يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
* These authors contributed equally
باستخدام نموذج فأر ناتج عن النظام الغذائي عالي الدهون لمرض الكبد الدهني المرتبط بخلل الأيض، تقيم هذه الدراسة تأثيرات مكملات زيت الطحالب الدقيقة الغنية بحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA) وتظهر أن التدخل يحسن ملفات الدهون الكبدية ويرتبط بتغيرات في تركيب ميكروبيوم الأمعاء.
من الناحية الأيضية، يعد مرض الكبد الدهني الخلل اضطرابا أيضيا شائعا مرتبطا بخلل ميكروبيوم الأمعاء واختلال توازن الدهون الكبدية. في هذه الدراسة، تم إنشاء نموذج فئران محفز بنظام غذائي عالي الدهون لتقييم تأثيرات المكملات بزيت الطحالب الدقيقة الغني ب DHA. تم إطعام الفئران (عدد = 4 لكل مجموعة) نظاما غذائيا غنيا بالدهون لمدة 8 أسابيع وتلقوا إعطاءا يوميا من زيت الطحالب الدقيقة، أو البروبيوتيك، أو مزيج من زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA والبروبيوتيك. تم تقييم المعايير الأيضية، وتركيب ميكروبيوتا الأمعاء (تسلسل 16S rRNA)، والمسارات الوظيفية الميكروبية، وملفات الأيض الكبدية. أظهرت النتائج أن زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA حسن توازن الدهون كما يتضح من انخفاض مستويات LDL-c في المصل والدهون الثلاثية الكبدية وزيادة البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL-c)، وكان مرتبطا بتخفيف إصابات الكبد والإجهاد التأكسدي. كشف تحليل الميكروبيوم عن تغيرات انتقائية في تركيب ميكروبات الأمعاء، بما في ذلك إثراء البكتيريا العصيرية والبكتيريوم وتقليل الأنواع المرتبطة بالنظام الغذائي عالي الدهون مثل الكلوستريديوم والرومينوكوس. أشارت التنميط الوظيفي إلى تغييرات في مسارات الأيض الميكروبي، بما في ذلك دورة إنقاذ إل-ميثيونين وتحلل الفينيل إيثيل أمين. كما حدد التحليل المتكامل للميكروبيوم-المستقلبات الروابط بين الأنواع الميكروبية ومستقلبات الكبد المشاركة في استقلاب الأحماض الدهنية، وتغير الأحماض الصفراوية، ومسارات الأحماض الأمينية. تشير هذه النتائج إلى أن مكملات زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA مرتبطة بتحسن في استقلاب الدهون الكبدية وتركيب ميكروبيوم الأمعاء في هذا النموذج، دون الإشارة إلى آلية سببية مباشرة.
مرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي (MASLD) هو حالة عالمية شديدة الانتشار، تؤثر على حوالي 32.4٪ من سكان العالم1. يعرف MASLD بوجود دهون زائدة في الكبد، مما يساهم في مشاكل صحية متنوعة. يحتوي الجهاز الهضمي البشري على مجتمع ميكروبي متطور ومتوازن، يشمل البكتيريا والفيروسات والفطريات والطفيليات2. نظرا للتفاعل بين هذا المجتمع الميكروبي والكبد، تعتبر البروبيوتيك طريقة واعدة للوقاية من وعلاج MASLD من خلال تعديل هذا الاتصال الحرج3. تشير الأبحاث الناشئة إلى أن البروبيوتيك قد تؤثر إيجابيا على MASLD من خلال تعديل ميكروبيوم الأمعاء وتقليل الالتهاب. تحديدا، أظهر إعطاء البروبيوتيك أنه يعيد التوازن إلى ميكروبيوم الأمعاء ويقلل من الالتهاب الكبدي4. علاوة على ذلك، ثبت أن بعض البروبيوتيك، خاصة تلك التي قد تعزز أيض حمض الصفراء، تخفف من انقطاع الكبد الدهني وتدعم الصحة الأيضية العامة للأشخاص المصابين ب MASLD 5,6. علاوة على ذلك، أشارت أدلة قوية إلى أن مرضى اضطراب العضلات المفرطة يظهرون تغيرات كبيرة في بيئة الأمعاء، وهي حالة تعرف باسم خلل الحيوية 7,8. كان من الاكتشافات الحاسمة تقليل التنوع الألفا، مما يعني أن العدد الكلي والتنوع للأنواع الميكروبية قد انخفض. علاوة على ذلك، غالبا ما تتميز ميكروبيوم الأمعاء لدى مرضى اضطراب العضلات المفرطة المفرطة بهيمنة شعبة البكتيريا فيرميكيوتس 9,10,11. غالبا ما يستهلك الأشخاص المصابون باضطراب العضلات المتوسطة المفرطة المفرطة الحساسية الغذائية الجيدة، وغالبا ما تتضمن تناول كميات عالية من الدهون المشبعة واستهلاك منخفض للمغذيات الدقيقة الأساسية. هذه الأنماط الغذائية غير الصحية، التي تلاحظ كثيرا في السكان الحضريين، ترتبط بنسبة مرتفعة بين الفيرميكوتس إلى الباكترويديتس مقارنة بالأشخاص الذين يعيشون في المناطق الريفية14. علاوة على ذلك، كانت الأنظمة الغذائية عالية الدهون مرتبطة بشكل مباشر بالتسبب في اختلال أمعاء أعمق. على وجه التحديد، أظهرت الأبحاث في نماذج الحيوانات والدراسات على مرضى مرض الكبد المتقدم، MASLD، أن تناول الدهون العالية مرتبط بتغير فيروس الأمعاء. شملت هذه التغيرات زيادة في نشاط الفاج الليتي، مما أدى في النهاية إلى تفاقم خلل حيوية الأمعاء الموجود15,16.
يمكن لأحماض أوميغا-3 الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs)، التي توجد عادة في زيت السمك، أن تحسن عملية أيض الدهون وتنظم ميكروبيوم الأمعاء. برز زيت الطحالب الدقيقة كمصدر واعد ومستدام لأحجامات أوميغا-3 الخالية من الفروع الزائدة (PUFAs). على وجه التحديد، يعد زيت الطحالب الدقيقة للفصام مصدرا تجاريا واعدا لأنه يحتوي على تركيز عال من حمض الدوكوساهيكسانويك النقي (DHA). أفادت دراسات سابقة من هذه المجموعة أنه في نموذج فئران السمنة الناتج عن الحمية عالية الدهون (HFD)، كانت فعالية زيت الطحالب الدقيقة في تعزيز فقدان الوزن مماثلة لفعالية زيت السمك ودواء فقدان الوزن أورليستات. والأهم من ذلك، أن زيت الطحالب الدقيقة أظهر هذه التأثيرات في فقدان الوزن قبل زيت السمك أو أورليستات17. أظهرت النتائج السابقة أيضا أن زيت الطحالب الدقيقة له تأثيرات مميزة ومفيدة على ميكروبيوم الأمعاء مقارنة بزيت السمك التجاري وأورليستات. على الرغم من أن زيت الطحالب الدقيقة لم يغير بشكل ملحوظ التنوع الكلي للبكتيريا، إلا أنه ارتبط بزيادة وفرة البكتيريا المفيدة المنتجة للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFA) وانخفاض في الأنواع الممرضة، بما في ذلك الجنس المرتبط بالسمنة Desulfovibrio. علاوة على ذلك، أعاد زيت الطحالب الدقيقة القدرة الأيضية لميكروبيوتا الأمعاء بشكل ملحوظ، مما عزز المسارات المتعلقة بالأحماض الأمينية، وSCFAs، وأيض الأحماض الصفراوية، مع تقليل تخليق الدهون المتعددة السكريات (LPS) بشكل حاسم. من المرجح أن هذه التعديلات كانت مسؤولة عن تحسين أيض الدهون وتعزيز الحاجز المخاطي القولوني، مما يشير إلى أن زيت الطحالب الدقيقة كان مكملا غذائيا متميزا لتخفيف السمنة.
على الرغم من التقدم في ربط خلل حيوية ميكروبيوم الأمعاء بتطور اضطراب الميكروبات الميكروبية المفرطة، إلا أن العلاقات المحددة بين تركيب الميكروبات، ووظائف الأيض الميكروبي، واستقلاب الدهون الكبدية لا تزال غير مفهومة بشكل كامل. على وجه الخصوص، لا تزال الروابط السببية بين التغيرات في الميكروبيوم وتطور المرض غير واضحة، وما إذا كانت التدخلات الغذائية، مثل زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA، مرتبطة بتغيرات منسقة في مجتمعات ميكروبات الأمعاء وملفات الأيض المضيفة لم يتم التحقيق بشكل منهجي. يعد زيت الطحالب الدقيقة الغني ب DHA مصدرا مستداما وفعالا لأحماض أوميغا-3 الدهنية، حيث يحتوي على زيت الطحالب الدقيقة الغني ب DHA يقارن بالمكملات المشتقة من الأسماك. أشارت دراسات سابقة إلى أن مكملات زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA قد تحسن من تعقيم الكبد والمعايير الأيضية18,19. ومع ذلك، لا تزال ارتباطاته بتركيب ميكروبيوم الأمعاء ووظيفة الأيض الميكروبي في سياق MASLD غير واضحة.
لذلك، في هذه الدراسة، استخدمت الدراسة الحالية نموذج فئران محفز بنظام غذائي عالي الدهون لتقييم تأثيرات مكملات زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA على معايير الأيض، وتركيب ميكروبيوم الأمعاء، وملفات الأيض الكبدية. تم افتراض أن مكملات زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA سترتبط بتحسن في استقلاب الدهون الكبدية وتغيرات متزامنة في تركيب ميكروبيوم الأمعاء ومسارات الأيض الميكروبية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تفاصيل جميع الحيوانات، والأنظمة الغذائية، والكواشف، والمجموعات، والأجهزة، والبرامج، ومزودي الخدمات المستخدمة في هذا البروتوكول موفرة في جدول المواد. أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وحصلت على موافقة لجنة الحيوانات التجريبية في مستشفى شاندونغ الإقليمي (الموافقة الأخلاقية رقم 2022–007، المعتمدة في 24 يناير 2022).
تحذير: يجب التعامل مع دم الحيوانات وعينات البراز والأنسجة كمواد قد تكون خطيرة بيولوجيا. يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية، والعينات البيولوجية، والسائب، والمذيبات العضوية، ومواد التحليل الكيميائي وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية، ورعاية الحيوانات، والسلامة الكيميائية. يجب جمع جثث الحيوانات والأنسجة والمواد الملوثة بالدم وعينات البراز في حاويات نفايات بيولوجية مخصصة والتخلص منها من خلال منشأة الحيوانات المؤسسية أو مكتب السلامة البيولوجية. يجب التخلص من الإبر، وإبر الجافاج، والأنابيب الشعرية، وغيرها من الحادات فورا بعد الاستخدام في حاويات الحاد المعتمدة. يجب جمع نفايات المذيبات العضوية، بما في ذلك الميثانول والأسيتونيتريل والمحاليل التي تحتوي على حمض الفورميك، في حاويات نفايات كيميائية موسومة والتخلص منها من خلال برنامج النفايات الكيميائية الخطرة المؤسسي. يجب جمع النفايات الناتجة عن اختبارات الإجهاد الكيميائي الحيوي والتأكسدي والتخلص منها وفقا لأوراق بيانات السلامة الخاصة بالشركة المصنعة وقواعد السلامة الكيميائية المؤسسية.
الحيوانات التجريبية
تم الحفاظ على الفئران الذكور ذات الستة أسابيع C57BL/6J (عدد = 4 لكل مجموعة) تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) محددة مع دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة عند 22 ± 2 درجة مئوية ورطوبة نسبية 50–60٪. كان للحيوانات إمكانية الوصول إلى الطعام والماء، مع وجود خمسة فئران كحد أقصى لكل قفص. تم إطعام الفئران الضابطة نظاما غذائيا قياسيا يتكون من 70٪ كربوهيدرات، 20٪ بروتين، و10٪ دهون (كيلو سعرة). لتأسيس نموذج فئران MASLD، تم إطعام الفئران نظاما غذائيا عالي الدهون لمدة 8 أسابيع يحتوي على 20٪ كربوهيدرات، 20٪ بروتين، و60٪ دهون (kcal). تم تخزين جميع الحميات عند 4 درجات مئوية وإعادة تجديدها مرتين في الأسبوع. تم توزيع الفئران عشوائيا على مجموعات تجريبية باستخدام مولد أرقام عشوائية، وتم تحديد حجم العينة (n = 4 لكل مجموعة) بناء على دراسات سابقة باستخدام نماذج فئران عالية الدهون وتجارب أولية مشابهة استندت إلى نظام غذائي عالي الدهون. تم إعطاء جميع العلاجات في نفس الوقت يوميا لتقليل التغيرات اليومية.
تم استخراج وتنقية زيت الطحالب الدقيقة بواسطة أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية، بنقاء يقارب 99٪. تم تخزين زيت الطحالب الدقيقة عند −30 درجة مئوية محمي من الضوء. قبل الاستخدام، كان يحضر الزيت باستخدام مستحلب ويخلط جيدا لضمان التجانس. تحديدا، تم استحلاب زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA في صوديوم معقم يحتوي على 0.5٪ كربوكسي ميثيل سيلولوز يحتوي على 0.5٪ Tween-80 في محلول ملحي طبيعي. تم خلط زيت الطحالب الدقيقة ومركبة المستحلب بنسبة 1:9 (v/v) وتم تحويلهما إلى دوامة لمدة دقيقتين قبل التثبيت مباشرة للحصول على تعليق متجانس. تلقت الفئران في مجموعة معالجة الطحالب الدقيقة الزيوت التحضير مرة واحدة يوميا عن طريق التنقيب الفموي باستخدام إبرة تغذية معقمة بجرعة 10 ميكرولتر/جم من وزن الجسم. تم تعديل حجم الجافاج يوميا حسب وزن الجسم لضمان ثبات الجرعة. تلقت الفئران في المجموعة الضابطة حجما مكافئا من محلول ملحي طبيعي معقم تحت نفس الظروف. كان محلول ملحي مستخدم بنسبة حقن 0.9٪ من كلوريد الصوديوم.
تكون العلاج بالبروبيوتيك من تركيبة مركبة تحتوي على لاكتوباسيلوس بلانتاروم (DY-1)، لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس (KDB-03)، لاكتوباسيلوس كاسي (KDB-LC)، وبكتيريا التخثر (GIM 1.645). تم خلط السلالات الأربع بنسبة خلايا قابلة للحياة متساوية تبلغ 1:1:1:1. ساهمت كل سلالة بنسبة 2.5 × 107 CFU/mL في التركيبة النهائية، مما أدى إلى تركيز بكتيريا إجمالي يبلغ 1 × 108 CFU/mL. تم تصنيع خليط البروبيوتيك من قبل أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ولا يتوفر تجاريا. تكون العلاج بالبروبيوتيك من مرق تخمير بروبيوتيك مركب يحتوي على لاكتوباسيلوس بلانتاروم DY-1، ولاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس KDB-03، ولاكتوباسيلوس كاسي KDB-LC، وباسيلوس كواجولانس GIM 1.645. كان تركيز البكتيريا في التركيبة 1 × 108 CFU/mL. تم تخزين مرق التخمير البروبيوتيك عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. تلقت الفئران في المجموعة المعالجة بالبروبيوتيك تركيبة البروبيوتيك مرة واحدة يوميا عن طريق التشويش الفموي بجرعة 0.01 مل/جم من وزن الجسم طوال فترة التجارب.
تم زراعة السلالات الفردية تحت ظروف مناسبة وحصادها في مرحلة النمو المتوسطة (OD₆₀₀ ≈ 0.6)، ثم تم دمجها عند النسبة المشار إليها. تم طرد المزارع البكتيرية لإزالة الفائق، وأعيد تعليق الحبيبات في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). تم الاحتفاظ بتعليق البكتيريا المحضر حديثا في الثلاجة قبل الإعطاء للحفاظ على الصلاحية. تم تعديل التركيز النهائي للبكتيريا إلى 1 ×10 8 CFU/mL قبل الإعطاء. تلقت فئران مجموعة البروبيوتيك التركيبة عن طريق التشويش الفموي بجرعة 0.01 مل/جم من وزن الجسم مرة واحدة يوميا طوال فترة التجارب. لم يتم تطبيق أي علاج مسبق بالمضاد الحيوي قبل إعطاء البروبيوتيك. لتقليل التحيز التجريبي، أجري الباحثون الأعمى تقييم النتائج عند الحاجة. تم تأكيد MASLD من خلال تحليل كيميائي حيوي في الدم.
تحليل الدم
في نهاية فترة التجارب، صمت الفئران طوال الليل (12 ساعة) مع وصول مجاني إلى الماء قبل قياس الجلوكوز وجمع الدم النهائي. تم تخدير الفئران بعمق باستخدام الإيزوفلوران باستخدام جهاز تبخير تخدير حتى تم تأكيد فقدان رد فعل الدواسة. تم جمع عينات دم نهائية عن طريق النزيف الرجعي الحجاج. بعد جمع الدم، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم أثناء التخدير العميق، وتم تأكيد الوفاة بتوقف التنفس وضربات القلب. كان يسمح للدم بالجلط في درجة حرارة الغرفة ثم يزرع في الطرد المركزي عند 3,000 × جرام لمدة 10 دقائق للحصول على المصل. تم جمع عينات المصل وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى التحليل. تم قياس جلوكوز المصل، والكوليسترول الكلي (TC)، والدهون الثلاثية (TG)، والكوليسترول منخفض الكثافة (LDL-c)، والكوليسترول عالي الكثافة (HDL-c)، وإزيزاز الأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST)، وإنزيم الألينين أمينوترانسفيراز (ALT) باستخدام محلل كيميائي حيوي تلقائي، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس هذه المعلمات باستخدام اختبارات الألوان الإنزيمية مع مجموعات كواشف قياسية مدمجة في نظام المحلل. تم تطبيع جميع المعايير الكيميائية الحيوية إلى حجم المصل والتعبير عنها بالوحدات التي يحددها المصنع.
اختبارات الإجهاد التأكسدي
تم قياس مؤشرات الإجهاد التأكسدي باستخدام مجموعات علاجية، بما في ذلك تلك الخاصة بالمالونديالديهايد، وإنزيم الأكسجين الفائق الأكسيد، والكاتالاز. تم إجراء الفحوصات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، تم توحيد أنسجة الكبد في حاجز بارد جدا وتم طردها للحصول على مواد فائقة للتحليل. تم تحديد مستويات المالونديالديهايد (MDA) باستخدام اختبار المواد التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS)؛ تم قياس نشاط إنزيم الأكسجين الفائق (SOD) بقدرته على تثبيط التفاعلات التي تتتوسط بواسطة الأكسيد الفائق؛ وتم قياس نشاط الكتالاز (CAT) من خلال مراقبة معدل تحلل بيروكسيد الهيدروجين. أجريت القياسات باستخدام قارئ الألواح الدقيقة، وتم حساب القيم باستخدام المنحنيات القياسية أو الصيغ المقدمة في المجموعات. تم تطبيع مؤشرات الإجهاد التأكسدي إلى وزن نسيج الكبد والتعبير عنها وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
تسلسل 16S rRNA وتحليل الميكروبيوم
تم جمع عينات البراز في نهاية فترة التجربة مباشرة من فئران فردية تحت ظروف معقمة، وتم تجميدها فورا في النيتروجين السائل، وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي. تم استخراج الحمض النووي الميكروبي باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تضخيم منطقة V3–V4 من جين 16S rRNA البكتيري باستخدام بادئات 341F/806R. تم إجراء تضخيم PCR في نظام تفاعل بسعة 25 ميكرولتر يحتوي على الحمض النووي النموذجي، ومزيج رئيسي ل PCR مرتين و0.2 ميكرومولار من كل برايمر. تكون برنامج التضخيم من إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تلتها 25 دورة بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، مع تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم بناء وترتيب مكتبات Amplicon على منصة Illumina MiSeq باستخدام استراتيجية ثنائية الطرف 2 × 250 بت من قبل مزود خدمة تسلسل تجاري. تم تقييم جودة المكتبات قبل التسلسل، وتم تحميل المكتبات المجمعة وفقا لكثافة التجمعات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. تمت إزالة القراءات منخفضة الجودة ذات الأسس الغامضة، أو الطول غير الكافي، أو متوسط درجة الجودة أقل من Q20 قبل التحليل اللاحق.
تمت معالجة قراءات التسلسل الخام باستخدام QIIME 2 الإصدار 2019.420. باختصار، تم فك إرسال القراءات ذات الطرف المزدوج إلى التعدد، وتصفية الجودة، وإزالة الضوضاء، ودمجها، وتصفيتها بتقنية الكيميرا باستخدام DADA2 مع المعلمات الافتراضية ما لم يذكر خلاف ذلك. تم الاحتفاظ بمتغيرات تسلسل الأمبلكون غير الأحادية (ASVs) للتحليل اللاحق. تم إجراء التعيين التصنيفي باستخدام قاعدة بيانات Greengenes الإصدار 13_8 الذي تم تنفيذه في QIIME221. نظرا لقيود الدقة الجوهرية لتسلسل جينات 16S rRNA، خاصة عند استخدام قاعدة بيانات Greengenes، تم تفسير التعليقات التصنيفية حصريا على مستوى الجنس. لم يعتبر التصنيف على مستوى النوع موثوقا، وبالتالي لم يستخدم في أي تحليلات لاحقة أو مقارنات إحصائية أو تفسيرات بيولوجية. تم دمج جميع الميزات الميكروبية إلى مستوى الجنس قبل التصور والتحليل.
تم استخدام مقاييس التنوع الألفا (Chao1، الأنواع المرصودة، شانون، سيمبسون، PD فيث، وتساوي بيلو). تم إجراء مقارنات إحصائية لتنوع ألفا بين المجموعات باستخدام اختبارات غير معلمية مناسبة (مثل اختبار كروسكال–واليس). تم استخدام مسافة جاكارد واختلاف براي-كيرتس كمقاييس تنوع بيتا. تم استخدام مخططات التحليل الإحداثي الرئيسي (PCoA)، والتدرج متعدد الأبعاد غير المتري (NMDS)، وحجم تأثير التحليل الخطي المميز (LEfSe) لتوضيح التغيرات في مجتمعات الميكروبيوم، مع عتبة درجة LDA تبلغ 2.0. تم استخدام التحليل متعدد المتغيرات التبديلي للتباين (PERMANOVA) لتقييم الدلالة الإحصائية في تنوع بيتا. تم إجراء تصور البيانات والتحليلات الإحصائية باستخدام منصة GenesCloud (https://www.genescloud.cn).
تم استنتاج الملفات الوظيفية الميكروبية من بيانات تسلسل 16S rRNA بدلا من قياسها مباشرة بواسطة التسلسل الانتقالي أو الترجمة الجنونية باستخدام بندقية الصيد. استنادا إلى جدول المسار المعياري أو جدول وفرة المجموعة الوظيفية، تم تعيين الوحدات الوظيفية المتوقعة إلى قواعد بيانات شائعة، بما في ذلك KEGG وMetaCyc وCOG. تم تلخيص وفرة مسار KEGG وفقا لفئاتها الوظيفية الهرمية، مع استخدام تصنيفات المسارات من المستوى 2 للمقارنة في المراحل اللاحقة. تم حساب متوسط وفرة كل فئة مسار باستخدام برنامج R.
تحليل الأيض غير المستهدف لعينات الكبد
تم استئصال أنسجة الكبد بسرعة فور تأكيد الوفاة، وتجميدها فورا في النيتروجين السائل، وتخزينها عند −80 درجة مئوية قبل التحليل. تم تجانس حوالي 50 ملغ من نسيج الكبد المجمد في ميثانول بارد جدا (4:1، v/v) مع معايير داخلية. كانت نسبة المذيب بين الأنسجة والاستخلاص 1:10 (مع الضرب). تم تدوير العينات لمدة دقيقة واحدة، ثم صوتها على الثلج لمدة 10 دقائق، ثم حضنتها عند −20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحسين ترسيب البروتين. تم خلط النظافات المتجانسة جيدا، وخضعت للصوت على الجليد، وتم طردها المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم جمع المواد الفائقة بعناية، وتبخرها تحت تدفق نيتروجين خفيف، وأعيد تكوينها في 50٪ ميثانول للتحليل لاحقا.
تم توليد عينات مراقبة الجودة (QC) عن طريق تجميع أحجام متساوية من كل عينة وتم تحليلها بشكل متقطع طوال فترة التشغيل لتقييم الاستقرار التحليلي وقابلية التكرار. تم إجراء تحليل الأيض غير المستهدف باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء مرتبط بمطيافية الكتلة عالية الدقة، يديره مزود خدمة تجاري. تم فصل المستقلبات على عمود C18 عكسي الطور باستخدام نظام مذيب ثنائي يتكون من ماء يحتوي على حمض الفورميك 0.1٪ والأسيتونيتريل بحمض الفورميك 0.1٪. كان حجم الحقن 2 ميكرولتر، وتم الحفاظ على درجة حرارة العمود عند 40 درجة مئوية، وتم ضبط معدل التدفق عند 0.30 مل/دقيقة. تم استخدام برنامج إزالة التدرج لتحقيق فصل واسع للمستقلبات. تم إجراء الكشف الطيفي الكتلي في أوضاع التأين الكهربائي الموجب والسالب عبر نطاق m/z من 70–1000 لتحقيق تغطية واسعة للمستقلبات. تم ضبط جهد رش الأيون على 3.5 كيلو فولت في الوضع الموجب و−2.5 كيلو فولت في الوضع السالب. تم الحفاظ على درجة حرارة الشعيرات الدموية عند 320 درجة مئوية، وتم جمع البيانات في وضع التصوير المتعدد الكامل مع اكتساب التصلب المتعدد/المتعدد المعتمد على البيانات لتوضيح المستقلبات. تمت معالجة البيانات الخام باستخدام برنامج استيض مخصص (MassLynx v4.1) لاكتشاف الميزات، والمحاذاة، والتطبيع. تم تحديد المستقلبات بناء على الكتلة الدقيقة، ووقت الاحتفاظ، وأنماط تجزئة التصلب المتعدد/التصلب المتعدد بالمقارنة مع قواعد البيانات العامة، بما في ذلك قاعدة بيانات المستقلبات البشرية (HMDB) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) (v2023)، حيثما كان ذلك مناسبا.
تحليل متعدد المتغيرات والمسارات
خضعت بيانات الأيض المعالجة لتحليلات إحصائية متعددة المتغيرات، بما في ذلك تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتحليل التمييز الجزئي للمربعات الصغرى (PLS-DA)، لتصور الفروق الأيضية بين المجموعات التجريبية. تم تحديد المستقلبات التفاضلية بناء على مزيج من درجات التقدير (VIP) المتغيرة (>1.0) والدلالة الإحصائية (p < 0.05). تم رسم خرائط مستقلبات محددة إلى مسارات أيضية باستخدام تحليل إثراء مسار KEGG لتوضيح العمليات البيولوجية المرتبطة بمكملات زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA.
التحليل الإحصائي
تم عرض البيانات كمتوسط ± SEM وتم تحليلها باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار المقارنات المتعددة الذي أجرته توكي. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها p < 0.05. تم إجراء تحليل إثراء مستقلبات الكبد باستخدام R (الإصدار 4.4.1). تم تحليل الارتباطات الزوجية بين الأجناس الميكروبية ومستقلبات الكبد باستخدام ارتباطات رتبة سبيرمان. فقط هناك ارتباطات ذات دلالة كبيرة (معدل الاكتشاف الكاذب، FDR < 0.05) مع |ρ| تم تضمين ≥ 0.6 في تحليلات الشبكة التكاملية. تم إجراء معالجة بيانات الميكروبيوم والميتابولوميات كما هو موضح أعلاه، بما في ذلك استخدام منصة GenesCloud وإجراءات مراقبة الجودة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA يحسن عملية أيض الدهون، وإصابة الكبد، والإجهاد التأكسدي الكبدي في فئران MASLD الناتجة عن HFD
لتقييم تأثير المكملات الغذائية على توازن الجلوكوز والدهون، تم تقييم المعايير الكيميائية الحيوية عبر خمس مجموعات: الطعام العادي (RC)، النظام الغذائي عالي الدهون (HFD)، المكملات الغذائية الغنية ب DHA، المكملات بزيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA، المكملات بالبروبيوتيك، وزيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA + الفئران المكملة بالب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
في السنوات الأخيرة، بحثت عدة دراسات في التغيرات في الميكروبيوم المرتبط ب MASLD. ومع ذلك، ركزت معظم هذه الدراسات على مقارنة الأفراد الأصحاء بمرضى اضطراب الدهان المفرط المفرط أو فحص درجات الدهانالمختلفة 24. وبالتالي، لا تزال الأدلة محدودة توضح التغيرات المحددة في ميكروبيوم الأمعاء المرتبطة بتليف الكبد في اضطراب الميثال المتوسط الكبير، رغم أن التليف هو العامل الأكثر أهمية في التنبؤ بنتائج المرضى. في هذه الدراسة، نظهر أن زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA حسن بشكل أساسي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
تم تمويل هذا البحث من وزارة العلوم والتكنولوجيا ("برنامج البحث والتطوير الوطني الرئيسي في الصين" رقم 2021YFA0702100، 2022YFE0132200) ونظام صناعة التكنولوجيا الزراعية الحديثة في مقاطعة شاندونغ، الصين (رقم المنحة: SDAIT-26).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مزيج PCR Master مرتين | شركة تاكارا بيو، اليابان | RR902A | يستخدم لتضخيم PCR بنظام 16S rRNA |
| الأسيتونيتريل | ميرك، ألمانيا | 100030 | المذيب المستخدم في مرحلة UHPLC المتنقلة |
| جهاز تبخير التخدير | علم الحياة للدفع الخلفي | R580 | يستخدم لتوصيل التخدير بالإيزوفلوران للفئران |
| المحلل الكيميائي الحيوي الأوتوماتيكي | معهد جيان تشنغ للهندسة البيولوجية، نانجينغ، الصين | A110-1 & A111-1 | يقيس معايير المصل (الجلوكوز، TC، TG، LDL-c، HDL-c، AST، ALT) ومستويات الدهون في الكبد |
| عصية التخثر (GIM 1.645) | مركز جمع الزراعة الميكروبية في قوانغدونغ، الصين | GIM 1.645 | السلالة المكونة في تركيبة البروبيوتيك |
| صوديوم كربوكسي ميثيل سليلوز (CMC-Na) | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | C4888 | يستخدم كمكون مستحلب لتحضير زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA |
| مجموعة اختبار كاتالاز (CAT) | شركة نانجينغ للإنشاءات المحدودة | A007-1-1 | يكتشف نشاط التصوير المقطعي المحوسب (مؤشر على قدرة مضادات الأكسدة) في أنسجة الكبد |
| حزمة برامج DADA2 | فريق تطوير DADA2 | مشمول في QIIME 2 v2019.4 | يستخدم لإزالة الضوضاء وتصفية الكيميرا لقراءات التسلسل |
| زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA (مشتق من Schizochytrium sp.) | - | - | غني بحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA)؛ يعطى يوميا بواسطة جافاج عند 10 ميكرو؛ L/g كتدخل تجريبي |
| الحيوانات التجريبية (فئران ذكور C57BL/6J) | مختبر نهر بكين لتقنية الحيوانات | - | عمره 6 أسابيع، n = 4 لكل مجموعة؛ واستخدم لإنشاء نموذج MASLD عبر تغذية HFD |
| حمض الفورميك | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | F0507 | إضافة الطور المتنقل لتحليل الأيض |
| قاعدة بيانات Greengenes | جرينجينز | الإصدار 13_8 | يستخدم في التعيين التصنيفي الميكروبي |
| النظام الغذائي عالي الدهون (HFD) | شركة ريسيرش دييتس، الولايات المتحدة الأمريكية | D12492 | يتكون من 20٪ كربوهيدرات، 20٪ بروتين، 60٪ دهون (كالوري الحراري)؛ تم إرضائي لمدة 8 أسابيع لتحفيز اضطراب العضلة المفرط |
| مطياف الكتلة عالي الدقة | ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية | Q إكسكتيف أوربيراب | يستخدم للكشف عن المستقلبات في أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة |
| قاعدة بيانات الأيض البشري (HMDB) | جامعة ألبرتا، كندا | إصدار 2024 | قاعدة بيانات التعليقات العامة للمستقلبات |
| منصة إلومينا ميسيك | إلومينا، الولايات المتحدة الأمريكية | نظام MiSeq | يستخدم للنهاية المزدوجة في النهاية 2 & times؛ تسلسل 250 نقطة أساس |
| إيزوفلوران | ميرك، ألمانيا | PHR2874 | يستخدم في التخدير الاستنشاق لدى الفئران |
| موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) | مختبرات كانهيسا، اليابان | الإصدار 2023 | قاعدة البيانات المستخدمة لإثراء المسارات وتوضيح المستقلبات |
| لاكتوباسيلوس أسيدوفيلوس (KDB-03) | أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية، الصين | - | السلالة المكونة في تركيبة البروبيوتيك |
| لاكتوباسيلوس كاسي (KDB-LC) | أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية، الصين | - | السلالة المكونة في تركيبة البروبيوتيك |
| لاكتوباسيلوس بلانتاروم (DY-1) | أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية، الصين | - | السلالة المكونة في تركيبة البروبيوتيك |
| النيتروجين السائل | الهواء السائل | - | يستخدم للتجميد السريع وحفظ عينات البراز والكبد |
| مجموعة اختبار مالوندياليديهايد (MDA) | شركة نانجينغ للإنشاءات المحدودة | A003-1 | يكتشف MDA (علامة على تأكسد الدهون/تلف التأكسد) في نسيج الكبد |
| برنامج ماس لينكس | شركة ووترز، الولايات المتحدة الأمريكية | الإصدار 4.1 | يستخدم في معالجة البيانات الخام في علم الأيض، واستخراج الميزات، وتطبيع البيانات |
| الميثانول | ميرك، ألمانيا | 106035 | مذيب يستخدم لاستخراج المستقلبات |
| منصة تحليل بيانات الميكروبيوم | جينس كلاود | V1 | المنصة الإلكترونية: https://www.genescloud.cn/home؛ تستخدم في تحليلات PCoA وNMDS وLEfSe وغيرها من تحليلات تصور الميكروبيوم< وأخرى> |
| مجموعة OMEGA للحمض النووي للتربة | أوميغا بيو-تيك، نوركروس، جورجيا، الولايات المتحدة الأمريكية) | (M5635-02) | عزل الحمض النووي |
| تسلسلات OTUs المرجعية | جينس كلاود | مشار إليه من ماكدونالد وآخرون 2012؛ يستخدم في تعيين التصنيف لمتغيرات تسلسل المضخمات (ASVs) | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية | 10010023 | يستخدم لإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية |
| برايمر 341F/806R | شركة تسينغكه للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، الصين | - | يستخدم لتضخيم 16S rRNA V3&ndash؛ منطقة V4. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′ |
| البروبيوتيك | - | - | سلالات محددة لم تذكر صراحة؛ يستخدم كتدخل مقارن (يحسن بشكل رئيسي توازن الجلوكوز) |
| برنامج QIIME 2 | - | 2019.4 | يستخدم لتحليل المعلوماتية الحيوية للميكروبيوم (معالجة ASV، حساب التنوع ألفا/بيتا) |
| برنامج R | - | 4.4.1 | يستخدم في تحليل إثراء مستقلبات الكبد وتحليل سبيرمان لارتباط الميكروبات مع المستقلبات |
| الطرد المركزي المبرد | إبندورف، ألمانيا | 5810R | يستخدم في عينات الطرد المركزي في المصل والميتابولوميات |
| عمود C18 العكسي | شركة ووترز، الولايات المتحدة الأمريكية | 186002350 | يستخدم في فصل المستقلبات الكروماتوغرافية |
| المحلول الملحي | شيجياتشوانغ رقم 4 للأدوية | 2211112304 | يتم إعطاؤه يوميا بواسطة القاعة لمجموعة التحكم (مقابل علاج زيت الطحالب الدقيقة) |
| حمية الطعام التقليدية | شركة كياو شيلي للتغذية المحدودة، الصين | 1016706714625204224 | يتكون من 70٪ كربوهيدرات، 20٪ بروتين، 10٪ دهون (كيلو سعرة); يتم تغذية مجموعة التحكم (RC) |
| إبرة تغذية معقمة | مختبرات إنستيك، الولايات المتحدة الأمريكية | FTP-20-38 | يستخدم في إعطاء الجامد الفموي |
| مجموعة اختبار إنزيم الأكسجين الفائق (SOD) | شركة نانجينغ للإنشاءات المحدودة | A001-3 | يكتشف نشاط SOD (مؤشر على قدرة مضادات الأكسدة) في أنسجة الكبد |
| Tween-80 | سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية | P4780 | يستخدم كمكون مستحلب لتحضير زيت الطحالب الدقيقة الغنية ب DHA |
| التوحيد بالموجات فوق الصوتية | ساينتز بيوتكنولوجي، الصين | JY92-IIN | يستخدم لصوت أنسجة الكبد أثناء استخراج المستقلبات |
| الأيض الكبدي غير المستهدف | شركة ميتابو-بروفايل للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودة. | رمز المشروع: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH | |
| خلاط الدوامة | ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية | مزج LP Vortex | يستخدم لتوحيد العينات واستحلبها |
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً