أكسدة فينتون بمساعدة فيتامين سي تحسن القتل التأكسدي لحبوب الهليكوباكتر في المختبر

ملخص

تفحص هذه الدراسة كيف ينظم فيتامين C السلوك الحركي لتفاعل فينتون تحت ظروف المختبر . تظهر اختبارات الصبغة الكيميائية والاختبارات البكتيرية أن جرعة فيتامين C المسيطر عليها تغير السلوك التأكسدي للتفاعل وترتبط بزيادة النشاط المضاد للبكتيريا ضد هيليكوباكتر بيلوري في نظام نموذجي مبسط.

الملخص

لا تزال عدوى الهليكوباكتر بيلوري عبئا صحيا عالميا كبيرا، وتؤكد زيادة مقاومة المضادات الحيوية على الحاجة إلى استراتيجيات بديلة مضادة للبكتيريا. فحصت هذه الدراسة ما إذا كان جرعة فيتامين C يمكن أن تعدل أكسدة فينتون وتعزز النشاط التأكسدي المضاد للبكتيريا ضد H. pylori في ظروف حمضية محددة في المختبر. تم تقييم النشاط التأكسدي باستخدام إزالة اللون بحمض البرتقال 7 كقراءة كيميائية غير مباشرة واختبار فلورة حمض التيريفتاليك كمؤشر نسبي لتكوين المنتج المرتبط بجذور الهيدروكسيل في تفاعلات الحديد وبيروكسيد المدعومة بفيتامين C. تم تقييم فعالية البكتيريا المضادة من خلال تعريض هيليكومبيك بيلوري الموحد التعليقات في محلول ملحي يحتوي على اليوريا عند درجة حموضة 3 إلى بيروكسيد الهيدروجين والحديد مع أو بدون مكملات فيتامين C تدريجيا، تليها تعداد وحدات تكوين المستعمرات. غير مكملات فيتامين سي قراءات الأكسدة وكانت مرتبطة بانخفاض أكبر في البكتيريا الحية مقارنة بكيمياء فينتون التقليدية. تجارب الإنقاذ التي استخدمت ديفيروكسامين وثيوريا خففت النشاط المضاد للبكتيريا، مما يدعم الفرضية القائلة بأن النشاط المضاد للبكتيريا مرتبط بعمليات أكسدة تعبر عن الحديد ومرتبطة بالراديكاتور. قدم التلوين الفلوري الحي/الميت والمجهر الإلكتروني الماسح ملاحظات بصرية نوعية تتوافق مع نتائج وحدة تشكيل المستعمرات (CFU). تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن جرعات فيتامين C المسيطر عليها يمكن أن تعدل التفاعلات التأكسدية القائمة على فينتون وتعزز النشاط المضاد للبكتيريا ضد هيليكومبيك بيلوري في نموذج مبسط وحمضي في المختبر.

المقدمة

أظهرت دراسات صحة السكان أن هناك بكتيريا سالبة للجرام ذات شكل حلزوني وتنتمي إلى جنس هيليكوباكتر، من خلال دراسات صحة السكان أن لديها انتشار عال للعدوى عبر المناطق الجغرافية والجنس والعمر، مع معدل انتشار عالمي يقارب 50٪¹. صنفت الوكالة الدولية لأبحاث السرطان (IARC) هيليكومبيا البوابية كمسرطنة من المجموعة الأولى، مؤكدة ارتباطها القوي بسرطان المعدة ولمفاوما الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالمخاط المخاطي (MALT). حاليا، تعتمد الإدارة السريرية لعدوى هبكتر بوابات بشكل أساسي على الأنظمة الدوائية. تشمل أكثر العوامل التي تم دراستها بشكل أوسع مثبطات مضخة البروتون (PPIs)، التي تثبط إفراز حمض المعدة؛ مركبات البزموت، التي تعزز فعالية المضادات الحيوية؛ والمضادات الحيوية مثل الأموكسيسيلين، الكلاريثرومايسين، والميترونيدازول. ومع ذلك، ثبت أن العلاج الأحادي غير كاف للقضاء الكامل، مما أدى إلى الاستخدام الواسع للأنظمة المركبة، والتي تعرف عادة بالعلاج الثلاثي. عادة ما يتكون هذا النهج من مثبط مضخة البروتون، وكلاريثرومايسين، وإما أموكسيسيلين أو ميترونيدازول، يعطى لمدة تقارب أسبوعين³. مع تزايد انتشار سلالات هيليكومبيك بيلوري المقاومة للمضادات الحيوية، انخفضت فعالية العلاج الثلاثي بشكل ملحوظ، مما دفع إلى اعتماد العلاج الرباعي الذي يجمع بين مثبط مضخة البروتون، البسموث، ومضادين حيويين³. ومع ذلك، لا تزال هذه الأنظمة تعتمد بشكل أساسي على المضادات الحيوية، ولا تزال مقاومة المضادات الحيوية تحديا كبيرا ^{في الإدارة} السريرية^. وبالتالي، جذب استكشاف استراتيجيات بديلة ومستقلة عن المضادات الحيوية اهتماما متزايدا.

بعيدا عن تأثيراته المرضية المباشرة، ارتبطت عدوى هيليكومبيك بيلوري أيضا بتغيرات في توازن المغذيات الدقيقة في المعدة. أفادت الدراسات السريرية والوبائية عن انخفاض تركيزات فيتامين سي في عصير المعدة والمصل^{لدى الأفراد} المصابين، والتي قد تكون مرتبطة بالتهاب الغشاء المخاطي أو ضعف الإفراز أو زيادة الاستهلاك التأكسدي ^7,8,9. بالتوازي، تم ربط عدوى هيليمبيك بيلوري بنقص الحديد من خلال عدة آليات، منها انخفاض حموضة المعدة، وضعف امتصاص الحديد في النظام الغذائي، والمنافسة البكتيرية على الحديد المتاح¹⁰. تسلط هذه الملاحظات الضوء على البيئة الكيميائية الحيوية المعقدة المصاحبة لعدوى هيليمو بيلوري وتؤكد أهمية العمليات المرتبطة بالأكسدة والاختزال والحديد في الظروف الحمضية المعدية.

حظيت أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) باهتمام كبير في أبحاث المضادات الحيوية بسبب خصائص هذه الأنواع التأكسدية. تشير ROS إلى فئة من الجزيئات التفاعلية كيميائيا التي تتكون أثناء الاختزال الجزئي للأكسجين، مثل أنيون الأكسيد الفائق (O₂•⁻)، بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂)، الأكسجين المفرد (¹O₂)، وجذور الهيدروكسيل (•OH)، من بين أخرى. في الأنظمة البيولوجية، يشارك ROS بشكل واسع في الأيض الفسيولوجي الطبيعي وهو ضروري لأنشطة تنظيمية خلوية متنوعة¹¹. ومن الجدير بالذكر أن العديد من الدراسات أظهرت أن فرط ROS المفرط يمكن أن يقطع أغشية الخلايا البكتيرية من خلال تأكسد الدهون، مما يؤدي إلى تغييرات في بنية ووظيفة الغشاء، مما يؤدي في النهاية إلى تعطيل البكتيريا¹². وبناء عليه، جذبت الأساليب المضادة للميكروبات القائمة على ROS اهتماما كوسيلة محتملة للتحقيق في التأثيرات المضادة للبكتيريا غير المضادة الحيوية ضد H. pylori 13,14,15,16. من بين طرق إنتاج ROS المختلفة، حظي تفاعل فينتون باهتمام كبير لإنتاجه الجذري عالي الكفاءة. تفاعل فينتون هو عملية أكسدة متقدمة¹⁷ حيث تتفاعل الأيونات الحديدية (Fe²⁺) مع H₂O₂ تحت ظروف حمضية لإنتاج جذور هيدروكسيل (•OH)، التي تمتلك جهدا تأكسديا قويا ويمكنها أكسدة جزيئات حيوية داخل الخلية.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+OH^-

Fe³⁺+ H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

تحديدا، عند درجة حموضة تقريبا 2.8–4.5، يخضع H₂O₂ لتحلل حفاز بواسطة Fe²⁺، مولدا • OH بينما يتأكسد Fe²⁺ إلى Fe³⁺. ثم يتفاعل Fe³⁺ مع H₂O₂ لتجديد Fe²⁺، مما يخلق دورة أكسدة اختزال Fe²⁺/Fe³⁺ تحافظ على إنتاج ROS المستمر¹⁸. ومع ذلك، فإن تقليل Fe³⁺ إلى^{Fe 2}⁺ بطيء نسبيا، مما يشكل خطوة تحديد المعدل وبالتالي يقلل من الكفاءة الإجمالية لتفاعل فنتون. تشير الدراسات إلى أن إدخال عامل اختزال مناسب في نظام تفاعل فينتون يمكن أن يسرع تقليل الحديد²⁺ إلى Fe²⁺، مما يعزز توليد ROS. لفيتامين C دور الأكسدة الاختزال حسب السياق. في الأنظمة التي تحتوي على الحديد، يمكن أن يعزز تقليل الحديد²⁺ إلى Fe²⁺ وبالتالي يدعم دورة فنتون، بينما عند تركيزات أعلى أو تحت ظروف تفاعل مختلفة، قد يعمل أيضا كمضاد للأكسدة أو كمزيل جذور¹⁹.

استنادا إلى هذا السياق، تبحث الدراسة الحالية في نظام تفاعل فينتون المدعوم بفيتامين C كنهج قابل للضبط كيميائيا لتعديل النشاط التأكسدي تحت ظروف حمضية محددة في المختبر ^20,21. تم استخدام فيتامين سي كعامل اختزال لتسهيل تجدد الحديد²⁺ وبالتالي تغيير السلوك التأكسدي الفعال لتفاعل فينتون. كان النظام التجريبي المستخدم هنا نموذجا مبسطا لليور الحمضي المالحي ولم يكن الهدف منه إعادة إنتاج البيئة المعدة الفسيولوجية الدقيقة بالكامل، التي تحتوي على مخاط، ومكونات العزلة، وخلايا المضيف، وعوامل المناعة، والركائز العضوية المتنوعة. ضمن هذا النموذج المحكم، تم تمييز النشاط التأكسدي باستخدام قراءات كيميائية وتقييمه بالتوازي مع الاستجابات الظاهرية البكتيرية، مما وفر أساسا تجريبيا لفحص التأثيرات المضادة للبكتيريا المرتبطة ب ROS ضد H. pylori في المختبر.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات
كانت هذه الدراسة دراسة بكتيرية في المختبر ولم تشمل مشاركين بشريين أو مواضيع حيوانية أو مواد مشتقة من المرضى. لذلك، لم تكن موافقة لجنة المراجعة المؤسسية أو موافقة أخلاقيات الحيوان مطلوبة.

تقييم تحلل AO7 في نظام فينتون المدعوم بفيتامين C
لتقييم تأثير فيتامين C على السلوك التأكسدي الملحوظ لتفاعل فينتون، تم استخدام تحلل حمض البرتقال 7 (AO7) كقراءة كيميائية غير مباشرة للنشاط التأكسدي. هذا الاختبار لا يحدد تحديدا أنواع الأكسجين التفاعلية الفردية. جهزت 100 مل من محلول AO7 بتركيز 5 ملغ/لتر وعدلت المحلول إلى درجة حموضة 3. تمت إضافة H₂O₂ و FeSO₄ إلى تركيزات نهائية 2.2 ملمولار و0.055 ملمولار على التوالي. تمت إضافة فيتامين C إما كجرعة واحدة عند بدء التفاعل أو في نظام جرعات من ثلاث خطوات. في تجربة الجرعة-الاستجابة، تم استخدام نسب مولية ل Vc: Fe²⁺ 0، 0.12، 0.24، 0.48، 2، 4، 6، و8، تتوافق مع تركيزات فيتامين C النهائية 0، 0.0066، 0.0132، 0.0264، 0.110، 0.220، 0.330، و0.440 ملمولار على التوالي، عندما يستخدم FeSO₄ عند 0.055 ملليمولار. في حالة الإضافة الثلاث، قسم نفس كمية فيتامين C الإجمالية إلى ثلاثة أليكوات متساوية وأضفت أليكوت واحد عند 3 و5 و7 دقائق بعد بدء التفاعل. على سبيل المثال، عند نسبة Vc:Fe²⁺ تبلغ 0.48، أضيف فيتامين C عند 0.0088 ملم لكل أليكوت، مما يعطي تركيزا كلا نهائيا 0.0264 ملليمو.

حركت محلول التفاعل بشكل مستمر في الظلام لمدة 10 دقائق مع الحفاظ على درجة الحرارة أقل من 30 درجة مئوية. جمعت عينات بحجم 2 مل قبل وبعد التفاعل. تم قياس الامتصاص عند 483 نانومتر باستخدام مطياف UV-Vis، وحساب معدل تحلل AO7 باستخدام المعادلة 1:

معدل التحلل (٪) = [(A₀ − A₁) / A₀] × 100٪ (1)

هنا، تمثل A₀ امتصاص العينة قبل التفاعل، بينما A₁ تمثل امتصاص العينة بعد التفاعل.

تقييم إشارة الفلورة المرتبطة ب OH باستخدام مسبار TA
لتقييم إشارات الفلورة المرتبطة بجذور الهيدروكسيل تحت نفس الظروف الحمضية في المختبرات المستخدمة في التجارب المضادة للبكتيريا، تم إنشاء نظام كيميائي خال من الخلايا باستخدام تيريفثالات ثنائي الصوديوم (TA، 1 ملليمول) كمسبار فلوري. تم استخدام هذا الاختبار كمؤشر نسبي لتكوين المنتج المرتبط ب OH ولم يفسر كقياس مطلق لتوليد جذور الهيدروكسيل. تم تضمين سبع مجموعات: (1) الفراغ (1 ملليمولار TA في مخزن التفاعل فقط)، (2) H₂O₂ فقط، (3) Fe²⁺ فقط، (4) Vc وحده (إضافة تدريجية)، (5) فينتون التقليدي (Fe²⁺ + H₂O₂)، (6) فينتون بمساعدة فيتامين C مع إضافة Vc الجرعة (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc، بولوس)، و(7) فينتون بمساعدة VC مع إضافة Vc خطوة بخطوة (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc، خطوة بخطوة (تدريجيا). في شرط الجمع التدريجي، تم إدخال Vc عند 3 و5 و7 دقائق بعد بدء التفاعل بأقسامات متساوية، بينما يحصل شرط البولوس على نفس الكمية الإجمالية من Vc مثل الإضافة الفردية.

تم جمع الأليكوات خلال فترة تفاعل مدتها 10 دقائق، ثم تم قلويتها فورا باستخدام NaOH لتهدئة التفاعلات الجذرية الإضافية وتثبيت الفلورة، وتم تخزينها عند 4 درجات مئوية قبل القياس. تم قياس شدة الفلورة للمنتج المشتق من TA باستخدام قارئ ميكرولوح (مثال/Em: 315/425 نانومتر). تم التعبير عن توليد الجذور كشدة فلورية بعد طرح فراغ واستخدم كمؤشر نسبي لتوليد الجذر. تم إجراء ثلاث تجارب مستقلة على الأقل، وتم تقديم البيانات كملفات زمنية ومسارات ونقاط نهاية عند 10 دقائق.

تقييم الأداء المضاد للبكتيريا من خلال عد المستعمرات
تم تخزين سلالات هيليكومبيك بيلوري عند درجة حرارة −80 درجة مئوية في مرق حقن القلب في الدماغ (BHI) يحتوي على 25٪ جليسرول. السلالة الأساسية المستخدمة في اختبار عد المستعمرات الرئيسي، واختبار الإنقاذ، واختبار التداخل المصفوفي، والتلوين الفلوري الحي/الميت، وتحليل المجهر الإلكتروني الماسح كان H. pylori G27. قبل كل تجربة، كانت البكتيريا تضع على ألواح أجار دم كولومبيا وتحضن لمدة 3 أيام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية تحت ظروف ميكروهوائية تتكون من 5٪ O₂، 10٪ CO، و85٪ N^₂2.

اختبار عد المستعمرات في السلالة الأولية
استخدم وحدة تشكيل المستعمرات (CFU) لتقييم النشاط المضاد للبكتيريا تحت ظروف علاجية مختلفة. شملت المجموعات التالية: مجموعة ضابطة غير معالجة، H₂O₂ وحده، فيتامين C وحده، تفاعل فينتون التقليدي، وتفاعل فينتون بمساعدة فيتامين C. إذا لم يتم تضمين مجموعة Fe²⁺ فقط في التجربة الأصلية، تجنب تفسير الاختبار الأولي على أنه يفصل تماما تأثيرات الحديد فقط عن تأثيرات الأكسدة الناتجة عن تفاعل فينتون. تم جمع H. pylori المزروعة وإعادة تعليق البكتيريا في محلول ملحي فسيولوجي. تم تعديل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀₀) إلى 0.5، ونقلت التعليق إلى محلول ملحي فسيولوجي يحتوي على 3 ملليمولار يوريا مع تعديل إلى pH 3. تمت إضافة H₂O₂، FeSO₄، وفيتامين C حسب مجموعة العلاج المخصصة. استخدم تركيزات نهائية 2.2 ملمولار H₂O₂ و0.055 ملليمولار FeSO₄. في علاج فينتون بمساعدة فيتامين C، أضيفت فيتامين C في ثلاث مجموعات متساوية خلال 3 و5 و7 دقائق، بتركيز إجمالي نهائي 0.0264 مل.

بعد 10 دقائق من المعالجة، تم تخفيف كل عينة فورا بنسبة 100 ضعف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS، pH 7.4) لتحييد التعليق الحمضي وتقليل انتقال المؤكسدات والحديد المتبقية إلى مرحلة الدرع. تم طلاء التعليق البكتيري المخفف على صفائح أجار دم كولومبيا وحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام تحت ظروف ميكروهوائية بدرجة 5٪ O₂، 10٪ CO، و85٪ N₂. تم احتساب الوحدات الكيميائية المعتمدة وحساب النشاط المضاد للبكتيريا كتقليل لوغاريتم-�� CFU مقارنة بالمادة الضابطة غير المعالجة باستخدام المعادلة 2:

_{لوغاريتيم 10} تقليل CFU = لوغاريتيم₁₀ (_التحكم في CFU) − log10 (_{تمت معالجة} CFU) (2)

اختبار الإنقاذ
لفحص ما إذا كان النشاط المضاد للبكتيريا في نظام فينتون المدعوم بفيتامين C مرتبطا بتوفر الحديد والعمليات المرتبطة بالجذور، أجريت تجارب إنقاذ باستخدام الديفيروكسامين (DFO) كمخلب للحديد، والثيوريا كمزيل جذور الهيدروكسيل. تمت إضافة DFO أو ثيوريا إلى التعليق البكتيري قبل 5 دقائق من إضافة FeSO₄ و H₂O₂. تم استخدام DFO وثيوريا بتركيزات نهائية 100 ميكرومولار و5 مللي مولار على التوالي.

تم تضمين ست مجموعات تجريبية: ضابط غير معالج، فينتون بمساعدة فيتامين C، فينتون بمساعدة فيتامين C مع DFO، فينتون بمساعدة فيتامين C مع الثيوريا، DFO وحده، والثيوريا فقط. جميع المعايير التجريبية الأخرى، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني، خلفية المحلول الملحي/اليوري، تركيز H₂O₂، تركيز FeSO₄، جدول جرعات فيتامين C، مدة العلاج، التخفيف/التعادل/التعادلية قبل الطبق، وظروف الحضانة، كانت مطابقة لتلك المستخدمة في اختبار عد المستعمرات الأولي. تم قياس النشاط المضاد للبكتيريا بواسطة تعداد CFU وعبر عنه كتقليل لوغاريتم-��₀ CFU مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة.

التحقق من صحة السلالات المتعددة
لتوفير دعم محدود للسلالات المتقاطعة للتأثير المضاد للبكتيريا الذي لوحظ في السلالة الأولى، تم تطبيق اختبار عد المستعمرات على سلالين مرجعيين إضافيين من H. pylori ، وهما ATCC 43504 وATCC 26695. لكل سلالة، تم تضمين ثلاث مجموعات تجريبية: مجموعة ضابطة غير معالجة، تفاعل فنتون التقليدي، وتفاعل فينتون بمساعدة فيتامين C مع إضافة تدريجية لفيتامين C. كانت الظروف والإجراءات التجريبية مطابقة لتلك المستخدمة في اختبار عد المستعمرات الأولي. تم التعبير عن النشاط المضاد للبكتيريا كتقليل لوغاريتمي CFU مقارنة بالمجموعة غير المعالجة لكل سلالة. أجريت كل تجربة باستخدام n = 3 نسخ بيولوجية مستقلة، وتم تقديم البيانات كنقاط بيانات فردية ذات متوسط انحراف معياري ±.

اختبار التداخل المصفوفي
لتقييم ما إذا كانت مكونات المصفوفة العضوية يمكن أن تخفف من النشاط المضاد للبكتيريا في نظام فينتون المدعوم بفيتامين C، تم إنشاء نموذج لتداخل البروتين باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA). تم تضمين BSA عند تركيزات نهائية 0 و1 و3 جم· L⁻¹. عند كل تركيز لتحليل البكتيريا الكهربائية، تم تضمين ثلاث مجموعات تجريبية: (1) ضابط غير معالج، (2) فينتون التقليدي (Fe²⁺ + H₂O₂)، و(3) فينتون بمساعدة فيتامين C مع إضافة فيتامين C تدريجيا. تم إجراء الفحص باستخدام السلالة الأولية وفق نفس البروتوكول الموصوف في اختبار عد المستعمرة الأولية، مع نفس حالات الحموضة، وخلفية ملحية/يوريا، وتركيزات الكاشف، ومدة العلاج (10 دقائق)، وإجراءات الطبق. تم التعبير عن النشاط المضاد للبكتيريا كتقليل لوغاريتم-لج₀ CFU مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة عند كل تركيز من BSA. تم إجراء كل تجربة على الأقل ثلاث مرات بشكل مستقل. ركزت المقارنة الأساسية على ما إذا كانت حالة فينتون المعززة لا تزال متفوقة أو على الأقل ليست أضعف من الحالة التقليدية في ظروف تحتوي على البروتين.

صبغة الفلورة البكتيرية الحية/الميتة
بعد المعالجة، تم تخفيف التعليق البكتيري بنسبة 100 ضعف في PBS كما هو موضح أعلاه لتقليل انتقال الحموضة والتأكسدية المتبقية. قمت بطرد المركزي في نظام التعليق عند 1800 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلصت من السوبرناتانت. أعاد تعليق الحبيبات البكتيرية في 200 ميكرولتر من المحلول الملحي الفسيولوجي. تمت إضافة SYTO9 ويوديد البروبيديوم (PI) إلى تركيزات نهائية تبلغ 6 ميكرومولار و30 ميكرومولار على التوالي. حضنت التعليق في الظلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وضعت 5–10 ميكرولتر من التعليق البكتيري المصبوغ على شريحة زجاجية نظيفة وتغطيتها بغطاء داخلي. صور فلورية مكتسبة باستخدام مجهر فلوري مع قنوات فلورية خضراء وحمراء تحت إعدادات تعريض متطابقة لجميع مجموعات العلاج. تم التقاط ثلاثة حقول عشوائية على الأقل لكل مجموعة. استخدمت الصور كدليل بصري نوعي على أنماط التلوين الحية/الميتة بدلا من كونها قياسا كميا لفعالية البكتيريا.

تحليل مورفولوجيا البكتيريا باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح
بعد المعالجة، تم جمع العينات البكتيرية وتثبيتها في غلوتارالديهيد بنسبة 2.5٪ محضر في محلول فوسفات 0.1 مليون متر (pH 7.4) عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة. بعد التثبيت، تم غسل العينات باستخدام عازل الفوسفات لإزالة المثبت المتبقي. ثم تم تجفيف العينات بشكل متسلسل في محاليل إيثانول مصنفة بنسبة 50٪، 70٪، 90٪، و100٪. بعد الجفاف، تم إجراء تجفيف نقاط حرجة. تم تركيب العينات المجففة على قطع SEM وغطيت بطبقة ذهبية رقيقة بعمق يقارب 10 نانومتر. تم فحص شكل البكتيريا باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح بجهد متسارع قدره 5 كيلوفولت. تم التقاط صور تمثيلية بتكبير منخفض وعالي لكل مجموعة علاج. استخدمت صور SEM كملاحظات شكلية نوعية بدلا من كونها دليلا كميا على آلية ضرر محددة.

التحليل الإحصائي
تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام GraphPad Prism الإصدار 10.0. أجريت جميع التجارب الكمية مع n = 3 نسخ بيولوجية مستقلة، وتعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). بالنسبة لاختبارات فلورة TA، أجريت مقارنات إحصائية بين مجموعات العلاج المتعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاها اختبار Tukey للمقارنات المتعددة. بالنسبة لاختبارات عد المستعمرات في السلالة الأولية التي تتضمن عدة حالات علاجية، أجريت مقارنات إحصائية باستخدام تحليل النوفاع المبكر أحادي الاتجاه تلاها اختبار المقارنات المتعددة لتوكي. بالنسبة لاختبارات الإنقاذ، أجريت مقارنات بين المجموعات باستخدام تحليل التحليل المضاد الأصغر أحادي الاتجاه تلاها اختبار دنيت للمقارنات المتعددة، مع مجموعة فينتون المدعومة بفيتامين سي كمرجع. لتجارب التحقق المحدودة من السلالات المتقاطعة، تمت مقارنة تخفيضات اللوغاريتيوم في وحدة التوازن الخارجي بين مجموعتي فينتون التقليدية ومجموعة فينتون المدعومة بفيتامين سي داخل كل سلالة باستخدام اختبار t ثنائي الذيل غير المرتبط. في اختبارات التداخل المصفوفي، تم إجراء تحليل أنفاوي ثنائي الاتجاه مع معالجة وتركيز BSA كعاملات، بما في ذلك مصطلح التفاعل. تم إجراء مقارنات زوجية بين العلاجات عند كل تركيز من BSA باستخدام اختبار Šídák للمقارنات المتعددة. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها P < 0.05. تشير مستويات الدلالة إلى *p < 0.05، ** P < 0.01، ***P < 0.001، و ****p < 0.0001.

النتائج

تقييم تحلل AO7 في نظام فينتون المدعوم بفيتامين C
تم استخدام تحلل AO7 كمسبار كيميائي لدراسة كيفية تأثير فيتامين C على السلوك التأكسدي الملحوظ لتفاعل فينتون تحت ظروف حمضية. في غياب فيتامين C، أدى نظام فينتون التقليدي إلى تحلل جزئي ل AO7 خلال فترة تفاعل مدتها 10 دقائق. عند إدخال فيتامين C، زاد مدى تحلل الصبغة، ويعتمد التأثير على نسبة الأضراس بين فيتامين C وFe2⁺. عند انخفاض نسبتي نسبيا بين فيتامين C إلى Fe²⁺، زاد تحلل AO7 مقارنة بحالة خالية من فيتامين C. لوحظ أ...

المناقشة

فحصت الدراسة الحالية ما إذا كان جرعة فيتامين سي يمكن أن تعدل السلوك التأكسدي والقراءات المضادة للبكتيريا في نظام قائم على فينتون تحت ظروف حمضية محددة في المختبر . عبر الفحوصات الكيميائية والميكروبيولوجية، غير مكملات فيتامين سي خطوة بخطوة سلوك التفاعل الملحوظ وارتبطت بنشاط مضاد للبكتيريا أكبر ضد هيليكومبيك بيلوري مقارنة بتفاعل فينتون التقليدي في الظروف المختبرة. من المهم أن يفسر هذا النظام كنموذج مبسط للحمض واليوريا المالحة بدلا من بيئة دقيقة فسيولوجية كاملة للمعدة الدقي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	يستخدم كصبغة نموذجية لاختبار تحلل AO7.
Bovine serum albumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	يستخدم لاختبار تداخل المصفوفة.
Brain Heart Infusion (BHI) broth powder	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	يستخدم لزراعة البكتيريا والتخزين بالتبريد.
Columbia blood agar plates (5% sheep blood)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	يستخدم لزراعة البكتيريا وحصر CFU.
Critical point dryer (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	يستخدم لتحضير العينة SEM بعد تجفيف الإيثانول المتدرج.
Deferoxamine (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	يستخدم كمخلب للحديد في اختبار الإنقاذ.
Disodium terephthalate	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	يستخدم كمجس فلوريسنت TA لكشف الإشارة المرتبطة بـ•OH.
Ethanol, absolute	Sigma-Aldrich	E7023	يستخدم لتحضير سلسلة الإيثانول المتدرجة لتجهيز عينة SEM.
Fluorescence microscope (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	يستخدم لتصوير الفلوريسنت الحي/الميت.
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	يستخدم لتثبيت العينات البكتيرية قبل SEM.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	يستخدم للتخزين بالتبريد للبكتيريا في مرق BHI.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	يستخدم للتحليل الإحصائي ورسم الرسوم البيانية.
Helicobacter pylori strain ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	سلالة مرجعية إضافية مستخدمة للتحقق المحدود عبر السلالات.
Helicobacter pylori strain ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	سلالة مرجعية إضافية مستخدمة للتحقق المحدود عبر السلالات.
Helicobacter pylori strain G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	السلالة الأساسية المستخدمة لعد المستعمرات، واختبار الإنقاذ، واختبار تداخل المصفوفة، وتلطيخ الحي/الميت، و SEM.
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	يستخدم كمادة خاضعة للأكسدة في اختبارات تفاعل فنتون.
Iron(II) sulfate monohydrate (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	يستخدم كمصدر للأيونات الحديدية في تفاعل فنتون.
Microplate reader (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	يستخدم لقياس الفلوريسنت المشتق من TA (Ex/Em = 315/425 nm).
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	يستخدم لتخفيف/تحييد ما بعد العلاج قبل الزرع وتنظيف العينة.
Physiological saline (0.9% sodium chloride solution)	Millipore	567442	يستخدم لتعليق البكتيريا وتحضير نموذج المحلول الملحي الحمضي واليوريا.
Scanning electron microscope (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	يستخدم لتحليل مورفولوجيا البكتيريا.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	يستخدم لتقرير القلوية لعينات اختبار TA وتثبيت الفلوريسنت.
Sputter coater (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	يستخدم لوضع طلاء الذهب الرقيق قبل تصوير SEM.
SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	يستخدم لتلطيخ البكتيريا الحي/الميت قائم على الفلوريسنت.
Thiourea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	يستخدم كمادة مضادة للجذور في اختبار الإنقاذ.
Urea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	يستخدم لتحضير نموذج المحلول الملحي الحمضي واليوريا.
UV-Vis spectrophotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	يستخدم لقياس امتصاص AO7 عند 483 نانومتر.
Vitamin C (L-ascorbic acid)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	يستخدم كمختزل في نظام فنتون المساعد بفيتامين C.