تقييم كفاءة النقل واستهداف الخلايا بواسطة الببتيدات المخترقة للخلايا في رئة الفأر

ملخص

يصف هذا البروتوكول سير عمل متكامل لتقييم كفاءة النقل وخصوصية الخلية للببتيدات المخترقة للخلايا، باستخدام الببتيد المستهدف للرئة الحلقي R11A (cR11A؛ KAPWHLSSQYSAT) كمثال. يجمع سير العمل بين FACS المزدوج يتبعه تسلسل RNA الخلوي الواحد، وقياس تدفق الخلايا في فئران المراسلين AT2، وتصوير z-stack كونفوكال لتأكيد تفاعل الببتيدات المستهدفة المرتبطة ب AT2.

الملخص

الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) هي ببتيدات قصيرة (5–30 حمضا أمينيا) قادرة على عبور أغشية الخلايا وتوصيل الشحنات الجزيئية الكبيرة دون الحاجة إلى كواشف النقل. ومع ذلك، فإن تعريف الانتقائية الخلوية في الجسم الحي يتطلب التحقق من الصحة على مستوى نوع الخلية. يتم تقديم سير عمل متكامل لتقييم كفاءة النقل لجهاز CPP دوري موسوم ب Cy5.5، cR11A، داخل خلايا الظهارة الحنخيية من النوع الثاني (AT2) بعد الحقن الوريدي بالجناح الرجعي في الفئران. تم جمع الرئتين بعد 15 أو 60 دقيقة من الحقن وتحليلها باستخدام قراءات تكميلية، بما في ذلك فرز الخلايا المنشطة بالفلورة المزدوجة (FACS) لعزل معلقات خلية واحدة من Cy5.5⁺ وCy5.5⁻ تلتها تسلسل RNA بخلية واحدة، وقياس خلوي تدفق الخلايا الفردية للرئة من Sftpc-CreERT2^(+/−)؛ فئران ^{LSL-GFP(+/−)} AT2 لقياس أحداث GFP⁺/Cy5.5⁺، وتصوير Z-stack كونفوكال لعمليات التبريد الرئية لتأكيد التداخل مع cR11A-Cy5.5 مع إشارة مرتبطة ب AT2. يوفر هذا البروتوكول أدلة متوافقة على تفاعل أنواع الخلايا باستخدام عدة قراءات مكملة ويوفر إطارا قابلا للتكرار لتقييم استهداف الخلايا الخاصة ب CPPs، مع تعديلات لأعضاء مستهدفة مختلفة.

المقدمة

الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) هي 5–30 ببتيدا من الأحماض الأمينية يمكنها عبور أغشية الخلايا وتسهيل توصيل البروتينات الجزيئية الكبيرة داخل الخلية بشكل سليم ووظيفي بالكامل دون الحاجة إلى كواشف النقل ^1,2. أظهرت أبحاث سابقة باستخدام منهجيات عرض العميليات في المختبر وفي الجسم الحي، ببتيدا مكونا ب 12 حمضا أمينا يستهدف القلب (APWHLSSQYSRT) يتم امتصاصه تحديدا من خلايا عضلة القلب خلال 5 دقائق ^3,4 فقط. لدراسة آلية تحويله، أجري مسح ألانين، مما أدى إلى اكتشاف نوعين من النوعين، S7A وR11A (APWHLSSQYSAT)، أظهرا بشكل غير متوقع تثريبا في الرئة في الجسم الحي. ولذلك أطلق عليهما اسم الببتيدات المستهدفة للرئة (LTPs)⁵. علاوة على ذلك، أدى إضافة الليسين في الطرف N والدورة من الرأس إلى الذيل إلى إنتاج نسخة دورية من R11A (cR11A) مع استقرار مصلي أفضل بشكل ملحوظ وزيادة ملحوظة في امتصاص الخلايا مقارنة بنظيره^{الخطي 5}.

تمتلك الخلايا الظهارية طويلة الأمد القدرة على توصيل العلاجات بدقة إلى مجموعات الظهارة في الرئة البعيدة، بما في ذلك خلايا الظهارة الحنيخية من النوع الثاني (AT2). تعد هذه الخلايا ضرورية للحفاظ على توازن المواد الفعالة للتوتر السطحي وتعمل كأسلاف لتجديد السنيخات⁶. ومع ذلك، فإن التحدي الرئيسي في تطوير LTP هو التقييم الدقيق للانتقائية الخلوية في الجسم الحي. التوزيع البيولوجي على مستوى الأعضاء وحده لا يمكنه التمييز بين الانتقال الخلوي الحقيقي والإشارة الوعائية، أو الاحتفاظ خارج الخلية، أو التنظيف البلعمي، وبالتالي يجب أن يكمله قياسات خلية واحدة محلولة⁷. لمعالجة هذا القيد، يدمج هذا السير التعيين النصي لخلية واحدة، وقياس خلوي التدفق المعتمد على المراسل، وتصوير مكدس Z الكونفوكال لتوليد أدلة على مستوى نوع الخلية على تفاعل الببتيدات بما يتجاوز قراءات الفلورة أو التوزيع الحيوي على مستوى الأعضاء ^8,9.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير سير عمل متعدد القراءات قابل للتكرار للتحقق من كفاءة النقل في الجسم الحي وخصوصية الخلية في cR11A الموسوم ب Cy5.5 في الرئة البعيدة، مع التركيز على خلايا AT2 بعد الحقن بالعكس. يعرف البروتوكول هوية الخلايا المرتبطة بالببتيدات باستخدام قراءات تكميلية ومستقلة، بما في ذلك فرز الخلايا المنشطة بالفلورية المزدوجة (FACS) (Cy5.5⁺ مقابل Cy5.5⁻) تليها تسلسل RNA لخلية واحدة لرسم خريطة السكان المرتبطة بالببتيدات، وتقييم الامتصاص الكمي في رئتي مبلغي AT2 عبر قياس تدفق الخلية، والتصوير الكونفوكال Z-stack لعمليات التبريد في الرئة لتأكيد التزامن مع cR11A-Cy5.5 مع إشارة مرتبطة ب AT2. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع علاجات طويلة الأمد أو ناقلات توصيل أخرى وتطبيقه على الرئة أو أنظمة الأعضاء الأخرى لتقييم خصوصية الخلايا في CPPs قيد التطوير. وهو مناسب بشكل خاص للتطبيقات التي تتطلب التحقق من صحة نوع الخلية لاستهداف CPP في الجسم الحي بدلا من تقييم تراكم الأعضاء فقط.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في عيادة مايو، وتمت الموافقة عليها بموجب البروتوكول رقم A00006842-22-R25. تم بذل كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات وضمان التعامل الأخلاقي مع الامتثال للوائح الوطنية والمؤسسية ذات الصلة. أدوات البحث المستخدمة لهذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. الحيوانات

1. استخدم فئران مختلطة الجنس بالغة C57BL/6J (عمرها 6–8 أسابيع) التي تم الحصول عليها من مختبر جاكسون (السلالة #000664).
2. للقياس النوعي ل AT2، استخدم Sftpc-CreERT2^(+/+) (سلالة Jax #028054) متقاطع مع LSL-GFP^(+/+) (سلالة Jax #007906) لتوليد Sftpc-CreERT2^(+/−)؛ فئران مراسل ^{LSL-GFP(+/−)} AT2.
3. فئران المنزل في أقفاص مهواة بشكل فردي. تأكد من أن جميع بروتوكولات الحيوانات معتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية.
4. إجراء تحفيز تاموكسيفين في Sftpc-CreERT2^(+/−)؛ فئران ^{LSL-GFP(+/−).} عندما تبلغ الفئران ≥6 أسابيع، أعط 100 ملغ/كجم تاموكسيفين مذاب في زيت الذرة عبر التمهيد الفموي لمدة ثلاث جرعات على مدى 7 أيام. قم بإجراء تجارب بعد أسبوعين على الأقل من الجرعة النهائية للسماح بأقصى كفاءة في إعادة التركيب.

2. تحضير المواد الكيميائية والمعدات

1. حضر تخديرا (مزيج عمل الكيتامين/زيلازين).
   1. حضر محلول عمل بسعة 5 مل: كيتامين (1 مل 50 ملغ/مل)، زيلازين (50 ميكرولتر 100 ملغ/مل)، ومحلول ملحي معقم (3.95 مل).
   2. أعط 1 ميكرولتر/جم وزن الجسم عبر .حقن داخل الصفاق (الجرعة النهائية: 10 ملغ/كجم كيتامين و1 ملغ/كغ زيلازين).
2. تحضير الببتيد (cR11A-Cy5.5).
   1. احصل على CPPs كمسطحات مصابة بالليوفيل. تخزين المسطحات عند −20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنتين أو كمحاليل مخزونية في DMSO عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر في أنابيب محمية من الضوء. تجنب دورات التجمد والذوبان وقلل من التعرض للضوء. جهز محلول مخزون بسعة 10 مللي مولار من cR11A-Cy5.5 في DMSO.
   2. وزن الفأرة، وحساب الجرعة، وتخفيف المخزون إلى 1 ملغ/كغ في ماء خال من النوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل فأر.
3. حضر محلول هضم (طازج؛ احتفظ به على الثلج).
   1. جهز محلول هضم يحتوي على 2 ملغ/ملليتر ديسباز II، 0.1 ملغ/ملليتر DNase I، DMEM/F12، و1٪ (v/v) بنسلين-ستريبتومايسين.
   2. استخدم 3 مل لكل فأرة.
4. حضر محلول غسيل إنزيم بروتيزي غير محدد (احتفظ به على الثلج).
   1. يحتوي DMEM/F12 على 0.05 ملغ/ملتر DNase I و1٪ (v/v) بنسلين-ستريبتومايسين.
   2. استخدم 10 مل لكل فأرة.
5. جهز حاجز تحلل خلايا الدم الحمراء (احتفظ بالبرد).
   1. قم بتخفيف 10× محلول التحلل إلى 1× باستخدام PBS.
   2. استخدم 2 مل لكل عينة.
6. جهز مخزن التروية.
   1. استخدم DMEM/F12 البارد جدا (10 مل لكل فأرة).
7. جهز حاجز الغسيل.
   1. استخدم DMEM/F12 مع 2٪ FBS.
8. الطرد المركزي قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية.

3. إعطاء cR11A-Cy5.5 بنظام المدار الرجعي

1. قم بتخدير الفأر باستخدام محلول الكيتامين/زيلازين العامل. تأكد من وجود تخدير كاف من خلال عدم وجود انسحاب للطرف استجابة لقرص إصبع القدم.
2. حقن 100 ميكرولتر من cR11A-Cy5.5 (1 ملغ/كجم) عن طريق حقن وريدي بخلفية الحجاج باستخدام حقنة الأنسولين.
3. شغل المؤقت وحافظ على الفأرة على وسادة تسخين تحت مراقبة مناسبة لمدة 15 أو 60 دقيقة.

4. حصاد الرئة والتروية

1. قتل الفأر وفقا للبروتوكولات المعتمدة (مثل استنشاق CO₂ يليه خلع عنقي الرقبة). ضع الفأر في وضعية الاستلقاء ورش الصدر بنسبة 70٪ إيثانول.
2. افتح تجويف الصدر لكشف القلب والرئتين.
3. قم بعمل شق في الأذين الأيمن للسماح بتصريف المياه أثناء التروية.
4. أدخل إبرة 26 جرام متصلة بحقنة 10 مل تحتوي على DMEM/F12 بارد جدا في البطين الأيمن. حافظ على فتح الشق الأذيني الأيمن طوال فترة التروية للسماح بالتصريف.
5. قم بالحقن يدويا بدون مضخة حقنة عن طريق حقن 10 مل من DMEM/F12 ببطء وثبات خلال حوالي دقيقة إلى دقيقتين. حافظ على ضغط منخفض أثناء الحقن وتجنب الانتفاخ الزائد أو التسرب الظاهر في الرئة من جدار البطين. استمر حتى تصبح الرئتان شاحبين بشكل موحد.

5. انتفاخ الرئة والهضم

1. قم بتقلب القصبة الهوائية بقسطرة وريدية بوزن 20G وثبتها بخياطة حرير 3-0. زرع محلول هضم بسعة 1 مل عبر حقنة بسعة 1 مل لنفخ الرئتين.
2. قم بتشريح الرئتين كوحدة واحدة سليمة وانقله فورا إلى طبق مبرد مسبقا بحجم 100 مم على الثلج.
3. فصل فصوص الرئة وانقله إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 2 مل من حاجز الهضم البارد (رئة واحدة لكل أنبوب).
4. حضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 ساعة على جهاز هزاز دوار (10–15 دورة في الدقيقة).
   ملاحظة: راجع جاناس PP. ^{وآخرون 10} للمنهجية التفصيلية.

6. تفكك الأنسجة

1. ضع مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي بحجم 50 مل وترطبها مسبقا باستخدام محلول غسيل إنزيم بروتياز غير محدد بسعة 1 مل.
2. انقل أنسجة الرئة إلى المصفاة وقم بتفكيك التيار بلطف باستخدام مكبس حقنة معقمة.
3. اشطف بمحلول غسيل إنزيم بروتيز غير محدد بسعة 10 مل فقط.
4. الطرد المركزي عند 130 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
5. أعد تعليق الحبيبة في مخزن تحلل RBC بسعة 2 مل 1× لمدة 90 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
6. تفكيك التبريد باستخدام محلول غسيل 10 مل.
7. فلتر عبر مصفاة بحجم 40 ميكرومتر وشطفها باستخدام محلول الغسيل.
8. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
9. أعد تعليق الخلايا في 500–1000 ميكرولتر PBS + 2٪ FBS (≥1 × 10⁶ خلايا/مل).
10. مرر عبر غطاء فلتر بحجم 35 ميكرومتر إلى أنبوب FACS.
    ملاحظة: راجع Konishi S. وآخرون ¹¹ للمنهجية التفصيلية.

7. ترتيب FACS الكسور المزدوجة

1. قم بإجراء الفرز باستخدام مقياس تدفق خلوي.
2. استخدم الرئتين المحقونتين ب PBS كتحكم سلبي لتحديد بوابة Cy5.5.
3. تطبيق التداخل القياسي: استبعاد الحطام، الطبقات الفردية، وخلايا Cy5.5⁺.
4. قم بفرز مجموعات Cy5.5⁺ وCy5.5⁻ في أنابيب منفصلة.

8. تحضير عينات scRNA-seq

1. احتفظ بالعينات المصنفة على الثلج.
2. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليقها في مخزن 500 ميكرولتر.
3. تابع فقط إذا كانت الصلاحية ≥80٪).
4. جهز المكتبات والتسلسل حسب الحاجة.

9. قياس التدفق الخلوي في فئران AT2 Reporter

1. تحضير تعليق خلية واحدة للرئة كما هو موضح في الأقسام 5–6.
2. صبغ بصبغة قابلة للإصلاح (1:1,000) لمدة 30 دقيقة (للحماية من الضوء).
3. اغسله واستخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. قم بتصفية العينات واحتفظ بها على الثلج.
5. احصل على بيانات على جهاز قياس تدفق السايتومتر.
6. قم بإجراء البوابة لتحديد الخلايا، واختيار الطبقات المنفردة، واستبعاد الخلايا الميتة، وتحديد مجموعات GFP وCy5.5.
   1. قم بقياس أحداث GFP⁺/Cy5.5⁺ كنسبة مئوية من خلايا GFP⁺.

10. التثبيت والحماية بالتبريد

1. نفخ الرئتين ب 1 مل 4٪ من PFA وثبت القصبة الهوائية.
2. أثبت 10 مل 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
3. اغسله ب PBS (3×).
4. حضن السكروز بنسبة 15٪ طوال الليل.
5. انقل إلى 30٪ سكروز لمدة ~48 ساعة.

11. التضمين والتقسيم بالتجميد

1. جهز قوالب التجميد باستخدام OCT ووضع الرئتين ودمجه في OCT.
2. تجميده باستخدام النيتروجين السائل. تخزين عند 80 درجة مئوية.
3. مقطع عند 10 ميكرومتر بعد التوازن. ينزلق ليجف في الهواء طوال الليل.

12. التصوير والتحليل

1. اغسل الأقسام باستخدام PBS (3×).
2. ركبته باستخدام وسط DAPI.
3. احصل على مجموعات Z كونفوكل.
4. استخدم إعدادات التصوير المناسبة.
5. قم بإعادة بناء ثلاثية الأبعاد.
6. قم بقياس التجمع المشترك باستخدام عتبات متسقة.
   طرق اختيارية:
   هذه الطرق الاختيارية غير مدرجة في سير العمل التمثيلي، لكنها قد تدمج لتمكين استنزاف أو تحليل مجموعة خلايا المناعة CD45⁺، والتي تشكل نسبة كبيرة من خلايا الرئة¹².
   ملاحظة: استخدم استنزاف أو استبعاد CD45⁺ عندما يتركز التحليل على تجمعات الرئة غير المناعة، حيث تزيل هذه الخطوات أو تفصل إشارات امتصاص الخلايا المناعية وتغير تركيب الخلايا في العينة. يمكن أيضا استخدام صبغة CD45 لتحليل مجموعة الخلايا المناعية CD45⁺ بشكل منفصل.

13. استنزاف عدد الخلايا CD45⁺

1. بعد تفكك الأنسجة (الخطوة 6)، استخدم إما جسما مضادا CD45 مرتبط بخرزة مغناطيسية (Miltenyi Biotech 130-052-301) أو جسم مضاد CD45 مرتبط بفلوروفور متوافق مع Cy5.5 وGFP والصبغة الحية/الميتة، مثل CD45-BV605 (BioLegend #103140). ضع الصبغ لمدة 20 دقيقة عند 4°C في الظلام.
2. إذا كنت تقوم بإجراء استنزاف الخرزات المغناطيسية لقرص CD45، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لاستخدام عمود استنزاف النسب (LD) (Miltenyi Biotech 130-042-901) وتابع فصل الخلايا المغناطيسية (MACS) (Miltenyi Biotech). ثم انتقل إلى فرز FACS الكسور المزدوجة (الخطوة 7).
3. إذا كنت تجري تفريغ CD45 باستخدام جسم مضاد مترابط فلوري، اغسل أولا تعليق الخلية باستخدام محلول غسيل لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. ثم انتقل إلى الخطوة 7. بعد إنشاء بوابات لاستبعاد الدوبلات والحطام (الخطوة 7.3)، أدخل بوابة إضافية لاستبعاد مجموعة CD45⁺ . ثم انتقل إلى الخطوة 7.4.

14. تحليل مجموعة خلايا CD45⁺ أثناء قياس تدفق الخلايا

1. بعد الخطوة 9.3، استخدم جسما مضادا CD45 مرتبطا بفلوروفور متوافق مع Cy5.5 وGFP والصبغة الحية/الميتة، مثل CD45-BV605 (BioLegend #103140). ضع الصبغ لمدة 20 دقيقة عند 4°C في الظلام.
2. اغسل تعليق الخلية باستخدام مخزن الغسيل لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. ثم انتقل إلى الخطوة 9.4. بعد إنشاء بوابات لاستبعاد التشابكات والحطام (الخطوة 9.6)، أدخل بوابة إضافية لاستبعاد مجموعة CD45⁺ قبل البوابة لتحديد مجموعات ^GFP+ و Cy5.5^{+ 12}.

النتائج

يجب أن يولد التطبيق الناجح لهذا البروتوكول أدلة متوافقة من ثلاث قراءات تكميلية: تسلسل الحمض النووي الريبي السكري المزدوج (scRNA)، وقياس تدفق الخلايا المعتمد على المبلغ، والتصوير الدائري الكونفوكلي z-stack.

في تحليل scRNA-seq المزدوج الكسور، تم استرداد أجزاء خلية واحدة من Cy5.5⁻ وCy5.5⁺ بعد الإعطاء الجهازي ل cR11A-Cy5.5 وتحليلها بشكل منفصل. حدد تصور UMAP مجموعات رئيسية لخلايا الرئة، بما في ذلك المناطق المناعية، والبطانة، والظهارة، والميزنشيمية (الشكل 1A، B). على الرغم من أن الخلايا المناعية مثلت المجموعة السائدة في كلا الجزئين المرتبين، إلا أن نسبة Cy5.5⁺ أظهرت إثراء نسبي للأقسام غير المناعية، بما في ذلك الخلايا الطهارية (الشكل 1C). أظهر تحليل المجموعات الظهارية تمثيلا أكبر لخلايا AT2 في جزء Cy5.5⁺ مقارنة بجزء Cy5.5⁻، بينما بقيت خلايا AT1 منخفضة في كلا الجزئين (الشكل 1D). تشير هذه النتائج إلى أن تسلسل scRNA-seq المزدوج يمكن أن يحدد إثراء خلايا AT2 ضمن جزء خلايا الرئة الإيجابي cR11A-Cy5.5.

تم استخدام قياس خلوي التدفق لقياس إشارة cR11A-Cy5.5 داخل خلايا AT2 المعرفة من قبل المراسل. شملت البوابات التمثيلية اختيار الخلايا الكلية بواسطة FSC-A/SSC-A، وبوابتين متسلسلتين من الوحدات الفردية، وتحديد الخلايا الحية، واختبار GFP النهائي ضد. تحليل Cy5.5 (الشكل 2A–E). في عينة الضابطة، كانت أحداث GFP⁺/Cy5.5⁺ قليلة، مما حدد عتبة التألق الخلفي. بعد إعطاء cR11A-Cy5.5، ارتفعت الأحداث الإيجابية للإبلاغ عن AT2 في GFP⁺/Cy5.5⁺ إلى 7.99٪ عند 15 دقيقة و7.41٪ عند 60 دقيقة بعد الحقن في هذه المجموعة التمثيلية (الشكل 2E). تدعم هذه النتائج إشارة cR11A-Cy5.5 القابلة للكشف في خلايا المراسل الإيجابية ل AT2 في الجسم الحي.

يوفر التصوير الكونفوكال Z-stack التحقق المكاني للفلورة المرتبطة بالببتيدات في أقسام نسيج الرئة. تم تضمين ضابط غير مبلغ لتقييم التألق الخلفي وأظهر إشارة قليلة في قنوات GFP وCy5.5. في رئتي المراسلين AT2 المعالجين بمعالجة cR11A-Cy5.5، تم اكتشاف فلورة Cy5.5 بالقرب من خلايا GFP⁺ AT2 الإيجابية، وحددت قناة التجمع المولدة من إيماريس تداخلا بين إشارات GFP وCy5.5 (الشكل 3A). أظهر تحليل التداخل التمثيلي لإيماريس وجود 89.6٪ و86.8٪ ضمن قسم GFP⁺ AT2 عند 15 دقيقة و60 دقيقة على التوالي (الشكل 3B).

قد تشمل النتائج غير المثالية ارتفاع فلورة الخلفية Cy5.5 في عينات التحكم، أو ضعف تعافي الخلايا الظهارية، أو انخفاض القدرة على العيش في الخلايا، أو ضعف فصل أحداث GFP⁺/Cy5.5⁺. عادة ما تشير هذه المشاكل إلى نقص في التروية، أو اضطراب مفرط في الأنسجة، أو تعويض غير كاف، أو عتبات تصوير غير متسقة.

الشكل 1: يحدد تسلسل الفصول المزدوجة scRNA-seq تخصيب الظهارة السنخية في الجزء الرئوي الإيجابي cR11A-Cy5.5. تم تصنيف التعليق أحادي الخلية في الرئة إلى أجزاء Cy5.5⁻ وCy5.5⁺ بعد الحقن الرجعي ل cR11A-Cy5.5، وتم تحليل كل جزء بواسطة تسلسل RNA خلوي واحد. (أ) تظهر مخططات UMAP عناقيد من نوع الخلية في كسور متطابقة من فأرة ممثلة. (ب) يظهر تراكب UMAP توزيع خلايا Cy5.5⁻ و Cy5.5⁺. تشير المناطق الدائرية في (A) و(B) إلى الحيز الظهاري المميز لتحليل المجموعات الظهارية. (ج) تجمع المناعة منتشر بشكل كبير في كلا الجزئين، حيث يمثل أكثر من 80٪ من كل جزء. مقارنة بجزء Cy5.5⁻، يحتوي جزء Cy5.5⁺ على نسبة أكبر من التجمعات البطانية والظهارية والميزنشيمية، مما يشير إلى امتصاص cR11A داخل هذه التجمعات. (د) داخل مجموعة الظهارة، تكون خلايا AT2 ممثلة بشكل أكبر في جزء Cy5.5⁺ مقارنة بجزء Cy5.5⁻، بينما تبقى خلايا AT1 منخفضة في كلا الجزئين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: التحقق من صحة تدفق الخلايا الخلوية لامتصاص cR11A-Cy5.5 في رئتي مبلغي AT2. تم إعطاء فئران المبلغين AT2 من خلال الحقن الوريدي بعكسية الحجاج ، وتم جمع الرئتين بعد 15 دقيقة أو 60 دقيقة من الحقن لتحضير الخلية الواحدة. يظهر البوابة التمثيلية لعينات المعالجة ب PBS (Ctrl) وcR11A-Cy5.5: (A) تم اختيار الخلايا بواسطة FSC-A/SSC-A، (B, C) تم تحديد الخلايا المنفردة بواسطة استبعاد مزدوج قائم على التشتت، (D) تم تحديد الخلايا الحية من خلال استبعاد صبغات الحياة، و(E) GFP (مراسل AT2) مقابل. تم استخدام Cy5.5 لقياس أحداث GFP⁺/Cy5.5⁺. في هذه المجموعة التمثيلية من البيانات، كانت أحداث GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 حوالي 8٪ في كل من 15 دقيقة و60 دقيقة بعد إعطاء cR11A-Cy5.5. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التصوير الكونفوكي وتحليل التزامن الإيماريس لامتصاص cR11A-Cy5.5 في رئتي مراسلي AT2. (أ) تظهر الحقول الممثلة لرئتي AT2 المعالجتين ب cR11A-Cy5.5 بعد 15 دقيقة أو 60 دقيقة من الحقن للتجميد والتصوير الكونفوكال Z-stack. إشارة GFP (باللون الأخضر) تشير إلى خلايا AT2، ويشير فلورة cR11A-Cy5.5 (باللون الأحمر) إلى إشارة مرتبطة بالببتيدات. تعرض لوحة "Coloc" بكسلات أو كائنات مصنفة كمتمركزة بواسطة Imaris (أصفر)، وتظهر الصور المدمجة التداخل المكاني بين القناتين. تم تضمين الضابط غير المبلغ لتقييم التألق الخلفي في قنوات GFP وCy5.5. (ب) قياس التداخل داخل حجرة GFP⁺ AT2 يظهر أن 89.6٪ و86.8٪ من إشارة GFP تم توطينها مع cR11A-Cy5.5 خلال 15 دقيقة و60 دقيقة على التوالي. تشير هذه البيانات إلى وجود تداخل قوي مع خلايا GFP⁺ AT2 في كلا النقطتين الزمنيتين، مما يدعم التفاعل التفضيلي لقسم AT2 في الجسم الحي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يحدد هذا البروتوكول استهداف الببتيدات لمجموعات خلايا محددة باستخدام عدة قراءات مستقلة تعمل بدقة تكميلية: رسم الخرائط على مستوى النسخات (scrna-seq الكسر الزوج)، القياس الكمي القائم على الأحداث (قياس تدفق التقرير)، والتأكيد المكاني (مكدسات Z الكونفوكلية). معا، تقلل هذه الأساليب من الغموض الشائع في الدراسات القائمة على الفلورة أو التوزيع الحيوي الجماعي على مستوى الأعضاء، مثل التوهج الوعائي المربك أو الاحتفاظ خارج الخلية، بالإضافة إلى عدم القدرة على تعيين إشارة مرتبطة بالببتيدات لمجموعات خلايا رئة محددة⁷.

تتطلب عدة خطوات اهتماما خاصا. تؤثر جودة التروية بشكل كبير على التألق الخلفي وأداء الفرز في المراحل النهائية؛ يتميز التفريغ الكافي بمظهر أبيض عاجي موحد لجميع فصوص الرئة، في حين يمكن أن يؤدي التفريغ غير الكامل إلى رفع إشارة Cy5.5 في الحجرات غير المستهدفة. لتفكك الأنسجة، يستخدم الهضم المطول في البرودة (4 درجات مئوية، 20 ساعة) بدلا من ظروف الهضم المعتادة (37 درجة مئوية، 1–2 ساعة) للحفاظ على مجموعات الخلايا الطهارية وتحسين تعافي الخلايا الهشة، خصوصا الخلايا السنخية من النوع الأول (AT1)¹⁰. تفقد خلايا AT1 بسهولة أثناء العزل لأن شكلها الكبير والرقيق يجعلها شديدة الحساسية للهضم الميكانيكي. بعيدا عن الممارسات المختبرية القياسية، بما في ذلك الهضم المتسق، والتعويض، والتحديد السطحي، والعتبة، يساعد تحليل التداخل ثلاثي الأبعاد في تحديد ما إذا كانت إشارة الببتيد تتداخل مع إشارة المبلغ AT2 بدلا من الاعتماد على تداخل الفلورة ثنائي الأبعاد^{فقط 13}.

قد يتم النظر في خطوة استنزاف خلايا المناعة CD45⁺ قبل قياس sRNA-seq أو قياس تدفق الخلايا الكهربائية. تشكل الخلايا المناعية نسبة كبيرة من مجموعات خلايا الرئة وقد تمتص CPPs كجزء من استجابة مناعية نموذجية للجسيمات الغريبة. لقياس امتصاص CPP بدقة أكبر داخل المجتمعات غير المناعة، بما في ذلك أقسام البطانة والظهارة والميزنشيمية، قد يحسن استنزاف خلايا CD45⁺ الحساسية. يمكن تحقيق ذلك باستخدام الاستنزاف القائم على الخرزات قبل الفرز أو عن طريق استبعاد خلايا CD45⁺ أثناء تحليل تدفق القياس^{الخلوي 12}. ومع ذلك، يجب استخدام هذا التعديل بشكل انتقائي لأنه يزيل معلومات امتصاص الخلايا المناعية ويغير تركيب الخلايا للعينة المحللة.

يجب أخذ عدة قيود لهذا سير العمل في الاعتبار. يحدد فلورة Cy5.5 الإشارة المرتبطة بالببتيدات لكنها لا تميز بحد ذاتها بين الببتيد الداخلي والإشارة الملتصقة بالغشاء أو الإشارة حول الخلية. تتأثر نسبة scRNA-seq المزدوجة أيضا بتفكك الأنسجة، واستعادة الخلايا، وعتبات الفرز، والوفرة النسبية لكل مجموعة من خلايا الرئة. لذلك، قد تكون مجموعات نادرة مثل الخلايا القاعدية أو الخلايا الأيونية ممثلة بشكل ناقص أو مفقودة. يوفر قياس تدفق الخلية بالفأر المراسل تعيينا أقوى لنوع الخلية لكنه يتطلب خط مراسل مناسب أو لوحة أجسام مضادة موثقة. بالإضافة إلى ذلك، فإن التحكم في المركبات باستخدام فئران المراسلة سيحدد بشكل أفضل التزامن الخلفي داخل خلايا GFP⁺ AT2 في اختبارات التصوير. لذلك يجب أن يعتمد التفسير على أدلة متوافقة عبر تسلسل scRNA، وقياس تدفق الخلية، والتصوير الكونفوكالي بدلا من أي قراءة واحدة.

هذا سير العمل معياري ويمكن تكييفه مع الفلوروفورات البديلة، خطوط الفئران المراسلة، أنظمة الجرعات، أو نقاط الحصاد. بالنسبة للدراسات التي تطور CPPs إضافية خاصة بالخلايا أو الأعضاء، يمكن تطبيق تصميم scRNA-seq المزدوج مع تعديلات على أعضاء أخرى (مثل الكبد أو الكلية أو الدماغ). يوفر هذا البروتوكول نهجا فعالا لمقارنة التجمعات المرتبطة بالببتيدات داخل عضو واحد من نفس الحيوان، مما يحسن التفسير مع تقليل التباين بين الحيوانات. تشمل التطبيقات المستقبلية فحص CPPs إضافية، واختبار مرافق CPP–Cargo ومقارنة تصاميم الببتيدات الخطية والدورية، وتطبيق سير العمل على نماذج الأمراض التي يتم فيها تعديل بنية الأنسجة أو وفرة الخلايا المستهدفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	يستخدم لتحديد أو استبعاد الخلايا CD45+
فئران C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Strain #000664	فئران من النوع البري تستخدم في التجارب
CD45 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301	يستخدم لإزالة الخلايا المغناطيسية CD45+
عداد الخلايا	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	عد الخلايا الآلي
حاضنة CO2	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	تحضين الخلايا
مجهر دقيق متحد البؤر	Zeiss	LSM 980; 1872-551	يستخدم للحصول على صور المكدس z
الببتيد cR11A-Cy5.5	Mayo Clinic Proteomics Core	تركيب مخصص؛ لا يوجد رقم كتالوج	CPP مُعلق فلورسنتًا ويستخدم للتوصيل داخل الجسم
الأجهزة المجمدة	Leica Biosystems	Leica CM1950	يستخدم لقطع الأنسجة
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	إنزيم يستخدم لهضم أنسجة الرئة
DMEM/F12	Gibco	11330-032	محلول لفصل الخلايا وغسلها
DNase I	Roche	10104159001	يقلل من تكتل الخلايا الناجم عن الحمض النووي
فاصل الخلايا FACS	BD Biosciences	BD FACSAria II, 4 نظام ليزر	يستخدم لفرزة الخلايا Cy5.5+ و Cy5.5-
FBS	Gibco	A52567-01	يُضاف إلى الوسائط لتحسين حيوية الخلايا
برنامج FlowJo	FlowJo	الإصدار 10.10.0	تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
برنامج GraphPad Prism	GraphPad Software	الإصدار 10	التحليل الإحصائي ورسم المخططات
برنامج Imaris	Oxford Instruments	الإصدار 9.9.1	التصور ثلاثي الأبعاد وتحليل التوضع
مذبذب مداري محضن	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	يستخدم لهضم الأنسجة
Ketamine	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
أعمدة LD	Miltenyi Biotec	130-042-901	يستخدم لفصل الخلايا المغناطيسية (MACS)
أعمدة LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
مجموعة صبغة خلايا الموت الصالحة للحياة الصفراء	Invitrogen	L34968	يستخدم لتلطيخ الأحياء في قياس التدفق الخلوي
مجموعة صبغة خلايا الموت الصالحة للحياة الصفراء	Invitrogen	L34968
فئران LSL-GFP المبلغ	The Jackson Laboratory	Strain #007906	خط التعبير عن GFP القابل للحث بواسطة Cre
فئران LSL-GFP المبلغ	The Jackson Laboratory	Strain #007906
طارد ميكروسنتريفوج	Eppendorf	EPP-5427R	ترسيب العينة
طارد ميكروسنتريفوج	Eppendorf	EPP-5427R
وسط تثبيت مع DAPI	Abcam	AB104139	صبغة مضادة للنواة لتصوير
وسط تثبيت مع DAPI	Abcam	AB104139
ماء خالٍ من النيوكلياز	Qiagen	175034992
إبرة تجويع فموي	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	محلول غسل عام
PBS	Gibco	10010-023
البنسيلين-ستربتومايسين	Gibco	15140-122	يمنع التلوث البكتيري
البنسيلين-ستربتومايسين	Gibco	15140-122
الطرد المركزي المبرد	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	ترسيب الخلايا عند درجة حرارة مضبوطة
الطرد المركزي المبرد	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
الملح	Baxter	2F7124
فئران Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054	خط Cre قابل للحث النوعي لخلايا AT2
فئران Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054
فئران Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 المبلغ	تربى في المنزل	تم توليدها عن طريق عبور فئران Sftpc-CreERT2(+/+) مع فئران LSL-GFP(+/+)	يستخدم لتسمية AT2 النوعية لـ GFP
فئران Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 المبلغ	تربى في المنزل	تم توليدها عن طريق عبور فئران Sftpc-CreERT2(+/+) مع فئران LSL-GFP(+/+)
غرزة حريرية	Look	SP117
خدمة تسلسل RNA أحادي الخلية	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	إعداد المكتبة وتسلسلها
خدمة تسلسل RNA أحادي الخلية	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
حاضنة حمام مائي	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	حضانة بدرجة حرارة مضبوطة
حاضنة حمام مائي	Fisherbrand	Isotemp GPD 28
Xylazine (Rompun)	Dechra	NADA #047-956