطيلها بالكامل (أي التي تحتوي على كائنات حية متبقية وفقاً لما تم تحديده بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل qPCR لقياس الحيوية). كما تم الالتزام الصارم بالممارسات الميكروبيولوجية القياسية، ومتطلبات معدات الوقاية الشخصية (PPE)، وإجراءات تطهير النفايات طوال فترة الدراسة. وقد تم تعطيل جميع العينات البكتيرية بشكل صحيح قبل التخلص منها وفقاً للإرشادات المؤسسية لإدارة النفايات ذات المخاطر البيولوجية. تتوفر تفاصيل جميع الكواشف والمعدات والبرمجيات المستخدمة في التحليل الإحصائي في جدول المواد.
السلالة والاستزراع
تنبيه: تُصنف بكتيريا H. pylori كعامل ممرض بشري من مجموعة المخاطر 2. يجب إجراء جميع عمليات التعامل مع المزارع الحيوية (التلقيح، والتحضين، وتحضير المعلق) داخل كابينة سلامة بيولوجية معتمدة في مرافق ذات مستوى سلامة بيولوجية من الدرجة الثانية (BSL-2)، مع ارتداء معطف المختبر، والقفازات، ووسائل حماية العينين.
يؤدي التعطيل الحراري عند 56 °C لمدة 25 min إلى تقليل الكائنات الحية بشكل كبير ولكن لا يقضي عليها تماماً (انظر القسم 1)؛ لذا يجب الاستمرار في التعامل مع المعلقات المعطلة جزئياً وفقاً لشروط BSL-2. كما يجب تعقيم جميع النفايات البيولوجية والمواد الاستهلاكية الملوثة باستخدام الموصدة (autoclaved) عند (121 °C، ≥30 min) أو تطهيرها وفقاً لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية قبل التخلص منها. وقد تم التصريح بأعمال BSL-2 الموصوفة هنا بموجب نفس ملف السلامة البيولوجية (Beijing Dongcheng District Health Commission Laboratory Biosafety Filing [2020] No. 059).
الـ الملوية البوابية (Helicobacter pylori) كانت السلالات المستخدمة في هذه الدراسة عبارة عن 24 معلقاً بكتيرياً مستزرعاً، تم الحصول عليها في البداية من خزعات معدية وعينات براز بشرية بواسطة المستشفى الخامس التابع لجامعة Zhengzhou، ثم نُقلت في شكل معلق بكتيري إلى مجموعة السلالات الخاصة بـ في المختبر قسم تشخيص الأمراض المعدية في المعاهد الوطنية للرقابة على المخدرات (NIDC)، بكين، الصين، وقد أُجريت جميع الأعمال التجريبية في هذه الدراسة في المركز الوطني للأمراض المعدية (NIDC) (بكين، الصين). تم تلقيح هذه السلالات على أطباق وسط Brucella المضاف إليها 5% من دم أغنام منزوع الفبرين، واستُزرعت في ظروف نقص الأكسجين (85% N2)₂، 10% من CO₂، 5% O2₂) في 37 °C لمدة 72 ساعة. وتتوافق مدة الزرع هذه مع طور النمو السكوني، الذي يكون خلاله التعبير عن المستضد لكل سلالة مستقراً نسبياً. بعد ذلك، جُمعت المعلقات البكتيرية.
أُجري التعطيل الحراري باستخدام حمام مائي رقمي عند 56 °C لمدة 25 min. نُفذت هذه المعالجة لتلبية متطلبات السلامة الحيوية وضمان الاستقرار طويل الأمد للمواد المرجعية. يؤدي التعطيل الحراري عند 56 °C لمدة 25 min إلى خفض الحيوية البكتيرية بشكل كبير ولكنه لا يقضي تماماً على جميع الكائنات الحية، كما أكد ذلك تحليل PCR للحيوية اللاحق، والذي قاس متوسط كسر متبقٍ حي بنسبة 4.6% (المدى 0.00%–33.00%) عبر 24 معلقاً بكتيرياً مستزرعاً (راجع قسم النتائج 6 والمناقشة). يغطي اعتماد السلامة الحيوية لهذه الدراسة العمل مع المواد التي لم يتم تعطيلها بالكامل (راجع بيان الأخلاقيات والسلامة الحيوية). ويُعتبر التأثير المحتمل للتعطيل الحراري على الكشف عن المستضدات ضئيلاً، حيث أن المعالجة الحرارية أقل من عتبة تمسخ معظم المستضدات السطحية لـ H. pylori؛ ومع ذلك، فقد تؤثر على سلامة بعض المستضدات البروتينية الحساسة للحرارة. أما بالنسبة لتقدير كمية DNA، فإن التعطيل الحراري لا يؤدي إلى تكسير DNA الجينومي وقد يحسن في الواقع من كفاءة الاستخلاص عن طريق تدمير الأغشية الخلوية.
الكشف عن المستضد
تم تخفيف المعلقات البكتيرية الـ 24 التي تم جمعها بمقدار 100 ضعف باستخدام PBS لتحضير عينات الكشف عن المستضد. يعمل التخفيف الأولي بمقدار 100 ضعف على ضبط تركيز المستضد ليكون ضمن نطاق الكشف الخطي لأطقم الاختبار التجارية وتقليل تداخل المصفوفة، مما يضمن الحصول على نتائج كشف موثوقة ودقيقة. كما يساهم التخفيف في الحفاظ على حجم العينة. تم اختبار هذه العينات باستخدام ثمانية أطقم مسجلة للكشف عن مستضد H. pylori (الجدول 1)، بما في ذلك طريقة الذهب الغروي، وطريقة اللاتكس، وطريقة الكروماتوغرافيا المناعية. في حال كانت النتيجة إيجابية، يتم تخفيف العينة المخففة تسلسلياً (1:2، 1:4، 1:8، إلخ) واختبارها حتى تصبح النتيجة سلبية. يتم تسجيل أعلى نسبة تخفيف تظل إيجابية وتُعرف بأنها "نسبة التخفيف الإيجابية النهائية للمستضد" (على سبيل المثال، 1:64). تم تحضير التخفيفات التسلسلية بمقدار ضعفين في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS, 0.01 M, pH 7.2–7.4). بعد وضع العينة، يتم تحضين كل شريط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 دقيقة قبل القراءة؛ حيث يقوم مشغل مدرب بقراءة النتيجة بصرياً بمقارنتها بخط التحكم، ويتم تسجيل نقطة النهاية كأعلى تخفيف يظهر فيه خط اختبار مرئي. ونظراً لأن شرائط الذهب الغروي تُقرأ بصرياً، فإن حد القطع يعتمد على المشغل.
بالنسبة لكل عينة تم اختبارها باستخدام عدة أطقم تجارية للكشف عن المستضدات، تم تعريف عيار نقطة النهاية على أنه الوسيط لجميع عيارات الأطقم الفردية. وبما أن الأطقم الثمانية في هذه الدراسة قد صُممت بمستضدات مستهدفة ومبادئ كشف غير متجانسة، فلم يتم استخدام معامل كابا (Cohen's Kappa) أو معامل الاختلاف (CV%) لقياس مدى الاتساق بين الأطقم، لأن هذه المؤشرات تفترض وجود معيار مرجعي مشترك. وبالتالي، فإن التباين الملحوظ بين الأطقم يعكس التباين البيولوجي والتحليلي الحقيقي بدلاً من أخطاء القياس. ويمكن للوسيط، باعتباره مقياساً قوياً للنزعة المركزية، أن يقاوم بفعالية الانحرافات الخاصة بكل طقم. وعبر العينات الـ 24، تراوح مدى التشتت داخل العينة الواحدة بين أعلى وأدنى عيارات للأطقم من ضعفين إلى 16 ضعفاً (الوسيط، 4 أضعاف): حيث اختلفت ست عينات بمقدار ضعفين، وأربع عشرة عينة بمقدار 4 أضعاف، وثلاث عينات بمقدار 8 أضعاف، وعينة واحدة بمقدار 16 ضعفاً بين الأطقم. وتُدرج أقل وأوسط وأعلى العيارات لكل طقم لكل عينة في الجدول التكميلي 1.
الكشف الكمي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي
خضعت المعلقات البكتيرية الـ 24 التي تم جمعها لتخفيف بمقدار 500 ضعف باستخدام PBS، ثم استُخدمت كعينات للكشف الكمي بتقنية dPCR. أجري التقدير الكمي المطلق لهذه العينات المخففة بواسطة أربعة مختبرات dPCR (الجدول 2). تم تنفيذ dPCR باستخدام مجموعات من البادئات والمجسات المملوكة والخاصة بكل منصة، والتي تستهدف تسلسلات جينومية محفوظة لبكتيريا H. pylori. وتعد أطقم الكشف dPCR المستخدمة في هذه الدراسة أطقم كواشف عامة قابلة للتطبيق على مسببات أمراض وأهداف متعددة. وقد قامت كل منصة بشكل مستقل بتصميم وتحسين تسلسلات البادئات/المجسات ومناطق الجينات المستهدفة المحددة، والتي تمثل ملكيتها الفكرية الأساسية. ولم يتم الكشف عن هذه التسلسلات للمستخدمين النهائيين، بل تم إبلاغنا فقط بأن هدف الكشف المحدد لبكتيريا H. pylori هو منطقة جينومية محفوظة تم التحقق من قدرتها على الكشف النوعي. وقد تم إرسال تسلسلات جين 23S rRNA لـ 24 سلالة من Helicobacter pylori إلى NCBI GenBank تحت رقم الوصول للمشروع الحيوي PRJNA1520048. وقد قُدمت هذه التسلسلات لتأكيد هوية السلالات وليست هي الهدف الكمي لـ dPCR. ونظراً لأن تصميم البادئات/المجسات، وكيمياء التضخيم، وعدّ الأقسام القائم على توزيع Poisson هي ملكية خاصة لكل منصة، فإن هذه الخطوات تعتمد على المنصة ولا يمكن إعادة إنتاجها دون الوصول إلى بيانات الشركة المصنعة؛ وفي المقابل، فإن إجراءات تخفيف العينات، وتكرار الاستخلاص، وتجميع البيانات الموصوفة أعلاه مستقلة عن المنصة ومحددة بالكامل. تم حساب أعداد النسخ المطلقة باستخدام خوارزمية توزيع Poisson المطبقة في برنامج التحليل المملوك للجهاز. وتعد المعلمات الحسابية المحددة والشيفرة المصدرية ملكية خاصة للشركة المصنعة ولم يتم الكشف عنها للمستخدمين النهائيين. وأخيراً، تم حساب عدد النسخ المطلق (copies/mL) للجين المستهدف في المحلول الأصلي بناءً على توزيع Poisson وعامل التخفيف.
شاركت أربعة مختبرات مستقلة لتقنية dPCR في هذه الدراسة (Sniper، وJiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd.، وUstar Biotechnologies Ltd.، وTargetingOne)، حيث استخدم كل منها أطقم استخلاص وكواشف dPCR خاصة به ومحسنة لمنصة أجهزته، مع استهداف تسلسلات جينومية محفوظة لبكتيريا H. pylori. استلمت كل منصة المعلق البكتيري غير المخفف وجهزت العينات وفقاً للبروتوكول الخاص بها: استخدمت منصة Ustar المعلق غير المخفف مباشرة، بينما قامت منصات Sniper وJiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. وTargetingOne بتخفيفه بمقدار 500 ضعف في محلول PBS قبل الاستخلاص. وبالنسبة لكل عزلة على كل منصة، تم إجراء عمليتي استخلاص مستقلتين للأحماض النووية من نفس المعلق البكتيري المخفف 500 ضعف، واختُبر كل مستخلص في ثلاث مكررات، مما نتج عنه ست قياسات لكل عزلة لكل منصة (مع استثناء واحد في منصة Ustar حيث أنتج استخلاص واحد مكررين صالحين فقط). صُنفت العملية بأنها غير صالحة واستُبعدت إذا انخفض عدد القطيرات الإيجابية عن الحد الأدنى للكشف الخاص بالجهاز أو إذا أظهرت عينة الضبط السلبية (no-template control) تضخيماً غير نوعي؛ وقد كُررت التفاعلات غير الصالحة مرة واحدة، وأدى الفشل المستمر إلى استبعاد عملية الاستخلاص بأكملها. تتوفر البيانات الخام الخاصة بكل منصة في Supplementary Table 1.
اتبع تجميع البيانات إجراءً مكوناً من مستويين: أولاً، تم حساب متوسط جميع القياسات الخام الصحيحة (copies/µL) ضمن كل منصة وتحويلها إلى التركيز الأصلي للمعلق البكتيري غير المخفف (copies/mL) باستخدام صيغ تحويل خاصة بكل منصة؛ ثانياً، تم حساب متوسط التركيزات الأربعة المستمدة من المنصات لكل عزلة (المتوسط الحسابي) للحصول على قيمة عدد النسخ النهائية الواحدة. يضمن هذا الإطار مساهمة متساوية للمنصات بغض النظر عن التباين في المكررات داخل المنصة الواحدة، مع الحد من الانحيازات الممنهجة المتأصلة في الأجهزة الفردية أو أنظمة الكواشف.
تم تقدير كمية كل معلق بكتيري مستزرع بالتوازي على أربع منصات dPCR، وحُسب معامل الاختلاف (CV) لأعداد النسخ المحولة إلى log₁₀ عبر المنصات لكل عزلة لتقييم التباين بين المختبرات. وترد النتائج المقابلة في قسم النتائج.
التحليل الإحصائي
تم تحديد عيار مستضد H. pylori على أنه مقلوب أعلى عامل تخفيف للعينة الذي لوحظ عنده نتيجة إيجابية (على سبيل المثال، تخفيف 1:64 يقابل عياراً قدره 64). وبالنسبة لكل عزلة، تم تجميع عيارات المستضد الثمانية الخاصة بالمجموعات التشخيصية عن طريق حساب الوسيط، كما تم تجميع تركيزات dPCR الأربعة الخاصة بالمنصات عن طريق حساب المتوسط الحسابي، وذلك لاستخلاص قيمة تمثيلية واحدة لكل عزلة من أجل تحليل الارتباط اللاحق. وتُعد استراتيجية تقليل البيانات هذه مبررة منهجياً لأن: (1) مجموعات المستضدات الثمانية تكتشف نفس المادة التحليلية باستخدام مبادئ مقايسة مناعية متماثلة، والوسيط يوفر مقدراً قوياً مقاوماً للقراءات الشاذة المتفرقة؛ (2) تقوم كل منصة من منصات dPCR الأربعة بقياس موقع جينومي محفوظ لـ H. pylori، ويعطي المتوسط الحسابي لتقديرات التركيز الموزعة لوغاريتمياً طبيعياً نزعة مركزية غير منحازة؛ (3) يتوافق هذا التجميع مع الهدف الأساسي للدراسة، وهو تقييم التوافق بين طرق القياس الكمي القائمة على عيار المستضد وتلك القائمة على الحمض النووي DNA على مستوى العزلة، بدلاً من تقييم الأداء التحليلي بين المجموعات التشخيصية أو بين المنصات. تم تقييم الارتباط بين عيار المستضد والقياس الكمي بـ dPCR (copies/mL) أولاً باستخدام تحليل ارتباط بيرسون. ويتبع كلا المتغيرين توزيعاً طبيعياً تقريباً بعد التحويل اللوغاريتمي (skewness: log10 dPCR = −0.66; log2 antigen titer = −0.60; regression residual skewness = −0.16)، مما يحقق افتراضات ارتباط بيرسون. تم تحويل عيار المستضد باستخدام log2 ليعكس خطية التخفيف التسلسلي بمعدل ضعفين، بينما تم تحويل نتائج dPCR باستخدام log10، وهو ما يتوافق أيضاً مع تنسيق التقارير الخاص بمعيار الحمل البكتيري. لاحقاً، ولتقييم الارتباط الخطي، تم إجراء تحليلات ارتباط بيرسون والانحدار الخطي باستخدام تحويل log2 لعيار المستضد وتحويل log10 لنتائج dPCR. وفي جميع التحليلات، تم تطبيق مستوى دلالة (α) قدره 0.05، مع اعتبار P < 0.05 دالاً إحصائياً. أُجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام منصة التحليل الإحصائي عبر الإنترنت SPSSPRO.
النتائج
مقارنة بين هيليكوباكتر بيلوري مُستوى تركيز المستضد ونتائج التكمية المطلقة باستخدام تضخيم الحمض النووي الرقمي
من بين إجمالي 24 عينة من المعلق البكتيري المزروع، تراوح معدل التركيز المضدي من 8 إلى 256، بوساطة مقدارها 32 (الجدول 1.تباينت نتائج التكمية باستخدام تضخيم الحمض النووي الريبي الرقمي بين 2.67 × 107 نسخ/مل إلى 2.04 × 109 نسخ/مل، بوساطة وسطية تبلغ لوغ₁₀ = 8.61 (≈4.09 × 108 نسخ/مل) (الجدول 2) أظهرت العلاقة خصائص غير خطية في البيانات الأولية، مما يشير إلى ارتباط من نوع القوة أو الأسي، وهو ما يبرر التحويلات اللوغاريتمية اللاحقة المطبقة على قيم تركيز المستضد وقياسات التضخيم الرقمي بالبوليمراز.
الارتباط الخطي بين تركيز المستضد المحوّل لوغاريتمياً ونتائج القياس الكمي باستخدام تفاعل البوليميراز الرقمي
لإختبار ما إذا كانت هناك علاقة ارتباطية ذات دلالة إحصائية بين نتائج الطريقتين الكشفيتين، قمنا بتطبيق التحويل اللوغاريتمي وأجرينا تحليل ارتباط بيرسون، نظرًا لأن كلا المتغيرين يتوزعان توزيعًا طبيعيًا تقريبًا بعد التحويل اللوغاريتمي. كما هو موضح في الشكل 1، بعد التحويل، أظهر مؤشر المستضمن (محولًا باستخدام اللوغاريتم ذي الأساس 2) والنتيجة الكمية المطلقة لتحليل البصمة الرقمية (محولة باستخدام اللوغاريتم ذي الأساس 10) ارتباطًا خطيًا إيجابيًا معتدلًا وذو دلالة إحصائية (r = 0,536، n = 24، P = 0.007).
النمذجة الكمية للعلاقة بين تركيز المستضد وعدد نسخ تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي
لقياس العلاقة بين طريقتي الكشف وتقييم الإمكانية للتنبؤ المتبادل، قمنا بتطبيق تحليل الانحدار الخطي على البيانات التي خضعت لتحويل اللوغاريتمي، وذلك لاستخدام نموذج الانحدار للتنبؤ بالحمل البكتيري من خلال تركيز المستضد في المستقبل. يُظهر التحليل وجود علاقة خطية بين اللوغاريتم2 (تركيز المستضد) وتسجيل الدخول10 (دبي سي آر)، مما يعطي المعادلة: log10(د.ب.ح) = 0.1588 × تسجيل2(التركيز) + 7.7988 (R2 = 0.287). كانت معاملات الانحدار (مع الأخطاء القياسية وفترات الثقة 95%) كالتالي: الميل 0.1588 ± 0.053 (95% فاصل الثقة 0.048–0.270) وتقاطع 7.7988 ± 0.292 (95% فاصل الثقة 7.193–8.404)؛ وكان خطأ المعيار المتبقي 0.318 لوغ10 وحدات، وكانت الانحدار الكلي دالًا إحصائيًا (F(1،22) = 8.84، P = 0.007). وهذا يشير إلى أنه مع كل مضاعفة لتركيز المستضد، لا يزداد عدد النسخ في تفاعل البوليميراز الرقمي (dPCR) إلا بمعامل 1.441 مرة (100.1588). ومع ذلك، بالنسبة لتركيز معين لمولد المضاد، يمكن أن تمتد فترة التنبؤ بنسبة 95٪ لنتائج تفاعل البلمرة الرقمي (dPCR) لتغطي ما يقارب ترتيبَيْن رقميَّيْن (على سبيل المثال، عند تركيز 1:32، تكون فترة التنبؤ حوالي 8.3 × 107 إلى 1.85 × 109نسخ/مل). هذا يشير إلى أنه في التطبيقات العملية، لا يمكن لقيمة تركيز المستضد وحدها التنبؤ بدقة بعدد نسخ الحمض النووي في عينة واحدة، ولكن استخدام هذا النموذج قد يوفر تقديراً تقريبياً لرتبة المقدار عند المقارنة على مستوى المجموعات، رغم أنه محدود في التنبؤ بالعينات الفردية بسبب القوة التفسيرية المعتدلة (R2 = 0.287).
التباين بين المنصات في التكمية بالبزلر الرقمي وتحليل الحساسية للارتباط
تم تقييم التباين بين المختبرات على سجل10- تحويل التركيزات لمراعاة التوزيع اللوغاريتمي الطبيعي لبيانات كمّية الميكروبات. معامل التباين بالمئة (CV%) عبر البيانات الأربعة المستمدة من المنصة والمحولة لوغاريتمياً10 تراوحت التراكيز بين 0.9% و8.3% (الوسيط 1.8%، المتوسط 2.5%) بين 24 عزلة. وأظهرت حالة شاذة واحدة (Hp06، معامل التباين = 8.3%) >اختلاف ثلاثين ضعفًا بين سنايبر (5.93 × 108 نسخ/مل) وTargetingOne (1.50 × 107 نسخ/مل؛ باستثناء هذا العزلة، تراوحت معاملات التباين من 0.9% إلى 6.4%. للتأكد من أن هذه القيمة الشاذة لم تكن هي السبب في النتيجة المرصودة للضد–تحليل ارتباط dPCR، أُجري تحليل حساسية باستبعاد Hp06، والذي أعطى r = 0.479، R2 = 0.230، و P = 0.021 (ن = 23) — مما يعادل التحليل الأساسي الذي يشمل العزلات الـ24 جميعها — مما يؤكد أن الارتباط الوارد في العنوان لا يعتمد على هذا العزلة. وتعكس هذه التشتّتَ اختلافات منهجية بين المنصّات في كفاءة الاستخلاص، وحساسية الكواشف، ومعايرة الأجهزة، وليس خطأ قياس عشوائيًا، ما يدعم إجراء متوسط مقارن بين المنصّات للحد من التحيّز الخاص بكل منصة.
تحديد وتصنيف النتائج باستخدام عتبات الطريقة المزدوجة
استنادًا إلى التحليلات أعلاه ومعايير استكشافية خاصة بمجموعة البيانات، حددت هذه الدراسة التركيز الوسيط لاكتشاف المستضد عند 1:32 كعتبة لاكتشاف المستضد بمستوى مرتفع، نظرًا لتوزيع بيانات تركيز المستضد غير الطبيعي، واختير الوسيط اللوغاريتمي الفعلي₁₀(دبي سي آر) = 8.61 (≈4.09 × 108 نُسخ/مل) كحدٍّ أعلى لمحتوى الحمض النووي. هذه الحدود هي قيم عتبة استكشافية خاصة بمجموعة البيانات، تم اشتقاقها من بيانات العزلات المزروعة، ولا تمثل معايير تشخيصية سريرية مُعتمدة. وبالتالي، فإن تطبيق هذه القيم العتبية على مجموعات عينات أخرى أو في سياقات تحليلية مختلفة يستلزم إعادة اشتقاقها من البيانات المقابلة، بدلًا من نقلها مباشرة.
استخدام العتبات الاستكشافية (تركيز المستضد ≥ ١:٣٢ مرتفعًا بدرجة، ≤ ١:١٦ منخفضة؛ سجل dPCR₁₀ ≥ 8.61 كحمولة نووية عالية)، التصنيف الرباعي لل suspensions البكتيرية المزروعة الـ24 (الشكل 2، الجدول 3) هو كما يلي: 9 عينات (Hp03، Hp04، Hp11، Hp13، Hp18، Hp19، Hp21، Hp22، Hp25) تقع ضمن المستضد العالي–فئة الحمض النووي العالي (37.5٪)؛ تُصنَّف 3 عينات (Hp09، Hp26، Hp27) على أنها منخفضة في المستضد–حمض نووي عالي (12.5%)؛ وتبين 8 عينات (Hp01، Hp02، Hp05، Hp08، Hp10، Hp14، Hp15، Hp17) مستويات عالية من المستضد–حمض نووي منخفض (33.3%)؛ وتنتمي 4 عينات (Hp06، Hp07، Hp12، Hp20) إلى المستضد المنخفض–فئة الحمض النووي المنخفضة (16.7٪). نظرًا لأن العزلات الـ24 قُسّمت إلى ست مجموعات حسب التركيز، بمتوسط عينة واحدة فقط 4 عينات لكل مجموعة، فإن المقارنة الرسمية بين المجموعات (مثل اختبار كروسكال-واليس) ستكون غير مدعومة بقوة إحصائية كافية؛ لذلك، تم الإبلاغ فقط عن ملخصات وصفيّة لنتائج القياس الكمي بواسطة تضخيم الحمض النووي الرقمي (dPCR) عبر مجموعات التركيز.
النسبة المئوية الحيوية المتبقية بعد إيقاف التنشيط الحراري (تفاعل البلمرة المتسلسل للحيوية)
لقياس كمية البكتيريا القابلة للحياة المتبقية بعد التثبيط بالحرارة، تم استخدام نظام كاشف تفاعل البلمرة المتسلسل لتحديد القابلية الحيوية (viability PCR) لجميع العزولات الـ24. باختصار، تم أخذ كل معلق مُثبّط حراريًا (200 ميكرولتر) µل) تم حضنها مع كاشف تفاعل البلمرة المتسلسل للحيوية غير القابل لاختراق الغشاء (10 µالتركيز النهائي م) عند 37 °ج لمدة 75 دقيقة، مع تحكم متوازي يتم فيه حذف الكاشف (−VR) تم معالجتها بشكل مماثل. ثم تم إيقاف التفاعل كيميائيًا بإضافة محلول تحييد تفاعل البلمرة المتسلسل للكشف عن القابلية الحيوية (Viability PCR Neutralization Buffer) (20 µلتر، 10×) واحتضانها عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تم استخلاص الحمض النووي الجيني من كل من +VR و −تم توزيع عينات VR على هيئة كميات متساوية، وأُجرِي تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي (dPCR) على كل مستخلص؛ وحُسِّب الجزء القابل للحياة كنسبة بين +VR إلى −أعداد النسخ لفيروس VR × 100%. كان الكسر القابل للحياة الوسيط 4.6٪ (النطاق 0.00٪–33.00٪؛ النتائج الكاملة لكل عزلة على حدة في الجدول التكميلي 2). لم يُظهر النسبة المئوية للحيوية ارتباطًا ذا دلالة إحصائية مع تركيز المستضد (ر = 0.03، P = 0.90) أو مع عدد النسخ في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR) (r = 0.37، P = 0.08).
توافر البيانات:
تسلسلات جين 23S rRNA لـ 24 هيليكوباكتر بايلوري تم إيداع السلالات في NCBI GenBank تحت رقم الاستمارة الحيوية BioProject PRJNA1520048. استُخدمت هذه التسلسلات فقط لتأكيد هوية السلالة، ولا تمثل الهدف المستهدف في التضخيم الكمي بالبوليمرات الرقمية (dPCR)، وهو منطقة جينومية محفوظة تابعة للمُصنِّع، كما ورد في البروتوكول.
لا يمكن إيداع قيم التراكيز المصلية الأولية المحددة للمستضدات الخاصة بثمانية مجموعات تجارية تعتمد على تقنية التخثّر المناعي بالذهب الغروي، والقيم الكمية المحددة لتقنية تضخيم الحمض النووي الرقمي (dPCR) الخاصة بأربع أجهزة تضخيم الحمض النووي الرقمي، في مستودع عام بسبب الحساسية التجارية، واتفاقيات السرية مع المصنّعين، والقيود التنظيمية المرتبطة بالمنتجات الحاصلة على علامة CE أو المعتمدة من الإدارة الوطنية للمنتجات الطبية في المختبر المنتجات التشخيصية
قد تُتاح بيانات إضافية مقيدة بشكل سري عند الضرورة، وفقًا للقيود السرية والتنظيمية المعمول بها.
الشكل 1: الارتباط بين هيليكوباكتر بايلوري مقياس تركيز المستضد والقياس الكمي بالتفاعل المتسلسل البوليمراسي الرقمي (dPCR) يُعرض رسم مبعثر مع خط انحدار لتوضيح العلاقة بين تركيز المستضد وعدد نسخ الحمض النووي في 24 عينة من معلق البكتيريا المزروعة (n = 24). تم تحديد تركيزات المستضد باستخدام تحليل المناعة الكروماتوغرافي بالذهب الغروي مع القراءة البصرية. تم فحص تخفيفات متسلسلة من كل عينة، ويُعبّر عن التركيز بأنه أعلى معامل تخفيف يُنتج نتيجة إيجابية (مُقدّم على المحور السيني كلوغاريتم)2- محولة، قيم بلا أبعاد). تم تحديد أعداد نسخ الحمض النووي من خلال التضخيم المتسلسل الرقمي (dPCR) وتم عرضها على المحور الصادي كقيمة لوغاريتمية10- تركيزات محولة (لوغاريتمية) (log10 نُسخ/مل). يمثل كل نقطة عينة من عينة التعليق البكتيري. يمثل الخط الصلب الأزرق مطابقة الانحدار الخطي. يمثل الشريط المظلل حول خط الانحدار الفاصل الثقة 95% لاستجابة المتوسط المطابقة. تشير الخطوط المنقطة الرأسية والأفقية إلى عتبات التصنيف الاستكشافية (لوغاريتمية₂ التركيز = 5، أي 1:32؛ لوغاريتم₁₀ dPCR = 8.61، أي 4.09 × 108 نسخ/مل) المستخدمة في الشكل 2 والجدول 3. تم تقييم الارتباط باستخدام معامل ارتباط بيرسون، وأسفر ذلك عن قيمة r = 0.536، P = 0.007، R2 = 0.287، مما يشير إلى وجود ارتباط إيجابي ذو دلالة إحصائية بين الطريقتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: إطار تصنيف تحليلي ل هيليكوباكتر بيلوري اختبار دمج نتائج اختبار المستضد مع التكمية باستخدام تضخيم الحمض النووي بالتنقيط الرقمي (dPCR) يُظهر هذا الشكل التصنيف الرباعي لأربع وعشرين عينة من المعلقات البكتيرية المزروعة (ن = 24) بناءً على التوافق بين تركيز المستضد بالاختبار المناعي الكروماتوجرافي والنتائج الكمية لتقنية التضخيم البوليمراسي الرقمي (dPCR). باستخدام حدود استكشافية خاصة بمجموعة البيانات (تركيز المستضد ≥ ١:٣٢ مرتفعًا بدرجة، ≤ ١:١٦ منخفضة؛ سجل dPCR₁₀ ≥ 8.61 كحمولة نووية عالية)، تُصنف العينات إلى: مستضد عالي–حمض نووي عالي (ن = 9، 37.5%)، مستضد عالي–حمض نووي منخفض (n = 8، 33.3%)، مستضد منخفض–حمض نووي عالي (n = 3، 12.5%)، ومستوى منخفض من المستضمن–نسبة الحمض النووي المنخفضة (n = 4، 16.7٪). هذه القيم الحدية اجتهادية مشتقة من بيانات العزلات المزروعة، ولا تمثل معايير تشخيصية سريرية مُعتمدة. يوضح إطار التصنيف درجات الاتفاق والاختلاف بين الطرق الكشفية المناعية والجزيئية. وقد تعكس الفئات التي تظهر فيها تناقضات عوامل مثل استقرار المستضد، قابلية البكتيريا على الحياة، أو التباين في عدد نسخ الحمض النووي. يُقصد من هذا الإطار المقارنة التحليلية فقط، ولا يُعد توصية تشخيصية أو علاجية سريرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| رقم. | كاشف الكشف | الشركة المصنعة |
| 1 | كِت كشف مستضد الملوية البوابية (باستخدام طريقة الذهب الغروي) | Bioneovan Co., Ltd |
| 2 | طقم كشف المستضد المعدي لبكتيريا الملوية البوابية (HP) (الطريقة الغروية بالذهب) | شانغهاي تشيمترون بايوتيك المحدودة |
| 3 | طقم كشف المستضمر لبكتيريا هيليكوباكتر بيلوري (باستخدام طريقة الذهب الغروي) | شركة جيانغسو مول للعلوم البيولوجية المحدودة |
| 4 | كِت كشف مستضد هيليكوباكتر بايلوري (طريقة الذهب الغروي) | هانغتشو جينيسيس بايوديتيكشن & Biocontrol Ltd |
| 5 | كِت كشف مستضد هيليكوباكتر بايلوري (طريقة الذهب الغروي) | JIANGSU COWIN BIOTECH CO., LTD |
| 6 | كواشف الكشف عن مستضد هيليكوباكتر بيلوري (طريقة اللاتكس) | ABON Biopharm (هانغتشو) المحدودة |
| 7 | كواشف الكشف عن مستضد هيليكوباكتر بيلوري (HP) (الطريقة المناعية الكروماتوغرافية) | GUANGZHOU WONDFO BIOTECH CO., LTD |
| 8 | كِت كشف مستضد هيليكوباكتر بايلوري (طريقة الذهب الغروي) | شركة بكين للتكنولوجيا الأساسية المحدودة |
الجدول 1: قائمة بـ هيليكوباكتر بيلوري كواشف اكتشاف المستضد وشركات تصنيعها يُدرج الجدول ثمانية طُرق تحليل كروماتوغرافية مناعية متوفرة تجاريًا للكشف عن هيليكوباكتر بيلوري مستضد، والتي تم تقييمها في هذه الدراسة. لكل منتج، الرقم (كما قدمه المصنع)، والاسم التجاري لعامل الكشف، والمصنع'يتم عرض أسماء هذه العلب. وقد تم اختيار هذه العلب استنادًا إلى استخدامها الواسع في التشخيص السريري واختبارات الرعاية الصحية الأولية. تم استرجاع جميع المعلومات من الشركات المصنعة' الكتيبات المرفقة بالمنتجات والمواقع الإلكترونية الرسمية (تم الدخول في مارس 2026). إن تضمين هذه الكواشف لا يعني اعتمادها؛ وإنما هي تمثل تنوع الاختبارات المتاحة.
| رقم. | نموذج الجهاز | منصات تضخيم الحمض النووي الرقمي (PCR) |
| 1 | DQ24 | سنابر |
| 2 | جهاز بيو راد QX200 للتحليل الرقمي للبصمات بالقطرات | شركة جيانغسو بايوبرفيكتوس للتكنولوجيا المحدودة |
| 3 | DQ24 Pro | يوستار للتكنولوجيا الحيوية (هانغتشو) المحدودة |
| 4 | نظام TD-1 للبزل المتضاعف الرقمي | تارغيتينغوون |
الجدول 2: قائمة منصات تضخيم الحمض النووي الرقمي (dPCR) وطرازات الأجهزة. تحدد هذه الجدول أربع منصات مختبرية مجهزة بأنظمة تضخيم الحمض النووي الرقمي المتعدد (dPCR)، إلى جانب طرازات الأجهزة المستخدمة في الاختبار. وقد اختيرت هذه المنصات مع مراعاة تنوعها التكنولوجي وتمثيليتها للتطبيق الحالي لتقنية dPCR. وتُقدَّم جميع المعلومات من قِبل كل منصة على حدة. ولا يعني إدراج هذه المنصات تأييدًا لها؛ وإنما هي تمثل فقط نطاق أنظمة dPCR الحالية الموجودة.
| نوع | عدد الحالات | نسبة | عدد العينة |
| عالي المستضد - عالي الحمض النووي | 9 | 37.5% | Hp03، Hp04، Hp11، Hp13، Hp18، Hp19، Hp21، Hp22، Hp25 |
| مستوى منخفض من المستضد - مستوى عالٍ من الحمض النووي | 3 | 12.5% | Hp09، Hp26، Hp27 |
| منخفض المستضد - منخفض الحمض النووي | 4 | 16.7% | Hp06، Hp07، Hp12، Hp20 |
| مستوى عالٍ من المستضد - مستوى منخفض من الحمض النووي | 8 | 33.3% | Hp01، Hp02، Hp05، Hp08، Hp10، Hp14، Hp15، Hp17 |
الجدول 3: تصنيف ونسبة نتائج اختبار المستضد واختبار الحمض النووي في هذه الدراسة. يصنف هذا الجدول 24 عينة من المعلق البكتيري المزروع وفقًا لمدى الاتفاق بين تركيز المستضد (المحدد باستخدام التحليل المناعي الكروماتوجرافي، ويُعبّر عنه بالعامل الأعلى للتخفيف الذي يؤدي إلى نتيجة إيجابية) ونتائج التفاعل المتسلسل الكمي الرقمي للبوليمرات (dPCR) المطلقة (المُعبّر عنها بوحدة لوغاريتمية)₁₀ نسخ/مل). باستخدام عتبة تركيز المستضد 1:32 (عالية ≥ ١:٣٢، منخفض ≤ 1:16) وحدّة كشف كمّي dPCR قدرها 4.09 × 108 نسخ/مل (لوغاريتمي₁₀ = 8.61) كعوامل عتبة استكشافية خاصة بمجموعة البيانات، صُنّفت العزولات إلى أربع مجموعات فرعية: عالية المستضمر - عالية الحمض النووي، منخفضة المستضمر–حمض نووي عالي، مستضد عالي–منخفض الحمض النووي، ومنخفض المستضد-منخفض الحمض النووي. من بين العينات الـ24، صُنفت 9 عينات على أنها عالية المستضد–نسبة عالية من الحمض النووي (37.5٪؛ Hp03، Hp04، Hp11، Hp13، Hp18، Hp19، Hp21، Hp22، Hp25)، و3 كمستضد منخفض–نسبة عالية من الحمض النووي (12.5٪؛ Hp09، Hp26، Hp27)، و8 كمستضد عالي–منخفض الحمض النووي (33.3٪؛ Hp01، Hp02، Hp05، Hp08، Hp10، Hp14، Hp15، Hp17)، و4 كمنخفض المستضد–حمض نووي منخفض (16.7٪؛ Hp06، Hp07، Hp12، Hp20). تُظهر الجدول لكل فئة عدد الحالات (ن)، والنسبة المئوية بالنسبة إلى حجم العينة الكلي (٪)، وأرقام العينات داخل كل فئة. يوضح هذا التصنيف التوافق وعدم التوافق بين الطرق الكشفية المناعية والجزيئية؛ وقد تعكس الفئات التي تحتوي على تناقضات عوامل مثل استقرار المستضد، قابلية البكتيريا على الحياة، أو التباين في عدد نسخ الحمض النووي، مما يوفر معلومات مفيدة لتفسير نتائج الفحوصات التحليلية.
الجدول التكميلي 1: مجموعة البيانات المجمعة لاكتشاف المستضد والقياس الكمي بالبصمة الرقمية (dPCR) للـ 24 هيليكوباكتر بايلوري العزلات. الورقة 1 (كشف المستضد): قيم التراكيز النهائية لكل كت من الكتل الثمانية التجارية المستندة إلى تقنية المناعة الكروماتوغرافية بالذهب الغروي لكل عزلة، مع أقل تركيز وأعلى تركيز وتركيز المنتصف لكل عينة، إضافةً إلى المدى الطيّار (fold range) ضمن العينة الواحدة. الورقة 2 (الكشف الكمي بالتفاعل البوليميري الرقمي): تركيزات dPCR الخاصة بالمنصة (نسخ/مل) لكل عزلة، مع الإحصاءات التلخيصية بين المنصات (الوسيط، الحد الأدنى، الحد الأقصى، ومعامل التباين %) للوغاريتم₁₀التركيزات المحولة الورقة 3 (تحليل الارتباط والانحدار): سجل مستوى السلالة₂مستوى الأجسام المضادة المحولة وتسجيل الدخول₁₀التركيزات المُحوَّلة للـdPCR، ونتائج ارتباط بيرسون والانحدار الخطي (r، R2، معادلة الانحدار)، تحليل الحساسية باستبعاد القيمة الشاذة Hp06، والإحصائيات التفصيلية للانحدار (الأخطاء القياسية، فترات الثقة 95%، خطأ الانحدار القياسي، إحصائية F، و P-القيمة). تم إخفاء المعرفات الخاصة بالعدة والخاصة بالمنصة لأسباب تتعلق بالسرية التجارية؛ وتحتوي مجموعة البيانات على جميع القيم الضرورية لإعادة إنتاج الشكل 1–٢ والجدول ٣.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2: نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل لاختبار الحيائية للـ 24 هيليكوباكتر بايلوري العزلات. أعداد النسخ لكل عزلة باستخدام تفاعل البوليميراز الرقمي للعامل المحدد للحيوية–المعالجة (+VR) وحذف المُعدِّل (−VR) كميات صغيرة بعد إيقاف التفعيل بالحرارة عند 56 °س لمدة 25 دقيقة، مع الكسر القابل للحياة المحسوب (%) والمعادل ΔCq لكل عزلة. كانت الكسر القابل للحياة الوسيط عبر جميع العزولات 4.6٪ (المدى 0.00٪)–33.00%).يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
في هذه الدراسة التي شملت 24 عُزلة مستزرعة من H. pylori، أظهر عيار المستضد في الاختبار المناعي الكروماتوغرافي وعدد النسخ الجينومية في تقنية dPCR ارتباطاً إيجابياً متوسطاً ولكنه دال إحصائياً (r = 0.536, P = 0.007)؛ ومع ذلك، فإن عيار المستضد فسر 29% فقط من التباين في عدد نسخ dPCR (R2 = 0.287)، مما يعني أن المقياسين مرتبطان ولكنهما غير قابلين للتبادل. ويتمثل القصور الرئيسي لهذه الدراسة في صغر حجم العينة (n = 24)، مما يحد من القوة الإحصائية ويفسر الطبيعة الاستكشافية لعتبات التصنيف المستخدمة أدناه.
قامت هذه الدراسة بتحليل كمي لعيار المستضد في مستنبتات H. pylori وأعداد نسخ الحمض النووي التي تم الكشف عنها بواسطة dPCR، مما كشف عن ارتباط متوسط ولكن ملحوظ بين نتائج الكشف بهاتين الطريقتين (r = 0.536, P = 0.007). وعلى الرغم من ملاحظة ارتباط وثيق بين الطريقتين على مستوى المجتمع، إلا أنه كثيراً ما يتم مواجهة تباينات على المستوى الفردي في الممارسة السريرية. ويعود ذلك إلى أن أهداف الكشف المختلفة تعكس سمات بيولوجية متميزة لمسببات الأمراض. وتحديداً، تكشف اختبارات المستضد عن البروتينات التي قد تظل موجودة بعد التخلص من البكتيريا، بينما تكشف اختبارات الحمض النووي عن DNA الذي قد يستمر بمستويات منخفضة حتى بعد القضاء على البكتيريا الحية. وقد تم توثيق هذا التضارب بشكل جيد في مختلف الأمراض المعدية. على سبيل المثال، في التشخيص السريري لعدوى Clostridioides difficile، يظهر بعض الحاملين نتائج إيجابية في الكشف عن جين السموم ولكن نتائج سلبية في الكشف عن مستضد بروتين السموم، مما يؤدي إلى تشخيص خاطئ على أنهم أشخاص مصابون بالعدوى ويتسبب في الإفراط في العلاج وظهور مقاومة للأدوية. لذلك، ميزت جمعية الأمراض المعدية الأمريكية (IDSA)12 بوضوح في الإرشادات التوجيهية بين الأهمية السريرية لـ "الكشف عن السموم" و "الكشف عن جين السموم" لبكتيريا Clostridioides difficile. إذ لا يكفي تشخيص العدوى عن طريق اختبار الحمض النووي وحده، ويُوصى بتبني طرق يمكنها الكشف مباشرة عن بروتين السم النشط. بالإضافة إلى ذلك، في حالات الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع بعد العلاج بالمضادات الحيوية، ينخفض حمل DNA البكتيري في بلغم المريض بسرعة، بينما يظل المستضد البولي إيجابياً بعد التعافي ويستمر لعدة أسابيع إلى عدة أشهر13. كما تُلاحظ ظواهر مماثلة في تشخيص وعلاج عدوى H. pylori. ففي عام 2022، قيمت مختبرات Mayo Clinic Laboratories أنه في 223 مريضاً تمت متابعتهم بعد العلاج بالمضادات الحيوية، كان PCR حساساً نسبياً في الكشف عن DNA المتبقي بمستويات منخفضة في عينات البراز. فبعض المرضى، رغم تعافيهم سريرياً وسلبيّة نتائج المستضد لديهم، ظلت نتائج PCR إيجابية لعدة أسابيع14. وكل هذا يؤكد بشكل أكبر الاختلافات البيولوجية لأهداف الكشف المختلفة.
في هذه الدراسة، يوفر تحديد الارتباط الكمي والتكافؤ بين عيار المستضد لـ H. pylori المكتشف بطريقة الكروماتوغرافيا المناعية وقيم القياس الكمي بواسطة dPCR توجيهات عملية لتوصيف المواد المرجعية لـ H. pylori ولتقييم كواشف التشخيص in vitro. 1) تعزيز تطوير نموذج تقييم أداء المنتج: حالياً، يعتمد تقييم التجارب السريرية لكواشف الكشف عن مستضد H. pylori على المقارنة المتزامنة العمياء مع "المعايير الذهبية" السريرية مثل علم الأنسجة، أو المزرعة، أو اختبار تنفس اليوريا15. يقترح هذا البحث أن تفرض الهيئات التنظيمية على الشركات تقديم بيانات الارتباط ذات الصلة بين نتائج اختباراتها وطرق القياس الكمي للأحماض النووية في مواد الطلب أثناء عملية المراجعة، وتحديد أداء منتجاتها بوضوح في "نطاق النتائج غير المتوافقة"، وذلك لتعكس بشكل أكثر واقعية قدرة المنتج على الكشف في السيناريوهات السريرية المعقدة وتحدد LOD الخاص بالكاشف بشكل أكثر شمولاً. 2) يوفر هذا نهجاً جديداً لتعيين المواد المرجعية البكتيرية: حيث يمكن تحويل المواد المرجعية لمراقبة الجودة والمعايرة من مجرد "CFU" واحدة إلى "قيم خصائص متعددة الأبعاد"8 تشمل عيار المستضد وأعداد نسخ الحمض النووي. ويمكن لنموذج الانحدار الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة أن يوفر تقديراً تقريبياً لرتبة المقدار للعلاقة بين هاتين القيمتين، مما يوفر أساساً كمياً لاستخدام المواد المرجعية وللمقارنات بين المختبرات.
نوصي بأن يدرج المصنعون ليس فقط حد الكشف (LOD) بالوحدات التحليلية (مثل CFU/mL أو عيار المستضد)، بل وأيضاً ما يعادل ذلك من النسخ الجينومية — كما يتم تحديده بواسطة PCR الرقمي (dPCR) — لضمان إمكانية مقارنة النتائج ومواءمتها عبر المختبرات والمنصات المختلفة. ويتماشى هذا الإبلاغ ثنائي الوحدات مع متطلبات التتبع المترولوجي لمعيار ISO 175118 ومع إطار تقييم قدرة الكشف الخاص بـ CLSI EP17-A216.
تتمثل الأسباب المحتملة لظهور عينات ذات "مستضد منخفض - حمض نووي مرتفع" فيما يلي: 1) التباين الجيني للسلالة: إذا تم استبدال الحمض الأميني في الحاتمة المستضدية، أو إذا تم حظر البروتين الإفرازي أثناء النقل والإفراز، فقد تحدث ظاهرة "هروب" في الكشف عن المستضد17. 2) صُمم تفاعل dPCR لاستهداف وتضخيم تسلسلات جينية محفوظة. ولم يتم الكشف عن الجين المحدد الذي استهدفه تفاعل dPCR في هذه الدراسة في وثائق الشركة المصنعة. ومع ذلك، قد تستهدف أطقم الكشف عن المستضد التجارية مستضدات مختلفة لبكتيريا H. pylori (على سبيل المثال، VacA، أو اليورياز، أو البروتينات السوطية، أو مستضدات الخلية الكاملة)، وأي عدم تطابق بين الجين المستهدف في dPCR والمستضد الذي يتعرف عليه طقم معين قد يظهر في شكل تعارض كمي عبر الأرباع الأربعة لمخطط التشتت — dPCR مرتفع/مستضد منخفض، dPCR منخفض/مستضد مرتفع، توافق مرتفع-مرتفع، أو توافق منخفض-منخفض — بدلاً من التناقضات الثنائية إيجابي/سلبي18. 3) قيود طريقة الكشف: تتقيد تقنية الكشف عن المستضد بالتركيزات المنخفضة للغاية أو العالية للغاية من المستضدات، مما يؤدي إلى إضعاف الإشارة بسبب عدم كفاية الألفة مع الأجسام المضادة أو التشبع المفرط، كما تتأثر أيضاً بمصفوفة العينة. 4) عدم تماثل أداء حد الكشف: يمكن أن يصل الحد الأدنى للكشف (LOD) لتفاعل dPCR إلى 10–100 copies/mL، بينما يبلغ حد الكشف لطريقة الكروماتوغرافيا المناعية الغروية لليورياز حوالي 104–105 CFU/mL. وعندما تكون الكمية البكتيرية عند القيمة الحرجة، يكون ظهور ظاهرة "مستضد منخفض - حمض نووي مرتفع" أمراً مرجحاً. 5) يكون تأثير حالة العدوى على النتائج السريرية كبيراً، لا سيما في التمييز بين العدوى البكتيرية والعدوى الفيروسية. وفي عملية العدوى، لا يظهر عدد نسخ الجينات ومستوى تعبير المستضد علاقة مقابلة ثابتة. فبعد العلاج الناجح، قد تنخفض مستويات الحمض النووي بسرعة، بينما قد يتأخر التخلص من المستضد لفترة من الوقت19.
اشتُقت المعلقات البكتيرية المستخدمة في هذه الدراسة من كل من عينات الخزعات المعدية وعينات البراز، والتي تمثل بيئات مصفوفية متميزة ذات ملفات تداخل مختلفة. وتكون العزلات المشتقة من الخزعات المعدية خالية إلى حد كبير من مثبطات PCR المرتبطة بالبراز، ولكنها قد تتعرض لبقايا البيبسين أثناء معالجة العينة. وفي المقابل، تحتوي عينات البراز على مثبطات PCR (مثل أملاح الصفراء، والبوليسيكاريدات المعقدة، ونواتج تحلل الهيموجلوبين) التي يمكن أن تقلل من كفاءة التضخيم وتؤدي إلى تقدير أقل من القيمة الحقيقية في كميات dPCR، بالإضافة إلى البروتياز المعوي الذي قد يؤدي إلى تحلل المستضدات المستهدفة حتى عندما يظل الحمض النووي البكتيري سليمًا. وتعمل هذه التأثيرات الخاصة بالمصفوفة بشكل مستقل عن آليات عدم التطابق في المنطقة المستهدفة الموصوفة أعلاه، مما يشير إلى ضرورة مواءمة بروتوكولات التحضير والتحقق من صحة الطريقة مع نوع العينة عند تفسير التفاوت الكمي عبر العينات السريرية.
لتقدير نسبة البكتيريا الحية إلى غير الحية تجريبياً بعد التعطيل الحراري، أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل للحيوية (viability PCR) باستخدام نظام كواشف viability PCR على جميع العزلات الـ 24 المستزرعة. يعمل هذا الكاشف بشكل مماثل لـ propidium monoazide (PMA): حيث يخترق بشكل انتقائي الخلايا ذات الأغشية المتضررة ويعدل حمضها النووي الجينومي تساهمياً لمنع التضخيم اللاحق. وحُسبت النسبة المئوية للبكتيريا الحية وفقاً للمعادلة التالية: نسبة الحيوية % = (نسخ DNA/µL المعالجة بكاشف الحيوية (VR)) / (نسخ DNA/µL بدون VR) × 100. وبناءً على جميع العزلات، كان وسيط كسر الحيوية بعد التعطيل الحراري 4.6% (المدى: 0.00%–33.0%)، مما يؤكد أن التعطيل الحراري عند 56 °C لمدة 25 min يقلل بشكل كبير من حيوية البكتيريا، إلا أنه يفشل في القضاء التام على الكائنات الحية. تدعم بيانات الحيوية هذه بقوة تفسيرنا بأن أنماط التضارب المتمثلة في ارتفاع نتائج dPCR وانخفاض عيار المستضد تنشأ أساساً من DNA المتبقي الخالي من الخلايا وDNA الموجود داخل الجسيمات البكتيرية غير الحية بدلاً من بكتيريا H. pylori الحية والسليمة. وتلخص Supplementary Table 2 نتائج التقدير الكمي الكامل للحيوية لجميع السلالات الـ 24.
كشف تصنيف الأرباع الأربعة (بناءً على عتبات استكشافية خاصة بمجموعة البيانات) في هذه الدراسة أن 8 عينات أظهرت مستوى مستضد مرتفع-حمض نووي منخفض، وانتمت 4 عينات إلى فئة مستضد منخفض-حمض نووي منخفض، إلى جانب 9 عينات في فئة مرتفع-مرتفع و3 عينات في فئة منخفض-مرتفع من الفئات المتوافقة. ويشير وجود عينات ذات مستضد مرتفع-حمض نووي منخفض (n = 8) إلى أن تعبير المستضد ومحتوى الحمض النووي لا يتطابقان دائمًا، حتى في المزارع النقية. وقد تم حصاد جميع العزلات الـ 24 في طور النمو الثابت (مزرعة لمدة 72 h؛ انظر قسم البروتوكول 1). وفي الطور الثابت، يتوقف تضاعف DNA إلى حد كبير بينما تظل المستضدات الهيكلية والأيضية موجودة أو حتى تستمر في التراكم؛ ويوفر هذا الفصل المرتبط بطور النمو أساسًا بيولوجيًا منطقيًا لعدم التماثل بين فئة المستضد المرتفع والحمض النووي المنخفض الوفيرة (n = 8) وفئة المستضد المنخفض والحمض النووي المرتفع الصغيرة (n = 3)، على الرغم من أن ذلك لا يمكنه بمفرده استبعاد آليات أخرى مثل الاختلافات بين السلالات في تعبير المستضد أو التحلل الجزئي أثناء التعطيل الحراري. ويؤكد وجود عينات ذات مستضد منخفض-حمض نووي مرتفع (n = 3) أن عيار المستضد المنخفض لا يتوافق حتمًا مع حمولة منخفضة من الحمض النووي، مما يوضح أن اختبار الحمض النووي يكمل اختبار المستضد في سيناريوهات محددة. وتعد هذه العتبات استكشافية وخاصة بمجموعة البيانات، ولا تمثل معايير تشخيصية سريرية معتمدة.
تقتصر هذه الدراسة على صغر حجم العينة (n = 24)، مما يجعل القوة الإحصائية غير كافية لدعم تحليل دقيق للمجموعات الفرعية. حيث قُسمت العينة إلى ست مجموعات من العيارات، بمتوسط 4 عينات فقط في كل مجموعة، لذا تفتقر المقارنات الرسمية بين المجموعات إلى القوة الإحصائية الكافية للكشف عن فروق ذات دلالة. وبناءً على ذلك، لم يتم تطبيق اختبار كروسكال-واليس (Kruskal-Wallis)، لتجنب تقديم نتائج إحصائية استدلالية ذات قوة غير كافية. علاوة على ذلك، كانت جميع العينات عبارة عن عزلات مستنبتة ولم تغطِ تأثيرات المصفوفة الأكثر تعقيداً الموجودة في العينات السريرية مثل المخاطية المعدية، أو البراز، أو اللعاب.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
لم يتم استخدام أي أدوات ذكاء اصطناعي في كتابة هذه المخطوطة أو تحريرها أو تحليلها إحصائياً أو تطوير الأكواد البرمجية الخاصة بها أو إعداد الأشكال التوضيحية الملحقة بها.
مساهمات المؤلفين:
أكد جميع المؤلفين مساهماتهم المتبادلة في هذا العمل. وفيما يلي قائمة بأدوار كل مؤلف على حدة. وقد قرأ جميع المؤلفين المخطوطة النهائية المقدمة ووافقوا عليها، ويتحملون المسؤولية الكاملة عن دقة وسلامة بيانات البحث. Wenwen Sun: الاستقصاء، وتنظيم البيانات، والتحليل الرسمي، والمنهجية، وكتابة المسودة، والحصول على التمويل؛ Xiaona Han: الاستقصاء والمنهجية؛ Jin Zhang: الاستقصاء والمنهجية؛ Xinxin Duan: الاستقصاء والمنهجية؛ Tingting Li: وضع التصور والإشراف؛ Manyu Li: وضع التصور والإشراف، والكتابة - المراجعة والتحرير؛ Haiwei Zhou: وضع التصور والإشراف، والكتابة - المراجعة والتحرير.
شكر وتقدير
تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة أبحاث تنمية الشباب التابعة للمعاهد الوطنية لمكافحة المخدرات (NIDC) (منحة رقم 2025C5).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2X dPCR Probe Master Mix Plus (Rox) | Sniper | RT021096A | كاشف الكشف الكمي بتقنية dPCR |
| طقم استخلاص الحمض النووي الجينومي البكتيري | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd. | Y2213/DP302-02 | استخلاص الحمض النووي البكتيري |
| نظام Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | QX200 | الكشف الكمي بتقنية dPCR |
| جهاز dPCR متكامل | Sniper | DQ24 | الكشف الكمي بتقنية dPCR |
| جهاز dPCR متكامل | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd. | DQ24 | الكشف الكمي بتقنية dPCR |
| حمام مائي رقمي | Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | DK-8D | التعطيل الحراري للمعلقات البكتيرية عند 56 °C |
| بادئ أمامي | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | تضخيم الحمض النووي بتقنية dPCR |
| طقم الكشف عن مستضد Helicobacter pylori المعدي (طريقة الذهب الغروي) | Shanghai Chemtron Biotech Co., Ltd. | B202301020 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| وسط آغار لـ Helicobacter pylori (صلب) | Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd. | HB8647 | وسط زراعة H. pylori |
| طقم الكشف عن مستضد Helicobacter pylori (طريقة الذهب الغروي) | Bioneovan Co., Ltd. | 202403001 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| طقم الكشف عن مستضد Helicobacter pylori (طريقة الذهب الغروي) | Jiangsu Mole Bioscience Co., Ltd. | 20240310 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| طقم الكشف عن مستضد Helicobacter pylori (طريقة الذهب الغروي) | Hangzhou Genesis Biodetection & Biocontrol Ltd. | GG230601021 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| طقم الكشف عن مستضد Helicobacter pylori (طريقة الذهب الغروي) | Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd. | 28223 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| طقم الكشف عن مستضد Helicobacter pylori (طريقة الذهب الغروي) | Beijing Core Technology Co., Ltd. | 2415810 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| كاشف الكشف عن مستضد Helicobacter pylori (طريقة الكروماتوغرافيا المناعية) | Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd. | W028402001 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| كاشف الكشف عن مستضد Helicobacter pylori (طريقة اللاتكس) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co., Ltd. | 0000805308 | الكشف عن مستضد H. pylori |
| حضانة Heracell ثلاثية الغازات | Thermo Fisher Scientific | N/A | زراعة هوائية جزئية؛ تركيب الغاز: 5% O2, 10% CO2, 85% N2 |
| أنابيب طرد مركزي دقيقة (1.5 mL / 2 mL) | Axygen Scientific Inc. | MCT-150-C / MCT-200-C | تخفيف العينة واستخلاص الحمض النووي |
| كواشف استخلاص أو تنقية الحمض النووي | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | SDK60105 | استخلاص الحمض النووي البكتيري |
| كاشف استخلاص الحمض النووي | TargetingOne | Pathogens TNA-B1 (11019) | استخلاص الحمض النووي البكتيري |
| PBS, 1X (pH 7.2-7.4, 0.01 M، زراعة خلايا) | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1020 | تخفيف العينة |
| أطباق بتري (90 mm) | Beekman Biotech | N/A | أطباق زراعة معقمة لعزل البكتيريا واستزراعها الفرعي |
| رؤوس ماصات (10 uL / 200 uL / 1000 uL) | Axygen Scientific Inc. | T-300 / T-200-Y / T-1000-B | رؤوس مفلترة معقمة لتخفيف العينة وتوزيع الكواشف |
| مسبار | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | تضخيم الحمض النووي بتقنية dPCR |
| بادئ عكسي | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | تضخيم الحمض النووي بتقنية dPCR |
| منصة SPSSPRO للتحليل الإحصائي عبر الإنترنت | SPSSPRO | Web-based (https://www.spsspro.com/; accessed August 2026) | التحليل الإحصائي: ارتباط بيرسون، الانحدار الخطي |
| دم أغنام معقم منزوع الفبرين | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | TX0030-100 mL | مكمل لأطباق زراعة H. pylori |
| نظام TD-1 dPCR | TargetingOne | TD-1 | الكشف الكمي بتقنية dPCR |
| نظام كواشف Viability PCR | Promega | A8881 | تقييم حيوية H. pylori المعطلة حرارياً بواسطة Viability PCR |
| جهاز خلط دوامي (Vortex Mixer) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | تجانس المعلقات البكتيرية |
المراجع
- Ndip RN, et al. Helicobacter pylori isolates recovered from gastric biopsies of patients with gastro-duodenal pathologies in Cameroon: current status of antibiogram. Trop Med Int Health. 2008;13(6):848-54.
- Malfertheiner P, et al. Management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht VI/Florence consensus report. Gut. 2022;71(9):1724-62.
- Hooi JKY, et al. Global prevalence of Helicobacter pylori infection: systematic review and meta-analysis. Gastroenterology. 2017;153(2):420-9.
- International Agency for Research on Cancer. Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1994;61:1-241.
- de Martel C, et al. Global burden of cancer attributable to infections in 2018: a worldwide incidence analysis. Lancet Glob Health. 2020;8(2):e180-90.
- Wang YK, et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection: current options and developments. World J Gastroenterol. 2015;21(40):11221-35.
- Hindson BJ, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011;83(22):8604-10.
- International Organization for Standardization. ISO 17511:2020, In vitro diagnostic medical devices—requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples. International Organization for Standardization; Geneva; 2020.
- Morisset D, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR. PLoS One. 2013;8(5):e62583.
- World Health Organization. WHO international standard for SARS-CoV-2 RNA, NIBSC code 20/146. World Health Organization; Geneva; 2020.
- Forootan A, et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif. 2017;12:1-6.
- Johnson S, et al. Clinical practice guideline by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA): 2021 focused update guidelines on management of Clostridioides difficile infection in adults. Clin Infect Dis. 2021;73(5):e1029-44.
- Hyams C, Williams OM, Williams P. Urinary antigen testing for pneumococcal pneumonia: is there evidence to make its use uncommon in clinical practice? ERJ Open Res. 2020;6(1):00223-2019.
- Marrero Rolon R, et al. Erratum for Marrero Rolon et al., “Clinical evaluation of a real-time PCR assay for simultaneous detection of Helicobacter pylori and genotypic markers of clarithromycin resistance directly from stool.” J Clin Microbiol. 2022;60(2):e0245221.
- China Food and Drug Administration. Technical review guidelines for registration of Helicobacter pylori antigen/antibody detection reagents. China Food and Drug Administration; Beijing; 2018.
- Clinical and Laboratory Standards Institute. EP17-A2, Evaluation of detection capability for clinical laboratory measurement procedures; approved guideline. 2nd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute; Wayne, PA; 2012.
- Yamaoka Y, Graham DY. Helicobacter pylori virulence and cancer pathogenesis. Future Oncol. 2014;10(8):1487-500.
- Leal YA, et al. Utility of stool sample-based tests for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2011;52(6):718-28.
- Devonshire AS, et al. The use of digital PCR to improve the application of quantitative molecular diagnostic methods for tuberculosis. BMC Infect Dis. 2016;16:366.