التموقع المناعي ثلاثي الأبعاد في خلايا الذرة الانقسام

ملخص

يحافظ هذا البروتوكول المناعي في الخلايا الانقسامية الذكورية على سلامة الخلايا ثلاثية الأبعاد أثناء الانقسام الاختزالي. يسمح بتتبع التوطين الديناميكي داخل الخلية لما يصل إلى ثلاثة أجسام مضادة مستقلة في مادة ثابتة بالبارافورمالديهيد محفوظة، بالإضافة إلى DAPI التي تلطخ الحمض النووي.

الملخص

خلال المرحلة الأولية الانقسام الانقزالي، يختلف التكوين الفيزيائي للكروموسومات بشكل كبير عبر مراحل التطور، ولحسن الحظ تسمح هذه التكوينات الخاصة بالمرحلة المحددة بالتعرف الصحيح على كل من هذه المراحل الانقسام الكلاسيكية، والتي تعرف على التوالي بالليبتوتين (مثل "الخيوط الرفيعة")، والزيغوتين (مثل "الخيوط المتصلة")، والباكيتين (مثل "الخيوط السميكة")، والديبلوتين (مثل "الخيوط المزدوجة") والتحريك (مثل "حركة التنافر"). يتطلب التحليل البصري لعدة ظواهر خلوية وراثية تحدث خلال الطور الأول، مثل إعادة التركيب، والتزاوج، والتشابك العصبي، تقنيات تحديد مواقع مناعية موثوقة للغاية. على عكس تقنيات الانتشار والسحق التقليدية التي تقمع كل المعلومات تحت الخلوية وتحت النووية، تسمح عملية الحفظ ثلاثية الأبعاد الموصوفة هنا بالحفاظ على البروتينات الانقسام الانقسام الرئيسية في مواقع موقعها تحت الخلية الأصلية (السيتوبلازم، النووي، وتحت النووي: يوكروماتين، غير متجانس، ونوكليولار). لذا، يصف هذا البروتوكول كيفية تثبيت الأنثرات الانقسام الانقسام بكفاءة، وتشريح وإطلاق الخلايا الانقسامية من الأنثرات، وإجراء توطين مناعي متزامن لثلاثة بروتينات رئيسية في الخلايا الذكرية الذكرية في الذرة.

المقدمة

الانقسام المنzy هو عملية رئيسية تنظم انتقال الصفات في النباتات والمحاصيل النموذجية؛ لذا، فإن طرق المجهر البسيطة التي تسمح بتصور متسق ودقيق لتحديد مواقع البروتينات تسهل فهم كيفية نقل هذه الصفات بشكل أكثر كفاءة. للأسف، اختلفت عملية تصوير مواقع البروتينات داخل الخلايا الاختزافية كثيرا حسب التقنية المستخدمة ^1,2. لذا، فإن هدف البروتوكول هو توفير طريقة مباشرة وقابلة للتكرار تقضي على التشويهات أثناء مراقبة الخلايا الاختثاثية. على سبيل المثال، لطالما تم الاعتراف بأن مراقبة الكروموسومات الانقسام هي عملية دقيقة يتم تسهلها بسحق الخلايا إما بسحق بسيط أو بتقنيات انتشار أكثر تعطيلا ^3,4,5. في أرابيدوبسيس ثاليانا، يستخدم الباحثون عادة طرق الانتشار التي تستخدم مثبت كارنوي (خليط بنسبة 3:1 من الإيثانول وحمض الخليك) إلى جانب مصارف مختلفة مثل ليبسول، توين-20، وتريتون X-100، بالإضافة إلى خلطات إنزيمية تحتوي على السليلاز والبكتيناز والسيتوهيليكاز، لتفكيك الخلايا والسماح بتحديد مواقع مناعية فعالة على كروموسوماتها الصغيرة ^1,2. تحول هذه التقنيات تكوين كروموسوم ثلاثي الأبعاد إلى ثنائي الأبعاد، مما يتيح الملاحظة السريعة لجميع الكروموسومات المتناثرة صناعيا في صورة واحدة. قد تكون بعض خصائص الكروموسومات التي تتحمل هذه العلاجات القاسية واضحة؛ ومع ذلك، غالبا ما تفشل في تمثيل السلوك النموذجي للخلايا والكروموسومات في الجسم الحي⁶. يمكن الكشف السريع والواسع جدا عن ما يصل إلى جسمين مضادين باستخدام تقنيات الانتشار ثنائية الأبعاد في أنواع نباتية مختلفة بما في ذلك الذرة^{7، 8، 9، 10، 11}.

ومع ذلك، وعلى الرغم من سهولة تقنيات ثنائية الأبعاد القديمة، أصبح من المعترف الآن أن بعض الظواهر حساسة للطرق المزعجة ولا يمكن ملاحظتها إذا تضررت الخلية أو النواة أو الكروموسومات أثناء الانتشار أو السحق. على سبيل المثال، تم اكتشاف حركة بروتين RAD50 من السيتوبلازم إلى النواة خلال مرحلة اللبتوتين، أو أثناء اقتران السنترومير (اللبتونما/الزيجونوميما)، فقط في الخلايا الميوبلزمية ثلاثية الأبعاد^{السليمة 12}. هنا، يعرض على القراء بروتوكول ثلاثي الأبعاد مفصل لمدة 4 أيام يستخدم فيه أذرع مثبتة في 4٪ بارافورمالديهايد لتحديد مواقع مناعة ثلاثة بروتينات رئيسية في خلايا الذرة الذكرية، مما يحافظ على سلامتها الهيكلية. مقارنة بمنهجية مماثلة لتحديد المواقع المناعية ثلاثية الأبعاد^{للذرة 8}، أضفنا ملاحظات عملية ونصائح لحل المشكلات للباحثين. سيفيد هذا البروتوكول عمل علماء الأحياء النباتية ومربي النباتات المهتمين بدراسة العمليات الانقسام المختلفة، مثل التحكم في إعادة التركيب الانقسام بواسطة المركب المشبكي المشبكي.

البروتوكول

تحذير: التعامل مع الفورمالديهايد والأكريلاميد باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء كيميائي؛ كلاهما سام (الأكريلاميد أيضا سام للعصبيين قبل البلمرة). جميع المواد المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تثبيت أحلام الذرة للحفاظ على البنية السليمة للخلايا الاختزالية

1. استخدم نباتات الذرة في مرحلة V13 مع استمرار نمو النورات داخل الساق. خلال أسبوع التثبيت على الأنثر الانقسامي، ارتد قفازات واضغط بلطف على الساق المكبرة عند النتوء لتحديد ما إذا كان ناعما بما يكفي لفتحه.
   ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول للتثبيت والتمركز المناعي لكل من براعم الأزهار الانقسام الميوتية من الذرة وArabidopsis thaliana (أقل من 400 ميكرومتر). لكن في حالة الذرة، حسب النوع المستخدم ووقت السنة (هناك نمو أسرع في الربيع)، يستغرق حوالي 8 أسابيع من الزراعة كخط متزاوج داخلي مرجعي B73، لكن فقط 6 أسابيع لخط التزاوج الداخلي مبكر الأزهار A344.
2. تحضير الفواصل المؤقتة.
   ملاحظة: في اليوم الذي يسبق التثبيت الكيميائي، حضر المحاليل التالية الفعالة، قم بذلك بحذر، وقم بوضع علامات على جميع الزجاجات بشكل صحيح.
   1. تحضير 100 مل من أملاح Buffer A (BA) بسعة 10x من أملاح Buffer A (BA)، بإضافة 4.53 جرام PIPES (بيبرازين-N، N′-بيس(2-حمض الإيثانيسلفونيك) بتركيز نهائي 150 ملم)، 5.96 جرام KCl (التركيز النهائي 800 ملم م)، 1.17 جرام NaCl (التركيز النهائي 200 ملم م)، 0.74 جرام EDTA (التركيز النهائي 20 ملم م )، 0.19 جرام EGTA (التركيز النهائي 5 ملم م) و90 مل H2_O. أولا قم بضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8–7 باستخدام KOH، ثم ضبط الحجم إلى 100 مل.
   2. وأخيرا، قم بتعقيم الفلتر باستخدام وحدة فلتر معقمة سريعة التدفق ذات مسام PES بحجم 0.45 ميكرومتر (حافظ على درجة حرارة 4 °م ولكن لا تجمد؛ يمكنك تخزينها لعدة أشهر).
   3. استعد:
      -أنابيب 50 ملليمتر (تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7 باستخدام KOH).
      - مخزون من الحيوانات المنوية بتركيز 0.4 M (مذاب سابقا في أنابيب 50 ملليمولار، تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7 باستخدام KOH، والحفاظ على كميات 50 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية).
      - مخزونات من سبيرميدين بتركيز 0.4 م. (مذاب في أنابيب 50 ملليموتر، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7 باستخدام KOH، تحافظ على أليكوات مجمدة 125 ميكرولتر عند -20°م).
      - مخزونات من ديثيوثرايتول (DTT) 1 M (مذاب في أسيتات الصوديوم 0.01 مل، حتى درجة حموضة 5.2، تحافظ على أليكوات مجمدة 100 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية).
      - سوربيتول 2 م، يحافظ على درجة حرارة 4 °م.
3. حضر 50 مل من 2x Buffer A (BA) على الثلج، باستخدام 10 مل من أملاح Buffer A بسعة 10 مرات (محفوظة عند 4 درجات مئوية)، 50 ميكرولتر من سبيرمين (0.4 م في أنابيب 50 ملم، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7 باستخدام KOH)، 125 ميكرولتر من سبيرميدين (0.4 مليون في أنابيب 50 ملميول، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7 باستخدام KOH)، 100 ميكرولتر من DTT (1 M في 0.01 M أسيتات الصوديوم، pH 5.2) يذوب بقوة ليذوب؛ ولا تسخن.
   1. ثم أضف 16 مل من سوربيتول 2 متر. اضبط الحجم النهائي إلى 50 مل باستخدام ماء معقم. قم بتعقيم الفلتر باستخدام فلتر معقم سريع التدفق القابل للتخلص وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
4. جهز غرفة رطبة مصنوعة من 5–10 مناشف ورقية رطبة موضوعة في صندوق بلاستيكي. تأكد من أن الغطاء يغلق جيدا. تخلص من أي ماء زائد.
5. ثم ضع في صينية العناصر التالية: الحجرة الرطبة، شفرة حلاقة، ملقط ناعم (تم تعقيم سابقا بنسبة 70٪ إيثانول)، زجاجة صغيرة من الماء المعقم، وشريط لاصق لاصق. أحضر الصينية ومحتوياتها إلى نباتات الذرة التي تم فحصها في الخطوة 1.1.
6. استخدم شفرة حلاقة لفتح الساق المتعرجة على مستوى النورة. يمكن استخدام الفروع الرئيسية ذات الشرابات، بالإضافة إلى الفروع الجانبية للزهرة، لجمع الأزهار الانقسامية.
   ملاحظة: تحتوي هذه الفروع الشرابية على الأزهار ذات الاهتمام لجمع الأنثرات الانقسامية. تحتوي كل زهرة على ستة أسنان، وتستخدم عادة الثلاثة العلوية الأكبر للتحليل. الحجم واللون التقريبي للمناطق الانقسامية يرتبطان بكل مرحلة انتزازية. الأنثرات شبه الشفافة التي يبلغ طولها حوالي 1 مم تقع في مرحلة اللبتوتين، والانقبات الشفافة بطول 1.5 مم في مرحلة الزيجوتين، والنبات البيضاء بطول 2 مم في مرحلة الباشيتين، والنثرات الصفراء بطول > 2 مم قد تحتوي على خلايا ميوسين عند الديبلوتين، والرباعيات، وحبيبات حبوب اللقاح التي تنهي تكوين الأمشاج. لاحظ أن هناك ارتباطا آخر في المرحلة الطولية يمكن أن يختلف بين الخلفيات الجينية للذرة، وأن العوامل البيئية (مثل ارتفاع درجة الحرارة) يمكن أن تسرع تقدم الانقسام الاختزالي وتغير هذه العلاقة. يوصى بأن يقوم الباحثون بالتحقق من علاقات حجم ومرحلة أخرى لكل نمط جيني محدد من الذرة وظروف النمو (عبر سحق الأسيتوكارمين، انظر 1.6).
7. استخدم ملقطا دقيقا لتشريح وجمع الفروع الجانبية للنورات بعناية ولفها داخل منشفة ورقية في الحجرة الرطبة.
   ملاحظة: مع بعض الممارسة، يكفي شق خطي قصير بعرض 3–4 سم في الساق لاستخراج فروع الشرابة الاختزازية. يمكنك إغلاق هذا الشق بلفه ثلاث إلى أربع مرات بشريط لاصق قياسي، مما يسمح لك لاحقا بحصاد نفس النبات باستخدام النورة المتبقية غير المفصولة. تستمر الأنسجة في النمو وقد تستخدم لاحقا للتلقيح.
8. حافظ على الغرفة في درجة حرارة الغرفة. استخدم فقط فروع الزهرة التي تحتوي على زهورات تحمل الأنثرات في المرحلة الانقسامية. تأكد من تغطية الأغصان بنصف المناشف الرطبة، لكن لا تغمرها في الماء.
9. قم بترطيب الماء مرة أخرى إذا جفت المناشف. أغلق الصندوق حتى يتم تشريح الأنثرات، ويفضل حتى 30 دقيقة قبل بدء جمع الأنثر.
10. باستخدام ميكروسكوب ثنائي العين مع مقياس معاير، اجمع القطع الطازجة من الأزهار إلى 2 مل من 1x BA في طبق بترى 35 مم، لضمان التعرف الدقيق على المراحل الميوثية باستخدام مؤشر حجم ولون الأنتر.
    ملاحظة: لتحديد مرحلة الخلايا النصفية بدقة في الأنثرات المأخوذة من عينة معينة، يتم تحليل واحدة من ثلاث أسرات متزامنة لكل زهرة بسرعة باستخدام تثبيت الإيثانول-حمض الأسيتيك بنسبة 3:1، وتلوين الأسيتوكارمين، ومجهر القرع التقليدي¹³.
11. حضر ثبيتي الفورمالديهايد بنسبة 4٪ في 1x BA و0.0025٪ Tween-20
    ملاحظة: ل3 مل، أضف 750 ميكرولتر فورمالديهايد 16٪، 750 ميكرولتر_H2O،1.5 مل 2x BA، و7.5 ميكرولتر Tween-20 عند 1٪.
12. قم بإزالة مخزن التغذية المبكر وإضافة 3 مل من هذا المحلول المثبت الجديد إلى الحبوب المرحلية وثبتها لمدة 45 دقيقة داخل طبق بتري جديد بحجم 35 مم، مغلق بواسطة بارافيلم لمنع تبخر الفورمالديهايد، ثم ضعه على طبق بتري أكبر موضوع على هزاز دوار (مضبوط على 40–60 دورة في الدقيقة، أو 0.2 × g). افعل ذلك في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تكون الأنثرز تدور قليلا لتثبيت جيد. عادة ما تطفو على السطح.
13. اشطف العينة ب 3 مل من 1x BA، ثم انقل العينة إلى طبق بتري صغير وضعها على هزاز دوار (40–60 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
14. باستخدام ملقط نظيف، انقل الأنثرات إلى طبق بتري صغير بقطر 35 مم يحتوي على 3 مل طازجة من 1X BA. أغلق طبق بتيري بإحكام باراغليم. ثم يخزن طبق البتري الصغير داخل طبق بتري، وتغطيه بورق الألمنيوم للحفاظ عليه في الظلام، ثم يضعه عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. يمكنك تخزينه لعدة أشهر إذا لزم الأمر.

2. دمج خلايا الذرة الاختزاف داخل وسادات ساندويتش بولي أكريلاميد

اليوم الأول: تحضير شرائح ثلاثية الأبعاد

1. جهز 2 مل من محلول الأكريلاميد عن طريق خلط أحجام متساوية (1:1) من الأكريلاميد و2x BA. قبل إضافة كبريتات الصوديوم (NaS) وبيرسلفات الأمونيوم (APS)، قم بإزالة غازات محلول الأكريلاميد تحت الفراغ لمدة 5–10 دقائق.
2. يختلط Aliquot بين الأكريلاميد ونسبة 2x BA 1:1 عن طريق توصيل 100 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل.
   عدد الأنابيب التي تحضرها يعتمد على عدد الشرائح التي ستقوم بتحضيرها.
3. اصنع 1 مل و1x بطولة الهواء.
4. ضع قطعا من البارافيلم بحجم 2 سم × 2 سم فوق طبق بتري، ثم ضعها تحت مجهر تشريح. محلول BA بسعة 50 ميكرولتر مع أسماك على طبقة باراغليم. قم بقص طرف الماصة بالمقص لتسهيل توصيل الأجزاء الأخرى.
   1. محلول BA بسعة 25 ميكرولتر على طبقة باراغية في مكان آخر.
5. باستخدام الملقط لتثبيت الأنثرات، وقطع طرف الأنثرات بمشرط، وعصر الخلايا الانقزاية برفق. باستخدام الماصة، انقل الخلايا المييوكريتية بلطف إلى قطرة BA بسعة 25 ميكرولتر وامزج بلطف.
6. بيبت 10 ميكرولتر من خليط الخلايا الميوكريتية على غطاء منفصل.
7. بسرعة، تم إدخال الماصة بسعة 5 ميكرولتر من 20٪ (0.2 جم/1 مل) NaS و5 ميكرولتر 20٪ (0.2جم/1 مل) في أنبوب بسعة 1.5 مل مع أكريلاميد/2x Buffer A.
8. بسرعة، تمتزج الماصة بحجم 5 ميكرولتر من ما سبق على غطاء وتخلط مع الخلايا الميوثية. ضع غطاء غطاء بولي-إل-ليسين في الأعلى، لكن قم بتدويره 45 درجة. استخدام غطاء بولي-إل-ليسين واحد فقط (سواء تم الحصول عليه تجاريا أو مصنوع عن طريق غمر الغطاءات في محلول بولي-إل-ليسين في طبق بتري لبضع دقائق وتركه يجف على حافة طبق بتري جديد ونظيف) يساعد في تحرير وسادة كاملة بعد البلمرة. يتم رفع غطاء الغطاء بسرعة من المحلول وتجفيفه قبل الاستخدام. للمجهر فائق الدقة، يجب استخدام أغطية عالية الأداء بسماكة موحد (≤170 نانومتر)¹⁴.
9. يرجى عدم لمس الغطاء لمدة 30–50 دقيقة للسماح بالبلمرة الكاملة للعينة في درجة حرارة الغرفة (عملية البلمرة الأسرع تقلل من فترة جفاف الوسادة، والجودة الناتجة أقل من المثالية).
10. كرر الخطوات '2.6–2.9' لكل شريحة ترغب في تحضيرها.
11. افصل جميع أغطية الغطاء بعناية باستخدام شفرة حلاقة. ضع جميع الغطاء المغلف، على وجه الوسادة للأعلى، على وسادة بولي أكريلاميد (أو معظم الوسادة)، في صفيحة ذات 6 آبار.
12. اغسل كل غطاء بطبقة من الغطاء بطبقة من 2 مل من محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS) لمدة 10 دقائق. كرر هذا الغسيل مرة واحدة، ليصبح إجمالي وقت الغسيل 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
13. جهز 50 مل بخلط 49.4 مل PBS 1x، 100 ميكرولتر EDTA 0.5 متر، و500 ميكرولتر تريتون.
14. اشطف كل غطاء بطبقة بفوطة بسعة 1 مل من هذا القرص 1x PBS مع 1 ململ EDTA و1٪ ترايتون لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
15. جهز دفعة جديدة من مخزن الحظر يحتوي على 1x PBS، 1 مللي مولار EDTA، 0.1٪ Tween-20، و3٪ BSA (1 مل لكل شريحة). للحصول على 50 مل من محلول الحجب، اخلط 44 مل من PBS 1x، و100 ميكرولتر من EDTA 0.5 M، و5 مل من محلول Tween-20 بنسبة 1٪، و1.5 جرام من BSA. يفضل BSA على مصل الحمار كعامل حاجب لأنه يساعد في تقليل الإشارات غير المحددة عند استخدام عدة أجسام مضادة أولية وثانوية.

3. التمركز المناعي

1. جهز الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) عند التخفيف المطلوب باستخدام حاجز الحاجز. دمج الأجسام المضادة الأولية بناء على قدرتها على إنتاج إشارات مميزة عند استخدامها معا. يجب أن تأتي من كائنات مختلفة، مثل الأرنب أو الجرذان أو خنزير غينيا أو الدجاج، يمكن التعرف عليها بواسطة أجسام مضادة ثانوية محددة تحمل علامات فلورية. يتم تجنب استخدام الأجسام المضادة للحمار أو الماعز لأنها مخصصة كأجسام مضادة ثانوية. نوصي باستخدام نوع واحد من الأجسام المضادة الثانوية (مثل الماعز في التجربة الموضحة في الشكل 1).
2. أضف 50 ميكرولتر من هذا الجسم المضاد الأولي المخفف إلى مركز كل غطاء باستخدام وسادة.
   أضف الماء بين الآبار لإبطاء التبخر. ضع اللوحة في غرفة رطبة (صندوق بلاستيكي بغطاء). غادر طوال الليل.

اليوم الثاني: الغسيل

3. حضر 500 مل من محلول الغسيل (1x PBS + 0.1٪ Tween-20 + 1 mM EDTA).
4. أزل المحلول الليلي من الآبار عن طريق الشفط باستخدام الماصة.
5. اغسل بسرعة كل غطاء غطاء لوسادة مرتين مع 1 مل من مخزن الغسيل، ثم أزلها من الآبار.
6. أقطع 1 مل/غطاء غطاء آخر مع وسادة واتركها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   كرر ذلك 7 مرات أخرى. (8 ساعات إجمالا)
7. بعد الغسل النهائي، أضف الماء بين الآبار، غط الطبق، واتركه طوال الليل في غرفة رطبة.

اليوم الثالث: الأجسام المضادة الثانوية، الغسالات، والشرائح المثبتة

8. جهز الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف كل واحدة بنسبة 1:50 في العزل العائلي.
   استنشق محلول الغسيل. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف على مركز كل وسادة باستخدام ماصة.
   ملاحظة: يجب استخدام كل جسم مضاد ثانوي مع أصباغ فلورية مميزة ذات أطوال موجية انبعاث غير متداخلة. على سبيل المثال، يجب أن يصنف أحد الأجسام المضادة الثانوية ب AlexaFluor488 (باللون الأخضر)، والثاني ب AlexaFluor555 (برتقالي)، والثالث ب AlexaFluor647 (باللون الأحمر البعيد)، والذي يمكن دمجه مع DAPI (الإثارة عند 461 نانومتر، أزرق). أصباغ فلورية أخرى، مثل DyLight (من Dyomics GmbH)، قابلة للاستخدام أيضا. بالإضافة إلى ذلك، يجب ألا تتفاعل جميع هذه الأجسام المضادة الثانوية مع الأنواع الأخرى المستخدمة في مزيج الأجسام المضادة الأولية. على سبيل المثال، يجب تكييف الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب ليكون انتقائيا للأجسام المضادة للأرانب ولا يتعرف على أجسام مضادة للفئران أو خنازير غينيا. وينطبق الأمر نفسه على جميع الأجسام المضادة الثانوية. يجب استخدام تجربة مصممة جيدا للتحقق من صحة جميع هذه المتطلبات في نفس الوقت عند إجراء التجمع المناعي المشترك.
9. أضف الماء بين الآبار، وضع طبقا في الحجرة الرطبة، واتركه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
10. استنشق المحلول من الآبار.
11. قم بأربعة غسلات باستخدام 1 مل لكل بئر، ساعة لكل منها في درجة حرارة الغرفة (4 ساعات إجمالا).
12. اغسل كل بئر ب 1 مل من 1x PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وكرر العملية مرتين إضافيتين. (30 دقيقة إجمالا)
13. قم بتخفيف DAPI بحجم 1x PBS.
14. صبغ بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل من دابي (مسحوق دابي مذاب في الماء) لمدة 30 دقيقة على درجة حرارة الغرفة، ثم ضع 500 ميكرولتر/بئر.
15. قم بإزالة مضاد التلاشي من ProLong™ Gold من الفريزر بدرجة حرارة 4 درجات مئوية للسماح له بالذوبان والوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
16. اغسل السلايدات ب 1x PBS لمدة 30 دقيقة على درجة حرارة الغرفة، مع 1 مل/بئر. افعلها مرتين مرة أخرى. (ساعة ونصف دقيقة إجمالا)
17. أزل آخر غسلة.
18. ثم أضف قطرتين من ProLong™ Gold Antifade في منتصف كل وسادة.
19. تركيب غطاء الغطاء على كل منزلق، وضع علامة على كل شريحة، رفع شرائح الغطاء من البئر باستخدام ملقط دقيق، وضعها ببطء على الشريحة. باستخدام ملقط دقيق، أنزل غطاء ثان ببطء على الأول. باستخدام المكنسة الكهربائية، أزل الجلسرول الزائد من حواف الغطاء الداخلي. أغلق حواف الأغطية بطبقتين من طلاء الأظافر.
20. إذا لم يتم فحص الشرائح فورا تحت المجهر الفلوري. احتزنها في فريزر -20 درجة مئوية، محميا من الضوء، حتى الملاحظة. لاحقا، دع الشرائح تبقى في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة داخل صندوق منزلق، أفقيا وفي الظلام، لمنع التكثف.

اليوم الرابع: الملاحظات المجهرية

21. يراقب الشريحة تحت الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والفلاتر. المجهر الكونفوكلي القياسي كاف، لكن ينصح باستخدام مجهر بهدف 60x لتمكين تصوير ثلاثي الأبعاد للخلية بأكملها باستخدام مكدس z كل 0.2 ميكرومتر، مع التقاط صور متتالية ومعالجة فك الالتفاف باستخدام برنامج Applied Precision SoftWoRx^® .

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا في الوقت نفسه ملاحظة أنماط التجمع الثلاثة للبروتينات الانقسام الميوتي الرئيسية في الذرة (الشكل 1). البروتين الانقسام التصاعدي (غياب القسم الأول 1) (AFD1) هو نظير لوحدة ألفا-كليسين REC8 من مركب التماسك الانقسام الانقسام التصالي. ال ASYNAPTIC 1 (ASY1) هو عنصر محوري حاسم، بينما ZYPPER1 (ZYP1) هو العنصر العرضي في المركب المشبكي¹⁵. يظهر تلوين DAPI نواة واضحة وتلوين كروماتين، مما يسمح بالتعرف على المراحل الفر...

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول ميزة رئيسية على غيره من خلال الحفاظ على بيانات ثلاثية الأبعاد الأساسية حول تحميل البروتين الكروموسومي الانقساسي. لا يمكن الحفاظ على هذه الميزات باستخدام تقنيات الانتشار المنتظمة ^1,2. ومع ذلك، فإن لهذا البروتوكول حدودان: فهو بطيء ويتطلب تقنية متطلبة مقارنة بتقنيات الانتشار العادية التي تتم خلال يوم واحد. على النقيض من ذلك، يتطلب بروتوكولنا أربعة أيام من العمل، ويرجع ذلك أساسا إلى خطوات الغسل المكثفة وحضانة الأج...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Acetic acid, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1	Biorad	1610157
Aluminum fold	Reynolds	U07211R0
Amonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binocular stereomicroscope	NA	NA
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscope	Olympus	NA
Distilled H2O	NA	NA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Gloves	Merck	Z412392
Growing chambers / greenhouse / or field	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maize seeds	NA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscopic glass slides	Fisher Scientific	22-230-900
Microscope slide box	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nail polish	Electron Microscopy Science	72180
Paper towels	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastic box with lid	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Razor blade - single edged	Fisher Scientific	12-640
Rocking platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum