بروتوكول تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا جرثومية بدائية شبيهة بالخلايا الجرثومية

ملخص

إرشادات خطوة بخطوة لتوليد خلايا جرثومية بدائية شبيهة بالخلايا الجذرية متعددة القدرات من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يحثها الإنسان بطريقة قوية باستخدام طريقة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد مع طبقة مستخلص الغشاء القاعدي.

الملخص

استخدام تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في المختبر وسع بشكل كبير الفهم لأحداث تحديد النسب التي تحدث خلال التطور المبكر في الجسم الحي، وهي فترة يصعب دراستها للغاية. واحدة من أولى السلالات الجنينية التي تم تحديدها في الجنين البشري هي سلالة الخلايا الجرثومية، التي تتميز بتحفيز الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs). تعد الخلايا المحيطة بالأمامية هي المجموعة المؤسسة الوحيدة للأمشاج في مراحل لاحقة من الحياة، وتحديدها هو خطوة أولى حاسمة نحو خصوبة الكائن الحي. هنا، يوصف بروتوكول قوي لتوليد خلايا شبيهة ب PGLC (PGCLCs) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان (hiPSCs)، بدءا من التقييم الأولي للحالة متعددة القدرات والخصائص الخلوية للخلايا الفائقة لضمان تمايز فعال ل PGCLC. لهذا، تناقش تأثيرات كثافات الخلايا المختلفة، وطلاءات الصفائح، والخلايا العالية العالية للضغط النفسي المستخدمة في تمايز PGCLC. وأخيرا، يتم توفير سير عمل لتوصيف وقياس hPGCLCs، باستخدام التألق المناعي وقياس تدفق الخلية. يركز بروتوكول التمايز على الحالات التي يسهل تحديدها واختبارها في معظم المختبرات ويمكن تعديلها حسب الحاجة. علاوة على ذلك، هذا البروتوكول سريع، مما يسمح بتحديد ما إذا كانت الخلايا العالية النفسية مناسبة للتمايز بين PGCLC. يهدف البروتوكول إلى تعزيز الاتساق والتوافق في نتائج hPGCLC عبر خطوط ومنصات الزراعة المختلفة في hiPSC، لضمان إنتاجية قوية تدعم توصيفا موثوقا وتحسين خطوات التمايز لاحقا نحو نجاح تكوين الأمشاج في المختبر لدى البشر.

المقدمة

تطور الخط الجرثومي البشري هو عملية منسقة للغاية تبدأ في وقت مبكر من التطور الجنيني وتبدأ بتحديد الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs)، وهي المجموعة التي تنتج في النهاية البويضات^{والخلايا} المنوية. في الجسم الحي، يحدث تحديد PGC بعد فترة وجيزة من الزرع ^2,3 استجابة للإشارات الحثية من الخلايا المجاورة ^4,5. تم دراسة تطوير PGCs بشكل موسع في القوارض، لا سيما من خلال الدراسات الجينية التي أظهرت تورط مسارات الإشارة، مثل BMP، WNT، وTGFβ 6,7,8,9. بعد التحديد، تخضع المجموعات الجرثومية لإعادة برمجة فوق جينية، تتميز بإزالة ميثلة الحمض النووي على مستوى الجينوم وإعادة تشكيل الكروماتين، لتأسيس لاحقا هوية الخط الجرثومي (الخاصة بالجنس) 10,11,12,13,14.

في الثدييات، يتم دفع مواصفات PGC من خلال التداخل المنسق بين مسارات الإشارة، وبعض الجوانب محفوظة تطوريا بين البشر والرئيسيات غير البشرية والخنازير والفئران، بما في ذلك تورط عوامل تعددية القدرات مثل POU5F1 وNANOG 9,15,16,17,18 . على الرغم من الخصائص المشتركة، فإن الفروق الخاصة بالنوع في آليات تمايز PGC وشبكات تنظيم الجينات تحد من الترجمة المباشرة من نماذج الحيوانات إلى البشر 9,19,20,21.

لفهم تكوين الأمشاج في البشر، من الضروري إجراء دراسات باستخدام مواد بشرية، لكنها لا تزال صعبة بسبب محدودية الوصول إلى الأجنة البشرية المبكرة. التقدم المستمر في البروتوكولات الذي يمكن التمايز الصناعي لخلايا الإنسان الشبيهة بالخلايا الجرثومية الأولية (hPGCLCs) عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (hiPSCs)، قلل الاعتماد على نسيج الغدد التناسلية البشرية مع تمكين الترقية والدراسات الجينية ^18,22. تعتمد معظم الاستراتيجيات المعتمدة لتمييز hPGCLC على التجمعات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) أو الأجسام الجنينية¹⁸. باستخدام هذه المنصات، أظهرت العديد من الدراسات أن hPGCLCs تعيد تلخيص الخصائص اللاجينية الرئيسية لخلايا PGC البشرية المبكرة، بما في ذلك برامج النسخ الجرثومية^23,24 وإعادة برمجة الحمض النووي على مستوى الجينوم²⁵. معا، تمتلك هذه المنصات في المختبر معرفة متقدمة بشكل كبير في بيولوجيا PGC البشري، بما في ذلك الالتزام بالنسب وإعادة تعيين الجينات. ومع ذلك، تظل بروتوكولات التمايز المعتمدة على التجميع hPGCLC صعبة لأنها تستغرق وقتا طويلا، ويظل العائد الكلي ل hPGCLCs لتوصيف فوق جيني قوي، أو اختبارات تمايز إضافية، أو استخدامها في التطبيقات التجريبية عالية الإنتاجية منخفضا.

مؤخرا، أثبتت طريقة ثنائية الأبعاد أحادية الطبقة خالية من المغذيات باستخدام مستخلص الغشاء القاعدي المخفف (BMEx) مع مستويات منخفضة من BMP4 لتمييز hiPSCs إلى hPGCLCs سهولة نسبيا في التوسع في ألواح زراعة الأنسجة وحققت كفاءة عالية (~55٪) خلال نافذة تمايز قصيرة (5 أيام)²⁶. مقارنة بالأنظمة ثنائية الأبعاد الأخرى التي تتطلب خطوة تمهيد Activin A متوسطة قبل الحث وتستخدم تركيزات BMP4 أعلى (40–50 ng/mL)^27,28، لم يتطلب هذا النهج خطوة ما قبل الحث واستخدم مستويات BMP4 أقل (10 نانوغرام/مل)، مع الحفاظ على كفاءة مماثلة وتحسين قابلية التوسع.

هنا، يتم تقديم دليل مفصل خطوة بخطوة لبروتوكول التمايز ثنائي الأبعاد hPGCLC BMEx، يبدأ بالتقييم الأولي لصيانة hiPSC، بما في ذلك تعدد القدرات والخصائص الخلوية، يليه اختبار تأثيرات طلاءات ألواح hiPSC المختلفة وكثافات الخلايا على تمايز hPGCLC. كما تم وصف توصيف التيار السفلي من خلال تحليل قياس خلوية التدفق والفلورية المناعية. يتم توفير نقاط معالجة حرجة وإرشادات استكشاف الأخطاء لتقليل الانحرافات المختبرية، مما يمكن الباحثين من تكرار تمايز hPGCLC بشكل مستمر في هذا التنسيق ثنائي الأبعاد.

البروتوكول

يتبع هذا البروتوكول إرشادات ولوائح مركز جامعة لايدن الطبي (LUMC)، وبنك LUMC الحيوي والمواد الحيوية (TCBio)، ومركز LUMC في لايدن hiPSC (بموجب BB24.037). جميع المواد وخطوط hiPSC الذكورية (XY) المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد. تم إجراء جميع إجراءات زراعة الأنسجة في غرفة مخصصة لزراعة الأنسجة بمستوى السلامة البيولوجية 2، مجهزة بحاضنة نورتاكسيك رطبة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂)، وجهاز طرد مركزي متعدد الأغراض على سطح الطاولة (دوار دلو متحرك)، وخزانة سلامة حيوية من الفئة الثانية مع ميكروسكوب مجسم.

تحذير: ليست كل خطوط hiPSC يمكنها التمييز بين hPGCLCs^26,29. ومع ذلك، إذا تم استخدام hiPSCs أخرى لتمييز PGCLC ولوحظت PGCLCs، فإن الطريقة الموضحة هنا (الشكل 1A) ستسمح بتوسيع إنتاج hPGCLC.

1. تغطية ألواح زراعة الأنسجة لزراعة العضلات العالية (hiPSC)

يصف هذا البروتوكول تغطية صفائح زراعة الأنسجة بكل من BMEx المخفف وفيترونكتين.

1. طلاء مستخلص الغشاء القاعدي (BMEx)
   1. قم بإذابة كمية من BMEx على الثلج. قد يكون هذا جيلتريكس، كولتريكس، أو ماتريجيل.
   2. قم بتخفيف نسبة مستخلص الغشاء القاعدي في DMEM/F12 البارد إلى تركيز نهائي 1٪ (v/v) وأعد تعليقها بلطف.
   3. غطى العدد المطلوب من الآبار في صفيحة ذات 6 آبار ب 1 مل من BMEx المخفف لكل بئر.
   4. حضن الصفيحة المطلية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الصفائح المطلية عند 2–8 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. عند استخدام الألواح المطلية المخزنة عند 2–8 درجات مئوية، يجب حضن اللوحة لمدة لا تقل عن 10 دقائق عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام الإضافي.
2. طلاء فيترونكتين
   1. قم بإذابة كمية كبيرة من الفيترونكتين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10–15 دقيقة.
   2. قم بتخفيف الفيترونكتين إلى تركيز نهائي يبلغ 5 ميكروغرام/مل في DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS -/-) وأعد تعليقها بلطف.
   3. يحدد عدد الآبار المطلوبة في صفيحة ذات 6 آبار ب 1 مل من الفيترونكتين المخفف لكل بئر.
   4. حضن الصفيحة ذات الستة آبار المطلية لمدة ساعة واحدة في RT.

2. المرور لصيانة الهيبي سي سي

1. وسط تحضير الزراعة: وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل mTeSR Plus مع محلول منع تلوث الفطرية (MycoZap (1:1000)).
2. استنشق وسط الزراعة من الخلايا الجاهزة للعبور.
3. أضف 0.5 مل من عامل اختيار وتمرير PSC البشري (ReLeSR) إلى كل بئر واسحب هذا العامل خلال دقيقة واحدة. تأكد من ترك طبقة رقيقة جدا على الخلايا.
4. حضن الخلايا لمدة 6 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
5. انقر على جوانب لوحة الست حفر عدة مرات.
6. قم بفصل الخلايا بعناية باستخدام وسط زراعة 1 مل عن طريق التوصيل بأنبوب p1000 للأعلى والأسفل بأنبوب p1000، وتأكد من فحص حجم شظايا المستعمرة بانتظام للحفاظ على حجمها بين 50–200 ميكرومتر.
7. خذ الألواح المطلية مسبقا ذات الستة آبار وأزل محلول الطلاء (الخطوة 1).
8. أضف 2 مل وسط زراعة لكل بئر.
9. نقل وسط الزراعة الذي يحتوي على شظايا مستعمرة hiPSC المنفصلة إلى البئر الجديد بنسبة مطلوبة.
   ملاحظة: النسبة المثالية لتقسيم شظايا مستعمرة hiPSC هي 1:6-1:50، مما يسمح بالمرور كل 4-7 أيام.
10. ضع لوحة زراعة الخلايا مع شظايا مستعمرة hiPSC المارة في حاضنة نورموكسي رطبة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2).
11. قم بتحديث وسط الثقافة كل يومين بوسط زراعة 2 مل حتى تصبح الهي-PSC جاهزة للمرور مرة أخرى.
    ملاحظة: أضف 4 مل وسط زراعة بدلا من 2 مل لكل 6 بئر لتجنب الحاجة إلى التحديث خلال عطلة نهاية الأسبوع.
    تحذير: لا تمر ب hiPSCs عندما يكون التقاء منخفضا جدا، وتخلص من الثقافة عندما يكون التقاء مرتفعا جدا للحفاظ على ثقافة hiPSC صحية ولتجنب التمايز التلقائي.

3. تمايز hPGCLC

1. التحضير قبل تمايز hPGCLC (اليوم 0).
   1. قم بتحديث وسط الزراعة لعضلات hiPSC قبل ساعة واحدة من بدء التمايز في hPGCLC.
   2. جهز محلول الطلاء: محلول BMEx بنسبة 1٪ مخفف في DMEM/F12 البارد.
   3. غطى العدد المطلوب من الآبار من صفيحة مكونة من 12 بئر بمحلول طلاء بحجم 0.5 مل.
   4. حضن الصفيحة المطلية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل بدء التمايز.
   5. جهز وسط الطبق: محلول BMEx بنسبة 2٪ (v/v) في وسط الزراعة الباردة واستكمل ذلك بوسط تعافي بعد الذوبان (RevitaCell) (1:100).
      تحذير: حافظ على وسط الطلاء على الثلج أثناء تحضير وطلاء الهيبسكيوت.
2. طلاء hiPSC لتمييز hPGCLC (اليوم 0).
   1. قم بإزالة وسط الزراعة من الآبار الستة التي تحتوي على الهيبينسيكوتات لاستخدامها في تمايز hPGCLC. ابدأ بحلقات hiPSC عالية الجودة عند تلاقي 50–80٪، دون علامات تمايز تلقائي.
   2. أضف محلول تريبسين واحد مل (TrypLE) لكل بئر.
   3. حضن عضلات hiPSC لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   4. قم بإنشاء تعليق خلية واحدة عن طريق إعادة تعليق مستعمرات hiPSC بحذر 2–3 مرات باستخدام ماصة p1000.
   5. تحقق تحت المجهر المقلوب ما إذا كان يتم الحصول على تعليق خلية واحدة. إذا لم يكن كذلك، أعد تعليق مستعمرات hiPSC مرة أو مرتين إضافيتين باستخدام ماصة p1000.
   6. انقل تعليق خلية hiPSC إلى أنبوب بحجم 15 مل.
   7. أضف 4 مل DMEM-F12 متوسط إلى أنبوب 15 مل.
   8. قم بعمل جهاز تعليق خلية hiPSC بضغط 200 × g لمدة 5 دقائق.
   9. استنشق الفائق وأعد تعليق خلايا hiPSC بعناية في وسط صفائح بحجم 0.5–1.0 مل.
   10. عد عدد hiPSCs باستخدام عداد الخلايا أو مقياس الدم وحساب عدد hiPSCs المطلوب لكل بئر لتمایز hPGCLC.
       ملاحظة: كنقطة بداية، يمكن استخدام كثافة طلاء تتراوح بين 40–80 كيلو خلية/سم² . ومع ذلك، لكل خط خلية وعند كل رقم مقطع، يوصى بتحسين كثافة الطلاء لتحقيق أفضل إنتاجية. هنا، تم طلاء hiPSCs بكثافة طلاء تتراوح بين 10K إلى 100K خلايا/سم².
   11. أعد تعليق العدد المطلوب من hiPSCs بعناية في حجم وسط الطلاء المناسب (1 مل لكل بئر من صفيحة ذات 12 بئر)، وتأكد من الحصول على تعليق خلوي متجانس باستخدام ماصة p1000.
   12. خذ لوحة 12 بئر مطلية من الحاضنة وأزل محلول الطلاء.
   13. أضف 1 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة ذات 12 بئرا.
   14. اهز اللوحة بعناية لضمان توزيع الخلايا بشكل متساو في البئر.
   15. ضع صفيحة ال 12 بئر في حاضنة رطبة طبيعية (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂₎ لمدة 16–24 ساعة.
3. تمايز hPGCLC (اليوم 1–2)
   1. حضر وسط قاعدي RB27: RPMI160 متقدم مع B-27 (1:100)، وبديل 1X من حمض الأمين (غلوتامكس)، وأحماض أمينية غير ضرورية 1X MEM، ومحلول منع تلوث الميكوبلازما (1:1000).
   2. جهز وسط تمايز: محلول BMEx بنسبة 2٪ (v/v) في وسط قاعدي بارد RB27 وأضف BMP4 إلى تركيز نهائي يبلغ 10 نانوغرام/مل. مستخلص الغشاء القاعدي مطلوب لتحفيز تكوين اللومينوجين وتحفيز مواصفات PGCLC في الجسم الحي.
      تحذير: حافظ على وسط التمايز على الثلج أو عند 4 درجات مئوية. يمكن تحضير وسائط التمايز لليومين الأول والثاني من بروتوكول التمايز.
   3. في اليوم الأول (خلال 16–24 ساعة من وضع الطبقة العالية العالية (hiPSCs)، خذ الطبق من الحاضنة وأخرج وسط الطبق.
   4. اغسل الآبار بإضافة 0.5 مل RB27 وسط قاعدي لكل بئر.
   5. استنشق وسط RB27 الأساسي وأضف 1 مل وسط تمايز لكل بئر.
   6. ضع الصفيحة مع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة النورموكسية المرطبة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2).
   7. في اليوم الثاني من التمايز، قم بتجديد الخلايا بوسط تمايز بسعة 1 مل لكل بئر.
4. تمايز hPGCLC (اليوم 3–5)
   1. وسط تبديل التحضير: وسط قاعدي RB27 مغذى ب BMP4 (10 نانوغرام/مل)، LIF (10 نانوغرام/مل)، SCF (50 نانوغرام/مل)، وEGF (50 نانوغرام/مل). يعكس وسيط المفتاح التحول في الجسم من مواصفات hPGC إلى البقاء والانتشار. تم حذف BMEx لأن التلوين لم يعد ضروريا.
   2. في اليوم الثالث والرابع، قم بتحديث كل بئر بسعة 1 مل من السويتش ميديوم.
   3. في اليوم الخامس من التمايز، يمكن توصيف hPGCLCs باستخدام التألق المناعي أو قياس تدفق الخلايا.

4. توصيف hPGCLCs بواسطة التألق المناعي وقياس خلوية التدفق

1. التوصيف بواسطة التألق المناعي.
   1. تحضير محلول نفاذية: 0.3٪ ترايتون X-100 مخفف في PBS.
   2. محلول الغسيل الجاهز: 0.05٪ Tween 20 في PBS (PBST)
   3. حضر محلول حاجز: ألبومين مصل البقري بنسبة 1٪ (BSA) في PBST.
   4. إزالة وسط المفتاح من الآبار المستخدمة في تفاضل hPGCLC.
   5. اغسل الخلايا ب 1 مل لكل بئر DPBS (-/-).
   6. ثبت الخلايا ب 1 مل لكل بئر 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS لمدة 15 دقيقة عند RT.
   7. اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBS، باستخدام 1 مل لكل بئر.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين الصفائح عند 4 درجات مئوية قبل بدء التألق المناعي.
   8. قم بنفاذ الخلايا باستخدام محلول نفاذية لمدة 15 دقيقة عند RT، باستخدام 1 مل لكل بئر.
   9. اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام محلول الغسيل، باستخدام 1 مل لكل بئر.
   10. الخلايا الحجزية مع محلول حجب لمدة ساعة واحدة عند RT، باستخدام 1 مل لكل بئر.
   11. تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية: تخفيف الأجسام المضادة الأولية المهمة في محلول الانسداد.
       ملاحظة: هنا، تم استخدام تركيبتين من الأجسام المضادة التالية لمؤشرات PGC: مضاد SOX17 للماعز ومضاد TFAP2C للأرانب، ومضاد SOX17 للفأر ومضاد POU5F1 للفأر (جدول المواد).
   12. قم بإزالة محلول الانسداد، وأضف 0.4 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر، وحضن المحلول طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
       ملاحظة: من المهم تضمين ضوابط سلبية لتقييم ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. لهذا، احتفظ بإحكام جيدا طوال الليل في محلول الانسداد مع حذف الأجسام المضادة الأولية، ثم صبغ ذلك جيدا بمحلول الأجسام المضادة الثانوية.
   13. في اليوم التالي، أزل محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBST.
   14. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية: تخفيف الأجسام المضادة الثانوية محل الاهتمام (جدول المواد) وDAPI (1:500) في محلول الحجب.
       ملاحظة: محلول الأجسام المضادة الثانوي حساس للضوء ويجب إبقاؤه في الظلام.
   15. قم بإزالة PBST وإضافة 0.4 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر لمدة ساعة واحدة في RT في الظلام.
   16. اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBS، باستخدام 1 مل لكل بئر.
   17. قم بتصوير الخلايا (عدسة 20x الموضوعية).
       ملاحظة: تم التقاط صور الفلورة المناعية باستخدام هدف 20x على مجهر إيريسكان، بينما تم التقاط صور المجال الساطع باستخدام هدف 4x وهدف 10x على مجهر EVOS.
2. التوصيف بواسطة قياس خلوية التدفق
   1. تحضير مخزن FACS: 0.5٪ BSA في DPBS (-/-)
   2. أزل وسط المفتاح من الآبار التي تحتوي على hPGCLCs.
   3. غسل الخلايا ب 1 مل DPBS (-/-).
   4. أضف 0.5 مل من أكوتاز مسخن مسبقا لكل بئر وحضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بالنسبة للتفكك، يفضل إنزيم أكوتاز على محلول التريبسين لأن hPGCLCs حساسة جدا للتفكك.
   5. قم بعمل تعليق خلية واحدة عن طريق إعادة تعليق الخلايا بحذر 2–3 مرات باستخدام p1000.
   6. تحقق تحت المجهر المقلوب ما إذا كان يتم الحصول على تعليق خلية واحدة. وإذا لم يكن كذلك، أعد تعليق الخلايا مرة إلى مرتين إضافيتين باستخدام ماصة p1000.
   7. قم بترشيح تعليق الخلية عبر مصفاة بقطر 40 ميكرومتر إلى أنبوب بسعة 15 مل.
   8. اغسل مصفاة 40 ميكرومتر باستخدام مخزن FACS بسعة 5 مل.
   9. قم بطرد المركزي بنظام تعليق الخلية عند 300 × g لمدة 5 دقائق.
   10. أزل السوبرناتانت.
   11. أعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن FACS بسعة 0.3 مل في أنبوب بسعة 1.5 مل.
       ملاحظة: من الاختياري عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا أو جهاز قياس الدم الخلوي. إذا تم عد الخلايا، توقع حوالي مليون خلية لكل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا.
   12. تحضير عينات تحكم كافية لقياس خلوية التدفق (ضوابط غير مصبوغة وذات صبغة واحدة). لهذا، نقل 15–30 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنابيب بسعة 1.5 مل واملأها إلى 100 ميكرولتر باستخدام مخزن FACS.
       ملاحظة: في هذه الدراسة، تم إعداد 3 صبغات أحادية: EPCAM-PEcy7 (1:200)، ITGA6-BV421 (1:200)، و7AAD (1:200). المحاليل التي تحتوي على الأجسام المضادة المترافقة و7AAD حساسة للضوء ويجب إبقاؤها في الظلام.
   13. أضف الأجسام المضادة المترافقة المعنية مباشرة إلى تعليق الخلية لتحقيق تخفيف كاف. هنا، تم استخدام الأجسام المضادة المترافقة التالية لمؤشرات PGC معا: EPCAM-PEcy7 (1:200) و ITGA6-BV421 (1:200) (جدول المواد).
   14. حضن الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
   15. أضف 1 مل من FACS للعينات، والتحكم غير المصبوغ، وأنظمة التحكم بجسم مضاد واحد، وجهاز الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 دقائق.
   16. أزل السوبرناتانت.
   17. أعد تعليق العينات في 0.5 مل، وعينات التحكم في 0.2 مل، من مخزن FACS يحتوي على 1 ملليمول EDTA. هذا يمنع الخلايا من التكتل.
   18. أضف العينات وأدوات التحكم إلى أنبوب FACS بسعة 5 مل مع غطاء مصفاة خلية، ثم مررها عبر المصفاة.
   19. أضف 7AAD مباشرة إلى كل عينة قبل عدة دقائق من القياس في مقياس التدفق الخلوي.
   20. قياس العينات باستخدام مقياس تدفق خلوي. هنا، تم استخدام محلل الخلايا المعتمد على الفلورة لقياس العينات، وجمعت البيانات باستخدام برنامج FACSDiva (الإصدار 9.0)، وتم استخدام برنامج FlowJo (الإصدار 10.10.0) لتحليل البيانات.
   21. استخدم عينات التحكم (الضوابط غير المصبوغة وذات الأجسام المضادة الواحدة) لوضع استراتيجية البوابة وأداء التعويض إذا لزم الأمر.
   22. قم بعمل دوامة للعينات قبل وضعها في الآلة.
   23. استخرج مجموعة الخلايا من جميع الأحداث عن طريق وضع بوابة أولا بناء على المساحة [منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A)].
   24. من هذه المجموعة، يتم استخراج الخلايا المفردة بناء على الحجم [عرض FSC (FSC-W) وارتفاع FSC (FSC-H)] والحبيبات [SSC-W و SSC-H].
   25. استبعاد الخلايا الميتة من التحليل الإضافي عن طريق وضع بوابة لخلايا 7AAD سالبة.
   26. استخدم العينة للتحقق مما إذا كانت البوابات مضبوطة بشكل صحيح، وضبطها إذا لزم الأمر.
   27. حلل العلامات المثيرة للاهتمام من هذه المجموعة الحية. هنا، كانت الخلايا المدعومة الموجبة لكل من EPCAM وITGA6 تتوافق مع hPGCLCs.

النتائج

جودة وحالة استقرار الهيPSC مهمة لمزيد من التمييز
تم الحفاظ على الهيPSCs في صفائح ذات 6 آبار على الأقل لثلاثة مقاطع (في الطلاءات المختلفة) قبل تجارب التميز والتحليل. تم تمرير hiPSCs عندما وصلت مستعمرات الخلايا إلى التقاء 70–80٪ (الشكل 1B)، وهو أيضا التقاء hiPSC الأمثل لبدء تمايز hPGCLC. أظهرت ثقافات hiPSC الصحية شكل مستعمرات موحدا دون مناطق داكنة أو متمايزة، مرئية في صور الحقل الساطعة (الشكل 1B). ومع ذلك، تأثرت جودة الخلايا العصبية العالية عندما لم تحافظ مستعمرات الخلايا على التقاء أمثل أو أظهرت علامات تمايز (الشكل 1B). عند التقاء منخفض، استمر hiPSC في الانتشار، وكان هناك حاجة إلى مزيد من الوقت لتكوين المستعمرات حتى يصبح التقاء التقاطع مناسبا لتجارب المرور أو التمايز. عند التقاء عالي، نمت الخلايا العضلية فوق بعضها البعض، بينما ظهرت مناطق متمايزة. تم تأكيد حالة تعددية القدرات لدى الخلايا الدقيقة للعظام العالية من خلال التعبير عن SOX2 أو POU5F1، وهما عاملان نسخ أساسيان للحفاظ على تعددية القدرات والتجدد الذاتي في الخلايا الثلاثية³⁰، والأهم من ذلك، أن SOX2 لا يعبر عنه في hPGCLCs³¹. تم استخدام تلوين الفالويدين لتقييم تنظيم هيكل الخلايا وشكل المستعمرات، مما يدل على جودة الخلايا العضلية العضلية العالية (hiPSCs). لاحظ أن الاختلافات في شكل الخلايا مرتبطة بتقليل SOX2 أو POU5F1 (الشكل 1B).

تأثير ركيزة صيانة hiPSC على تمايز hPGCLC
لتقييم ما إذا كان الحفاظ على hiPSCs على ركائز الطلاء المختلفة يؤثر على التمايز مع hPGCLCs، تم زراعة hiPSCs على ركائز مختلفة (Geltrex، Matrigel، Cultrex، وvitronectin) (الشكل 2). على جميع الركائز، أظهرت الخلايا الدقيقة للضغط العالي مستويات SOX2 أو POU5F1 النووية القوية والموحدة، مما يدل على حالتها متعددة القدرات. كانت مستعمرات hiPSC التي تم الحفاظ عليها على جيلتريكس، ماتريجل، وكولتريكس ذات شكل مماثل، بما في ذلك حدود المستعمرات المحددة جيدا وأشكال المستعمرات غير المنتظمة بشكل عام، مقارنة بالمستعمرات الدائرية التي تستخدم الفيترونكتين (الشكل 2). تم طلاء الخلايا العالية العالية التي وصلت إلى 70–80٪ من التقاء الخلايا بكثافة 40 كيلوباينا/سم² وتمايزها إلى hPGCLCs على جيلتريكس²⁶. في اليوم الخامس، أظهرت صور الحقول المضيئة مستعمرات hPGCLC مميزة في جميع الظروف (الشكل 3). علاوة على ذلك، تم تحديد SOX17/TFAP2C/PDPN الثلاثي الإيجابي أو SOX17/POUF51 hPGCLCs مزدوج الإيجابية في جميع الحالات (الشكل 3). وهذا أشار إلى أن بروتوكول التمايز يمكن استخدامه مع تزريع الخلايا العضلية العالية في ظل ظروف مختلفة.

تأثير كثافة خلايا hiPSC الأولية على تمايز hPGCLC
من المهم فحص كثافة البذر المثلى لتحقيق تمايز hPGCLC الأمثل (على Geltrex) لأن معدلات التكاثر المختلفة لأنواع hiPSC. علاوة على ذلك، في حال انخفضت كفاءة تمايز hPGCLC مع مرور hiPSCs المستمر، ينصح بتعديل كثافة خلايا البذر في hiPSC. لتقييم تأثير كثافة خلايا البذر على كفاءة تمايز hPGCLC، تم زرع hiPSCs بكثافات مختلفة، من 10K إلى 100K خلايا/سم^مربع (الشكل 4A). في اليوم الخامس، تم تقييم نسبة hPGCLCs بواسطة قياس تدفق الخلايا باستخدام جسمين مضادين متقارنين مختلفين لمؤشرات PGC البشرية، وهما EPCAM وإنتيجين α6 (ITGA6)³². اتبع تحليل التدفق الخلوي استراتيجية بوابات متتالية قياسية، كما أظهرت لمخلوقات HiPSC في M199 البذرة عند 40 ألف خلية/سم^مربع (الشكل 4B). باختصار، تم تحديد إجمالي عدد الخلايا (جميع الحالات) لاستبعاد الحطام (مساحة الجسيمات)، ثم تم اختيار الخلايا المفردة بناء على الحجم (FSC) والحبيبية (SSC)، وأخيرا، تم استبعاد الخلايا الميتة بناء على تلوين 7AAD. بعد ذلك، تم ضبط البوابة لقياس الخلايا التي تعبر عن EPCAM-cy7 وITGA6-BV421 باستخدام عينات مصبوغة وغير مصبوغة (الشكل 4B).

مقارنة كفاءة تمايز hPGCLC باستخدام كثافات خلايا البذر المختلفة واستخدام hiPSC المزروعة على ركائز مختلفة كشفت عن اتجاه يعتمد على الكثافة (الشكل 4C). عند كثافة البذور 20–40 كيلوباينا/سم²، أظهرت هيPSCs في M54 وM199 أعلى نسبة من hPGCLCs مزدوجة الإيجابية EPCAM+/ITGA6+، والتي تم تحقيقها من hiPSCs محفوظة على Geltrex وCultrex. ومن المثير للاهتمام أن الكثافات الأعلى أدت إلى كفاءة تفاضل أقل. نتائج التألق المناعي باستخدام علامات PGC SOX17/TFAP2C/PDPN أو SOX17/POUF51 على hPGCLCs أكدت نتائج قياس تدفق الخلايا (الشكل 4D). تشير هذه النتائج إلى أن تعديل كثافة البذر مع الهيPSCs المحددة أمر مهم لتحقيق كفاءة تمايز مثالية. الجمع بين الفلورية المناعية وقياس تدفق الخلايا يعزز متانة اختبار التمايز hPGCLC.

الشكل 1: سير عمل التمايز في hPGCLC وجودة ال hiPSCs. (أ) مخطط سير العمل المستخدم في هذه الدراسة. تم الحفاظ على hiPSCs (في وسط الزرعة) ووصلت إلى 60–80٪ في يوم التمايز (اليوم 0، D0). في D0، تم تفكيك الخلايا الهيPSCs إلى خلايا مفردة وطلاؤها بكثافة البذور المطلوبة (في وسط الطبق). في اليوم التالي، عولجت الخلايا بوسط تمايز (D1–D3)، تلاه وسط تبديل (D3–D5). على D5، استخدمت hPGCLCs للفلورة المناعية أو قياس خلوية التدفق. (ب) صور برايتفيلد (الصف العلوي - تكبير 4x)؛ التألق المناعي لمادة SOX2، وتلوين الفالودين، والتلوين بتقنية DAPI (الصف الأوسط)؛ وبالنسبة ل POU5F1، وتلوين الفالودين، وتلوين DAPI (الصف السفلي) الذي يظهر وجود حلقات hiPSC مع تداخل مختلف. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. تم إنشاء الرسومات في الشكل 1A بواسطة المؤلفين باستخدام أدوات الرسم الأساسية في Adobe Illustrator؛ لم يتم استخدام أي برامج أو أدوات مدفوعة. لذا، لم تكن هناك حاجة لترخيص حقوق النشر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تأثير ركائز الطلاء المختلفة أثناء زراعة hiPSC. صور برايتفيلد (الصف العلوي)؛ التألق المناعي لمادة SOX2، وتلوين الفالودين، والتلوين بتقنية DAPI (الصف الأوسط)؛ وبالنسبة ل POU5F1، وتلوين بالفالودين، وتلوين DAPI (الصف السفلي) الذي يظهر وجود hiPSCs مزروعة على ركائز طلاء مختلفة. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تأثير ركائز الطلاء المختلفة أثناء زراعة hiPSC على تمايز hPGCLCs. صور برايتفيلد (الصف العلوي بتكبير 10 أضعاف); التألق المناعي لأنظمة SOX17، TFAP2C، PDPN، وتلوين DAPI (الصف الأوسط)؛ وللصبغة POU5F1 وSOX17 وDAPI (الصف السفلي) لتمایز hPGCLCs (باستخدام Geltrex) في اليوم الخامس، بدءا من الهيPSCs المزروعة على ركائز طلاء مختلفة. يبرز الخط الأصفر المتقطع المناطق التي تحتوي على hPGCLCs. أشرطة السلم = 25 ميكرومتر (الصف العلوي) و50 ميكرومتر (الصفوف الوسطى والسفلى). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تأثير كثافة بذور hiPSC على تمايز hPGCLCs. (أ) صور برايتفيلد في اليوم الأول (D1) وD3 لتمايز hPGCLCs باستخدام كثافات بذر hiPSC مختلفة (40K خلايا/سم²، 60K خلايا/سم2، 80K خلايا/سم²). أشرطة المقياس = 250 ميكرومتر. تكبير 4x. (ب) مخططات قياس تدفق الخلايا التمثيلية تظهر استراتيجية البوابات لقياس نسبة EPCAM+/ITGA6+ hPGCLCs. لهذا الغرض، تم استخدام حلقات HiPSC من نوع M199 (على Geltrex) بكثافة بذور تبلغ 40 كيلو خلية/سم^مربع. (ج) مخطط شريطي يوضح نسب ال EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLCs عند D5 عند استخدام hiPSCs (M199 وM54) المزروعة على طلاءات مختلفة ومزروعة بكثافات مختلفة. (د) الفلورة المناعية لصبغة SOX17، TFAP2C، PDPN، وتلوين DAPI (اللوحات اليسرى); وتلوين SOX17 وPOU5F1 وDAPI (اللوحات اليمنى) عند D5 لتمايز hPGCLCs باستخدام hiPSCs (M199 وM54، على Geltrex) التي تم بذرها عند 40K و80K خلايا/سم2. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تشكل التكوين الأمشاجي في المختبر منصة تجريبية قوية للتحقيق في تطور الخط الجرثومي البشري، والسمية التناسلية، والعقم تحت ظروف الزراعة المسيطر عليها وعلى أساس كل مريض. على الرغم من الإبلاغ عن عدة بروتوكولات لتمييز hPGCLCs عن hiPSCs¹⁸، إلا أن التقدم في المجال أعاق بسبب محدودية توفر الأساليب الموحدة والقابلة للتوسع والقابلة للتكرار عبر المختبرات. وصفت الدراسات الحديثة طرقا مبسطة وفعالة لتحفيز hPGCLC، بما في ذلك التمايز الدقيق المعتمد على BMP4²⁷، ومنصة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد سريعة تتيح توليد hPGCLC خلال 3.5 يوما^و28 يوما، ونظام زراعة ثلاثي الأبعاد يحاكي تطور الغرس المحيط بالغرس والإشارات المتخصصة الباراكرينية³³. على الرغم من أن هذه البروتوكولات دعمت تمايز hPGCLC بكفاءة، إلا أنها لا تزال تفتقر إلى القدرة على العمل كمنصات عالية الإنتاجية. لكي تكون الدراسات القائمة على hPGCLC قابلة للتطبيق على نطاق واسع، لا سيما في الفحوصات السمومية التناسلية، يجب أن تكون البروتوكولات قوية، وسهلة الفهم تقنيا، ومتوافقة مع الاختبارات الكمية اللاحقة. هنا، يعرض تحليل خطوة بخطوة لبروتوكول التفاضل BMEx في hPGCLCs، مع التركيز على المعايير التقنية الحيوية التي تحدد قابلية التكرار والأداء.

عامل رئيسي في التمايز الناجح هو الحالة الأولية للتعددية لدى الخلايا المفرطة المنخفضة (hiPSC). يمكن أن تؤثر أرقام الممر، وصحة الخلية، والخصائص الخاصة بالخط، وظروف الزراعة قبل التمايز على نتائج تمايز hPGCLC. في البداية، أثناء صيانة hiPSC، يمكن التركيز على ركيزة الطلاء، كثافة خلايا البذر، وشكل صفيحة الزراعة، والتي تحدد معا بنية المستعمرة وبيئات الإشارة عند بداية تمايز hPGCLC. تظهر الدراسة الحالية تأثير استخدام hiPSCs المزروعة على طلاءات مختلفة وكثافات بذور مختلفة على تمايز hPGCLCs (على Geltrex). أظهرت كلتا خطي hiPSC التي تم اختبارها هنا أقصى كفاءة تمايز عند كثافة بذور 20,000–40,000 خلية/سم^مربع . وهذا يؤكد الحاجة إلى تحديد كثافات البذور المثلى عند إدخال خطوط خلايا جديدة، أو بعد مرور ممتد، أو تغيير التخطيطات التجريبية أو صيغ ألواح الزراعة. حتى التغيرات الطفيفة الظاهرة في نسب مساحة السطح إلى الحجم أو حركية النمو قد تحتاج إلى تحسين للحفاظ على كفاءة التفاضل العالية. وبناء عليه، ينصح المستخدمون بإجراء تجارب تجريبية صغيرة النطاق أولا لتحديد الظروف المثلى لتمايز hPGCLC.

على الرغم من متانتها، فإن الطريقة لها قيود يجب الاعتراف بها. على الرغم من توافقها مع عدة طلاءات وكثافة، إلا أن كفاءة التمايز لا تزال حساسة للخصائص الجوهرية لتقنية hiPSC، بما في ذلك الحالة فوق الجينية وتاريخ الممر، والتي لا يمكن التحكم بها بالكامل. يبدو أن عدة منافذ hiPSC تم اختبارها غير قادرة على التمييز بين hPGCLCs²⁶. والأهم من ذلك، وعلى عكس الفيترونكتين، وهو منتج معرف بالكامل، فإن BMEx هو منتج مشتق من حيوان يخضع للتغيرات من دفعة إلى دفعة، مما قد يؤثر على قابلية التكرار. على الرغم من أن دفعات مختلفة من ماتريجيل وكالتريكس وجيلتريكس قد تم اختبارها سابقا وأسفرت عن نتائج متسقة²⁶، إلا أن هذا لا يزال مصدر قلق، ويجب النظر في بدائل محددة بالكامل ل BMEx لضمان قابلية التكرار والنقل في المستقبل. هنا، تم استخدام خطين ذكريين (XY) لخط hiPSC، لكن تم اختبار هذا البروتوكول مع كل من الخط الأنثوي (XX) والذكور (XY)²⁶. وأخيرا، بينما أسفر البروتوكول عن hPGCLCs، التي ثبت أنها متشابهة من حيث النسخ مع hPGCs ولديها القدرة على تطوير أكثر^26,34، لم يتم التطرق إلى النضج الإضافي إلى مراحل الخلايا الجرثومية اللاحقة هنا. على الرغم من إثبات قابلية التوسع في تطبيقات بأسلوب الفحص، فإن التكيف القائم على الأتمتة والتحقق بين المختبرات عبر مجموعة أوسع من خطوط hiPSC سيعزز فائدة الترجمة.

مقارنة باستراتيجيات التمايز الحالية في hPGCLC، يقدم هذا البروتوكول عدة مزايا. على عكس الأساليب المتخصصة للغاية أو المقيدة بالمصفوفات، فإنه يستوعب ركائز صيانة hiPSC الشائعة الاستخدام وصيغ ألواح الزراعة، مما يقلل من الحواجز التقنية. التركيز على تحسين الكثافة والتحكم في الجودة في المراحل المبكرة يحسن من قابلية التكرار، وهو تحد مستمر في مجال تكوين الأمشاج في المختبر .

الإطار المنهجي الموضح هنا ذو صلة خاصة بعلم السموم التناسلية، ونمذجة العقم، وعلم الأحياء التطوري. تسمح توافقها مع الصيغ القابلة للتوسع بفحص مركب متوسط إلى عالي الإنتاجية، بينما تدعم قابليته للتكرار مقارنات الدراسات المشتركة وجهود الاتحادات التعاونية. بشكل أوسع، سيكون التوحيد المنهجي لبروتوكولات تحفيز hPGCLC عبر المختبرات، مع مقارنة التوصيف ونقاط النهاية الوظيفية^18,35، ضروريا لدفع تكوين الأمشاج في المختبر نحو منصات تنبؤية ذات صلة بشرية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment for flow cytometry
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Dissolve in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment for imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment for cell counting
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Dissolve to 8% PFA in water first; and dilute to 4% (1:1) with 0.2 M phosphate buffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stock concentration of 100 µg/mL in 4 mM HCL containing 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stock concentration of 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stock concentration of 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stock concentration of 100 µg/mL in PBS
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell Supplement	Gibco	A26445-01