شاشات القضاء على الخلايا المقاومة للكيمياء على مستوى الجينوم القائم على CRISPR-Cas9

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد خلايا مقاومة كيميائية باستخدام نهج تصعيد الجرعة، يليه فحص مبني على كريسبر/كاس9 باستخدام مكتبة sgRNA مركزة تستهدف معدلات فوق جينية لتحديد منظمي مقاومة الكيمياء المكتسبة. يوفر البروتوكول أيضا عدة نقاط تحسين مصممة لنماذج الخلايا المقاومة للكيما، مما يوفر إطارا قويا للباحثين الذين يحققون في آليات المقاومة.

الملخص

تظل مقاومة العلاج الكيميائي تحديا كبيرا في علاج السرطان، مدفوعة بقدرة الخلايا السرطانية على اكتساب خصائص تكيفية، وإعادة برمجة مسارات الإشارة، وتغيير بنية الكروماتين لتجنب السمية الخلوية الناتجة عن الأدوية. نظرا لأن هذه العمليات تعتمد بشكل كبير على آليات فوق جينية تنظم تنظيم الكروماتين واللدونة النسخية، فقد برز المنظمون فوق الجينية كمساهمين رئيسيين في مقاومة العلاج الكيميائي. لدراسة مقاومة الباكليتاكسيل، أحد أكثر العوامل الكيميائية استخداما في سرطان الثدي ثلاثي السلبيات (TNBC)، استخدمنا مكتبة إخراج مركزة على الجينوم (EPIKOL)، وهي مكتبة تعتمد على CRISPR-Cas9، تهدف إلى تعطيل الجينات المشاركة في تنظيم الكروماتين بشكل منهجي. تم توليد خطوط خلايا مقاومة للكيمياء من خلال بروتوكول تصعيد الجرعة تدريجيا يلخص التكيف الدوائي السريري المناسب. ومع ذلك، تظهر هذه الخلايا المقاومة نمطا ظاهريا متعدد الأدوية (MDR)، مما يشكل تحديات كبيرة في نقل الفيروس الفعال واختيار مجموعات الخلايا المستقرة. في هذه الدراسة، نستعرض الخطوات المنهجية الرئيسية لتحقيق تحويل واختيار الفيروسات العدسية عالية الكفاءة، مما يمكن من التطبيق الناجح لشاشات EPIKOL CRISPR في نماذج TNBC المقاومة للكيماوياء. وفقا للبروتوكول المذكور، تم إجراء فحص CRISPR على خلايا TNBC المقاومة للكيماوي على مستوى الجينوم، وتم تحديد منظمات فوق جينية جديدة لمقاومة الكيماويات. يوفر هذا البروتوكول إطارا قويا لتحديد منظمات اللاجينية التي تساهم في مقاومة الباكليتاكسيل المكتسبة باستخدام نهج فقدان الوظيفة القائم على كريسبر.

المقدمة

سرطان الثدي السلبي الثلاثي (TNBC) هو نوع فرعي من سرطان الثدي يمثل 12–17٪ من جميع سرطانات الثدي¹. يتميز بضعف التعبير عن مستقبل الإستروجين (ER)، ومستقبل البروجسترون (PR)، ومستقبل عامل النمو البشري-2 (HER2)، مما يحد بشدة من توفر خيارات العلاج المستهدفة ويترك العلاج الكيميائي التقليدي كوسيلة العلاج الأساسية². تستخدم التاكسانات والأنثراسيكلينات بشكل شائع في علاج TNBC؛ ومع ذلك، عادة ما يطور المرضى مقاومة^2،3. اكتساب المقاومة الكيميائية هو عملية معقدة ومتعددة الأبعاد تشمل التكيفات الوراثية والاستيضية والنسخية والفوق جينية ^2,4. ظهرت التغيرات اللاجينية كمنظمات مركزية للمرونة الخلوية، مما يسهل إعادة البرمجة الديناميكية التي تمكن الخلايا السرطانية من تحمل السمية الناتجة عن العلاج الكيميائي⁵.

تاكسول (باكليتاكسيل) هو عضو في فئة التاكسان، التي تسبب موت الخلايا من خلال إضعاف ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ويعمل كعامل مضاد للانقسام⁶. على الرغم من أن مرضى TNBC يستجيبون في البداية لأنظمة العلاج الكيميائي بما في ذلك تاكسول، إلا أن المقاومة عادة ما تتطور^{مع مرور الوقت}. ترتبط مقاومة التاكسول المكتسبة عادة بالإفراط في التعبير عن ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC)، وتحديدا ABCB1 (MDR1، بروتين P-غليكو)، التي تتوسط تدفق الدواء من تاكسول، مما يؤدي إلى انخفاض سمية الدواء داخل الخلية⁷. نظرا لأن مجموعة واسعة من العوامل الكيميائية هي ركائز لهذه الناقلات ABC، فإن زيادة تنظيمها تحد من استخدام أدوية العلاج الكيميائي الأخرى، مما يسبب نمطا ظاهريا لمقاومة الأدوية متعددة (MDR)⁸. لقد ثبت أن تثبيط ناقلات ABC غير ناجح إلى حد كبير كاستراتيجية للتغلب على مقاومة الأدوية المتعددة في البيئات السريرية، ويرجع ذلك أساسا إلى تعبيرها الواسع وأدوارها الأساسية في نقل مجموعة واسعة من الركائز الداخلية والخارجية⁹. على الرغم من أن فيراباميل، وهو مثبط ABCB1 من الجيل الأول، أظهر فائدة سريرية محدودة أو معدومة وكان مرتبطا بسمية كبيرة في التجارب^{السريرية 10}، إلا أنه لا يزال أداة تجريبية قيمة لتعزيز كفاءة الاختيار في النماذج المختبرية لعلاج MDR.

النمط الظاهري MDR هو عملية ديناميكية وتكيفية تظهر غالبا خلال ظروف الضغط². يتم التحكم في تعبير ناقل ABC بشكل رئيسي بواسطة آليات التنظيم النسخي والفوق جيني، وليس بالأحداث الطفرية ^5,11. يبرز القيد في استهداف ناقلات ABC مباشرة الحاجة إلى تحديد المنظمين الأعلى لهذه البروتينات كنقطة ضعف خاصة بالخلايا المقاومة. لذلك، أصبح الاستجواب المنهجي للعوامل فوق الجينية استراتيجية مهمة لتحديد منظمات جديدة لمقاومة العلاج الكيميائي وتطوير علاجات مركبة تستهدف هذه الثغرات.

تتيح شاشات الإخراج الوظيفي المبنية على CRISPR-Cas9 اضطرابات غير متحيزة ومنهجية على مستوى الجينوم لدراسة تأثيرات فقدان الجينات في السرطان على مقياس الجينوم¹². ومع ذلك، توفر مكتبات كريسبر على مستوى الجينوم تمثيلا محدودا للحمض النووي الريبي الموجه الواحد (sgRNA) لكل جين، مما يقلل من الحساسية مقارنة بالمكتبات المركزة¹³. ومن المهم أن الشاشة المتينة لا تعتمد فقط على جودة الاضطرابات، بل أيضا على نموذج مناسب وبروتوكول تجريبي محسن. في هذا السياق، قد يستفيد دراسة عملية ديناميكية ومعقدة مثل مقاومة الأدوية من مكتبة مركزة تحتوي على بروتوكول مخصص¹³. في عمل سابق، أنشأنا مكتبة CRISPR-Cas9 تركز على الجينوم لاستهداف منظمات الكروماتين¹⁴. مقارنة بمكتبات كريسبر الأخرى المتاحة علنا تركز على الجينوم، تحتوي مكتبة الإكسكاوت فوق الجيني (EPIKOL) على 779 جينا، تتكون من قارئات الكروماتين، والكتاب، والممحايات، والبروتينات المرتبطة بها، وكل منها يستهدف 10 sgRNAs، مما يمكن من زيادة العمق لكل جين وتحسين متانة وقابلية التكاثر للشاشات الوظيفية المركزة على الكروماتين¹⁴. يتوفر EPIKOL في كل من نظام LentiGuide، حيث يعبر Cas9 عن متجه مختلف، وفي نظام LentiCRISPR الذي يشمل Cas9، مما يوفر مرونة حسب خط الخلية. الوصول إلى تغطية مكتبية كافية، والتي تعرف بمتوسط عدد الخلايا لكل sgRNA (مثلا 500×–1000×) أسهل ل EPIKOL مقارنة بمكتبات الجينوم بأكملها، مما يوفر ميزة أثناء دراسة خطوط الخلايا المقاومة للكيمياء بطيئة النمو.

بينما يقدم فحص كريسبر نهجا قويا لفحص آليات مقاومة الكيماو، فإن سير عمل الفحص المجمع القياسي غير مهيأ للخلايا المقاومة للكيمياء التي تحتوي على تدفق نشط للأدوية. يمكن ضخ البورومايسين، وهو مضاد حيوي انتقائي شائع الاستخدام في أنظمة كريسبر العدسية الفيروسية، من الخلايا المقاومة بواسطة ناقلات ABC، وخاصة ABCB1، مما يمنع الاختيار الناجح للخلايا المحولة^15,16. هذا القيد يمكن أن يؤدي إلى تعدد الخلايا غير المتجانس، وزيادة الضوضاء الخلفية، وفي النهاية يؤثر سلبا على جودة البيانات. لمواجهة هذا التحدي، قمنا بتحسين خطوة اختيار البيوروميسين من خلال تثبيط تدفق الأدوية المعبر عن ABC بشكل مؤقت باستخدام الفيراباميل، مما أتاح إثراء الخلايا المصابة بالرياح الريفية الجريء بفعالية. باستخدام هذه الاستراتيجية، حددنا البرومودومين وPHD Finger Containing 1 (BRPF1) كمنظم لتعبير ABCB1 ومقاومة التاكسول في TNBC¹⁷. أعاد تثبيط BRPF1، سواء وراثيا أو دوائيا، حساسية التاكسول في الخلايا المقاومة، مما يثبت فائدة هذا البروتوكول المحسن في تحديد الأهداف القابلة للتنفيذ في مقاومة الكيمياء¹⁷.

هنا، نستعرض الخطوات الرئيسية في فحص CRISPR للاختيار السلبي على نماذج مقاومة الكيماوي، مع التركيز بشكل خاص على التحديات التقنية التي غالبا ما يتم تجاهلها في معظم بروتوكولات فحص مقاومة الكيمياء أو CRISPR. يعرض البروتوكول أولا طريقة تصعيد الجرعات تدريجيا لتوليد خلايا مقاومة كيميائية، ثم يحسن ظروف توصيل واختيار الفيروسات للتغلب على تدفق الأدوية الناتج عن ناقل ABC. معا، تضمن هذه التحسينات إثراء فعال لخلايا sgRNA الموجبة خلال شاشات كريسبر، مع القضاء الفعال على الخلايا غير المحولة، مما يوفر استراتيجية قوية وفعالة للتحويل والاختيار في خلايا TNBC المقاومة للكيماوي. أخيرا، يسلط البروتوكول الضوء على أساسيات تحديد نتائج فحص كريسبر من خلال التسلسل الجيلي الجديد والتحليل المعلوماتي الحيوي.  معا، يتيح هذا البروتوكول تنفيذ منصة فحص EPIKOL بفعالية لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة للتغلب على المقاومة 17,18,19.

البروتوكول

جميع المواد والكواشف المستخدمة في هذه الدراسة موفرة في جدول المواد.

1. توليد خطوط خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية المقاومة للتاكسول

1. لتحديد حساسية الخلايا للأدوية، قم بضبط كثافة الخلايا SUM159PT الخلايا الملتصقة إلى 2 × 10³ خلايا في كل بئر في صفائح سفلى سوداء شفافة ب 96 بئرا مع خليط مغذي من Ham F12 مع 5٪ مصل أبقار جنيني (FBS)، 1٪ بنسلين-ستربتومايسين، 5 ميكروغرام/مل إنسولين، 10 ملليمولار HEPES، و1 ميكرولتر/مل هيدروكورتيزون، وحضن الخلايا لمدة 16 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
2. تحضير مخزون تاكسول مذاب في ثنائي ميثيل كبريتوكسيد (DMSO). لمعالجة الخلايا، قم بتحضير تخفيفات متسلسلة من تاكسول في وسائط الزراعة، تتراوح من 0.3 نانومول إلى 10 ميكرومولار (مثل 0.3 نانومولار، 1 نانوميلار، 3 نانومولار، 10 نانومولار، 30 نانومولار، 100 نانومولار، 300 نانومول، 1 ميكرومولار، 10 ميكرومولار)، واستخدم DMSO وحده كوسيلة تحكم للمركبات.
3. عالج الخلايا بجرعات متزايدة من تاكسول 200 ميكرولتر (تم تحضيرها في الخطوة 1.2) كثلاثي التكرار واترك اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_.
4. بعد 72 ساعة من العلاج الدوائي، قس بقاء الخلايا باستخدام اختبار قياس بقاء الخلايا القائم على التلميع (ATP) لقياس مدى بقاء الخلية. استخدم قارئ اللوحة الدقيقة لقياس التلميع وتطبيع القيم إلى ضوابط DMSO. احسب تركيز 10٪ من التركيز التثبيطي (IC10) وقيم IC50 باستخدام الانحدار غير الخطي باستخدام نموذج جرعة-استجابة لوجستي مكون من أربعة معاملات في برنامج إحصائي مناسب.
5. لبدء توليد خلايا مقاومة للكيما، قم بزرع 2 × 10^{إلى 5} SUM159PT الخلايا في كل بئر في صفائح ب 6 آبار. حضن الليلة عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_.
6. في اليوم التالي، عالج الخلايا بقيم IC10 أو IC50 من تاكسول في 2 مل من وسط الزراعة لمدة 72 ساعة كتركيزات بداية.
7. إذا كانت الخلايا تتحمل تركيز الدواء الحالي، قم بتقسيمها إلى بئرين. حافظ على بئر واحد كنظام احتياطي في وسط جديد واستبدل الوسط في البئر الثاني بوسط يحتوي على ضعف تركيز تاكسول السابق.
   ملاحظة: إذا كانت الخلايا بحاجة إلى تعافي بسبب تغيرات شكلية ناتجة عن الإجهاد مثل الإسقاط الخلوي غير الطبيعي، أو التقريب والانفصال الكبير، أو انخفاض ملحوظ في التكاثر، احتفظ بها في وسط خال من الأدوية وانتظر حتى تصبح الخلايا صحية وتلتقط. ثم كرر الخطوات بدءا من الخطوة 1.7.
8. أثناء توليد خلايا مقاومة، يمر الخلايا الأبوية باستخدام وسط يحتوي على DMSO كوسيلة تحكم. اضبط حجم DMSO ليتناسب مع كمية DMSO الموجودة في معالجة التاكسول المقابلة.
9. قس بقاء الخلايا كما في الخطوات 1.2–1.4 كل 3–4 أسابيع واستمر في هذا الإجراء حتى يتم الحصول على فرق كبير (p < 0.05 أو 10–50 مرة حسب الدواء المطبق) بين قيم IC50 لخطوط الخلايا الأبوية والمقاومة. عادة ما تستغرق عملية زيادة الجرعة من 6 إلى 9 أشهر، حسب نوع الدواء المستخدم.
10. بعد الحصول على خلايا مقاومة مستقرة، حافظ عليها في جرعة الصيانة (آخر جرعة مطبقة) من الدواء أثناء الزراعة للحفاظ على النمط الظاهري المقاوم.
    ملاحظة: توليد الخلايا المقاومة للمواد الكيميائية باستخدام طريقة تصعيد الجرعة هو عملية تستغرق وقتا طويلا، وتعتمد المدة على عدة عوامل، منها خط الخلايا، ومعدل النمو الداخلي، والعامل الكيميائي المعالج المستخدم. عادة ما يستغرق من 6 إلى 9 أشهر، حسب مستوى المقاومة السريري المناسب. نهج بديل لتحديد الفروق الدلالة في مستويات المقاومة هو تقييم الحد الأدنى من تركيز الأدوية الذي تبقى خلايا مقاومة عنده على قيد الحياة، بينما لا تبقى الخلايا الأبوية كذلك.
11. توصيف الخلايا المقاومة: إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي، وتحليل الحمض النووي الريبي، والتفاعل المتسلسل للبوليميراز الكمي (qPCR)، واختبارات بقاء الخلايا مع العلاج الدوائي (مثل اختبار تكوين المستعمرات) لتوصيف النمط الظاهري للخلايا المقاومة. تأكد من إعادة تقييم النمط الظاهري المقاوم بعد عدة مراحل لإثبات أن النمط المرتفع ل IC50 مستقر مع مرور الوقت.

2. إنتاج اللينتيفيروس

1. اليوم 0: زرع الخلايا HEK293T 4 × 10⁶ لكل طبق زراعة أنسجة 100 مم مع وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، لتحقيق 90٪ تلاقي في اليوم التالي.
2. اليوم الأول: تحضير خلطات البولي إيثيلينمين (PEI) والحمض النووي في DMEM (-/-) الخالي من المصل بشكل منفصل لكل فيروس. استخدم الجدولين 1 والجدول 2 لضبط حجم وتركيزات PEI والحمض النووي وفقا للإنتاج الفيروسي المطلوب.
   ملاحظة: يستخدم PEI أربع مرات من إجمالي ميكروغرام الحمض النووي (مثلا، في صفيحة بحجم 100 مم، استخدم 30 ميكرولتر من PEI ليصبح المجموع 7.5 ميكروغرام DNA). يتم اتباع إنتاج الفيروسات في أطباق 100 مم في هذا البروتوكول، وسيسمح الفيروس المستخرج من 5–10 أطباق بحجم 100 مم بإجراء شاشات متعددة. بالنسبة لتجارب التحقق أو العدوى الصغيرة النطاق، يكفي بئر واحد من صفيحة ذات 6 آبار أو طبق 60 مم. نظرا لأن هيدروكلوريد البولي إيثيلينامين الخطي عامل نقل سام، تأكد من أن التقاء الخلايا يكون 90٪ عند النقل.
   1. بعد الخلط جيدا، أضف خليط الحمض النووي إلى أنبوب PEI. اخلط جيدا ودع مركبات PEI-DNA تبقى لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. ثم أضف 600 ميكرولتر من مركب PEI-DNA إلى HEK293Ts، بشكل إسقاطي. ضع الألواح في حاضنة الفيروس لمدة 16 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
3. اليوم الثاني: استبدال وسط الخلايا المصابة عن طريق استنشاق PEI والوسائط المحتوية على الفيروسات وإضافة 8 مل من DMEM الكامل لكل طبق زراعة نسيج بحجم 100 مم. حضانة الخلايا للسماح بإنتاج الفيروسات.
4. اليوم الثالث: قم بأول جمع للفيروسات عن طريق إزالة 8 مل من المادة الفائقة بلطف في أنبوب طرد مركزي بحجم مناسب وتخزينها عند 4 درجات مئوية. إذا كان هناك عدة صفائح لإنتاج الفيروس، اجمع بين المواد الفائقة. ثم أضف 8 مل من DMEM الطازج الكامل إلى كل طبق وأعد الأطباق إلى حاضنة الفيروس.
5. اليوم الرابع: كرر خطوات الجمع ودمجها مع السوبرناتات من اليوم الثالث.
   1. جهز محلول بولي إيثيلين جليكول (PEG)-8000 بنسبة 50٪ (بدون ضخامة) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للحصول على محلول مخزون 5× PEG. المعقم ليذيب ويعقم.
   2. قم بالطرد المركزي بجمع المواد الفيروسية عند 300 x جرام لمدة 5 دقائق لتكوين الخلايا المتبقية، ثم الانتقال إلى الترشيح.
   3. قم بتصفية 16 مل من مادة الفائق الفيروسي باستخدام فلتر بحجم 0.45 ميكرومتر (إما بحقنة أو فلتر فراغ بسعة 50 مل) داخل الأنبوب الذي يحتوي على 4 مل من محلول PEG لتحقيق تركيز نهائي 1× PEG وإزالة الحطام والخلايا المتبقية.
   4. أغلق الأنبوب وامزج عن طريق العكس. كرر هذه الخطوة لجميع التحضيرات الفيروسية. خزن طوال الليل عند 4 درجات مئوية في الظلام، مع خيار التحريك اللطيف.
   5. في اليوم التالي، يجب أن تكون هناك ترسبات مرئية. قم بعمل الطرد المركزي للأنابيب عند 1400 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحبيبات الفيروسية المتأصلة من PEG عند 4 درجات مئوية حتى 5 أيام قبل الطرد المركزي؛ ومع ذلك، قد ينخفض عيار الفيروس مع فترة الحضانة الممتدة.
   6. بعد الطرد المركزي، تخلص من الفائق بعناية، مع ترك حجم صغير (حوالي 100 ميكرولتر) في الأنبوب لتجنب إزعاج الحبيبة.
   7. قم بعمل الطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 300 × جرام لجمع أكبر قدر ممكن من السائل من جوانب الأنبوب. ثم تخلص بعناية من السوبرناتانت المتبقي.
   8. لتركيز الفيروس 100 مرة، أضف PBS إلى 1/100 من الحجم الأولي للفائق الفيروسي إلى الحبيبة وأعد تعليق الحبيبة عن طريق التوصيل (مثلا، إذا بدأت ب 16 مل من الفائق الفيروس، أضف 120–140 ميكرولتر من PBS إلى الحبيبة للوصول إلى 160 ميكرولتر في الحجم النهائي، مع احتساب حجم الحبيبة). تجنب الرش القوي؛ التأثير على الفيروس.
      ملاحظة: العيار المتوقع بعد تركيز PEG هو >1 × 10⁸ جسيمات معدية لكل مل (ip/mL) لنظام LentiGuide و>1 × 10⁷ لنظام لينتي كريسبر. قد تكون العدادات الأقل بمقدار مرتبة واحدة مقبولة، ولكن يجب التحقق منها مقابل عدوى خط الخلايا المستهدف وحجم الفيروسات المطلوب.
   9. إذا لم يكن تركيز الفيروس مطلوبا، قم بتقسيم الفيروس لتقليل دورات التجمد والذوبان. تخزين الفيروس المركز أو غير المركز عند -80 درجة مئوية. مبيض وأطباق قمامة.
      ملاحظة: للحصول على وصف أكثر تفصيلا لإنتاج وتعامل مع فيروسات لينتيفيروس، يرجى الرجوع إلى البروتوكولات^{المعتمدة رقم 20}. للمشاكل الشائعة التي تواجهها أثناء إنتاج فيروسات العدس، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1.

	بئر واحد من صفيحة ذات 6 آبار	صفيحة 60 مم	صفيحة 100 مم	صفيحة 150 مم
حجم PEI (الحجم الأصلي 1 ملغ/مل)	6 ميكرولتر	9 ميكرولتر	30 ميكرولتر	60 ميكرولتر
DMEM (-/-)	54 ميكرولتر	100 ميكرولتر	270 ميكرولتر	540 ميكرولتر

الجدول 1: أحجام PEI وDMEM المطلوبة لأطباق مختلفة لخليط PEI.

	بئر واحد من صفيحة ذات 6 آبار	صفيحة 60 مم	صفيحة 100 مم	صفيحة 150 مم
VSV-G	75 نانوغرام	150 نانوغرام	375 نانوغرام	750 نانوغرام
غاغ-بول	675 نانوغرام	1350 نانوغرام	3375 نانوغرام	6750 نانوغرام
متجه الهدف	750 نانوغرام	1500 نانوغرام	3750 نانوغرام	7500 نانوغرام
DMEM (-/-) ضبط الصوت النهائي إلى	60 ميكرولتر	100 ميكرولتر	300 ميكرولتر	600 ميكرولتر

الجدول 2: تم المطلوب أحجام البلازميدات وDMEM لألواح مختلفة لخليط الحمض النووي.

3. تأسيس اختيار بوروميسين محسن لخلايا MDR

ملاحظة: في الخلايا المقاومة للكيمياء التي تظهر فرط في التعبير عن ABCB1، يفشل اختيار البوروميسين بسبب تدفق نشط للبورومايسين بوساطة ABCB1، مما يمنع الاختيار الفعال للخلايا المصابة ب sgRNA. لتجاوز هذا القيد، يتم إعطاء الفيراباميل مع بوروميسين لتثبيط التدفق الناتج عن ABCB1 بشكل مؤقت، مما يسمح بتراكم البيوروميسين داخل الخلايا وإزالة الخلايا غير المصابة بكفاءة.

1. تحديد تركيز الفيراباميل الذي يمنع تدفق الأدوية المعبر عن ABCB1 دون التأثير على بقاء الخلايا. لهذا، استخدم العامل الكيميائي العلاجي الذي اكتسبت له مقاومة (في هذه الحالة، تاكسول) مع زيادة جرعات الفيراباميل.
   1. بذور SUM159PT خلايا مقاومة للتاكسول وخلايا أبوية إلى صفائح سفلى سوداء شفافة ب 96 بئرا بحجم 2 × 10^خلايا في كل بئر ثلاثي النسخ. حضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
   2. عالج الخلايا بتخفيفات متسلسلة من الفيراباميل (0، 1.25، 2.5، 5، 10، 20، 40، و80 ميكرومول) مع الحفاظ على تركيز ثابت من تاكسول (مثل جرعة الصيانة) في جميع الحالات.
   3. بعد 72 ساعة من العلاج، قيم بقاء الخلايا باستخدام اختبار قياس ATP القائم على التلميع. تحديد تركيز الفيراباميل الذي لا يقلل من قابلية العيش بمفرده (≥90٪–95٪ مقارنة بالعناصر الضابطة غير المعالجة) لكنه يعيد الحساسية في الخلايا المقاومة.
2. لإيجاد تركيز البوروميسين المستخدم مع الفيراباميل، SUM159PT البذور خلايا مقاومة للتاكسول في صفيحة تضم 96 بئر بحجم 2 ×^{10 3}خلايا في كل بئر. حضن الصفيحة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
   1. تحضير تخفيفات متسلسلة من البوروميسين (0، 0.625، 1.25، 2.5، 5، 10، 20، و40 ميكروغرام/مل) في وسط يحتوي على تركيز الفيراباميل المحدد مسبقا ومعالجة الخلايا وفقا لذلك.
   2. بعد 72 ساعة، قس بقاء الخلايا باستخدام اختبار بقاء ATP قائم على اللمعان، وحدد الحد الأدنى للتركيز من البوروميسين الذي يقضي على جميع الخلايا (≤5٪) في وجود الفيراباميل. سيتم استخدام هذا التركيز للاختيار أثناء فحص كريسبر.
      ملاحظة: هذه الخطوات لتحسين تركيز الأدوية تعتمد على خط الخلية والسياق. عوامل مثل الحساسية الذاتية للأدوية، ومستويات تعبير ناقل ABC، ومعدل النمو يمكن أن تؤثر على التركيزات الفعالة. لذلك، قم بتنفيذ هذا التحسين لكل خط خلية جديد ونموذج مقاومة. (للمعلومية، يستخدم 5 ميكروغرام/مل بوروميسين مع 20 ميكرومولار فيراباميل للخلايا المقاومة للتاكسول المستخدمة في هذه الدراسة¹⁷). لحل مشكلة اختيار بوروميسين + فيراباميل، راجع الجدول التكميلي 1.

4. حساب معايرة الفيروسات وتعدد العدوى (MOI)

1. اليوم الأول: زرع SUM159PT خلايا مقاومة للتاكسول ك2 × 10⁵ في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار مع خليط كامل من مغذيات Ham's F12.
2. اليوم 0: أجر أربع عمليات تخفيف متسلسلة للفيروس في خليط مغذيات F12 من Ham يحتوي على كبريتات البروتامين (PS) عند 8 ميكروغرام/مل. (للفيروسات المركزة، ابدأ ب 1 ميكرولتر وقم بتخفيف القطرات عشرة أضعاف في كل تخفيف بمقدار 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. بالنسبة للفيروسات غير المركزة، قم بضبط الحجم وفقا لذلك (مثلا: 100 ميكرولتر > 10 ميكرولتر > 1 ميكرولتر > 0.1 ميكرولتر).
   1. أعط 1 مل من الوسائط المحتوية على الفيروس لكل من الآبار الأربعة. اترك بئرا واحدا كجهاز تحكم في اختيار البيوروميسين وآخر كجهاز تحكم غير معالج.
3. اليوم الأول: استبدل الوسائط الفيروسية ب 2 مل من الميديل الطازج بعد 16 ساعة من العدوى.
4. اليوم الثاني: نقل محتويات الخلايا في كل بئر إلى طبق زراعة خلايا بحجم 100 مم مع خليط مغذيات F12 من Ham يحتوي على بوروميسين + فيراباميل بتركيزات محددة في الخطوة 3.2. إذا كانت الخلايا غير المختارة متقاربة بشكل زائد، قم بزرع جزء محدد (مثل 1/2)، وسيتم أخذ ذلك في الاعتبار عند إجراء الحسابات النهائية.
   ملاحظة: قم بتجديد الوسائط ببوروميسين + فيراباميل طازج إذا لزم الأمر، خلال الأيام الثلاثة إلى الأربعة التالية حتى تموت جميع الخلايا في لوحة التحكم.
5. اليوم 4–5: عندما تموت الخلايا في صفيحة التحكم، حدد الألواح التي تحتوي على عدد كاف من الخلايا للعد. قم بتريبسين الخلايا، وعدها، وحدد العدد الإجمالي للخلايا.
6. بعد عد الخلايا القابلة للحياة، احسب كفاءة النقل وتعدد العدوى (MOI) كما يلي (استخدم الجدول التكميلي 2 كقالب):
   1. احسب معدل النقل (نسبة الخلايا المصابة) باستخدام الصيغة أدناه
      
      
      N_{المختار}: إجمالي عدد الخلايا بعد اختيار البوروميسين في الآبار المصابة
      N_ضابطة: إجمالي عدد الخلايا في بئر التحكم غير المحولة وغير المختارة
      p: معدل النقل (نسبة الخلايا المصابة).
      ملاحظة: إذا تم زرع جزء فقط من خلايا التحكم غير المعالجة، خذ ذلك في الاعتبار عند حساب N_Control
   2. احسب MOI. أثناء نقل الفيروسات العدسية، تتبع أحداث العدوى توزيع بواسون. لذلك، يعرف نسبة الخلايا المصابة بفيروس واحد على الأقل بأنها:
      p =1- e ^-MOI
      لذا، نحسب MOI كالتالي:
      MOI = - ln(1-p)
   3. احسب عيار العدسة الفيروسي (الجسيم المعدي/الميليتر، IP/mL) بناء على عدد الخلايا المصابة:
      العيار (IP/mL) = (MOI × N_{من البداية})/ حجم الفيروس
      _{N بداية}: عدد الخلايا التي تم زرعها للعدوى
      حجم الفيروس: حجم الفيروس المضاف لكل بئر (بالملليمتر)
      ملاحظة: احسب عيار الفيروسات العدسية لكل عدوى بشكل منفصل وحدد العيار النهائي بأخذ متوسط الآبار الذي يظهر كمية الفيروس النسبية وقيم العيار. يجب استبعاد الآبار التي تظهر تشبعا أو انحرافا عن القياس النسبي من حسابات العيار.

5. توليد و/أو التحقق من صحة خط خلوي مستقر يعبر عن Cas9

ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة عند استخدام LentiGuide_EPIKOL. إذا كان خط Cas9 المستقر مصدقا متاحا بالفعل، أو إذا تم استخدام LentiCRISPR_v2_EPIKOL، توجه مباشرة إلى القسم 6.

1. إنتاج فيروس العدسة Cas9 باستخدام ناقل LentiCas9_blast كما هو موضح في القسم 2.
2. ينفذ الخلايا في اليوم التالي، مستهدفا MOI بمقدار 10. احسب كمية الفيروس وفقا لمفهوم MOI المقصود في القسم 4، واستخدم الكمية المحسوبة من حجم الفيروس، وأعطها مباشرة إلى الخلايا في اللوحة التي تحتوي على وسط زراعة يحتوي على 8 ميكروغرام/مل كبريتات البروتامين (PS).
3. استبدل الوسط الفيروسي بالوسط الطازج بعد 16 ساعة من العدوى
4. في اليوم التالي، يتم تطبيق اختيار البلاستيسيدين بإعطاء الخلايا وسط الزراعة الذي يحتوي على التركيز المحدد مسبقا من البلاستيسيدين (التركيز النهائي يحدد لكل خط خلوي مع اختبار قابلية الخلية كما هو موضح في القسم 3) حتى يتم القضاء على الخلايا غير المصابة (عادة 6–7 أيام).
   ملاحظة: إذا تم زراعة الخلايا المعبرة عن Cas9 لفترات طويلة قبل الفحص، كرر اختيار البلاستيسيدين للقضاء على الخلايا السلبية ل Cas9.
5. التحقق من صحة Cas9 (موصى به): التحقق من نشاط Cas9 باستخدام sgRNA الضابط الذي يستهدف الجينات الأساسية (تتوفر تسلسلات sgRNA في مكتبة EPIKOL؛ انظر الجدول التكميلي 3) أو أنظمة الإبلاغ مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتقييم كفاءة الإقصاء والحركية. يمكن العثور على طرق تحقق مفصلة في دراسة سابقة¹⁹.

6. عدوى وفحص مكتبة فيروس لينتيفيروسات على مستوى الجينوم على مستوى الجينوم

ملاحظة: لضمان تحديد دقيق من النمط الجيني إلى النمط الظاهري، تتطلب شاشات CRISPR المجمعة عدوى منخفضة MOI وتغطية مكتبية كافية (عادة 500×–1000)، وذلك حسب صرامة التجارب وسلوك خطوط الخلايا. للمبادئ العامة لسير عمل فحص كريسبر المجمع على مستوى الجينوم، بما في ذلك تصميم المكتبة وإعداد التجارب، انظر البروتوكولات المنشورة^{سابقا 21,22}. بالنسبة لEPIKOL، ينصح بشدة بالحفاظ على تغطية >500x في جميع أنحاء الشاشة، حيث أن الانخفاض تحت هذا الحد يزيد من خطر فقدان sgRNA العشوائي، خاصة في قسم علاج المخدرات من الشاشة. الحسابات التالية مطلوبة لتحديد عدد الخلايا الابتدائي، وكفاءة التحويل، وحجم الفيروس اللازم لتحويل EPIKOL لأداء عدوى منخفضة المدى دون التأثير على تعقيد المكتبة.

1. اليوم -1: زرع كمية الخلايا المحسوبة أدناه في أطباق زراعة الخلايا بحجم 100 مم أو 150 مم مع عدد مناسب من الخلايا لكل طبق.
   1. احسب عدد الخلايا المصابة بنجاح للوصول إلى التغطية المطلوبة للمكتبة (استخدم الجدول التكميلي 2 كقالب):
      N_مصاب = (عدد sgRNAs) × (تغطية الهدف)
   2. احسب عدد الخلايا الابتدائي لكل نسخة لتعويض نسبة الخلايا غير المصابة عند انخفاض MOI (0.3–0.4):
      N_يبدأ = N_مصاب/p
      حيث p هو معدل النقل (نسبة الخلايا المصابة) الذي يحدد بناء على توزيع بواسون (انظر الخطوة 4.6).
      ملاحظة: يضمن هذا التعديل وجود عدد كاف من الخلايا المصابة ب sgRNA في المجموعة عند الإصابة منخفضة MOI للوصول إلى التغطية المكتبية المطلوبة.
2. اليوم 0 - التحويل
   1. حساب حجم الفيروس المطلوب لكل نسخة مكررة
      حجم الفيروس المطلوب = (N_يبدأ × MOI) / (عيار الفيروس (تم تحديده سابقا ip/mL))
      ملاحظة: كفاءة التحويل عند نطاق MOI المستهدف من 0.3–0.4 تتوافق تقريبا مع
      26٪–33٪ خلايا مقاومة للبورومايسين قبل الاختيار.
   2. أصيب الخلايا بالحجم الفيروسي المحسوب في وسط الزراعة الكامل الذي يحتوي على 8 ميكروغرام/مل من كبريتات البروتامين (PS). تقليل حجم الوسائط لزيادة الاتصال بين خلايا الفيروس أثناء العدوى (مثلا، 8 مل بدلا من 10 مل للوحة بحجم 100 مم)
   3. حضر خلطات عدوى مستقلة لكل نسخة بيولوجية.
      ملاحظة: يوصى باستخدام نسختين بيولوجيتين على الأقل؛ يفضل ثلاثة منها. يجب تحويل النسخ البيولوجية واختيارها وصيانتها بشكل منفصل (بما في ذلك تغييرات الوسائط والمرور) ولا ينبغي تجميعها في أي مرحلة قبل التسلسل.
3. اليوم الأول - استبدال الوسائط الفيروسية بوسائط جديدة بعد 16 ساعة واحتضان الوسط عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2
4. اليوم الثاني - اختيار الخلايا المحولة: تطبيق اختيار البوروميسين في وجود الفيراباميل (التركيزات المحددة في الخطوة 3.2) لإثراء الخلايا المصابة بالsgRNA في SUM159PT الخلايا المقاومة للتاكسول. استمر في الانتقاء حتى يتم القضاء على جميع الخلايا في صفيحة التحكم غير المصابة (عادة ~3 أيام).
5. اليوم 5 - أخذ عينات مرجعية من T₀ : بعد الانتهاء من اختيار البوروميسين + الفيراباميل، قم بتريبسين الخلايا وجمع حبيبات خلية بنقطة زمنية أولية بوقت صفر (T₀) من كل نسخة بيولوجية تتوافق مع مستوى التغطية المحددة أثناء التحويل. وبما أنه سيعمل كمرجع لتوزيع المكتبة الأولي، اجمع حبيبات الخلايا بمجرد الانتهاء من الاختيار، قبل حدوث أي فقدان للخلية. قم بالحصول على أرقام كافية من الهواتف للحفاظ على التغطية في جميع الأوقات.
   ملاحظة: بعد اختيار بوروميسين + فيراباميل، يختلف عدد الخلايا المحولة الباقية حسب وقت مضاعفة خط الخلية وكفاءة النقل المحققة. عادة ما يتعافى السكان الباقون إلى كثافة البذر الأولية عند اكتمال الانتقاء وقد يتجاوزها في خطوط الخلايا أسرع نموا. إذا سمح عدد الخلايا المتبقي، اجمع عدة حبيبات T₀ وجمد عينات احتياطية عند -80 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن حفظ الخلايا المصابة بالإيبيكول بالتبريد في النيتروجين السائل مع الحفاظ على التغطية. يمكن إذابة هذه المخزونات الاحتياطية في حال حدوث فشل شاشة غير متوقع أو لإجراء أساليب تجريبية بديلة مستقبلية (مثل اختبار علاجات دوائية إضافية). تحقق من كفاءة التحويل باستخدام لوحة تحكم غير مصابة للتأكد من تحقيق كفاءة النقل المقصودة (انظر القسم 4). إذا كانت كفاءة النقل المرصودة أعلى من المتوقع، أعد بدء التجربة لضمان أن التحويل يتم عند MOI منخفض، مما يمنع تكامل متعدد sgRNA لكل خلية.
6. تنفيذ الشاشة: بعد السماح بإكمال تحرير الجينوم بوساطة Cas9، ولمدة المحددة في القسم 5، قسم الخلايا إلى مجموعات علاج.
   ملاحظة: عادة ما يستغرق ذلك 7–9 أيام بعد التحويل، حيث يتم الوصول إلى أقصى كفاءة إلغاء الإغلاق تقريبا في اليوم 7 بعد التحويل^. بالنسبة للأهداف اللاجينية، تسمح نافذة 9 أيام أيضا بحدوث تغييرات على مستوى الكروماتين قبل بدء اختيار الدواء.
   1. تقسيم الخلايا إلى أذرع تجريبية مع الحفاظ على التغطية: أحدهما هو ذراع التحكم الذي يتلقى حالة أساسية تتلقى DMSO، والآخر هو ذراع العلاج الذي يتلقى الحالة التي تستقبل تاكسول.
   2. الحفاظ على الثقافات لتعدد عدد السكان من 14 إلى 16 سنة. يتم حساب مستوى مضاعفة السكان (PDL) كالتالي:
      PDL = PDL_s + 3.322 (log C_f – log C_i)
      PDL_s = مستوى مضاعفة السكان الابتدائي
      C_i = عدد الخلية الابتدائي المتلقى
      C_f = إجمالي عدد الخلايا في نهاية فترة النمو
   3. في كل مقطع، راقب فعالية الحياة وحركة النمو وتجنب عنق الاختناق من خلال الحفاظ على أعداد الخلايا الكافية. اضبط شدة العلاج إذا حدث موت خلاوي مفرط.
      ملاحظة: اهدف لجمع حبيبات الخلايا الاحتياطية في كل مقطع، أسبوعيا أو في بعض PDLs أثناء الشاشة. قد تعمل هذه العينات الاحتياطية كنقاط زمنية بديلة للتسلسل أو كعينات تحسين لعملية استخراج الحمض النووي الجينومية. يحافظ على الخلايا بالتبريد بشكل دوري لتجنب فقدان الخلايا غير المتوقع.
7. أخذ عينات_نهائية T: عند الوصول إلى PDL المطلوب، اجمع حبيبات النقطة الزمنية النهائية (T_{النهائية}) لكل نسخة وحالة من خلال الحفاظ على تغطية المكتبة لكل حبيبة. تخزين الحبيبات عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي في المرحلة النهائية.
   ملاحظة: حاول إنهاء الشاشة عند نقاط PDL مماثلة بين الأذرع، حتى لو اختلفت مدة الزراعة بين الظروف.

7. استخراج الحمض النووي الجيني

1. استخلاص الحمض النووي الجيني (gDNA) باستخدام طريقة موثقة (مثل مجموعة نسيج نيوكليوسبين MN)، مع تعديلات بسيطة في البروتوكول لتحسين كفاءة التحلل من الحبيبات الخلوية الكبيرة المجمعة.
   1. اتبع بروتوكول الأنسجة بدلا من بروتوكول الخلية بسبب حجم الحبيبات الكبير. فكر في زيادة حجم الكواشف واستخدام عدة أعمدة دوران لكل حبيبة خلية (لا تتجاوز 5 × 10 أو⁶ خلايا لكل عمود) إذا لزم الأمر لضمان تحلل فعال.
      ملاحظة: قبل التحلل، يمكن أن يعيد تعليق الحبيبة بكمية قليلة من PBS (~50 ميكرولتر) إلى تحسين كفاءة التحلل. قد يؤدي التحلل غير الكامل للحبيبة إلى انسداد عمود الدوران، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الحمض النووي.
   2. اتبع توصيات الإزالة عالية العائد والتركيز. الحمض النووي المائل في حجم منخفض من مخزن التسيح (حوالي ثلثي الحجم الموصى به) لكل عمود، خصوصا إذا تم تقسيم كريات الخلايا إلى عدة أعمدة.
2. قس جودة وكمية gDNA (مثل Nanodrop).

8. تحضير مكتبة تسلسل EPIKOL من الحمض النووي الجينومي

1. استخدم خزانة PCR مخصصة لأداء جميع خطوات PCR في المكتبة لمنع تلوث البلازميدات أثناء اختبارات gDNA، حيث أن قوالب البلازميد تضخم بشكل أكثر كفاءة من الحمض النووي الجينومي ويمكن أن تشوه توزيع sgRNA.
   1. نظف مساحة العمل، والميكروبايبت، والرفوف ب 10٪ مبيض و70٪ إيثانول على التوالي.
   2. أليكوت جميع الكواشف (وخاصة البرايمرز) في أحجام للاستخدام مرة واحدة قبل الاستخدام لتقليل خطر التلوث المتبادل ودورات التجمد والذوبان.
   3. خزن المواد الكيميائية عند -20 درجة مئوية واحتفظ بها في الثلاجة أثناء إعداد PCR.
2. تحسين حجم إدخال gDNA الابتدائي من خلال استهداف تغطية 200×–500× لكل sgRNA للحفاظ على تعقيد المكتبة المناسب. مثال: بالنسبة لمكتبة EPIKOL، يفضل استخراج gDNA من حبيبات خلوية جمعت بتغطية 1000×، وتستخدم التغطية النهائية 250× لتضخيم gDNA.
   1. احسب المدخلات المطلوبة ل gDNA للتغطية المرغوبة كما يلي.
      كمية gDNA = (عدد sgRNAs) × تغطية × (66pg DNA/نواة)
      مثال: يجب تضخيم 8000 gRNA × (250× تغطية) × (6.6 pg DNA/نواة) = 13.2 ميكروغرام gDNA/عينة.
   2. إجراء اختبار PCR باستخدام ظروف تفاعل PCR الخارجية والداخلية في الجدول 3، الجدول 4، الجدول 5، والجدول 6 مع زيادة كميات gDNA لكل تفاعل (مثل 1 ميكروغرام، 3 ميكروغرام، 6 ميكروغرام) لتحديد الكمية المثلى للحمض النووي لكل أنبوب.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي إدخال غير كاف ل gDNA أو تكرار PCR المفرط إلى تحيز التضخيم وتشويه تغطية sgRNA.
   3. شغل جل أغاروز بنسبة 2٪ لتحليل منتجات PCR الداخلية. تأكد من ملاحظة شريط ساطع عند حوالي 350 نقطة أساس حركة.
   4. استنادا إلى الكمية المثلى من gDNA لكل أنبوب، حدد العدد الإجمالي لتفاعلات PCR المطلوبة لكل عينة لتحقيق التغطية المكتبية المطلوبة مع تجنب الكميات الزائدة من gDNA لكل تفاعل فردي.
      ملاحظة: إذا كان مطلوبا 13.2 ميكروغرام من إجمالي gDNA و3.3 ميكروغرام من gDNA لكل تفاعل يؤدي إلى تضخيم مثالي، حضر أربع تفاعلات PCR متوازية بحجم 3.3 ميكروغرام من gDNA في حجم تفاعل 100 ميكرولتر. في هذا السياق، يجب ألا يتجاوز حجم gDNA 10٪ من حجم التفاعل لتجنب تثبيط PCR الناتج عن إدخال القوالب بشكل مفرط.
3. تضخيم أشرطة sgRNA من قالب gDNA (PCR أول/خارجي)
   1. تضخيم المناطق الجينومية التي تحتوي على شريط sgRNA المدمج بشكل مستقر باستخدام البادئات المدرجة في الجدول التكميلي 2. قم بإجراء تفاعلات PCR باستخدام كمية الحمض النووي الكربوني المحددة في الخطوة 8.2 (انظر الجدول 3) باستخدام ظروف تفاعل PCR في الجدول 4. جهز أنبوب تحكم PCR بدون نموذج DNA لفحص التلوث المحتمل، واحتفظ بالأنابيب على التجميد طوال الوقت.
   2. أضف البوليميراز DNA أخيرا، وامزج جيدا عن طريق النقر أو التقطيع، ثم قم بتدوير أنابيب PCR لفترة قصيرة قبل وضعها في جهاز الدورة الحرارية. قم بتشغيل التسخين لمنع التضخيم غير المحدد.
   3. عند الانتهاء من PCR الخارجي، قم بتجميع جميع تفاعلات PCR في أنبوب واحد من الطرد المركزي الدقيق. تنظيف PCR أو تصوير الجل بعد PCR غير مطلوب. استخدم منتج PCR المجمع مباشرة كقالب في النسخة الثانية (الداخلية). تخزين منتجات PCR عند -20 درجة مئوية.

المادة الكيميائية	الحجم لكل تفاعل
dNTP (10 مللي ميلار لكل منهما)	2 ميكرولتر
بوليميراز الفوزن	1 ميكرولتر
مخزن GC بطول 6 أقدام	20 ميكرولتر
برايمر أمامي (10 ميكرومتر)	5 ميكرولتر
الأساس العكسي (10 ميكرومتر)	5 ميكرولتر
gDNA	X μL
مياه خالية من النوكلياز	حتى 100 ميكرولتر (67–X ميكرولتر)
المجموع	100 ميكرولتر

الجدول 3: المواد الكيميائية المطلوبة لجهاز PCR الأول/الخارجي.

رقم الدورة	ديناتور	التلدين	الامتداد
1	95 درجة مئوية، 3 دقائق
2–19	95 درجة مئوية، 25 ثانية	65 درجة مئوية، 20 ثانية	72 درجة مئوية 15 ثانية
20			72 درجة مئوية 3 دقائق

الجدول 4: شروط PCR للجهاز الأول/الخارجي.

4. قم بترميز الفهرس (PCR ثاني/داخلي) واستخراج الجل
   1. خلال الفحص الثاني (الداخلي)، يستخدم مؤشر الأساس العكسي لترميز العينات؛ لذلك، استخدم بادئات مؤشر مختلفة لكل عينة.
      ملاحظة: بالنسبة للمكتبات التي يتم إنشاؤها باستخدام عمود pLentiCrispr v2 ، استخدم بادئات مؤشر عكسي تنتهي بقواعد CT، معنونة ب lenticrisprv2_rev(index X) (انظر الجدول التكميلي 2).
   2. بالنسبة للمكتبات التي يتم إنشاؤها باستخدام العمود الفقري pLentiGuide ، استخدم فهارس تنتهي بقواعد GT وتم تصنيفها ك rev_index_X في الجدول التكميلي 2.
   3. تحضير خليط برايمر متدرج أمامي عن طريق دمج 2 ميكرولتر من كل من التسع بادئات متدرجة (مخزون 100 ميكرومول) وإضافة 162 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى أنبوب ميكرو طرد مركزي معقم. التركيز النهائي لخليط البرايمر سيكون 10 ميكرومول.
   4. استخدم منتج PCR الخارجي المجمع كمدخل ونفذ تفاعلين داخليين متوازيين بسعة 100 ميكرولتر لكل عينة باستخدام التعليمات في الجدول 5 والجدول 6. جهز تفاعل تحكم PCR باستخدام التحكم 'بدون قالب DNA' من PCR الخارجي (الخطوة 7.3) كمدخل لمراقبة التلوث المحتمل.
   5. أضيف البوليميراز DNA أخيرا، وامزج جيدا عن طريق النقر أو التقطيع، ثم قم بتدوير أنابيب PCR لفترة وجيزة قبل وضعها في جهاز الدورة الحرارية. قم بتشغيل البدء الساخن لمنع التضخيم غير المحدد.
   6. اجمع ونفذ تفاعلات PCR الداخلية في جل أغاروز 2٪ لفصل الأمبليكون المستهدف.
      ملاحظة: لا ينبغي اكتشاف أي نطاقات في ضوابط PCR بدون قالب. يجب ملاحظة نطاق مميز حوالي 337 نقطة أساس لكل LentiCrispr_V2 و357 نقطة أساس لمكتبات LentiGuide. قد يكون هناك أيضا نطاق غير محدد علوي يقارب 500 وحدة حرارية ويجب استبعاده من المعالجة اللاحقة.
   7. تحميل 12 ميكرولتر (10 ميكرولتر من منتج PCR + 2 ميكرولتر من صبغة التحميل) من منتج PCR الداخلي لرؤية النطاقات، وتحميل بقية منتج PCR في آبار مدمجة أو مجاورة مخصصة لاستخراج الهلام. تقليل سمك الأغاروز لتعظيم استعادة الحمض النووي. تجنب تعريض ممرات استخراج الجل بشكل مفرط أثناء التصوير لتقليل تلف الحمض النووي الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية أثناء الاستئصال بالجل.
   8. منتجات Purify PCR من جل الأغاروز باستخدام مجموعة استخراج هلام محددة (مثل NucleoSpin Gel وPCR Clean-up) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس طياف. تخزين منتجات PCR عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتطلب التسلسل الصحيح تركيزا لا يقل عن >20 نانوغرام/ميكرولتر بعد استخراج الهلام. إذا لم يتم تحقيق العائد المطلوب حتى مع ثلاث تفاعلات PCR داخلية متوازية، اعزل الحمض النووي الجديد وكرر العملية.

المادة الكيميائية	الحجم لكل تفاعل
dNTP (10 مللي ميلار لكل منهما)	2 ميكرولتر
بوليميراز الفوزن	1 ميكرولتر
مخزن GC بطول 6 أقدام	20 ميكرولتر
برايمر خليط التدرج الأمامي (10 ميكرومتر)	5 ميكرولتر
بادئية ذات مؤشر عكسي (10 ميكرومتر)	5 ميكرولتر
PCR خارجي	5 ميكرولتر
مياه خالية من النوكلياز	62 ميكرولتر
المجموع	100 ميكرولتر

الجدول 5: المواد المطلوبة للاختبار الثاني/الداخلي للاختبار PCR.

رقم الدورة	ديناتور	التلدين	الامتداد
1	95 درجة مئوية، 3 دقائق
2–25	95 درجة مئوية، 25 ثانية	65 درجة مئوية، 20 ثانية	72 درجة مئوية 15 ثانية
26			72 درجة مئوية 3 دقائق

الجدول 6: شروط PCR للجهاز الثاني/الداخلي.

9. التسلسل

1. حدد العدد المطلوب من القراءات المخصصة بناء على تغطية المكتبة المحددة في بداية الشاشة. بافتراض كفاءة التعيين بين 60٪–70٪، اطلب عددا أكبر من القراءات الكلية لتعويض فقدان القراءة. لتغطية مكتبة EPIKOL بحجم 1000×، يلزم ~8 ملايين قراءة مجمعة، ما يعادل 10–12 مليون قراءة إجمالية.
2. قم بإجراء مراقبة جودة لمكتبات التسلسل باستخدام Tapestation أو Bioanalyzer قبل التسلسل لتأكيد حجم المكتبة وسلامتها.
3. تجمع مكتبات التسلسل من عينات مختلفة قبل التسلسل، لأنها مشفرة بشكل فريد مع بادئات فهرس.
4. تأكد من هيكل القراءة (اتجاه R1/R2) ومتطلبات التفكيك مع مرفق التسلسل. 2× يقترح تسلسل أزواج 150 بيتابلو في Illumina HiSeq أو Novaseq أو منصة تسلسل متوافقة مع Illumina. فكر في طلب زيادة PhiX بنسبة لا تقل عن 5٪ لتحسين تنوع التسلسل.

10. نظرة عامة على تحليل التسلسل لجهاز EPIKOL

1. استخدم خط أنابيب تحليل MAGeCK لتحليل ملفات FASTQ ذات الطرف المزدوج²⁴. نظم كل نسخة بيولوجية كملف إدخال فردي.
2. استخدم ملف إدخال sgRNA الخاص ب EPIKOL المتوافق مع MAGeCK كمكتبة مرجعية (موفرة في الجدول التكميلي 4) وطبق دالة العد لقياس قراءات sgRNA من ملفات FASTQ الفردية لإنشاء ملفات عد خام لكل نسخة وشرط.
   1. تطبيع كل ملف عد باستخدام تطبيع Reads per مليون (RPM) لفحص جودة وتوزيع كل عينة من خلال عرض رسوم sgRNA الموحدة¹⁴.
3. قم بتنفيذ دالة عد ثانية لدمج الأعداد في ملف واحد باستخدام التطبيع الوسيط مع الإعدادات الافتراضية.
4. شغل وظيفة اختبار - لتحديد التغيرات على مستوى الجينات باستخدام ملفات عدد خام مدمجة. لتقييم أداء الشاشة، قارن عينات_{T النهائية} مع عينات T₀ وتحقق من توزيع sgRNA الضابط غير المستهدف والجينات الأساسية التي تستهدف الجينات.
   ملاحظة: من الضروري تقييم استنزاف جينات التحكم الإيجابية في كل ذراع شاشة لتقييم أداء الشاشة. من المتوقع أن يلاحظ تباين بيولوجي بين النسخ في ذراع الشاشة المعالجة بالمخدرات، حيث يمكن أن يسبب التعرض للدواء اختلافات عشوائية في الاستجابة الخلوية. هذا التفاوت موجود في شاشات مقاومة الكيمياء ولا يعني بالضرورة أن تكون جودة الشاشة ضعيفة. لذلك، أثناء استدعاء الضربات، يجب تحليل ثلاث تكرارات بيولوجية على الأقل معا، ويجب تحديد الضربات كجينات تحتوي على 6 على الأقل من ال 10 sgRNA فعالة.
5. لتحديد التغيرات الناتجة عن الأدوية في وفرة sgRNA وتأثيرات على مستوى الجينات، قارن عينات معالجة بالتستوستيرون_{النهائي} مع T_{نهائي-DMSO}، باستخدام مجموعة DMSO كضابطة.
6. تطبيق حد معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) ل< FDR 0.05 لتحديد الجينات المستنزفة في مجموعة العلاج لكشف الجينات التي تساهم في لياقة أو مقاومة الخلايا المقاومة للتاكسول.

النتائج

لدراسة المنظمات اللاجينية للمقاومة الكيميائية في TNBC، يظهر البروتوكول العام باستخدام خط الخلية SUM159PT في الشكل 1. أولا، تم تحديد قيم IC₁₀ وIC₅₀ للتاكسول في SUM159PT الخلايا من خلال معالجة الخلايا التي تحتوي على تركيزات متزايدة من تاكسول (الشكل 2A). تم استخدام طريقة تصعيد الجرعة خطوة بخطوة لتوليد خلايا SUM159PT مقاومة للتاكسول. بعد عدة أشهر، يوضح تغير في قيم IC50 نجاحا في تأسيس نمط ظاهري مقاوم باستخدام هذا البروتوكول مقارنة بخلايا التحكم التي تم تمريرها على التوازي دون التعرض للتاكسول (الشكل 2B).

الشكل 1: مخطط شاشة EPIKOL في خلايا SUM159PT مقاومة للتاكسول. سير العمل العام لفحص EPIKOL في خلايا SUM159PT المقاومة للتاكسول الناتجة. تم إنشاء الشكل باستخدام BioRender.com يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بمجرد تأسيس الخلايا المقاومة، أجريت عدة تجارب لتوصيف التغيرات الظاهرية والجزيئية لديها. تم تقييم قدرات تكاثر الخلايا المقاومة تحت علاج تاكسول باستخدام اختبار تكوين المستعمرة مقارنة بالخلايا الأبوية. كما هو موضح في الشكل 2C,D، تحافظ الخلايا المقاومة على قدرتها على التكاثر تحت علاج التاكسول بينما لا تستطيع الخلايا الأبوية البقاء. يعد هذا الاختبار أحد الخطوات المهمة في توصيف الخلايا المقاومة ويظهر كيف يمكن تقييم القدرة على التكاثر تحت العلاج الدوائي بين الخلايا الأبوية والخلايا المقاومة.

كجزء من توصيف الخلايا المقاومة، تم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي على الخلايا الأبوية والمقاومة لتحليل التغيرات الترانسكريبتومية المرتبطة بمقاومة الكيمياء (الشكل 2E). من بين أكثر الجينات التي تم تنظيمها في الخلايا المقاومة كان ABCB1، وتبعه عدد من ناقلات ABC الأخرى، بما في ذلك ABCB4 وABCA5. تم التحقق من زيادة تنظيم تعبير ABCB1 بواسطة تفاعل بوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، وهذا يوضح كيف يمكن التحقق من تغيرات تعبير الجين المرشح باستخدام qPCR (الشكل 2F).

الشكل 2: توليد الخلايا المقاومة وتوصيفها. (أ) مخطط يوضح توليد خلايا SUM159PT مقاومة للتاكسول باستخدام طريقة تصعيد الجرعة. (ب) منحنى استجابة الجرعة الذي يوضح الفرق بين قيم IC50 للخلايا الأبوية والخلايا المقاومة الناتجة. IC50 الوالدي = 6 نانوميل وIC50 المقاوم للتاكسول = 355.4 نانومل. (ج) اختبار تكوين المستعمرة في وجود تاكسول. (د) قياس مناطق المستعمرة في (ج) تم تطبيق تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) باستخدام اختبار توكي اللاحق باستخدام بريزم 8 (برنامج GraphPad). تم تحديد مستويات الدلالة ك *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001. (ه) مخططات بركانية تظهر جينات معبرة بشكل مختلف في خلايا تاكسول-ريس مقارنة بالخلايا الأبوية، مع حد LFC>2 وp<0.001. (F) التحقق من qPCR لتعبير mRNA ل ABCB1 في خلايا الوالدين وخلايا Taxol-Res. قيم P التي يحددها اختبار t للطالب ذو الذيلين مقارنة بمجموعة التحكم؛ **P < 0.01. تم إنشاء اللوحة أ باستخدام BioRender.com. تم تعديل شكل اللوحة E بإذن من يديير-بايرام ^{وآخرون.} يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بعد إظهار فرط في التعبير عن ABCB1 وغيره من ناقلات ABC في الخلايا المقاومة للتاكسول والنظر في طيف الركيزة الواسع ل ABCB1، تم تقييم وجود النمط الظاهري MDR. لهذا الغرض، تم علاج الخلايا المقاومة للتاكسول بعدة أدوية معروفة بأنها ركائز لناقل ABCB1 ولها آليات عمل مختلفة، وتم تقييم حساسيتها للأدوية (الشكل 3A,B). تماشيا مع ملف تعبير ناقل ABC المرصود، أظهرت الخلايا المقاومة للتاكسول أيضا مقاومة لدوكسوروبيسين وفينكريستين، مما أكد وجود ملف MDR وموضح كيف يمكن تقييم النمط الوظيفي لمقاومة الأدوية المتعددة.

النمط الظاهري MDR يمثل تحديا لنهج الفحص القائم على كريسبر، EPIKOL، نظرا لأن المكتبة تتطلب اختيار بوروميسين لإثراء الخلايا المحولة. نظرا لأن البوروميسين يمكن ضخه من الخلايا بواسطة تدفق دواء ABCB1، فقد لا يكون اختيار البوروميسين فعالا في الخلايا المقاومة (الشكل 3C). لذا، يمكن للخلايا غير المحولة أن تنجو من الانتقاء، مما يربك نتائج الشاشة.

لمعالجة هذا القيد، تم تحسين عملية اختيار الخلايا المقاومة للكيمياء ذات ملف MDR قبل فحص EPIKOL. تم استخدام فيراباميل، وهو مثبط ABCB1 من الجيل الأول، لمنع تدفق الأدوية الذي يعبر عنه ناقل ABC، مما يسمح بتراكم العوامل الكيميائية أو البوروميسين داخل الخلايا (الشكل 3D). بينما لم يؤثر الفيراباميل وحده على بقاء الخلايا، إلا أنه أعاد حساسية الأدوية عند دمجه مع العوامل الكيميائية (الشكل 3E,F). وبالمثل، أظهرت منحنيات القتل للبورومايسين مع جرعات غير سامة من الفيراباميل أن تثبيط ABCB1 يعيد حساسية البوروميسين (الشكل 3G,H). هذا يضمن أن الخلايا التي تبقى من الانتقاء هي التي تم تحويلها بنجاح، وليس الخلايا التي تهرب من الانتقاء بسبب تأثير دواء مدفوع ب ABCB1. إن إنشاء سير عمل فعال للاختيار في الخلايا المقاومة للكيمياء أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج موثوقة لفحص EPIKOL.

الشكل 3: النمط الظاهري لمقاومة الأدوية المتعددة وتأثير الفيراباميل على الخلايا المقاومة. منحنيات استجابة الجرعة تظهر الفرق بين قيم IC50 للخلايا الأبوية والخلايا المقاومة الناتجة باستخدام (أ) دوكسوروبسين، (ب) فينكريستين، (ج) بورومايسين. (د) مخطط يوضح اختيار خلايا SUM159PT مقاومة للتاكسول مع وبدون فيراباميل. تم إنشاء التمثال باستخدام BioRender.com. (ه) اختبار بقاء الخلايا باستخدام خلايا تاكسول-ريس لتحديد التركيز الأمثل للفيراباميل باستخدام تاكسول. (F) يعيد فيراباميل تحسيس الخلايا المقاومة للتاكسول تجاه التاكسول. (G) لا يغير فيراباميل استجابة خلايا الوالدين للبورومايسين. (H) فيراباميل يعيد حساسية البوروميسين في خلايا تاكسول-ريس. تم إعادة استخدام اللوحات A وB وF بإذن من يديير-بايرام وآخرون ¹⁷. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

للعثور على منظمات جديدة للمقاومة الكيميائية في TNBC، تم إجراء فحص EPIKOL باستخدام خلايا SUM159PT مقاومة للتاكسول كما هو موضح في الشكل 4A. نظرا لأن الخلايا المقاومة تنمو أبطأ من الخلايا الأبوية¹⁷، فقد تم مراقبة مستويات تضاعف السكان طوال فترة الفحص في كل من المجموعات المعالجة بالتاكسول وDMSO لتحديد الوقت اللازم للوصول إلى 16 تضاعف سكاني (الشكل 4B). وبناء عليه، اكتمل فحص EPIKOL للمجموعة المعالجة ب DMSO تقريبا في اليوم 35، بينما تم تربية المجموعة المعالجة بالتاكسول لمدة 15 يوما إضافية للوصول إلى نفس مستوى تضاعف السكان.

بعد التسلسل، تم استخدام خط تحليل MAGeCK لدمج تأثير sgRNA التي تستهدف نفس الجين لكشف التغيرات على مستوى الجين عند القضاء^{على الجين 24}. تتضمن مكتبة EPIKOL الحمض النووي الريبي الريبي sgRNA التي تستهدف الجينات الأساسية كعوامل تحكم إيجابية، وكانت الخطوة الأولى لمراقبة الجودة هي تقييم ما إذا كانت هذه ال sgRNA قد استنفدت كما هو متوقع. توضح مخططات الشلال تغيرات طية Log2 للجينات الأساسية عبر مقارنات مختلفة (الشكل 4C–E). عند مقارنة العينات النهائية من الحالات المعالجة ب DMSO أو Taxol مع النقطة الزمنية الأولية، تم استنزاف جميع الجينات الأساسية تقريبا عند الإقصاء، مما يدل على أداء فعال في الشاشة (الشكل 4C,D). ومع ذلك، لم يلاحظ هذا الاستنفاد بوضوح عند مقارنة العينتين من نقطة النهاية (المعالجتين ب DMSO والمعالجتين بالتاكسول) مع بعضهما البعض، كما هو متوقع، لأن الجينات الأساسية مطلوبة لبقاء الخلية في كلا الحالتين (الشكل 4E).

تصور بديل لنتائج الشاشة هو مخطط البركان، الذي يعرض تغيرات طية Log2 مع الدلالة الإحصائية (قيم p أو FDR). في فحص EPIKOL الذي أجري في الخلايا المقاومة للتاكسول، تم تحديد عدة جينات ضابطة إيجابية على أنها مستنزفة بشكل كبير، مما يدعم موثوقية الفحص لأن استنزاف sgRNA التي تستهدف جينات التحكم الإيجابية يوضح رقابة جودة نموذجية لفحص ناجح (الشكل 4F). بالإضافة إلى ضوابط جينية أساسية، تتضمن مكتبة EPIKOL رنا sgRNA إيجابية للتحكم بسياق محددة تستهدف عدة جينات ناقلة ABC. كما هو متوقع، أبرزت أعداد الحمض النووي الريبي المنتظم ABCB1 في مجموعات مختلفة الانخفاض الكبير في الحمض النووي الريبي الريبي الريبي المستهدف ل ABCB1 تحديدا في مجموعة المعالجة بالتاكسول (الشكل 4G). بشكل عام، يظهر هذا كيف يمكن تفسير التغيرات على مستوى sgRNA لتحديد الجينات المرشحة المرتبطة باستجابة الدواء.

الشكل 4: تظهر شاشة EPIKOL خلايا مقاومة للتاكسول وأمثلة على الرسوم البيانية. (أ) مخطط بروتوكول شاشة EPIKOL. (ب) مستوى مضاعفة السكان (PDL) لخلايا التاكسول-ريس. (C–E) مخططات الشلال تظهر نتائج شاشة EPIKOL على خلايا Taxol-Res مع تسليط الضوء على الجينات الأساسية، المجموعة المعالجة ب DMSO مقارنة بالنقطة الزمنية الأولية في اللوحة C، المجموعة المعالجة بالتاكسول مقارنة بالنقطة الزمنية الأولية في اللوحة D، المجموعة المعالجة بالتاكسول مقارنة بالمجموعة المعالجة ب DMSO في اللوحة E. (F) مخطط البركان الذي يظهر Log2Foldتغيرات الجينات في العينات المعالجة بالتاكسول مقارنة بالنقطة الزمنية الأولية. الجينات التي تحتوي على p<0.05 كانت ملوونة وموسومة. تم تعديل هذا الرقم عن منشور سابق¹⁷. (G) قراءة عدد لكل مليون (دورة في الدقيقة) ل 10 مخططات مختلفة من ABCB1 sgRNA من EPIKOL. تم إنشاء اللوحة أ باستخدام BioRender.com. تم إعادة استخدام اللوحة E بإذن من يديير-بايرام وآخرون ¹⁷. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول الإضافي 1: جدول استكشاف المشكلات.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: حساب عيار الفيروس وMOI.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: قائمة sgRNA لمكتبة EPIKOL.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: البادئات المستخدمة في إعداد مكتبة تسلسل EPIKOL. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

أساليب الفحص المجمعة المبنية على CRISPR-Cas9 راسخة جيدا في سياقات خلوية مختلفة. ومع ذلك، فإن الفحص في الخلايا المقاومة للكيمياء يطرح تحديات واضحة ويتطلب تحسينات إضافية. نظرا لأن الخلايا المقاومة للكيمياء تعد نماذج قيمة لدراسة هشاشة الأورام المقاومة للكيما، فمن المهم معالجة هذه القيود في استراتيجيات الفحص لتحديد المنظمين الجينيين أو اللاجينيين لمقاومة الكيمياء بشكل موثوق.

توليد خطوط خلايا مقاومة كيميائية قد يكون بحد ذاته أمرا مرهقا ويعتمد بشكل كبير على العامل الكيميائي العلاجي المستخدم. بينما قد تتكيف الخلايا بسهولة مع بعض الأدوية، إلا أنها قد تكون شديدة الحساسية لأخرى²⁵. لذلك، من المهم تحديد قيم IC50 الخاصة بخط الخلية قبل بروتوكول توليد خط الخلايا المقاوم. في الحالات التي تفشل فيها الخلايا في تحمل التعرض لدواء بمستوى IC50 على عدة مرات، يمكن البدء بتركيز دواء أقل (مثل IC10-20) (انظر القسم 1 من البروتوكول^). نظرا لأن اكتساب المقاومة حدث عشوائي، يمكن معالجة عدة آبار/صفائح من الخلايا في نفس الوقت لزيادة احتمال الحصول على خلايا مقاومة. من الضروري توصيف مجموعة الخلايا المقاومة للأدوية بشكل شامل لوصف التغيرات النسخية والظاهرية أثناء عملية تصعيد الجرعة مقارنة بحالتها الساذجة. يمكن استخدام طرق التنميط العالمية مثل RNA-seq لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف بالنسبة للخط الأبوي. وظيفيا، يجب التحقق من مقاومة الأدوية المكتسبة من خلال اختبارات بقاء وتكاثر الخلايا لإثبات أن الخلايا المقاومة تحافظ على بقائها تحت ظروف علاج المخدرات التي تكون سامة للخلايا الأبوية. أيضا، يجب قياس التغيرات المحتملة في قدرتها على التكاثر ومعدل النمو مقارنة بخط الخلايا الأبوية لحساب مستويات PDL الخاصة بهم. نظرا لأن مقاومة التاكسول المكتسبة معروفة بأنها تتوسط، على الأقل جزئيا، بواسطة تدفق دوائي بوساط ABC، يجب تقييم تعبير ناقلات ABC الرئيسية (مثل ABCB1) على مستويات mRNA والبروتينات باستخدام qPCR وWestern blotting، ويمكن تكامله ببيانات النسخ النصي. استنادا إلى ملف تعبير ناقل ABC، يجب النظر في وجود النمط الظاهري MDR، ويجب تقييم مقاومة العوامل الكيميائية الأخرى. في دراستنا السابقة، قمنا بتوصيف خطوط الخلايا المقاومة للتاكسول وحددنا ABCB1 كأحد أكثر الجينات تنظيما، واستنتجنا أن مقاومة الأدوية المتعددة التي تتوسطها ABCB1 يمكن أن تسبب فشلا في اختيار البيوروميسين¹⁷. لذلك، بعد توليد الخلايا المقاومة، يجب تقييم تعبير ناقلات ABC ونمط MDR قبل أي إجراء نقل.

تقدم طريقة تصعيد الجرعة مزايا مقارنة بروتوكولات التعرض للجرعات العالية، حيث يمكن حفظ الخلايا بالتجميد في كل خطوة قبل زيادة جرعة الدواء، مما يوفر مرونة وحماية من فقدان الزرعة. علاوة على ذلك، يسمح التصاعد التدريجي للجرعات باكتساب أنماط المقاومة مع مرور الوقت، مما يمكن التطور التكيفي؛ على عكس العلاج الحاد بجرعات عالية، الذي يؤدي إلى اختيار مجموعات فرعية مقاومة موجودة مسبقا. تمكن تطوره التدريجي الباحثين من اختيار مستوى المقاومة المطلوب لإيقاف الانتقاء وتقييم خصائص النمط الظاهري الناتج. أيضا، يمكن الاستفادة من الخطوات الوسيطة لتصعيد الجرعة لدراسة آليات المقاومة المكتسبة بطريقة زمنية محددة. وفقا للسؤال البيولوجي الأساسي، يمكن الحصول على مستويات مقاومة مختلفة لدراسة الآليات التكيفية المبكرة ذات مستويات مقاومة أقل أو أنماط مقاومة مستقرة ومثبتة بالكامل في الخلايا الأكثر مقاومة. علاوة على ذلك، تختلف عتبات المقاومة ذات الصلة سريريا بشكل كبير حسب الدواء، وخط الخلايا، ومعدل التكاثر الداخلي؛ لذلك، قد يختلف الجدول الزمني لتصعيد الجرعة وفقا لذلك (في حالتنا، استغرق توليد الخلايا المقاومة للتاكسول حوالي 6 أشهر). تماشيا مع هذا المنطق، حددنا مستويين مختلفين من المقاومة مع SUM159PT الخلايا في دراستنا السابقة وقارنا ميزاتها المميزة والمشتركة¹⁷. لذلك، نوصي بأن يحدد الباحثون نطاق IC50 المستهدف للدواء المعني وفقا للصلة السريرية والبيولوجية.

من المعروف جيدا أن سحب ضغط الدواء قد يؤدي إلى فقدان المقاومة الكيميائية، حيث قد تعيد الخلايا توصيل الجينوم الفوق الجينوم والنسخ. لهذا السبب، ينصح بتقييم استقرار النمط الظاهري للمقاومة على مدى عدة أشهر. إذا كانت الخلايا تميل إلى العودة إلى الحالة الحساسة عند سحب الدواء، فقد تزرع الخلايا المقاومة بوجود جرعة الصيانة، والتي عادة ما تتوافق مع التركيز النهائي للدواء المستخدم أثناء توليد المقاومة، للحفاظ على نمط المقاومة الخاص بها. بينما تعتبر نماذج خطوط الخلايا المقاومة للكيميائيا في المختبر عملية وقابلة للتكرار وتستخدم على نطاق واسع لدراسة المقاومة الكيميائية المكتسبة، إلا أنها قد لا تعيد تماما التباين الظاهري الذي لوحظ في أورام المرضى وتفتقر إلى البيئة الدقيقة للورم، والتفاعلات المناعية، والتباين المكاني ^3,4,25. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الانتقال المطول خلال توليد المقاومة إلى تغييرات جينية وفوق جينية تختلف عن تلك التي لوحظت في عينات المرضى، مما قد يحد من الصلة الانتقالية للضربات المحددة. لذلك، يجب التحقق من صحة الجينات والآليات المرشحة التي تم تحديدها من خلال هذا البروتوكول في أنظمة تجريبية أكثر ملاءمة سريريا، مثل نماذج الزراعة المشتركة، أو الأعضاء المشتقة من المريض، أو الدراسات في الجسم الحي. يوفر EPIKOL مزايا بطبيعته المركزة إذا كان من المقرر إجراء شاشات تكميلية على هذه النماذج، حيث يكون الحد الأقصى من الخلايا المتاحة محدودا بطبيعته.

غالبا ما تنمو الخلايا المقاومة للكيمياء أبطأ من نظيراتها الأبوية، مما قد يشكل تحديا عمليا للشاشات الجينومية التي تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا للحفاظ على تغطية المكتبة. توفر المكتبات المركزة مثل EPIKOL ميزة لأداء شاشة بكمية أقل من المادة الأولية مع زيادة عمق sgRNA لكل جين، مما يحسن الحساسية وقابلية التكرار داخل الفضاء المستهدف المحدد. ومع ذلك، من حيث التصميم، يلتقط EPIKOL فقط آليات المقاومة فوق الجينية ولا يغطي المساهمات غير اللاجينية في مقاومة الكيماويات. لذا يجب أن يكون اختيار المكتبة موجها بالتجارب السابقة والسؤال البيولوجي المحدد. يجب أن يكون مستخدمو هذه المكتبات على دراية بقيود المكتبات المركزة وأن يفسروا النتائج ضمن نطاق المكتبة.

أحد العائقات الرئيسية في فحص كريسبر للنماذج المقاومة للكيمياء هو ظهور النمط الظاهري MDR المدفوع بزيادة تنظيم ناقل ABC ^9,10. تتوسط ناقلات ABC المختلفة تدفق الركائز المختلفة. بمجرد توليد خط خلوي مقاوم للأدوية، من المهم تقييم ما إذا كانت المقاومة تمتد إلى عوامل علاج كيميائي أخرى. مقاومة البيوروميسين تحدث بشكل رئيسي بسبب الإفراط في التعبير عن ABCB1، وهذا يؤثر على عملية اختيار أساليب الفحص المجمعة بتقنية كريسبر، حيث أن معظم هذه المكتبات تحمل أشرطة اختيار بوروميسين لإثراء الخلايا المحولة. هنا، استخدمنا فيراباميل، وهو مثبط ABCB1 من الجيل الأول، لتسهيل تراكم البوروميسين داخل الخلايا والقضاء انتقائيا على الخلايا المقاومة غير المحولة التي قد تفلت من الانتقاء بسبب تدفق دواء ABCB1. نظرا لأن الفيراباميل يرتبط ب ABCB1 بشكل عكسي، يتم استعادة وظيفة ABCB1 خلال ساعات من إزالة الفيراباميل. لذلك، لا يمنح فيراباميل ضعفا إضافيا للخلايا المقاومة خلال مرحلة العلاج الدوائي اللاحقة من الفحص. ومع ذلك، يجب الاعتراف بعدة قيود في الفيراباميل. نظرا لأن الفيراباميل مثبط لقنوات الكالسيوم والناقلات الأخرى، فإنه يمكن أن يؤثر على فسيولوجيا الخلية إلى ما يتجاوز تثبيط ABCB1¹⁰. بالإضافة إلى ذلك، يختلف تركيز الفيراباميل الفعال عبر خطوط الخلايا ونماذج MDR حسب مستوى تعبير ABCB1 ونشاط الناقلات الأخرى. لذلك، يجب تحسين تركيز الفيراباميل لكل خط خلوي، وقد يتم النظر في جيل جديد من مثبطات ABCB1 أكثر تحديدا ل ABCB1 إذا كانت التأثيرات خارج الهدف مصدر قلق. كخطوة حاسمة أخرى، يجب إجراء قياس العدوى الفيروسي على الخلية المقاومة نفسها بدلا من نظيراتها الأبوية، حيث تختلف العدوى وقابلية الاختيار غالبا بين الخلايا المقاومة.

اعتبار مهم آخر هو تحديد مدة الفحص المناسبة، حيث تنمو الخلايا المقاومة للكيمياء غالبا أبطأ من نظيراتها الأبوية^{المطابقة 26}. لأخذ هذا الفرق في الاعتبار، استخدمنا حسابات مضاعفة السكان (القسم 6 من البروتوكول) لتقييم متى وصلت مجموعات الضابط والعلاج إلى الحد المطلوب لمستوى PDL. لذلك يمكن إنهاء الفحوصات في أيام مختلفة، مما يسمح بتضاعف عدد السكان بشكل مماثل ويتيح تفسيرا أكثر أمانا لتأثيرات sgRNA في مجموعة العلاج.

تعد أجهزة PCR لتحضير المكتبة مهمة جدا لدقة تحديد الضربة في المراحل النهائية. قد يؤدي التحيز الناتج عن انخفاض إدخال الحمض النووي المطلوب وزيادة دورات PCR إلى تضخيم بعض تسلسلات sgRNA، مما يسبب تخصيبات إيجابية كاذبة أو استنزاف. للتخفيف من ذلك، نوصي باستخدام أقصى كمية ممكنة من gDNA، والالتزام بأرقام دورات PCR التي يقدمها هذا البروتوكول، وإجراء تفاعلات متوازية للتجمع قبل التسلسل. عندما يكون ذلك ممكنا، يجب ألا تنخفض تغطية المكتبة عن العتبات الموصى بها (>300× التغطية) لضمان الكشف الموثوق عن sgRNA المنخفض وليس السقوط العشوائي لل sgRNA منخفضة الوفرة بسبب انخفاض التغطية.

بعد التسلسل، استخدمنا إطار تحليل MAGeCK وأجرينا عدة تحليلات لمراقبة الجودة لاحقا وخطوات تفسير^{البيانات 24}. أولا، تم استخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتقييم توزيع وقابلية تكرار النسخ البيولوجية (البيانات غير معروضة، مخرجات MAGeCK). من المتوقع تكرار التجميع في PCA داخل كل ذراع؛ ومع ذلك، فإن التغير الأعلى في الذراع المعالجة هو سمة شائعة في شاشات مقاومة الكيميائيا، حيث يمكن للدواء أن يسبب تغيرات عشوائية. إذا تصرفت الضوابط الإيجابية والسلبية كما هو متوقع في كل ذراع، فإن هذا التباين لا يمنع تحديد الضربات الإيجابية الحقيقية. بعد ذلك، تم تطبيق تطبيع قراءات لكل مليون (RPM) لعدد sgRNA في النقاط الزمنية الأولى والنهائية لتقييم ما إذا كانت sgRNA المستهدفة جينات أساسية قد استنفدت كما هو متوقع¹⁴. لاحقا، تم استخدام التطبيع الوسيط لتجميع تأثيرات sgRNA، مما مكن من تحديد استنزاف مستوى الجينات²⁴. تم تصور درجات استنزاف الجينات باستخدام مخططات الشلال، التي تصنف الجينات من الأكثر استنزافا إلى الأكثر تثراء. يمكن أن تؤثر تغييرات أرقام النسخ وتعدد الصيغ الصبغية الناتجة عن التعرض المطول للأدوية نتائج الشاشة بسبب تقليل Cas9 بشكل غير فعال أو مفرط²⁷. بينما يستهدف EPIKOL منظمات الكروماتين التي عادة لا تخضع لتضخيم مدفوع بالتاكسول، نوصي بتقييم حالة الصيغة الصغرية وتغيرات عدد النسخ في الخلايا المقاومة قبل الفحص. إذا اشتبه في تغييرات في عدد النسخ، يمكن تطبيق أدوات التصحيح الحسابي مثل CRISPRcleanR أو CERES أثناء تحليل MAGeCK.

في الفحوصات التي تشمل ذراعين تجريبيين، مجموعة التحكم والعلاج، تتطلب مقارنات مختلفة لتفسير أداء الشاشة والاعتماديات البيولوجية بشكل صحيح¹⁷. المقارنات من البداية إلى النهائية مناسبة لتقييم أداء الشاشة، بما في ذلك السلوك المتوقع للجينات الأساسية والضوابط غير المستهدفة. مقارنة نقطة النهاية لمجموعة التحكم (DMSO) مع نقطة الزمن الأولية تسمح بتحديد الجينات اللازمة لنمو ولاياقة الخلايا المقاومة في غياب ضغط الدواء. في المقابل، تكشف مقارنة عينتين من نقطة النهاية، المعالجتين بالأدوية (تاكسول) والضابطة (DMSO)، عن الجينات المحددة التي كانت مطلوبة لمقاومة الدواء بدلا من اللياقة العامة. يجدر بالذكر أن المقارنة المباشرة بين العينتين النهائيتين تؤدي إلى توزيع غير معقد للجينات الأساسية للضبط، حيث أنها ضرورية للبقاء في كلا المجموعتين. طريقة تصور بديلة قد تكون مخطط البركان، الذي يعرض تغيرات log2 مع قيم دلالة، مما يمكن من تحديد الجينات المستنزفة بشكل كبير. بمجرد تحديد الجينات المرشحة، تصبح عداد sgRNA الطبيعية ومخططات التصور مفيدة لتحديد أفضل sgRNA أداء لاختبارات التحقق اللاحقة. بالنسبة لفحص EPIKOL، نوصي بإعطاء الأولوية للجينات المرشحة المدعومة بالسلوك المتوافق لما لا يقل عن 6 من كل 10 sgRNAs، حيث يوفر ذلك ثقة أكبر في تأثيرات الجينات.

هنا، نقدم بروتوكولا محسنا لإجراء فحص EPIKOL على سلاسل الخلايا المقاومة للتاكسول التي رفعت تنظيم ABCB1 وأظهرت نمطا ظاهريا ل MDR. ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع على أي نموذج مقاوم للكيماوي يظهر مقاومة متبادلة للبوروميسين أو المضادات الحيوية الأخرى للاختيار، مما يمكن من إجراء فحص كريسبر في هذه الخلايا. يقدم الجدول التكميلي 1 إرشادات عملية حول أكثر التحديات التقنية شيوعا التي تواجهها جميع خطوات البروتوكول.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
لوحة 100 مم	كورنينج	353003	ثقافة الخلايا
فلتر 45 ميكرومتر	سيجما-ألدريتش	SLHVM33RS	ثقافة الخلايا
لوحة 6 آبار	كورنينج	3506	ثقافة الخلايا
ألواح 96 حجرة أسود وشفاف القاع	سيجما-ألدريتش	CLS356259	لاختبار حيوية الخلايا CellTiter-Glo المضيء
بلاستيسيدين	ثرمو فيشر	A1113903	للانتقاء
اختبار حيوية الخلايا CellTiter-Glo المضيء	CellTiter-Glo, بروجيما	G7570	لاختبار حيوية الخلايا CellTiter-Glo المضيء
DMEM	جيبكو		ثقافة الخلايا
DMSO	بانرياك أبليكيم	A3672,0050	ثقافة الخلايا
FBS	جيبكو	16140071	ثقافة الخلايا
خليط غذائي هام F12	جيبكو	11765054	ثقافة الخلايا
خلايا HEK293T			هدية كريمة من روبرت وينبرج (معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية).
HEPES	ثرمو فيشر	15630080	ثقافة الخلايا
هيدروكورتيزون	سيجما-ألدريتش	H4001-1G	ثقافة الخلايا
إنسولين	سيجما-ألدريتش	I9278-5ML	ثقافة الخلايا
لنتيكاس9-بلاست	أدجين	#52962	لتوليد خط خلوي مستقر Cas9
لنتيغايد-بورو	أدجين	#52963	بنية أساسية لتكاثُر gRNA
مجموعة MN NucleoSpin للأنسجة	ماشيري-ناجل	740952.5	لإستخراج الحمض النووي الجيني
PBS	جيبكو	10010023	ثقافة الخلايا
بينسيلين-ستربتومايسين	جيبكو	15140122	ثقافة الخلايا
pLentiCRISPR v2	أدجين	#52961	بنية أساسية لتكاثُر gRNA
بولي إيثيلين جلايكول (PEG)-8000	سيجما-ألدريتش	P2139-500G	لتركيز اللينتيفيروس
بولي إيثيلين إييمين، خطي (PEI)	سيجما-ألدريتش	765090-1G	لإنتاج اللينتيفيروس
بروتامين سلفات (PS)	سيجما-ألدريتش	P4380-25G	لإلتهاب اللينتيفيروس
psPAX2	أدجين	# 12260	لإنتاج اللينتيفيروس
بورومايسين	ثرمو فيشر	A1113803	للانتقاء
خلايا SUM159PT اللاصقة			هدية كريمة من روبرت وينبرج (معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية).
تاكسول	باكليتاكسيل، سيجما	PHR1803-200MG	لتوليد الخلايا res والصيانة
تريبسين-EDTA (0.05%)	جيبكو	25300054	ثقافة الخلايا
فيراباكميل	سيلكيك كيميكال	S4202	للانتقاء
VSV-G	أدجين	# 8454	لإنتاج اللينتيفيروس