يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إطار عمل متعدد الأنماط لتقييم المزارع المشتركة للخلايا المناعية والعضوانيات الورمية في القولون المشتقة من المرضى

196 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71204

⸱

سبتمبر 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء عضوانيات أورام القولون المشتقة من المرضى في استزراع مشترك مع الخلايا اللمفاوية ذاتية المنشأ، متبوعاً بالمعالجة بجزيئات علاجية صغيرة ومثبطات نقاط التفتيش المناعية لتقييم تفاعلية الخلايا التائية وفعالية العلاج.

الملخص

تلعب الخلايا التائية دوراً رئيسياً في العلاج المناعي للسرطان، ويعد فهم تفاعلاتها مع الأورام أمراً ضرورياً لتطوير علاجات مناعية جديدة. يصف هذا البروتوكول سير العمل خطوة بخطوة لإنشاء عضوانيات مشتقة من مرضى سرطان القولون والمستقيم (PDOs) من البنك الحيوي الخاص بنا، وتطوير أنظمة استزراع مشترك بين الخلايا التائية والعضوانيات الذاتية. وباستخدام صبغ Annexin V NIR وcleaved caspase-3، قمنا بتوحيد بروتوكولات قياس التدفق الخلوي للصبغ السطحي والداخلي لتقييم تفاعلية الخلايا التائية وسميتها الخلوية، فضلاً عن قتل العضوانيات الورمية. وبالإضافة إلى التحليل القائم على قياس التدفق الخلوي، يتضمن البروتوكول مناهج منهجية للمقايسات الوظيفية، مثل مقايسات ELISpot لتقدير إفراز granzyme B وperforin، وتصوير الخلايا الحية لمراقبة قتل الورم بوساطة الخلايا التائية بمرور الوقت عبر الكشف عن موت الخلايا المبرمج القائم على Annexin V. ويفصل سير العمل هذا كذلك إعداد ظروف الاستزراع المشترك، بما في ذلك دمج المثبطات المستهدفة ومثبطات نقاط التفتيش المناعية في سياقات العلاج الأحادي والعلاج المركب. كما يتم تقديم إرشادات لاختيار وتطبيق المؤشرات المناعية والمؤشرات المرتبطة بالأورام الرئيسية، بما في ذلك CD137 لتفاعلية الخلايا التائية، وCD107a لإزالة حبيبات الخلايا التائية، وcaspase-3 لموت الخلايا الورمية المبرمج، وKi67 لتكاثر الورم. وبشكل جماعي، توفر هذه الورقة إطاراً شاملاً وقابلاً للتكرار لإنشاء عضوانيات سرطان القولون والمستقيم، واستزراع وتوسيع الخلايا التائية الذاتية، وإعداد الاستزراع المشترك، والاضطرابات العلاجية، والتحليلات اللاحقة باستخدام قياس التدفق الخلوي، وELISpot، والمجهر البؤري، وتصوير الخلايا الحية.

المقدمة

لا يزال سرطان القول والمستقيم (CRC) أحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم على الرغم من التقدم في الكشف المبكر والعلاجات متعددة الأنماط1. ويتمثل التحدي الرئيسي في تحسين نتائج المرضى في نقص النماذج قبل السريرية التي تحاكي بدقة البنية المعقدة، وعدم التجانس داخل الورم، والتفاعلات بين الورم والجهاز المناعي، والاستجابات العلاجية الملحوظة في سرطان القول والمستقيم البشري2,3,4,5,6. وقد ساهمت النماذج التقليدية، بما في ذلك نماذج الفئران المعدلة وراثياً (GEMMs) والطعوم الغريبة المشتقة من المرضى (PDXs)، في تطوير أبحاث سرطان القول والمستقيم بشكل كبير ولكنها تنطوي على قيود ملحوظة. فغالباً ما تفشل نماذج GEMMs في استيعاب تنوع الأورام البشرية، ويتم تطويرها في بيئات دقيقة فئرانية تختلف جوهرياً عن الفسيولوجيا البشرية. وبالمثل، تحافظ نماذج PDX على جوانب من عدم التجانس الورمي ولكنها مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتعتمد على فئران تعاني من نقص المناعة، ومحدودة في قدرتها على دراسة الاستجابات المناعية الخاصة بالبشر بسبب الاختلافات النوعية بين الأنواع7,8. بالإضافة إلى ذلك، فإن القيود المتزايدة على استخدام الحيوانات الصغيرة تؤكد الحاجة إلى بدائل أكثر صلة بالبشر وأكثر استدامة من الناحية الأخلاقية.

ظهرت العضوانيات المشتقة من المرضى (PDOs) في السنوات الأخيرة كمنصة تحولية لأبحاث السرطان الترجمية. وتحافظ عضوانيات سرطان القولون والمستقيم (CRC) التي يتم إنتاجها من عينات جراحية أو خزعات حديثة على الخصائص النسيجية والجينية والنمط الظاهري للأورام الأولية، بما في ذلك التنوع النسيلي والحالات الخلوية المستجيبة للعلاج. وتجعل هذه الخصائص من العضوانيات المشتقة من المرضى أدوات قيمة لنمذجة الأمراض، وعلم الجينوم الوظيفي، واكتشاف المؤشرات الحيوية، والطب الشخصي7,8,9,10,11. ومن الأهمية بمكان أن دمج المكونات المناعية البشرية في أنظمة العضوانيات قد وسع من فائدتها بشكل أكبر؛ حيث يتيح الاستزراع المشترك لعضوانيات سرطان القولون والمستقيم مع الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) أو المجموعات المناعية المهندسة استقصاء التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي، وآليات الهروب المناعي، وتقديم المستضدات، واستجابات العلاج المناعي في نظام ذي صلة فسيولوجياً12. وتدعم هذه النماذج تقييم مثبطات نقاط التفتيش، وعلاجات CAR-T/TCR، والأجسام المضادة ثنائية الخصوصية، مع تقديم رؤى حول المؤشرات الحيوية التنبؤية وآليات المقاومة.

بعيداً عن العلاج المناعي، اكتسبت عضويات سرطان القولون والمستقيم (CRC organoids) أهمية متزايدة في تطبيقات فحص الأدوية وعلم الأورام الدقيق. حيث يمكن اختبار المزارع المشتقة من المرضى مقابل العوامل العلاجية الكيميائية والعلاجات الموجهة للتنبؤ باستجابات العلاج الفردية، وقد أظهرت دراسات عدة وجود ارتباطات بين استجابات العضويات والنتائج السريرية. وبناءً على ذلك، توفر هذه الأنظمة بديلاً قابلاً للتوسع ومركزاً حول المريض مقارنة بالنهج التقليدية القائمة على الحيوانات10,13,14,15,16,17,18.

يتم هنا تقديم بروتوكول مرن وقابل للتوسع لإنشاء عضوانيات سرطان القولون والمستقيم (CRC) المشتقة من المرضى ودمجها مع أنظمة الزراعة المشتركة المناعية لأغراض الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية. يتم تفكيك الأنسجة الورمية إنزيميًا وتضمينها داخل مصفوفة خارج خلوية ثلاثية الأبعاد تحت ظروف نمو محسنة تحافظ على التغاير الورمي والتمايز السلالي. ويمكن توسيع العضوانيات المنشأة، وتجميدها للحفظ، وتعديلها جينيًا، واستخدامها في تطبيقات لاحقة، بما في ذلك التوصيف الجزيئي، ودراسات الاضطراب الدوائي، والتوصيف المناعي. بالإضافة إلى ذلك، تتيح الزراعة المشتركة مع الخلايا أحادية النواة في الدم الطرفي (PBMCs) تقييم السُمية الخلوية بوساطة المناعة، والحساسية لمثبطات نقاط التفتيش، والتنشيط المناعي النوعي للورم.

نصف كذلك البروتوكولات الخاصة بمعالجة الأنسجة، وتقييم جودة العضوانيات، والتحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي، والتصوير المناعي الفلوري، والمراقبة المناعية القائمة على تقنية ELISpot. وبشكل جماعي، توفر هذه الأنظمة القائمة على العضوانيات منصة مستدامة أخلاقياً وذات صلة سريرياً لدراسة بيولوجيا سرطان القولون والمستقيم (CRC)، والمقاومة العلاجية، وعدم التجانس الورمي، واستجابات العلاج المناعي. وتستمر التطورات الجارية في هندسة العضوانيات وتكامل البيئة الدقيقة في ترسيخ هذه النماذج كحجر زاوية لأبحاث سرطان القولون والمستقيم المستقبلية وعلم الأورام الدقيق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

قدم جميع المرضى موافقة مستنيرة بموجب بروتوكول البنك الحيوي لمركز مونتيفيوري أينشتاين الشامل للسرطان المعتمد من مجلس مراجعة المؤسسة (Einstein IRB# 2021-13730). وقدم مكتب التجارب السريرية للسرطان (CCTO) التنسيق السريري والدعم التنظيمي. جُمعت أنسجة الأورام بعد الاستئصال الجراحي وفق معايير الرعاية ومراجعة علم الأمراض، ثم عولجت من أجل التثبيت بالفورمالين، أو توليد عضوانيات مشتقة من المريض، أو الحفظ بالتجميد في DMEM مع 20% FBS و 10% DMSO. جميع تحضيرات الكواشف موجودة في الجدول 1.

1. تأسيس مستنبت عضواني ورمي من خزعة أو نسيج مستأصل (4 ساعات)

  1. ضع نسيج الورم الذي تم الحصول عليه حديثاً في طبق بتري معقم، واغسله باستخدام محلول غسل العضويات (organoid washing buffer) 5 مرات، لمدة 5 دقائق في كل مرة على الثلج. وباستخدام شفرة حلاقة معقمة أو إبر دقيقة، قم بتشريح النسيج إلى مكعبات صغيرة بحجم تقريبي يبلغ ١-٢ مم3.
    ملاحظة: حافظ على رطوبة النسيج باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) مبرد بالثلج أثناء عملية التشريح لمنع الجفاف.
  2. انقل قطع الأنسجة المشرحة إلى أنبوب Falcon سعة 15 مل، واغسلها مرة واحدة باستخدام محلول دولبيكو الملحي المنظم بالفوسفات (DPBS)، ثم قم بطردها مركزياً عند 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من الطافي بعناية، ثم انقل مكعبات النسيج إلى طبق ستريل مكون من 6 آبار أو طبق بتري بقطر 35 ملم.
  3. باستخدام مقصات معقمة ومائلة ومعالجة بالمؤتوميكليف (autoclaved)، يتم تقطيع النسيج أكثر إلى قطع أصغر. وبإستخدام محلول Gentle Collagenase/Hyaluronidase بتركيز 1X، يتم تخفيف 1 مل في 9 مل من محلول DPBS. أضف 10 µL من Y-27632 (مثبط ROCK) و 20 µL من البريموسين (Primocin).
  4. أضف محلول التفكيك المسخن مسبقاً إلى أنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على قطع الأنسجة. أعد تغطية طرف الماصة P1000 قبل السحب والدفع بالماصة لتحريك قطع الأنسجة.
  5. قم بحضن الأنبوبة سعة 15 مل في... 37 °C حمام مائي هزاز لمدة 30 دقيقة، مع القلب كل 10 دقائق. اترك قطع الأنسجة تترسب، وانقل معظم محلول الهضم إلى أنبوب جديد، ثم قم بالطرد المركزي عند 500 x جـ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. أضف 1 مل من وسط DMEM إلى الأنبوب الأصلي سعة 15 مل، ثم قم بالماصة بقوة باستخدام رأس P1000 مطلي لتفكيك شظايا الأنسجة ميكانيكياً وتحرير المزيد من الخبيات.
  7. تحقق من التقدم تحت المجهر لمراقبة ما إذا كانت الأنسجة تتفكك إلى خلايا مفردة أو تجمعات صغيرة. انقل 10-20 µL من وسط DMEM الذي يحتوي على قطع نسيجية في طبق بتري، وافحصها تحت المجهر للبحث عن الخبيئات.
    ملاحظة: تختلف مدة الحضن باختلاف نوع العينة. وبالنسبة للخزعات، تكون مدة الحضن هي من ١٥ إلى ٣٠ دقيقة، وبالنسبة للاستئصالات الجراحية، فهي ٤٥-٦٠ دقيقة.
  8. بمجرد اكتشاف الخبايا (أو بعد مرور 30 دقيقة بالنسبة للخزعات/60 دقيقة بالنسبة للاستئصالات)، يتم إيقاف عملية الهضم بإضافة حجم مساوٍ من الوسط الأساسي المبرد بالثلج، ثم يتم إجراء الطرد المركزي عند 500 x جـ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. اغسل الراسب باستخدام DPBS لإعادة تعليقه، ثم قم بطرده مركزياً مرة أخرى. اختيارياً، انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي وقم بطرده مركزياً عند ٣٠٠ × ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا.
    ملاحظة: لـ بالنسبة لسرطان القولون والمستقيم (CRC)، لا تكون عملية تحلل كريات الدم الحمراء (RBC lysis) مطلوبة عادةً.
  10. إذا ظهر الراسب باللون الأحمر، فقم بتحليل كريات الدم الحمراء عن طريق الحضن في ٥ مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء (RBC lysis buffer) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد عملية التحلل، املأ الأنبوب فوراً بمحلول PBS ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى.
  11. اغسل الراسب مرة واحدة بـ محلول منظم منات الفوسفات المتوازن (DPBS). يتم الطرد المركزي عند طرد مركزي بسرعة 300 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم التخلص من السائل الطافي. إعادة تعليق الراسب في حجم صغير من الوسط الغذائي. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس كرات الدم (هيموسيتوميتر) باستخدام استبعاد صبغة تريبان الزرقاء أو أداة جهاز عد الخلايا الآلي.
  12. أعِد تعليق الخلايا في ماتريجيل (Matrigel) (مصفوفة الغشاء القاعدي) مبرد بالثلج (اختياري: تركيز يتراوح بين ~1.5-3 × 10)4 خلية لكل 10 µL وسط). اخلط معلق الخلايا مع مصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام رؤوس ماصات واسعة الفتحة ومبردة (تستخدم بعض المختبرات نسبة 1:1 من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى وسط نمو العضوانيات الكامل).
    ملاحظة: احتفظ بمصفوفة الغشاء القاعدي وجميع المخاليط بارد جداً (بدرجة حرارة الجليد) لمنع البلمرة المبتسرة.
  13. طبق50 µL قباب من خليط الخلايا ومصفوفة الغشاء القاعدي في كل بئر من بئر مسبقة التسخين ومعقمة طبق زراعة بـ 24 بئراً. يتم تحضين الطبق عند 37 °C لمدة 10-12 دقيقة للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالتصلب على شكل قبة (مع جعل الطبق مقلوباً).
  14. بعد تصلب مصفوفة الغشاء القاعدي، اقلب الطبق لوضعية قائمة. أضف بعناية 500 µL/well من وسط PDO الذي يحتوي على مثبط Rock (بنسبة 1:1000) وPrimocin (بنسبة 1:500).
    ملاحظة: استخدم Primocin في جميع أوساط الزرع حتى يتم إنشاء بنك حيوي مجمد من العضوانيات لمنع التلوث.
  15. استبدال الوسط الغذائي للعضوانيات مرتين أسبوعياً بوسط عضواني كامل وجديد. راقب نمو العضوانيات بانتظام تحت المجهر.

2. عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) البشرية من الدم (ساعتان)

  1. قم بتوزيع 5 مل من Histopaque في أنابيب Falcon معقمة سعة 15 مل، واتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم أضف بعناية حجماً مساوياً من دم بشري طازج (حتى 5 مل) كطبقة علوية. أضف الدم ببطء على طول جدار الأنبوب فوق Ficoll دون تعكير الواجهة الفاصلة؛ مع الحفاظ على الحجم الإجمالي بحيث لا يتجاوز 10 مل لكل أنبوب.
    ملاحظة: حافظ على فصل طبقتي الـ Ficoll والدم قبل عملية الطرد المركزي لضمان تحقيق الفصل الأمثل.
  2. في حال استخدام أنابيب متعددة، يجب موازنتها بدقة في جهاز الطرد المركزي. تجنب الخلط أو الرج. الـ يجب أن تظل الواجهة الفاصلة بين الدم وFicoll سليمة.
  3. طرد مركزي عند ١٥٠٠ × جـ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم 0 إعدادات الكبح لمنع اضطراب التدرج. بعد عملية الطرد المركزي، ستتشكل طبقات متمايزة: أ) طبقة كريات الدم الحمراء في الأسفل، ب) طبقة الخلايا الوحيدة النوكلوية الدموية (buffy coat) في الوسط، ج) طبقة البلازما في الأعلى. اسحب البلازما بلطف وتخلص منها حتى تصبح طبقة الخلايا الوحيدة النوكلوية الدموية مرئية.
    ملاحظة: تعامل مع الأنبوب برفق لتجنب تشتيت طبقة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC).
  4. باستخدام ماصة معقمة وجديدة، قم بسحب الـ... بعناية طبقة الغشاء الأبيض (Buffy coat) تحتوي على خلايا PBMC، ونقل الخلايا إلى وعاء جديد معقم أنبوب Falcon سعة 15 مل. ولإزالة الـ Ficoll والصفائح الدموية، تُغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 مل من محلول PBSA (محلول PBS + 0.1% BSA) عن طريق الطرد المركزي عند 1000 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع التخلص بعناية من السائل الطافي بعد كل عملية غسل.
  5. لإزالة الصفائح الدموية المتبقية، اغسل مرة واحدة بمحلول PBSA، ثم قم بالطرد المركزي عند ٢٠٠ × جـ لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السائل الطافي بعناية. إذا ظهرت الراسبة باللون الأحمر، قم بإجراء تحلل لكريات الدم الحمراء عن طريق الحضن في 5 مل من محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء عند 37 °C لمدة 5 دقائق، ثم تُغسل باستخدام PBSA وتُفصل بالطرد المركزي عند 200 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. أعد تعليق رسب الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC pellet) في 2 مل من محلول DPBS أو وسط زراعي، وحدد عدد الخلايا الحية باستخدام صبغة Trypan blue مع مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد خلايا آلي. وفي حال عدم استخدامها فوراً، تُحفظ الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) بالتجميد عند تركيز 5-10 × 106 خلية/مل في 90% من مصل جنين البقر (FBS) و10% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يتم التجميد تدريجياً عند –80 °C ليلة كاملة، ثم تُنقل إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
  7. توسيع الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (7-12 يوماً):
    1. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد التعليق بتركيز 5 × 105 خلايا/بئر في وسط توسيع الخلايا التائية، وتنشيطها باستخدام مزيج CD3/CD28.
    2. قم بتحفيز الخلايا باستخدام 500 وحدة دولية/مل من IL-2 واحضنها لمدة 3 أيام. وفي اليوم الثالث، اخلط الخلايا وقم بتعدادها، ثم قم بتوسيع المزرعة بإضافة وسط توسيع الخلايا التائية المكمل بـ IL-2.
    3. اضبط تركيز الخلايا ليكون بين 1–2.5 × 10^5 خلية/مل في وسط توسيع الخلايا التائية (T Cell Expansion Medium) الكامل، وحضنها لمدة يومين، مع مراقبة الحيوية كل 2–3 أيام خلال فترة التوسع.
      ملاحظة: استبدل الوسط الكامل الطازج والدافئ كل يومين إلى 3 أيام (لا تتجاوز >(3 أيام). ويمكن حفظ الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) بالتجميد في وسط تجميد الخلايا التائية لاستخدامها مستقبلاً.

3. الزراعة المشتركة للعضوانيات (4 أيام):

  1. التحضير ومراقبة الجودة:
    1. التأكد من أن العضوانيات (organoids) سليمة، وخالية من التلوث، ومحددة ظاهرياً قبل الاستزراع المشترك. الحصول على خلايا PBMC من متبرعين موافقين أو من مصادر تجارية، والتأكد من حيويتها ونمطها الظاهري الأساسي قبل الاستخدام.
    2. تحديد ما إذا كانت خلايا PBMC ستُستخدم طازجة، أو مستريحة، أو منشطة مسبقاً، وما إذا كانت ذاتية (autologous) أو خيفية (allogeneic). تقييم حيوية العضوانيات، وتجانس حجمها، وتعبير المؤشرات قبل الاستزراع المشترك.
    3. التحقق من حيوية PBMC والتركيب المناعي الأساسي (مؤشرات CD3، CD4، CD8، NK، والخلايا الوحيدة)، وتسجيل البيانات الوصفية للمتبرع.
  2. عزل العضوانيات للاستزراع المشترك مع PBMC:
    1. إزالة وسط الاستزراع وإضافة محلول استعادة الخلايا المُدفأ مسبقاً في كل بئر لإذابة المصفوفة خارج الخلوية وتحرير العضوانيات. إعادة تعليق العضوانيات برفق باستخدام طرف ماصة واسع الفتحة وتحضينها لفترة وجيزة حتى تذوب المصفوفة وتتحرر العضوانيات.
    2. نقل المعلق إلى أنبوب تجميع، وإضافة 0.5M EDTA إذا لزم الأمر، وضبط الحجم باستخدام محلول منظم متوازن. إجراء الطرد المركزي لترسيب العضوانيات، والتخلص من السائل الطافي، والغسل بوسط أساسي يحتوي على مكملات (HEPES و Glutamax) ومضادات حيوية، ثم إجراء الطرد المركزي مرة أخرى لإعادة الترسيب.
    3. إعادة تعليق العضوانيات في وسط استزراع كامل، وزراعتها في طبق معالج لزراعة الأنسجة، وتركها للتعافي لمدة تقارب 24 h قبل إجراء المزيد من العمليات.
  3. استعادة PBMC بالتوازي:
    1. إذابة خلايا PBMC المحفوظة بالتبريد بسرعة باستخدام الممارسة القياسية وتخفيفها فوراً في وسط توسيع الخلايا T المُدفأ مسبقاً لتقليل الصدمة الأسموزية.
      ملاحظة: يُعد فقدان بعض الخلايا أمراً طبيعياً أثناء الإذابة؛ ويؤدي تدفئة الوسط مسبقاً إلى تحسين عملية الاستعادة.
    2. طرد خلايا PBMC المذابة مركزياً عند 400 x g لترسيب الخلايا، وإزالة وسط التجميد، وتحضينها لفترة وجيزة في وسط توسيع الخلايا T الذي يحتوي على benzonase لتقليل تكتل الخلايا وتحسين جودة معلق الخلايا المفردة.
    3. غسل وإعادة ترسيب PBMC في وسط توسيع طازج، ثم إعادة تعليقها في وسط استزراع الخلايا T المكمل بالسيتوكينات (مثل IL-2) لدعم الحيوية والاستعادة. زراعة PBMC في طبق متعدد الآبار لفترة راحة ليلة واحدة قبل الاستزراع المشترك.
  4. التحضير ما قبل الاستزراع المشترك (قبل يوم واحد من الاستزراع المشترك):
    1. اختيارياً، تُعالج العضوانيات بسيتوكين محفز للمناعة (مثل IFN-γ) قبل الاستزراع المشترك لتعزيز مسارات تقديم المستضد.
    2. تحضير طبق الاستزراع المشترك قبل 24 h على الأقل عن طريق طلاء الآبار بجسم مضاد محفز مشترك (مثل anti-CD28) وتخزينه عند 4 °C. قبل الاستخدام، يتم إزالة الجسم المضاد غير المرتبط وغسل الآبار مرتين باستخدام DPBS.
  5. تفكيك العضوانيات إلى خلايا مفردة (يوم تجربة الاستزراع المشترك):
    1. جمع العضوانيات المنشطة مسبقاً، وترسيبها وإزالة السائل الطافي، ثم إعادة تعليقها في كاشف تفكيك إنزيمي (مثل TrypLE) جنباً إلى جنب مع أي خلايا ملتصقة لاستعادة مجتمع الخلايا كاملاً.
    2. التحضين مع خلط لطيف والمراقبة مجهرياً حتى تتفكك معظم العضوانيات إلى خلايا مفردة أو تجمعات صغيرة، مع تجنب الهضم المفرط.
    3. إيقاف مفعول كاشف التفكيك باستخدام محلول منظم، وترسيب الخلايا، وإزالة السائل الطافي، وإعادة تعليقها في وسط استزراع الخلايا T لغرض العد والخلط.
  6. عد الخلايا والتحضير للاستزراع المشترك:
    1. خلط معلق الخلايا برفق وتحديد عدد الخلايا الحية باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد آلي مع صبغة حيوية. ضبط نسبة الورم إلى PBMC للوصول إلى الكثافة المطلوبة في وسط الخلايا T.
    2. تحضير PBMC عن طريق الترسيب، وإعادة التعليق في وسط طازج، وتحديد أعداد الخلايا الحية. غسل وإعادة تعليق PBMC في وسط الخلايا T المكمل بالسيتوكينات (مثل IL-2) والأجسام المضادة المعدلة مناعياً الاختيارية (مثل anti-PD-1) حسب الحاجة.
  7. إجراء الاستزراع المشترك:
    1. دمج الخلايا الورمية المفككة وخلايا PBMC بالنسب المطلوبة (المؤثر : الهدف). غسل الآبار المطلية بـ anti-CD28 قبل إضافة الخلايا، مع تجنب جفاف الآبار.
    2. زراعة خليط العضوانيات و PBMC بالحجم المطلوب للمقايسة والتحضين تحت ظروف الاستزراع القياسية. يتم تجديد أو تقسيم المزارع حسب الحاجة خلال التجربة.
  8. التصميم التجريبي والضوابط (لاستراتيجية العلاج):
    1. استخدام نظام الاستزراع المشترك لتقييم كيفية تعديل الأدوية (مثل مثبطات نقاط التفتيش أو الجزيئات الصغيرة) لاستجابات PBMC تجاه العضوانيات الورمية.
    2. تضمين مكررات بيولوجية (خطوط عضوانيات ومتبرعين PBMC متعددين) ومكررات تقنية (ثلاث آبار على الأقل لكل حالة).
    3. تضمين الضوابط: العضوانيات فقط، PBMC فقط (الناقل أو المنشطة)، العضوانيات + PBMC (الناقل)، العضوانيات + الدواء، وحالات PBMC + الدواء.
  9. أطر زمنية نموذجية للاستزراع المشترك:
    1. تحليل المزارع المشتركة عند 24، و 48، و 72 h بعد البدء لتقييم التنشيط المناعي، والتكاثر، وإفراز السيتوكينات، والموت الخلوي المبرمج، وقتل الخلايا الورمية.
    2. تقييم مؤشرات التنشيط المبكر وإفراز السيتوكينات عند 24 h، وتقييم السمية الخلوية، والتكاثر، ومؤشرات التنشيط/الإنهاك عند 48–72 h باستخدام قياس التدفق الخلوي، أو التصوير، أو مقايسات الحيوية.
      ملاحظة: يمكن تضمين نقاط زمنية لاحقة (على سبيل المثال، الأيام 5-7) لتقييم التنشيط المزمن، أو الإنهاك المناعي، أو استجابات الدواء طويلة المدى.
  10. تلوين العضوانيات بالفلورة المناعية:
    1. غسل الشرائح في PBS لمدة 5 min وتثبيتها في محلول بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 4% لمدة 20 min في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد التثبيت، تُغسل الشرائح في PBS مرتين لمدة 5 min لكل مرة.
      ملاحظة: الحفاظ على ترطيب العضوانيات طوال عملية التلوين. يمكن تخزين الشرائح في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 h إذا لزم الأمر، ولكن يجب تجنب التخزين طوال الليل في PBS.
    2. نفاذ العضوانيات باستخدام 0.1–0.5% Triton X-100 في PBS لمدة 15–20 min في درجة حرارة الغرفة لتمكين التلوين داخل الخلايا والنوى مع الحفاظ على بنية العضوانيات.
      ملاحظة: تجنب النفاذ المفرط، لأنه يمكن أن يؤدي إلى تخريب بنية العضوانيات. يضمن النفاذ الصحيح تلويناً متجانساً للسيتوبلازم والنواة مع الحفاظ على المورفولوجيا من أجل التصوير.
    3. غسل الشرائح مرتين باستخدام محلول IF المنظم 1x، والمنع (blocking) باستخدام 1–10% BSA (أو مصل مطابق للنوع) في محلول IF المنظم لمدة 60–120 min في درجة حرارة الغرفة لتقليل التلوين غير النوعي.
      ملاحظة: يُعد BSA مناسباً للمنع العام، ولكن يُوصى باستخدام مصل مطابق للنوع لتلوين مؤشرات محددة لتقليل الارتباط غير النوعي وتحسين خصوصية الإشارة.
    4. غسل الشرائح ثلاث مرات (5 min لكل مرة) والتحضين مع الأجسام المضادة الأولية (10–50 µg/mL) في محلول منع يحتوي على مصل 1% طوال الليل عند 4 °C في غرفة رطبة.
      ملاحظة: تغطية الشرائح بـ parafilm لمنع التبخر، وتحسين تركيز الجسم المضاد الأولي عن طريق المعايرة للحصول على تلوين محدد مع أقل قدر من الخلفية.
    5. غسل الشرائح في 1x IF لمدة 3 × 5 min.
      ملاحظة: يجب تحسين عملية الغسل لكل تلوين بجسم مضاد على حدة. في حال استخدام أكثر من جسم مضاد أولي في وقت واحد، يجب توحيد عملية الغسل.
    6. تحضين شرائح العضوانيات مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بفلوروفور (1:200–1:500 في محلول منع يحتوي على مصل 1%) في غرفة رطبة طوال الليل عند 4 °C أو لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      ملاحظة: بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي، تُجرى جميع الخطوات اللاحقة في الظلام لمنع التبييض الضوئي للفلوروفورات.
    7. غسل الشرائح بمحلول IF المنظم 1x (2x 5 min) متبوعاً بـ PBS (5 min). التحضين مع DAPI (1 µg/mL) وأجسام مضادة مقترنة بـ AlexaFluor-594 (20 µg/mL) في محلول منع يحتوي على مصل 5% لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة في الظلام، ثم الغسل بـ PBS (3x 5 min).
    8. إضافة وسط التثبيت (mounting medium) إلى الشرائح وغطاء الشريحة، ثم قلب غطاء الشريحة على الشريحة مع تجنب فقاعات الهواء. بدلاً من ذلك، إذا تم استخدام وسط تثبيت يحتوي على DAPI، يتم تخطي تلوين DAPI. استخدم وسط تثبيت صلباً لتطبيقات مسح الشرائح.
    9. ترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، وتخزينها عند –20 °C، وتصويرها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) أو ماسح الشرائح.

4. بروتوكول قياس التدفق الخلوي والصبغ داخل الخلوي للعضويات

  1. قم بشفط وسط استزراع العضوانيات بعناية واغسل العضوانيات مرة واحدة بلطف باستخدام 1x PBS لإزالة بقايا الوسط وبروتينات المصل. حرر العضوانيات من المصفوفة خارج الخلوية باستخدام PBS بارد أو محلول استعادة، واستخدم الماصة بلطف لتفكيك المصفوفة مع تقليل إجهاد القص.
  2. انقل معلق العضوانيات إلى أنبوب طرد مركزي، وقم بترسيبها عند 300 x g لمدة 5 min عند 4 °C، ثم تخلص من السائل الطافي. أعد تعليق راسب العضوانيات في 250–500 µL من محلول 0.05% TrypLE للتفكيك الإنزيمي. حضن العينات عند 37 °C لهضم الروابط بين الخلايا بكفاءة.
    ملاحظة: كل 5 min، اخلط المعلق بلطف عن طريق النقر وبالسحب والضخ بالماصة، وراقب تحت المجهر حتى يتم الحصول على معلق من خلايا مفردة دون حدوث هضم مفرط.
  3. مرر معلق الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسامية 40 µm لإزالة التكتلات. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 x g لمدة 5 min عند 4 °C وأعد تعليقها في محلول 1x PBS الخالي من Ca2+ / Mg2+.
  4. قم بعد الخلايا وضبط تركيزها ليكون ~1 x 106 cells/mL في محلول التلوين. حضن الخلايا مع Fc block (بنسبة 1:200) وصبغة الحيوية (على سبيل المثال، Live/Dead Blue بنسبة 1:1000–1:3000) لتقليل الارتباط غير النوعي وتحديد الخلايا الحية والميتة.
  5. حضن الخلايا لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام، ثم اغسلها مرة واحدة بـ 1x PBS ومرة واحدة بمحلول التلوين.
  6. قم بتحضير مزيج الأجسام المضادة السطحية عن طريق خلط كل جسم مضاد بتخفيفه التشغيلي الأمثل في محلول التلوين، وحساب الأحجام الإجمالية باستخدام قيم µL/test المعايرة للمزيج الرئيسي.
    ملاحظة: إذا كانت اللوحة تحتوي على عدة فلوروكروماات قائمة على البوليمر (مثل أصباغ Brilliant Violet أو Brilliant Ultraviolet أو Brilliant Blue)، أضف Brilliant Stain Buffer (BSB) إلى مزيج الأجسام المضادة لتقليل التفاعلات بين الفلوروكروماات وتحسين دقة الإشارة. أضف BSB وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة (عادةً بتركيز نهائي 1x)، واخلط بلطف، وحضر مزيجاً رئيسياً لجميع العينات (مع إضافة حجم إضافي بنسبة ~10%). احفظ المزيج بعيداً عن الضوء وعلى الثلج حتى الاستخدام.
  7. أضف مزيج الأجسام المضادة وحضنه لمدة 30–50 min في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل بمحلول التلوين وPBS (الخالي من Ca2⁺/Mg2⁺)، ثم قم بالطرد المركزي عند 500 x g لمدة 5 min. حضر محلول التثبيت والنفاذية التشغيلي عن طريق تخفيف المركز بالمخفف. على سبيل المثال، جزء واحد من المركز: 3 أجزاء من المخفف (للحصول على تركيز 1x أو القوة التشغيلية المحددة).
  8. أضف محلول التثبيت والنفاذية لإعادة تعليق الخلايا بالكامل (~100–200 µL لكل مليون خلية) وحضنها لمدة 15–20 min في درجة حرارة الغرفة أو عند 2–8 °C، مع حمايتها من الضوء. بعد وقت التثبيت، اغسل الخلايا بـ 1x Permeabilization Buffer. تخلص من السائل الطافي. كرر الغسيل مرة واحدة على الأقل (وأحياناً مرتين) لإزالة المثبت الزائد.
  9. حضر مزيج التلوين داخل الخلايا عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المتقارنة فلورياً إلى التراكيز المثلى في 1x permeabilization buffer. أضف مزيج الأجسام المضادة داخل الخلايا إلى الخلايا المنفذة، بما في ذلك الأجسام المضادة التي تستهدف السيتوكينات أو عوامل النسخ أو البروتينات المفسفرة، حسب الحاجة.
  10. حضن الخلايا لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن تقصير مدة التحضين إلى الحد الأدنى الموصى به من الشركة المصنعة أو إجراؤه طوال الليل عند 4 °C في الظلام دون التأثير على جودة التلوين.
  11. اغسل الخلايا مرتين بـ 1x permeabilization buffer ومرة واحدة بمحلول التلوين، ثم أعد تعليق الراسب في 250–300 µL من محلول التلوين.
  12. مرر المعلق عبر مصفاة 40 µm للحصول على معلق من خلايا مفردة، واحفظ العينات على الثلج أو عند 4 °C، محمية من الضوء، حتى التحليل. تجنب تخزين العينات الملونة لفترة طويلة واجمع العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي في أقرب وقت ممكن بعد التلوين.
  13. استخدم جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer) مزوداً بالليزرات والمرشحات المناسبة التي تطابق الفلوروفورات. قم بإعداد ضوابط التعويض (compensation controls)، بما في ذلك العينات الملونة بلون واحد وضوابط fluorescence-minus-one (FMO).
  14. اجمع ما لا يقل عن 50,000–100,000 حدث (event) لكل عينة لضمان تحليل إحصائي قوي. حلل البيانات باستخدام FlowJo أو FCS Express أو برنامج مكافئ. قم بتحديد (Gate) الخلايا الحية المفردة. حلل تعبير الواصمات السطحية وداخل الخلوية.
    ملاحظة: قم بمعايرة كل اقتران جسم مضاد-فلوروكروما باستخدام التخفيفات المتسلسلة لتحديد التركيز الأمثل الذي يوفر أقصى إشارة، وأقل خلفية، وفصلاً واضحاً للمجتمعات الخلوية.

5. تحليل الموت الخلوي المبرمج القائم على Annexin V بواسطة قياس التدفق الخلوي:

  1. الضوابط والكواشف الأساسية:
    1. ضابط غير مصبوغ: يحدد الخط الأساسي للتألق الذاتي الخلوي، مما يسمح بتمييز الإشارة الإيجابية الحقيقية عن الخلفية.
    2. ضوابط الصبغ الفردي: مطلوبة لكل فلوروكروم في اللوحة لتمكين التعويض المناسب (قياس التدفق الخلوي التقليدي) أو فك الخلط الطيفي (قياس التدفق الخلوي الطيفي). وتضمن هذه الضوابط فصلاً دقيقاً للإشارات عبر القنوات.
    3. ضوابط الفلورة ناقص واحد (FMO): أساسية لتحديد بوابات المجموعات الخلوية الباهتة أو الانتقالية، حيث تساعد في منع المبالغة في تقدير الأحداث الإيجابية الضعيفة.
    4. ضابط إيجابي للموت الخلوي المبرمج: عينة تم تحفيزها عمداً للخضوع للموت الخلوي المبرمج (على سبيل المثال، خلايا معالجة بالستاوروسبورين) للتحقق من أن المقايسة تكشف عن أحداث الموت الخلوي المبرمج بشكل موثوق.
    5. ضوابط النمط المتماثل (Isotype controls): غير مفيدة لـ Annexin V نفسه، لأن الارتباط متخصص بالفوسفوليبيدات وليس بوساطة الأجسام المضادة. ومع ذلك، يمكن إدراجها للأجسام المضادة لعلامات السطح الإضافية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: استخدم محلول ربط Annexin V الذي يحتوي على أيونات الكالسيوم، لأن ارتباط Annexin V يعتمد على الكالسيوم؛ استخدم محلولاً تجارياً أو محلولاً مكافئاً معتمداً.
    6. يُستخدم صبغ حيوية غير نفاذ للغشاء (على سبيل المثال، PI أو 7-AAD أو DAPI أو صبغات الخلايا الميتة القابلة للتثبيت) للتمييز بين الخلايا في المراحل المبكرة من الموت الخلوي المبرمج والخلايا في المراحل المتأخرة من الموت الخلوي المبرمج/النخرية. اختر صبغاً متوافقاً مع ليزرات جهاز قياس التدفق الخلوي وظروف التثبيت.
  2. إجراء الصبغ:
    1. احصد الخلايا المستزرعة معاً عن طريق طرد مركزي للأطباق عند 500 x g لمدة 5 min. اشفط السائل الطافي بعناية وتخلص منه لإزالة وسط الاستزراع والحطام العائم. اغسل الخلايا مرتين بمحلول صبغ بارد (على سبيل المثال، PBS مع 1–2% FBS) لتقليل صبغ الخلفية وإزالة البروتينات المتداخلة.
    2. إذا كانت هناك حاجة لعلامات السلالة أو المجموعات الفرعية (على سبيل المثال، CD8 لخلايا PBMCs، أو علامة الخلايا الجذعية السرطانية مثل Lgr5 في الخلايا الورمية)، قم بحضن الخلايا مع كوكتيلات الأجسام المضادة لمدة 30–45 min في درجة حرارة الغرفة على هزاز لطيف، مع حمايتها من الضوء. يحافظ الصبغ السطحي في هذه المرحلة على سلامة المستضد ويسمح بالتحليل النوعي لكل مقصورة خلوية.
    3. اغسل الخلايا مرتين: أولاً بمحلول صبغ بارد لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة، ثم بمحلول ربط Annexin V (على سبيل المثال، BioLegend Cat. No. 422201) لضمان توفر الكالسيوم. اضبط تركيز الخلايا ليكون حوالي 1 x 106 cells/mL في محلول الربط.
    4. أضف 5 µL من كاشف Annexin V المقترن بالفلوروكروم إلى 100 µL من معلق الخلايا لكل عينة. يجب أن يكون الفلوروكروم المختار متوافقاً طيفياً مع الأصباغ الأخرى في اللوحة.
    5. أجرِ صبغاً مضاداً بصبغ حيوية مثل PI أو 7-AAD أو DAPI. بالنسبة لـ PI و DAPI، تتراوح التخفيفات المثلى عادةً من 1:1000 إلى 1:60,000، اعتماداً على الجهاز وقوة الليزر، ويجب تحديدها تجريبياً. يفضل استخدام أصباغ الحيوية القابلة للتثبيت إذا كان التثبيت اللاحق مطلوباً.
    6. أعد تعليق الخلايا بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة واحضنها لمدة 20–40 min في درجة حرارة الغرفة في الظلام. يجب تحديد وقت الحضن الأمثل تجريبياً، لأن الحضن المفرط قد يزيد من الارتباط غير النوعي أو النتائج الإيجابية الكاذبة.
    7. أضف 200 µL من محلول ربط Annexin V إلى كل بئر (بحد أدنى 100 µL إذا كانت العينات مركزة للغاية). يوفر هذا حجماً كافياً لقياس التدفق الخلوي ويحافظ على ظروف المحلول أثناء عملية التحصيل. قم بتحصيل العينات فوراً على جهاز قياس تدفق خلوي معاير، مع التأكد من تحسين إعدادات الجهد للفصل الواضح بين المجموعات السالبة والموجبة.
  3. استراتيجية تحديد البوابات الموصى بها:
    1. استخدم مخططات التشتت الأمامي (FSC) مقابل التشتت الجانبي (SSC) لاستبعاد الحطام الصغير والتجمعات الكبيرة، والاحتفاظ بالخلايا السليمة فقط. طبق تحديد البوابات FSC-A مقابل FSC-H (أو FSC-W) لإزالة الثنائيات والتجمعات، لضمان تحليل الخلايا المفردة فقط.
    2. بناءً على صبغ الحيوية، استبعد الخلايا الميتة الإيجابية بقوة إذا كان ذلك مناسباً. بدلاً من ذلك، قم بتضمين الصبغ في أرباع تحليل Annexin V. استخدم علامات السطح لتمييز خلايا PBMCs (على سبيل المثال، +CD45) عن الخلايا الورمية (على سبيل المثال، +EpCAM أو أي علامة أخرى خاصة بالورم). يتيح ذلك تقييناً كمياً للموت الخلوي المبرمج خاصاً بكل مقصورة.
    3. داخل كل مقصورة محددة، ارسم Annexin V مقابل صبغ الحيوية لإنشاء أربع مجموعات: أ) Annexin V− / Dye− = خلايا حيوية؛ ب) Annexin V+ / Dye− = خلايا في مرحلة الموت الخلوي المبرمج المبكر؛ ج) Annexin V+ / Dye+ = خلايا في مرحلة الموت الخلوي المبرمج المتأخر أو خلايا نخرية؛ د) Annexin V− / Dye+ = خلايا نخرية أولية أو شوائب (يتم تفسيرها بحذر).
    4. قم بتقسيم خلايا PBMCs بشكل أكبر إلى مجموعات فرعية (على سبيل المثال، خلايا T CD4، وخلايا T CD8، وخلايا NK، والوحيدات) لفحص أنماط الموت الخلوي المبرمج في مجموعات مناعية محددة.

6. مقايسة ELISPOT لمراقبة الخلايا التائية في المستنبتات المشتركة للعضوانيات (3 أيام):

  1. في اليوم 0، اغسل لوحة 96 بئر المكسوة مسبقاً بغشاء PVDF وقم بتنشيطها. تُخزن في درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة وفقاً لبروتوكول طقم ELISpot الخاص بالكشف عن الجسم المضاد/السيتوكين المطلوب.
  2. في اليوم 1،
    1. حوّل العضوانيات إلى معلق خلوي فردي كما هو موضح في القسم 3.5. قم بالطرد المركزي عند 500 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم أعد التعليق في وسط CTL (المرفق مع طقم CTL ELISpot). قم بإذابة خلايا PBMCs المحفوظة بالتجميد أو استخدم خلايا PBMCs المعزولة حديثاً. قم بالطرد المركزي لخلايا PBMCs عند 500 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. أعد تعليق خلايا PBMCs في وسط الطقم. قم بإجراء الزراعة المشتركة عن طريق خلط الخلايا الفردية للعضوانيات بلطف مع خلايا PBMCs بنسبة 5:1. أضف 200 µL/بئر من خليط الزراعة المشتركة إلى كل بئر من لوحة المقايسة ذات 96 بئراً والمنشطة مسبقاً. انقر على اللوحة بحذر شديد. تحضن لمدة 4 ساعات عند 37 °C. بعد 4 ساعات، أخرج لوحة المقايسة بلطف من الحاضنة. أضف المعالجات إلى الآبار المحددة مع تضمين الضوابط الموجبة والسالبة المناسبة.
      ملاحظة: يجب تحسين نسبة العضوانيات إلى خلايا PBMCs من أجل الحصول على أفضل تطوير لبقع السيتوكين ونتائج المسح.
  3. في اليوم 2،
    1. بعد تحضن لمدة 24 ساعة، اتبع بروتوكول الصبغ الخاص بالشركة المصنعة. ضع في الاعتبار استخدام ضوابط للون الواحد واللون المزدوج للكشف عن عدد الخلايا التي تفرز العلامات المحددة ومقارنتها. يختلف وقت التحضن حسب اللون، ويجب مراقبة تطور البقع بانتظام. قم بمسح اللوحة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم برسم ومقارنة بقع المناعة المفرزة.
      ملاحظة: بناءً على التصميم التجريبي والعلامات المطلوبة، تشير العلاقة بين الخلايا المزروعة والبقع إلى تعبير السيتوكين/الجسم المضاد بلون واحد أو لون مزدوج.

7. الكشف عن الموت الخلوي المبرمج في الوقت الفعلي باستخدام Annexin V NIR وتصوير الخلايا الحية (3 أيام):

عند دمجه مع التصوير الآلي للخلايا الحية، يتيح Annexin V NIR مراقبة فورية وعالية الإنتاجية لموت الخلايا المبرمج من أجل تحليل الاستجابة الدوائية والسمية الخلوية.

  1. في اليوم 0، يتم تحويل العضويات إلى معلق خلوي أحادي. تُصبغ الخلايا باستخدام متتبع خلايا GFP. تُزرع الخلايا الفردية المصبوغة في 100 µL من الوسط الكامل لكل بئر. تُترك الخلايا لتلتصق وتُشكل تجمعات.
    ملاحظة: استخدم أطباق 96 ذات قاع على شكل حرف U فائقة انخفاض الالتصاق. كثافات البدء النموذجية (تُعدل تجريبيًا): 5,000 خلية/بئر، 10,000 خلية/بئر. قم بتضمين آبار للتحكم السلبي غير المعالج، والتحكم في الناقل، وأي معالجات تجريبية (في ثلاث مكررات أو أكثر).
  2. في اليوم 1، يتم إذابة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) المحفوظة بالتبريد أو استخدام PBMCs معزولة حديثًا. تُطرد خلايا PBMCs مركزياً عند 500 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يتم إعادة تعليق PBMCs في وسط التوسيع المدعم بـ IL-2 وتحضينها في الحاضنة.
  3. في اليوم 2، تُصبغ خلايا PBMCs بصبغة متتبع الخلايا الصفراء. بعد الصبغ، يتم إعادة تعليق PBMCs في RPMI. يتم سحب وسط العضويات من الطبق برفق شديد. يتم إجراء الزراعة المشتركة عن طريق خلط الخلايا الفردية للعضويات برفق مع PBMCs بنسبة 1:5. يتم إضافة 200 µL من وسط RPMI الذي يحتوي على PBMCs إلى كل بئر من خليط الزراعة المشتركة. يُنقر على الطبق بحذر شديد ويوضع في الحاضنة.
    ملاحظة: تجنب إزعاج الخلايا الفردية للعضويات الموجودة في قاع الآبار.
  4. يتم التحضين لمدة 2-4 ساعات عند 37 °C. بعد 4 ساعات، يُخرج الطبق برفق من الحاضنة.
  5. يتم تحضير آبار العقاقير مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة. يتم إعادة تشكيل كاشف Annexin V NIR المجفف بالتجميد في 100 µL من الوسط الكامل أو PBS، ويُخلط برفق. يتم تحضير وسط معالجة 2x يحتوي على Annexin V NIR بضعف التركيز النهائي العامل (على سبيل المثال، 1:100 لتخفيف نهائي 1:200) والتأكد من أن الوسط يحتوي على ≥1 mM Ca2⁺.
  6. يُضاف تخفيف 1:200 من Annexin V NIR إلى الآبار. يوضع الطبق في حاضنة تصوير الخلايا الحية لمدة 48-72 ساعة القادمة.
    ملاحظة: يجب تحسين نسبة العضويات إلى PBMCs لضمان تفاعلات كافية بين الخلايا واستجابات استماتية قابلة للقياس.
  7. تصوير وتحليل الخلايا الحية
    1. استخدم عدسة شيئية 4x أو 10x والتقط الصور في قناة NIR لـ Annexin V NIR (بالإضافة إلى قنوات إضافية في حالة التعددية). يتم مسح الطبق كل 4-6 ساعات لمدة 24-72 ساعة، اعتمادًا على مدة المعالجة.
    2. استخدم برنامج تصوير الخلايا الحية مثل IncuCyte CX3. للتقدير الكمي الأساسي، قم بتحليل قناة NIR باستخدام المساحة الكلية أو عدد الأجسام؛ بالنسبة لحركية الخلية الواحدة، استخدم وحدات تحليل Cell-by-Cell أو تحليل الأجسام. في حالة التعددية (على سبيل المثال، متتبع الخلايا الأصفر و GFP)، راجع ملاحظات فك الاختلاط الطيفي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للبدء، قمنا بتوليد عضوانيات ورمية من عينات مأخوذة من عدة مرضى باستخدام سير عمل معياري (الشكل 1). وتتطلب هذه العضوانيات المشتقة من المرضى (PDOs) عادةً أسبوعين من التأسيس، يمكن بعدها توسيعها وتمريرها لإجراء المزيد من الأبحاث. وتجدر الإشارة إلى أن وقت التأسيس وتوليد العضوانيات يختلف باختلاف الأنسجة؛ فعلى سبيل المثال، تحتاج بعض الأنسجة إلى وقت إضافي لتوليد العضوانيات، وتحتاج بعض العضوانيات إلى وقت أطول للوصول إلى درجة التلاقي المناسبة ليتم تمريرها. ويمكن تعديل مكملات وسط العضوانيات وفقاً لذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول، تم وصف طريقة سهلة وقابلة للتكرار لإنتاج العضوانيات الجلدية المشتقة من المرضى (PDOs) والخلايا التائية (T cells) الموسعة من مستودع البنك الحيوي الخاص بنا. كما تم وصف إعدادات الزراعة المشتركة لـ PDO CRC لعينات المرضى ذات الطفرات المختلفة بالتفصيل، بالإضافة إلى نظام العلاج. وأظهرت النتائج التي تم الحصول عليها تأثير العلاج على نماذج الزراعة المشتركة.

يوفر نظام الزراعة المشتركة للعضوانيات الموصوف هنا منصة قوية وقابلة للتكيف لنمذجة التفاعلات البيولوجية المعقدة في المختبر. ومن خلال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يُقر C.K. بالإفصاحات التالية، والتي لا علاقة لها جميعاً بهذه المخطوطة: Loki Therapeutics (تمويل بحثي)، وTeiko (استشاري)، وSeattle Genetics (استشاري)، وInsights Driven Research (استشاري)، وBMS (استشاري)، وGuardant Health (استشاري)، وOMNI Oncology (استشاري)، وExelixis (استشاري)، وNuvectis Pharma (استشاري، أدوية)، وReal CME (مكافآت). ويُعد C.K. وN.T. مخترعين مشاركين في الطلب المؤقت لبراءة الاختراع الأمريكية رقم 63/746,435 المودع في 17 يناير 2025، والذي لا علاقة له بهذه المخطوطة. أما بقية المؤلفين، فليس لديهم أي إفصاحات للإبلاغ عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مركز مونتيفيوري أينشتاين الشامل للسرطان CCSG (P30CA013330). ونتوجه بالشكر إلى Hillary Guzik وRotem Alon وJinghang Zhang وSwathi Swaminathan وJacky Chuen على المساعدة التقنية. أُجريت دراسات قياس التدفق الخلوي باستخدام محلل Cytek Aurora الممول من المعاهد الوطنية للصحة (1S10OD026833-01) في مرفق نواة قياس التدفق الخلوي بكلية ألبرت أينشتاين للطب. كما أُجري التصوير المجهري البؤري باستخدام مجهر Leica STELLARIS 8 الممول من NIH (1S10OD034397-01) في مرفق التصوير التحليلي بكلية ألبرت أينشتاين للطب. وقد تلقى كل من E.N. وW.E. وC.K. دعماً من منح NIH رقم T32CA200561 وR01CA248536 وR42CA287679 وK12CA279871. لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطة.

كما نتقدم بالشكر لمعهد Ruth L. and David S. Gottesman لأبحاث الخلايا الجذعية والطب التجديدي لدعم كل من MM و NS و NT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد الكيميائية والكواشف والأجسام المضادة
مكمل B27 بدون فيتامين A GIBCO C12587-010
مكمل B27 GIBCO 17504-044 
إن-أسيتيل سيستئين Sigma-Aldrich A9165-5G 
نيكوتيناميد Sigma-Aldrich N0636 
عامل نمو البشرة البشري المؤتلف (Human recombinant EGF) Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
بروستاجلاندين E2 Cayman Chemicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
كولاجيناز النوع الثاني Sigma-Aldrich C6885 
هيالورونيداز من النوع الرابع Sigma-Aldrich H3506 
وسط DMEM-F12 المتقدم GIBCO 12634-028 
بنسلين/ستربتومايسين GIBCO 15070063
أولترا جلوتامين من النوع الأول (Ultraglutamine type I) Lonza BE17-605E 
هيبس (HEPES) GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
وسط تجميد لاستعادة المزارع الخلوية GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
مصل بشري، مشتق من بلازما بشرية ذكورية من الفصيلة AB Sigma-Aldrich H3667 
بنزونيز (Benzonase) Merck 70746-3 
إنترفيرون غاما البشري المأشوب Peprotech 300-02 
ديسباز من النوع الثاني (Dispase type II) Sigma-Aldrich D4693 
محلول استعادة الخلايا Corning 354253
Invivogen PrimocinInvivogen ANTPM1NC9141851
إنترلوكين-2 البشري المؤتلف (مُعبّر عنه في بكتيريا E. coli، خالٍ من الحوامل)Biolegend791906
إنترلوكين 7 البشري المؤتلف (مُعبّر عنه في بكتيريا E. coli، خالٍ من البروتينات الحاملة)Biolegend569706
إنترلوكين-15 البشري المؤتلف (خالٍ من الناقل)Biolegend570306
مضاد CD107a (LAMP-1) البشري المرتبط بـ PE/Cyanine5Biolegend328656
بريليانت فيوليت 711 (Brilliant Violet 711)™ مضاد CD137 (4-1BB) البشريBiolegend309832
باسيفيك بلو (Pacific Blue)™ جسم مضاد ضد CD8a البشريBiolegend300928
مضاد CD3 البشري المرتبط بـ APC/Cy7Biolegend317342
anti-human CD4PerCP/Cyanine5.5 مضاد CD4 البشريBiolegend980810
Alexa Fluor® 647 مضاد لـ Granzyme B البشري/الفأريBiolegend515406
مضاد CD56 البشري-PE/Cy7Biolegend985912
PE/Dazzle™ 594 المضاد لـ IFN- البشريγ جسم مضادBiolegend506530
PE المضاد لـ CD274 البشري (B7-H1, PD-L1)Biolegend393608
جسم مضاد مُنقى مضاد لـ CD28 البشريBiolegend302901
Brilliant Violet 510™ جسم مضاد لـ CD45 البشريBiolegend304036
جسم مضاد من الفئران مضاد لـ CD326 البشري (EpCAM) (مقترن بـ PE/Cy7)Biolegend324222
مضاد Ki67Abcamab15580
NucView® طقم تحليل Caspase-3 488 للخلايا الحيةBiotium30029
طقم كشف الموت الخلوي المبرمج Annexin V المرتبط بـ FITC مع PIBiolegend640914
PE/Cyanine7 Annexin VBiolegend640950
Incucyte® صبغة الأنيكسين V ذات الأشعة تحت الحمراء القريبةالعضلة الخياطية4768
حي/ميت™ طقم صبغة الخلايا الميتة الزرقاء القابلة للتثبيت، للإثارة بالأشعة فوق البنفسجيةInvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FischerC34567
صبغة تتبع الخلايا بالأشعة تحت الحمراء البعيدة (Cell Trace Far red)Thermo FischerC34564
CMFDA الأخضرMedChem ExpressHY-126561 
Human TruStain FcX™ (محلول حجب مستقبلات Fc)Biolegend422302
محلول صبغة بريليانت المنظم (Brilliant Stain Buffer)BD Biosciences563794
BD Pharmingen™ محلول صبغ منظم (BSA)BD Biosciences554657
خرز التعويضبيولجيندز (BioLegends)424602
Corning® دولبيكو’محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، تركيز 1X بدون كالسيوم ومغنيسيومCorning20-031-CM
Corning® دولبيكو’محلول ملحي منظم بالفوسفات، تركيز 1X مع الكالسيوم والمغنيسيومCorning20-030-CV
جسم مضاد مضاد لـ PD1 البشري (nivolumab)Merus/SelleckchemA2002
ثنائي ميثيل سلفوكسيدFisher ScientificBP231-100 
وسط ديلوكس ميم (DMEM)جنيسي25-500
محلول EDTA المنظمInvitrogen15575020
مصل جنين البقرVWR97068-075
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)جنيسي25-507
بارافورمالدهيد (PFA)مواد Thermo Scientific الكيميائية0473779L
طقم محلول التثبيت والنفاذيةبي دي (BD)554714
جاسترين 1 البشريMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
مزيج CD3/CD28 STEMCELL Technologies 10971
وسط Immunocult للتوسيعSTEMCELL Technologies 10981
مادة تثبيت ProLong Diamond Antifade مع صبغة DAPIInvitrogenP36962
Triton X-100كيماويات Thermo Scientific215680025
محلول صبغة تريبان الزرقاء، 0.4%Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
الأجهزة والمعدات
وحدة قياس التدفق الخلوي/قياس التدفق الخلوي المركزيةسايتك (ووشي) للعلوم الحيوية (Cytek (Wuxi) Biosciences)طراز رقم N7-0021
جهاز قياس التدفق الخلوي/مختبر سينغInvitrogenATTUNE NXT (موديل رقم 4486517)
المجهر البؤريLeicaSTELLARIS 8
نظام تحليل الخلايا الحيةSartoriusIncucyte CX3

المراجع

  1. Cervantes A, et al. Metastatic colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guideline for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2023;34(1):10-32.
  2. Colonna G. Overcoming barriers in cancer biology research: current limitations and solutions. Cancers (Basel). 2025;17(13):2102.
  3. Liu Y, et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):160.
  4. Rocha Neto J, Gaspar MM, Reis CP. Experimental murine models for colorectal cancer research. Cancers (Basel). 2023;15(9):2570.
  5. Bleijs M, van de Wetering M, Clevers H, Drost J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. EMBO J. 2019;38(15).
  6. Hou X, et al. Opportunities and challenges of patient-derived models in cancer research: patient-derived xenografts, patient-derived organoids and patient-derived cells. World J Surg Oncol. 2022;20(1):37.
  7. Tentler JJ, et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 2012;9(6):338-50.
  8. Drost J, Clevers H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 2018;18(7):407-18.
  9. Zeng G, et al. Advancing cancer research through organoid technology. J Transl Med. 2024;22(1):1007.
  10. Jin MZ, et al. Organoids: an intermediate modeling platform in precision oncology. Cancer Lett. 2018;414:174-80.
  11. Dart A. Organoid 2.0. Nat Rev Cancer. 2019;19(3):126-7.
  12. Cattaneo CM, et al. Tumor organoid-T-cell coculture systems. Nat Protoc. 2020;15(1):15-39.
  13. Neal JT, et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  14. Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Clevers H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 2020;20(5):279-93.
  15. Jang J, et al. Redefining preclinical testing: human-relevant alternatives beyond animal models. BMB Rep. 2025; in press.
  16. Xie BY, Wu AW. Organoid culture of isolated cells from patient-derived tissues with colorectal cancer. Chin Med J (Engl). 2016;129(20):2469-75.
  17. Vlachogiannis G, et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 2018;359(6378):920-6.
  18. Ooft SN, et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Sci Transl Med. 2019;11(513).
  19. Mohammadi M, et al. Cyclin-dependent kinase 9 inhibitors as oncogene signaling modulators in combination with targeted therapy for the treatment of colorectal cancer [Preprint]. bioRxiv. 2025:2025.08.13.669992. doi:10.1101/2025.08.13.669992.
  20. Guo L, et al. Toward reproducible tumor organoid culture: focusing on standardization. Front Immunol. 2024;15:1290504.
  21. Wang J, et al. Tumor organoid-immune co-culture models: exploring a new frontier in cancer research. Cell Death Discov. 2025;11:98.
  22. Najafi M, et al. Organoid-immune co-cultures: a next-generation platform for studying human immunology and disease. Trends Immunol. 2026;47(1):45-62.
  23. Kakni P, et al. A microwell-based intestinal organoid-macrophage co-culture system to study intestinal inflammation. Biomaterials. 2022;276:121018.
  24. Meirelles LA, Persat A. Decoding host-microbe interactions with engineered human organoids. EMBO J. 2025;44(6):1569-73.
  25. Ryu JO, et al. Applications and research trends in organoid-based infectious disease models. Sci Rep. 2025;15:7816.
  26. Du L, et al. Spatial omics in 3D culture model systems. Nat Rev Bioeng. 2025;3(1):45-67.
  27. Lombardi M, et al. Organoid models through the lens of metabolomics. Analyst. 2026;151(4):1458-78.
  28. Skardal A, et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 2020;12(2):025017.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عضويات أورام القولونالزراعة المشتركة للخلايا التائيةقياس التدفق الخلويمقايسة ELISpotالتصوير الحي للخلايامقايسة قتل الورممثبطات نقاط التفتيش المناعيةصبغ الكاسبيز-3إفراز الجرانزيم Bمؤشرات تكاثر الورم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.