طريقة شبه آلية لاكتشاف اختلافات المجموعة في أعداد الخلايا العصبية الدوبامينية في دماغ ذبابة الفاكهة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول طريقة شبه آلية لقياس أعداد الخلايا العصبية الدوبامينية في مجموعة الذبابة الدماغية الأمامية الكبيرة من ذبابة الفاكهة . صمم هذا النهج خصيصا لاكتشاف ومقارنة الفروقات بين المجموعات التجريبية ومجموعة الضبط، ويقلل الاعتماد على العد اليدوي ويوفر أداة عملية للتحليلات على مستوى المجموعة.

الملخص

تعمل ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر كنموذج قوي لدراسة الأمراض التنكسية العصبية، بما في ذلك مرض باركنسون، بشكل أساسي من خلال تحليل تنكس الخلايا العصبية الدوبامينية (DA) ونقص الحركة المرتبط. تاريخيا، كان قياس فقدان خلايا العصبون الدماغية الدماغية في دماغ الذبابة مقتصرا على مجموعات أصغر وسهلة العد، بما في ذلك عناقيد الدماغ الخلفي الوسطي (PPM) ومجموعات الدماغ الخلفي الجانبي (PPL). في المقابل، يشكل العنقود الأمامي الدماغي الأكبر بكثير (PAM)، الذي يضم أكثر من 100 عصبون، تحديا كبيرا للعد اليدوي، مما يؤدي إلى تمثيله الناقص في الدراسات الكمية. حتى الآن، لا تزال التحقيقات المبلغ عنها تعتمد على العد اليدوي الذي يتطلب جهدا كبيرا عبر مكدس Z الكونفوكي، والتي تستغرق وقتا طويلا وعرضة للتقلبات. لسد هذه الفجوة المنهجية، طورنا خط أنابيب تحليل صور شبه آلي باستخدام أداة مفتوحة المصدر Labkit. يتيح هذا البروتوكول القياس الفعال النسبي للمجموعات العصبية الإيجابية للهيدروكسيلاز التيروزين (TH) في مجموعة PAM ضمن نفس الدفعة التجريبية. تبدأ الطريقة بتلوين فلوري مناعي قياسي وتصوير كونفوكالي، يليه دليل مفصل خطوة بخطوة للتقسيم والتحليل. يعالج هذا النهج عنق الزجاجة في قياس تجمع PAM ويوفر سير عمل عملي لاكتشاف الفروق بين المجموعات في ضعف خلايا DA في نماذج التنكس العصبي. تعكس ندرة دراسات باركنسون على مجموعة PAM حاجزا تقنيا تاريخيا وليس نقص الصلة البيولوجية. من خلال تجاوز هذا الحاجز، تفتح طريقتنا الباب للتحقيق المنهجي في ضعف عصبونات PAM في اضطرابات باركنسون وارتباطها المحتمل بالأعراض غير الحركية.

المقدمة

ذبابة الخل، ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر، هي كائن نموذجي شائع لدراسة الأسس الجينية والجزيئية للأمراض التنكسية العصبية، وأبرزها مرض باركنسون (PD^). مسارات الإشارات العصبية المحفوظة، وأدوات الوراثة المتطورة، وعمرها القصير تجعلها مناسبة بشكل استثنائي لدراسة هشاشة الخلايا العصبية المعتمدة على العمر وإجراء فحوصات جينية ودوائية عالية الإنتاجية ^2,3. في جوهر هذه التحقيقات هو تحليل الخلايا العصبية الدوبامينية (DA)، التي يعد تحولها الانتقائي سمة مرضية مميزة لمرض باركنسون⁴. في دماغ ذبابة الفاكهة، تنظم خلايا DA في مجموعات منفصلة وقابلة للتعرف وراثيا ^5,6. الفقدان التدريجي لخلايا DA داخل مجموعات محددة، والذي يرى بواسطة صبغة المناعة الصبغية الصبغية وتم قياسه عبر المجهر، يعد قراءة وظيفية أساسية لتقييم تقدم المرض والتدخلات الواقية العصبية في النماذج التجريبية ^7,8. لذا، فإن القياس الدقيق لفقدان عصبون DA ضروري لترجمة قوة جينات ذبابة الفاكهة إلى نتائج بحثية ذات معنى في اضطرابات باركنسون.

تقليديا، ركز التحليل الكمي لفقدان عصبون DA على صبغ المناعة بتقنية التيروزين هيدروكسيلاز (TH) للعناقيد الصغيرة، بما في ذلك عناقيد الدماغ الخلفي الإنسي (PPM) ومجموعات البروتودماغية الخلفية الجانبية (PPL)، حيث يحتوي كل تجمع على أقل من 10 خلايا يمكن عدها بسهولة بواسطة العين⁷. التعداد اليدوي عبر مكدسات Z الكونفوكلية، رغم أنه مرهق، كان الطريقة المعتمدة لهذه التجمعات في العديد من دراسات مرض باركنسون باستخدام ذبابة الفاكهة ^9,10,11. على النقيض من ذلك، فإن العد اليدوي لمجموعة الدماغ الأمامي (PAM)، وهو أكبر مجموعة عصبية للضمير المنشط في دماغ الذبابة، والذي يضم أكثر من 100 خلية، يشكل عنق زجاجة منهجي طويل الأمد ويمنع إدراجها في غالبية دراسات مرض باركنسون ^9,10,11. على الرغم من الدور الحاسم لخلايا PAM في دوائر التعلم والذاكرة والتحفيز، إلا أن هذا القيد أدى إلى تمثيلها الناقص نسبيا في التحليلات الكمية للتنكس العصبي^{12، 13، 14، 15}. ومن الجدير بالذكر أن حتى التحقيقات الحديثة لا تزال تعتمد على هذا النهج غير الفعال في العد اليدوي، مما يؤكد الحاجة المستمرة وغير الملباة لحل موحد وآلي^{ضمن المجال.}

لسد هذه الفجوة الحرجة، طورنا خط تحليل صور شبه آلي يتيح القياس النسبي الفعال للمجموعات العصبية العصبية الإيجابية (TH⁺) في عنقود PAM داخل تجربة. يستفيد هذا البروتوكول من الإضافة المفتوحة المصدر المعتمدة على التعلم الآلي Labkit ضمن منصة Fiji/ImageJ وبرنامج معالجة الصور ثلاثية الأبعاد^16,17. يتطلب سير العمل الأساسي من المستخدم تعليق على مجموعة ممثلة من الصور لتدريب نموذج تصنيف البكسل، والذي يطبق بعد ذلك على مجموعات بيانات تجريبية تجريبية في عملية التلوين الثانوي، تليها إنشاء وتصنيف نقطة النواة بالنسبة لمنطقة ^TH+. يوازن هذا النهج بين الأتمتة والإشراف الخبير: فهو يقلل من عبء وتغير العد اليدوي الكامل مع الاحتفاظ بمدخلات الباحثين لتوجيه الخوارزمية ومراجعة النتائج.

هدف هذا المقال هو تزويد الباحثين ببروتوكول خطوة بخطوة للقياس النسبي الفعال لعصبون DA في مجموعة PAM للمقارنات النسبية بين المجموعة داخل التجربة. نعرض سير العمل الكامل، من تشريح الدماغ، وتلوين الفلورة المناعية، والتصوير الكونفوكلي إلى خط تحليل الصور التفصيلي باستخدام الطريقة شبه الآلية. من خلال توحيد هذه الخطوة الكمية الرئيسية، يهدف هذا البروتوكول إلى تمكين مجتمع البحث من دمج تجمع PAM الكبير بشكل مستمر في تحليلاتهم. تم تصميم هذه الطريقة شبه الآلية خصيصا لمجموعة PAM ولا تنطبق على مجموعات الدوبامين الأخرى أو على الخلايا العصبية الموجبة للتروفيرادومينات في الفصوص البصرية. قد تسهل هذه الطريقة دراسات على مستوى دفعات لضعف عصبونات DA في مجموعة PAM وإجراء المزيد من التحقيقات في اللدونة المشبكية، والتنكس العصبي، والفحص العلاجي باستخدام نموذج ذبابة الفاكهة .

البروتوكول

1. تحضير العينة والتصوير الكونفوكالي

1. تربية الذباب وجمعها
   1. يتحول ذباب الوالدين المختلط للأنماط الجينية المطلوبة لإنتاج نسل تجريبي. عند الإخراج، اجمع 20–30 ذبابة لكل قارورة طعام طازجة. حافظ على الذباب وفقا لتصميم المستخدم التجريبي حتى يصل إلى العمر التجريبي المطلوب.
2. التحضير للتشريح
   1. جهز طبق تشريح عن طريق ملء غطاء طبق بتري بقطر 30 مم إلى نصف الارتفاع بمطاط سيلغارد السيليكوني. املأ الطبق بمحلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS) مرة واحدة. أليكوت 450 ميكرولتر من المثبت يحتوي على 1x PBS و4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في أنبوب ميكرو طرد مركزي بسعة 0.6 مل، ثم وضع الأنبوب على الثلج.
   2. تخدير ذبابة 10–20 بنبضة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 5–10 ثوان، ثم ينقلها فورا إلى طبق بتري بقطر 60 مم موضوع على الجليد للحفاظ على الجمود.
      تحذير: PFA سام ويشتبه في كونه مسرطنا. أمسك بغطاء بخار مع قفازات ومعطف مختبر ونظارات أمان. التخلص من النفايات وفقا لإرشادات المواد الخطرة المؤسسية.
3. تشريح وتثبيت دماغ الذباب
   1. أمسك ذبابة من جذر الجناح باستخدام الملقط واغمرها من الجانب البطني للأعلى في طبق التشريح المملوء ب PBS. اخترق الصدر بدبوس دقيق لتثبيت الطعم على وسادة سيلغارد.
   2. وجه الجسم أفقيا (مثلا، الرأس إلى اليسار، البطن يمين). أمسك قاعدة الخرطوم بملقط واحد بينما تستخدم الأخرى لإزالة الخرطوم بالكامل، مما يخلق فتحة بين العينين المركبات.
   3. أمسك حواف العين المكشوفة بملقطين واسحبهما ببطء متناظر، مكشوفا الدماغ مع الحفاظ على اتصاله بالحبل العصبي البطني.
   4. قم بإزالة أكياس القصبة الهوائية والجسم الدهني المحيط بالدماغ. اقطع الحبل العصبي البطني لتحرير الدماغ والسماح له بالاستقرار على الطبق بحيث يكون جانبه الأمامي متجها للأعلى.
      ملاحظة: إذا أظهر الدماغ المستقر النصف البطني في وضع أعلى من النصف الظهري (الشكل 1B,C)، استخدم الملقط للضغط بلطف على الجزء المرتفع.
   5. بلل رأس ماصة P10 بنسبة 0.1٪ ترايتون X-100 لمنع التصاق الدماغ المفكك بجدار الطرف الداخلي. باستخدام هذا الطرف المبلل مسبقا، انقل كل دماغ مفصل إلى الأنبوب الذي يحتوي على المثبت، ثم انتقل إلى التشريح التالي. بعد نقل جميع الأدمغة، قلب الأنبوب 5 مرات وضعه أفقيا على الجليد لمدة 30 دقيقة. حضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ساعة واحدة مع التحريك.
   6. دع الدماغ يستقر في القاع لمدة دقيقة واحدة. اغسل الأدمغة لمدة 3 مرات 10 دقائق بمحلول غسيل يحتوي على 1x PBS و0.1٪ Triton X-100 (PBST) مع التحريك. تخزين الأدمغة في PBS يحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية أو تابع عملية التلطين المناعي.
4. المناعة
   1. صبغ الأدمغة في 300 ميكرولتر من محلول صبغ الأجسام المضادة الأولية يحتوي على 1x PBS، 0.1٪ ترايتون X-100، 5٪ مصل الماعز العادي، 0.1٪ أزيد الصوديوم، والأجسام المضادة للأرنب المضادة TH (تخفيف 1:500) لمدة يومين عند 4 درجات مئوية مع التحريك. اغسل الدماغ لمدة 3 مرات 10 دقائق باستخدام PBST.
   2. صبغ الأدمغة بمحلول مضاد ثانوي يحتوي على 1x PBS، 0.1٪ ترايتون X-100، 5٪ سيروم الماعز العادي، 0.1٪ أزيد الصوديوم، ومضاد الأرنب أليكسا فلور 635 لمدة يومين عند 4 درجات مئوية. اغسل الدماغ مرة واحدة باستخدام PBST.
   3. حضن الأدمغة في PBST بإضافة 4',6-دياميدينو-2-فينيل ليندول (DAPI) (تخفيف 1:1,000) لمدة ساعتين في RT، ثم غسل الأدمغة في PBST لمدة ساعتين. خزن الأدمغة عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو استمر في التركيب.
5. التركيب
   1. تحميل 0.5 مل من التركيب على حقنة 1 مل مزودة بإبرة دقيقة القياس. إنشاء غرفة تثبيت عن طريق تثبيت شريطين متوازيين من شريط لاصق شفاف على شريحة زجاجية، مع ترك فجوة بحجم 3 مم (الشكل 1A,D).
      تحذير: الإبر الحادة تشكل خطر الثقب. تعامل دائما بحذر، وأعد الغطاء باستخدام تقنية الملعقة بيد واحدة إذا لزم الأمر، وتخلص من الإبر المستخدمة فورا في حاوية حادة معتمدة.
   2. انقل الأدمغة إلى طبق بترى نظيف باستخدام رأس P200 مقطوع. أزل السائل الزائد المحيط بالأدمغة ووزع 10 ميكرولتر من التركيب على الأدمغة. اخلط الدماغ مع التركيب برفق.
   3. وزع ثلاث قطرات من التثبيت على طول الفجوة في الشريحة ووزعها بالتساوي عبر الفجوة. نقل ووضع الأدمغة على طول الخط المركزي للفجوة باستخدام ماصة P10 (الشكل 1A).
   4. ضع الأدمغة بشكل متساو على خط منتصف الفجوة بحيث يكون الجانب الأمامي متجها للأعلى. غط الفجوة ببطء بغطاء منزلق. اضغط بالقرب من حواف غطاء الغطاء بالإبهامين لمدة 3 ثوان لضمان التلامس القوي.
   5. ضع الشريحة أفقيا في مجلد شرائح لتجفيف طوال الليل في RT في الظلام، ثم عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأمد.
6. التصوير الكونفوكلي
   1. شغل نظام المجهر الكونفوكال وانتظر 15 دقيقة لتثبيت الليزر. حدد موقع الأدمغة في مجال ساطع بعدسة موضوعية بحجم 10x، ثم انتقل إلى عدسة غمر زيتي 100x وانتقل إلى مجموعة PAM تحت العرض المباشر.
   2. قم بضبط المرحلة XY لتحديد مجموعة PAM واحدة في مركز التصوير. معاينة حتى Z لتأكيد الحدود والاتجاه. اضبط التكبير الرقمي والاتجاه حتى يتناسب مجموعة PAM مع إطار التصوير على طول القطر.
   3. حدد الوضع العلوي والسفلي للتكديس. اضبط حجم خطوة Z إلى 0.34 ميكرومتر ودقة الصورة إلى 512 × 512. اضبط ثقب الدبوس على الوضع التلقائي. قم بضبط جدول البحث في العرض (LUT) على مؤشر التشبع.
   4. قم بضبط قوة الليزر وكسب الكاشف لقناة TH حتى يتم تشبع الحد الأدنى من النقاط المنفصلة والمبعثرة داخل خلايا PAM. قم بضبط إعدادات قناة DAPI للحصول على إشارة نووية ساطعة وواضحة دون تشبع.
      ملاحظة: عامل التكبير الأمثل يختلف. يمكن أن تحدث اختلافات في انكماش الأنسجة بين دفعات التجارب وبين الأدمغة الفردية داخل نفس الدفعة.
   5. احصل على الصور وحفظها بصيغة خام باستخدام 12-بت أو 16-بت في مجلد الإدخال (مثل D:\Confocal\images). ارجع إلى العرض المباشر، وأعد ضبط التكبير، وتصفح على طول الفجوة للعثور على الدماغ التالي دون الحاجة إلى تقليل التكبير.
      ملاحظة: لا تحفظ أو تصدر أو تحول ملفات البيانات الأساسية إلى صيغة .tif معالجة في هذه المرحلة. الحفاظ على البيانات الوصفية الخام الأصلية أمر ضروري لمعالجة الصور لاحقا.

2. معالجة الصور والقياس الكمية

1. تحويل ملف الصورة وتقسيم قناة TH
   1. حول الصور الخام الموجودة في مجلد الإدخال إلى تنسيق متوافق مع برنامج تحليل الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام محول الملفات المرتبط (جدول المواد). ضع الملفات المحولة في المجلد المحولة (مثلا: D:\Confocal\converted)
   2. افتح فيجي وانتقل إلى ملف | جديد | نص. في محرر النصوص، اضغط على ملف | افتح لتحميل ملف ماكرو ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (الملف الإضافي 1). انقر على تشغيل بالقرب من أسفل نافذة المحرر (إذا كان الزر مخفيا، انقر على الأيقونة المثلثة الصغيرة لعرضها).
   3. في مربع التكوين، اضغط على التصفح واختر المجلد المحول. تحت نظام التسمية، اختر الخيار 3. تحت القناة للتصدير، اختر مؤشر القناة المقابل ل TH. انقر على موافق لتقسيم قناة TH دفعات؛ سيتم حفظ تكدسات TH المصدرة تلقائيا في مجلد ينتهي ب ChannelSplitOut.
2. تدريب مصنف لابكيت
   1. إعداد مجموعة بيانات التدريب
      1. اختر 20 تكدسة تمثيلية تلتقط مجموعة من شدات الإشارة وتغيرات الخلفية للعينات من مجلد TH stack. انسخ الملفات المحددة إلى مجلد الاختيار (مثل D:\Confocal\selection).
      2. شغل ملف Fiji macro ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (الملف التكميلي 2). عند طلب ذلك، اختر المجلد الذي يحتوي على صور التدريب. يقوم الماكرو بتقليم كل مكدس إلى نفس عدد شرائح Z ويربطها في ملف TIFF بتقنية التايم لابس للتدريب.
   2. التدريب التفاعلي لمصنف البكسل
      1. إطلاق Labkit عبر إضافات فيجي | لابكيت | افتح الصورة الحالية باستخدام Labkit (جدول المواد). في شريط الأدوات، انقر على زر 3D Box للتبديل إلى وضع عرض الشرائح للتنقل بين Z-slices (شريط التمرير على الجانب الأيمن) وعبر العينات (شريط التمرير في الأسفل).
      2. اضغط S لفتح لوحة السطوع والتباين واضبط شريط Max لرؤية أفضل لخلايا ^TH+ . حدد حجم فرشاة مناسب (مثلا 5 بكسل). انقر على الإعدادات لتوسيع لوحة الأدوات. احتفظ بأوضاع العرض الافتراضية (مدمجة، مصدر، أقرب).
      3. انقر على السحب. في لوحة التصنيف، قم بتحديد الخلفية واستند إلى بعض المناطق غير الخلوية؛ قم بإبراز المقدمة وارسم من داخل بعض خلايا ^TH+ العصبية.
      4. قم بالتكبير والتقليل من الحقل باستخدام Ctrl + Shift + Scroll. انتقل إلى شرائح Z الأخرى باستخدام المنزلق العمودي وإلى عينات تدريب أخرى باستخدام المنزلق السفلي. كرر الرسم عدة مرات لضمان تدريب قوي على المصنفين.
      5. انقر على تصنيف البكسل. انقر على مثلث بدء التدريب لبدء التدريب والتنبؤ الكسول، والذي يوفر لاحقا تغذية راجعة في الوقت الحقيقي أثناء التنقل بين العينات أو الشرائح أو المواقع (انقر بزر الفأرة الأيمن والسحب) في أي وقت.
      6. انقر على Draw لإضافة تعليقات تصحيحية حيث يكون التنبؤ غير دقيق، مع خيار تبديل رؤية التنبؤ والتسمية في لوحة المصادر وإعادة التدريب. قم بالتكرار حتى يميز المصنف بشكل موثوق خلايا ^TH+ عن الخلفية، ثم حفظ المصنف عبر تقسيم | احفظ المصنف قبل إغلاق Labkit.
3. تقسيم مجموعة المختبر الدفعية
   1. افتح صورة عشوائية من مجلد TH stack في فيجي. شغل Labkit واضغط على إزالة الكل، ثم قم بتحميل المصنف المدرب مسبقا عبر تقسيم | افتح المصنف لتقسيم الصورة. افحص الجودة بصريا للتحقق من قابلية تعميم المصنف، ثم أغلق النافذة.
   2. كرر 2.3.1 على عدة صور عشوائية أخرى. أغلق النافذة بعد كل فحص ما عدا النهائي.
   3. أنشئ مجلد إخراج Labkit (مثلا: D:\Confocal\LabkitOut). ابدأ المعالجة الدفعية عبر صور > الدفعات من الأجزاء الأخرى. قم بتعيين Input Directory في مجلد TH stack وضبط Output Directory في مجلد إخراج Labkit، ثم اضغط على OK لبدء معالجة الدفعات.
   4. للتجارب المستقبلية باستخدام نفس الجسم المضاد ل TH وإعدادات الكونفوكال المماثلة، تخطي 2.2 وأعد استخدام المصنف السابق.
      ملاحظة: نحن نوفر أيضا مصنفا مدربا مسبقا لأغراض الاختبار (الملف التكميلي 3).
4. إنشاء نقاط DAPI وTH⁺ قياس الكمية العصبية
   1. ضع XT_Jove_Labkit_TH.m (الملف التكميلي 4) في مجلد سكريبت (مثل D:\scripts). افتح برنامج ثلاثي الأبعاد وانتقل إلى ملف | التفضيلات، ثم اختر الأدوات المخصصة. في لوحة مجلد XTension ، اضغط على إضافة... لاختيار مجلد السكريبت والنقر على موافق.
   2. لكل ملف محول، سيقوم السكربت تلقائيا بتنفيذ العمليات التسلسلية التالية.
      ملاحظة: هذا القسم التفسيري لا يحتوي على إجراءات للمستخدم، لكنه ضروري للانتقال إلى الخطوات التالية.
      1. تتم معالجة قناة DAPI بواسطة طرح الخلفية ومرشح Gaussian لتسهيل التعرف النقطي المحسن.
      2. يتم تحسين قناع تقسيم لابكيت عن طريق إزالة الضوضاء وملء الثقوب وربطه كقناة قناع بمجموعة البيانات. يتم بناء جسم سطحي مكرر من TH من قناة القناع. يقوم كائن سطح TH بإنشاء قناع محسن لاستبدال قناة القناع.
      3. يتم إنشاء قناة تحويل مسافة من سطح TH، حيث يتم تعيين الفوكسل داخل السطح على 0 ويتم تعيين فوكسلات خارج السطح بقيم فاصلة عائمة تمثل المسافة الإقليدية إلى أقرب سطح TH.
      4. استخدم ملف شدة كل نقطة DAPI في قناة تحويل المسافة كمقياس لتحديد خلايا ^TH+ . نقاط DAPI الواقعة داخل مناطق ^TH+ أو بالقرب منها لها قيم مسافة منخفضة. يساعد هذا المعيار في إنقاذ السلبيات الكاذبة، مثل نوى خلايا DA الحقيقية الموجودة خارج المنطقة الأمامية غير الكاملة التي تنبأ بها Labkit.
   3. التحسين اليدوي للجودة لإنشاء نقاط DAPI
      1. افتح عينة عشوائية من المجلد المحول في برنامج ثلاثي الأبعاد. انتقل إلى تعديل | خصائص الصورة والتحقق مما إذا كان حجم فوكسل Z في لوحة الإحداثيات هو 0.340 ميكرومتر. إذا لم يكن كذلك، قم بتغييره يدويا إلى 0.340 ميكرومتر.
      2. تطبيق طرح الخلفية على قناة DAPI بالنقر على معالجة الصور | تحديد العتبة | طرح الخلفية. في الحوار، ضع علامة على قناة DAPI فقط، ثم اضبط عرض الفلتر إلى 3، ثم اضغط على موافق. كرر هذه الخطوة مرة أخرى ثم قم بتكرار ثالث بعرض فلتر 1.
      3. تطبيق التلميع الغاوسي بالنقر على معالجة الصور | التنعيم | مرشح غاوسي. ضع علامة فقط على قناة DAPI، واضبطت عرض الفلتر على 0.2، ثم اضغط موافق.
      4. في مشهد التجاوز، انقر على إضافة نقاط جديدة لتشغيل ساحر إنشاء البقع. اختر قناة DAPI وأدخل قطر XY المقدر ب 1.2 ميكرومتر. باتباع الساحر، أضف مرشح "الجودة الأعلى" وضبط العتبة بدقة حتى ينتج نقطة دقيقة لكل نواة.
      5. كرر الخطوات 2.4.3.1–2.4.3.4 عبر عدة عينات عشوائية مختارا، وحدد القيم العتبية التي تعمل بشكل موثوق عبر العينات.
   4. افتح السكربت XT_Jove_Labkit_TH.m (الملف التكميلي 4) في محرر النصوص لتعديل المعلمات التالية التي يحددها المستخدم.
      1. تعيين ims_Folder على مسار المجلد المحول؛ تعيين LabkitOut_Folder إلى مسار مجلد إخراج Labkit. تعيين Ch_DAPI إلى فهرس قنوات DAPI لجميع الملفات في المجلد المحوله (مثلا، 1 إذا كانت DAPI هي القناة الأولى، 2 إذا كانت DAPI هي القناة الثانية).
      2. اضبط reVoxelSizeX، reVoxelSizeY، reVoxelSizeZ. إذا كانت أحجام الفوكسل صحيحة في خصائص الصورة (انظر الخطوة 2.4.3.1)، اترك الإجابات كأقواس فارغة []. وإلا، أدخل يدويا القيم المناسبة (مثل 0.130، 0.130، 0.340 على التوالي) والتي سيتم تطبيقها على جميع الملفات في المجلد المحول.
   5. حدد معايير إنشاء الموقع.
      1. تخصيص عدة إصدارات من المعاملات في مصفوفة خلايا SpotsParameterAss ، حيث يحدد كل صف نسخة واحدة. يشمل ذلك تحديد قطر XY المقدر (μm) لاكتشاف بقعة DAPI في الجزء الأيسر من كل صف، وتحديد سلسلة مرشح مكونة من مرشح معايير في الجزء الأيمن من كل صف، وتحتوي على عتبة الجودة من الخطوة 2.4.3.4 و/أو عتبة الشدة على قناة القناع المنقحة من الخطوة 2.4.2.2 أو قناة تحويل المسافة من الخطوة 2.4.2.3.
      2. اضبط "مركز الشدة Ch=aSizeC+1" فوق 0.5 للاحتفاظ فقط بالنقاط التي يقع مركزها الهندسي ضمن قناة قناع TH المكررة من 2.4.2.2 (قيمة الفوكسل > 0.5). هذا هو المعيار الأكثر مباشرة وصرامة لتصفية النقاط ب ^TH+ DAPI.
      3. قم بتعيين "متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" تحت [العتبة] للاحتفاظ بالنقاط التي ينخفض متوسط شدتها في قناة تحويل المسافة من الخطوة 2.4.2.3 إلى أقل من عتبة محددة. العتبات السفلى تختار الأماكن الواقعة داخل أو قريب جدا من سطح TH؛ تشمل العتبات الأعلى البقع التي تبتعد تدريجيا. هذا يسمح بمعايرة تجريبية للقرب المقبول لتعيين ^TH+ .
      4. مثال معدة مسبقا:
         SpotsParameterAss = {
         1.2، ['"الجودة" فوق 94.5,"مركز الشدة Ch=aSizeC+1" فوق 0.5'];
         1.2، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" أقل من 0.0001'];
         1.2، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" أقل من 0.001'];
         1.2، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" تحت 0.01'];
         ... يتم توفير المزيد من تركيبات المرشحات في السكريبت.
         };
      5. للتجارب المستقبلية باستخدام نفس الأجسام المضادة ل TH وإعدادات الكونفوكان، أعد استخدام تركيبات المعلمات السابقة. احذف تلك التركيبات السيئة التي تعطي عدادا نقطيا يخرج اختلافا كبيرا عن الأرقام الفعلية، مما يقلل العبء الحسابي غير الضروري.
   6. إنشاء الدفعة الموقعية
      1. احفظ جميع التعديلات السابقة على النص XT_Jove_Labkit_TH.m. افتح نافذة برنامج ثلاثية الأبعاد جديدة. انقر على القائمة معالجة الصور | PAM_TH_processing تنفيذ النص دفعة واحدة.
      2. في البداية، لاحظ لبضع دقائق أنه لكل تركيبة مرشح، ينشئ السكربت كائن Spots يعكس معلماته، وأن الملفات من المجلد المحول تتم معالجتها وحفظها كنسخ في مجلد إخراج جديد يحمل لاحقا "معالجة". ثم اترك الكمبيوتر دون مراقبة.
      3. عند الانتهاء، سيتم إنشاء جدول بيانات. راقب العمود الأول الذي يحتوي على أسماء الملفات، والأعمدة التالية التي تحتوي على نقاط DAPI تتوافق مع كل تركيبة مرشح، مع رؤوس الأعمدة التي تشير إلى القطر المقدر XY وسلسلة المرشح المستخدمة.
   7. التحقق من صحة ما بعد المعالجة
      1. بعد إكمال الخطوة 2.4.6، افتح يدويا بعض الملفات العشوائية من مجلد "معالجة" وافحص كائنات Spots المختلفة في التراكب مع قناة TH الأصلية. استنادا إلى الفحص البصري، اختر مرشحا أو اثنين مثاليين يعطيان تمثيلا دقيقا لعدد الخلايا العصبية الحقيقي ل ^TH+ . تصدير الأعمدة المقابلة من جدول البيانات للتحليل الإحصائي لاحقا وإعداد الأرقام.
      2. لتصحيح أخطاء العد النقطي في تركيبة المرشح المفضلة، اختر كائن النقاط المقابل في مشهد Overpass وانقر على تبويب التحرير . قم بإزالة البقع الخاطئة يدويا أو إضافة النقاط المفقودة حسب الحاجة بالضغط على زر Shift والنقر على الشاشة. احفظ التحديثات باستخدام التخزين باسم/التصدير باسم/حفظ ك لاستبدال الملف المقابل في المجلد "المعالج" الذي يحمل نفس اسم الملف.
         ملاحظة: لا تحذف أو تضيف أو تعيد تسمية أو تسحب/تعيد تموضع أي كائنات في Spots—فقط قم بتحرير الأماكن المفضلة. لا حاجة لتعديلات على النص؛ ببساطة أعد تشغيل السكريبت لتوليد جدول بيانات محدث يعكس التحسينات اليدوية على الفور. للاتساق، إما أن تترك أي شيء محرر، أو تعدل كائنات النقاط المفضلة لجميع العينات في التجربة.

النتائج

تم إيداع البيانات الخام التي تم جمعها من البرنامج في مستودع عام ويمكن الوصول إليه في DOI التالي: 10.5281/zenodo.19814348. لإثبات استخدام هذا المسار شبه الآلي للقياس، طبقناه على نموذج ذبابة الفاكهة المعروف جيدا لمرض باركنسون باستخدام التعبير العصبي الشامل للسينوكلين α البشري (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). كانت طيارات التحكم تنقل سائق nSyb-QF2 وحده. تم عمر كلا النموذجين عند 29 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع، ثم تم تشريح الأدمغة، وتلوينها المناعية للعلاج ب TH، وتصويرها لمجموعة PAM. كما هو موضح في الشكل 3E، اكتشف خط الأنابيب شبه الآلي انخفاضا كبيرا في عدد عصبونات PAM TH⁺ في الذباب الذي يعبر عن السينوكلين α مقارنة بالضوابط (اختبار t لستودنت، p < 0.0001)، مما يثبت أن الطريقة يمكنها التقاط الفروق المعتمدة على النمط الجيني داخل نفس الدفعة التجريبية. تصف الأقسام التالية تكوين التركيب (الشكل 1)، وواجهة تدريب لابكيت (الشكل 2)، وخطوات معالجة الصور (الشكل 3) التي تمكن هذا القياس الكميمي.

يوضح الشكل 1 التكوين المتزايد لأدمغة ذبابة الفاكهة المفككة وتأثيره على تصوير عنقود PAM. بعد التشريح، تظهر الأدمغة أحيانا انحناء أو ميلان للأعلى في الأنسجة المجاورة للحبل العصبي البطني المقطوع. هذا الرفع في الجزء البطني من الدماغ يغير المنظور تحت المنظار المجسم، مما يؤدي إلى تغيير في إسقاط الأخاديد النمطي في الشكل الظهري واختلاف في المنظور النسبي للمعالم البطنية. (الشكل 1B,C). غالبا ما يحدث هذا التشوه في اللحظة التي ينفصل فيها الدماغ عن الجسم. يؤثر هذا التشوه على اتجاه تجمع PAM أثناء التركيب، مما يؤثر على عمق المكدس Z المطلوب (الشكل 1C,D). في ظروف التثبيت المثلى، يخلق فاصل شريط سكوتش ذو الطبقة الواحدة ضغطا كافيا على منطقة الدماغ المركزية، مما يجعل عنقود PAM الموجود ظهريا يتخذ اتجاها أفقيا مجاور مباشرة للغطاء الداخلي. ينتج هذا التكوين مكدسات Z من 15 إلى 25 شريحة بفواصل 0.34 ميكرومتر (الشكل 1D). في الحالة الأخرى، يحتفظ عنقود PAM بوضعية مائلة، مما يستلزم وجود مكدسات Z أعمق (الشكل 1D). وبالمثل، يفشل استخدام فاصل شريط مزدوج الطبقة في توفير ضغط كاف، مما يترك عنقود PAM في تكوينه الأصلي المائل، مما يزيد أيضا من عمق المكدس Z (الشكل 1D). يوضح الشكل 1E رؤى إسقاط جانبي ممثلة لمجموعات Z المصبوغة ب TH تحت ظروف مثالية ومائلة.

يعرض الشكل 2 واجهة مستخدم Labkit وسير عمل تدريبي ممثل. مع وجود بعض التعليقات المتفرقة على عينة واحدة فقط (الشكل 2A)، ينتج مصنف البكسل الأولي بالفعل تقسيما معقولا بشكل ملحوظ (الشكل 2B). ومع ذلك، من الضروري التأكيد على أن مثل هذا التعليق البسيط غير كاف لأداء قوي وقابل للتعميم عبر مجموعة بيانات كاملة. يتطلب إنشاء مصنف يقسم خلايا ^TH+ العصبية بشكل موثوق عبر مجموعة البيانات الكاملة بشكل أكثر تكرارا — يشمل عدة شرائح Z، وعينات، وتغيرات التلوين. ومن الجدير بالذكر أن صور التدريب المتعددة متصلة على طول بعد الزمن (الإطار) بدلا من تكديسها على محور Z. يحافظ هذا التصميم على السلامة المكانية لكل حجم دماغي فردي، مما يضمن أن نوى المرشح ثلاثي الأبعاد تعمل حصريا داخل العينات البيولوجية — وليس عبرها — إذا تم تكديس العينات عموديا في مكدس Z سميك واحد، فإن شرائح Z عند الحدود بين العينات المجاورة ستصبح متجاورة مكانيا، مما يؤدي إلى معاملة فوكسلات من أدمغة مختلفة كهياكل متجاورة، مما يزيد من خطر التصحيحات اليدوية غير الضرورية (الشكل 2C). يتجنب التداخل على طول محور الزمن مثل هذا التلوث عبر العينات، مع تمكين التدريب الفعال ومتعدد العينات في جلسة Labkit واحدة.

يوضح الشكل 3 خط أنابيب المعالجة اللاحقة والقياس النهائي. تحتوي أقنعة تقسيم Labkit الخام (الشكل 3A) على العديد من البقع الصغيرة الإيجابية الكاذبة والثقوب الداخلية. بعد تطبيق عمليات إزالة الضوضاء الشكلية وملء الفتحات (الشكل 3B)، يتم بناء سطح TH ملمس ويستخدم لتوليد قناع ثنائي مكرر (الشكل 3C). يتم تصور التحسين الذي حققته هذه التحسين كتراكب يقارن بين الأقنعة الأولى والنهائية (الشكل 3D، الجزء العلوي). ومن الجدير بالذكر أن بعض مناطق العصبية الغنية ب TH تحتفظ أحيانا في القناع النهائي؛ ومع ذلك، فإن هذه المناطق غالبا ما تكون خالية من النوى المصبوغة ب DAPI، وبالتالي تساهم بشكل ضئيل في عدد الخلايا العصبية النهائي. يمكن للمستخدمين المتقدمين تعديل المعلمات الشكلية في سكريبت معالجة الدفعات المرفق لضبط إزالة هذه التشويذات المتبقية بدقة. الشكل 3D (الأسفل) يوضح البقع النهائية ل DAPI (الأرجواني) موضوعة على قناة TH (الأخضر) من إسقاط شدة قصوى. يكشف الشكل 3D أيضا عن نوع نادر من الإيجابيات الكاذبة التي تلاحظ أحيانا في خط أنابيب الإنتاج: قد تصنف نواة مصبوغة ب DAPI داخل منطقة عصبية غنية ب TH بشكل خاطئ كنقطة TH⁺ عندما تتداخل إشارة العصب بشكل كبير مع النواة. ومع ذلك، كما هو موضح في الشكل 3C، فإن النوى الموجبة ل DAPI بالقرب من الأعصاب عادة ما تكون قليلة. علاوة على ذلك، غالبا ما تبقى إشارات DAPI القليلة الموجودة بالقرب من هذه المناطق العصبية مصنفة بشكل صحيح كسلبية حقيقية (أي لا تحتسب ك TH⁺)، لأنها لا تخطئ في التعرف عليها من قبل خط الأنابيب. يوضح الشكل 3E الفائدة العملية للطريقة: حيث تظهر ذبابات nSyb-QF2>SNCA التي مضى عليها 3 أسابيع انخفاضا كبيرا في عدد عصبونات PAM ^TH+ مقارنة بعناصر التحكم nSyb-QF2 عبر عدة مرشحات (اختبار t، p < 0.0001). على الرغم من أن العد المطلق للنقاط قد يختلف عبر تركيبات المرشحات المختلفة وأن الطريقة لا تحقق دقة مثالية في النقطة الواحدة، إلا أن الفرق النسبي بين المجموعات التجريبية والضابطة يبقى قويا. بالنسبة لعدة مرشحات تم اختبارها، يتم الحفاظ على النتيجة الإحصائية للمقارنة الجماعية إلى حد كبير عبر المرشحات ضمن نفس دفعة التجارب. وبناء عليه، يجب تفسير الناتج كقراءة مقارنة داخل الدفعة بدلا من العد المطلق الخالي من الأخطاء لخلايا PAM العصبية.

الشكل 1. تشريح دماغ ذبابة الفاكهة وتكوين التركيب. (أ) مخطط تخطيطي لمجموعة تركيب الدماغ. تمثل الأشرطة الصفراء فواصل شريط اسكتلندي. يشير مخطط الدماغ المتوسع إلى الموقع التقريبي لمجموعة PAM (باللون البنفسجي). (ب) مخططات مقطعية جانبية تتوافق مع المستوى المتقطع في A توضح شكلين شائعين للدماغ بعد التشريح: موضع مثالي (علوي) ومائل (أسفل). (ج) دماغان ذبابان مفصولان ينظر إليهما تحت جهاز ستيريوسكوب: في وضع مثالي (يسار) مقابل مائل (يمين). تشير الأسهم الصفراء إلى الأخاديد النمطي على طول المنحنى الظهري. تربط الخطوط الزرقاء المتقطعة بين معلمين متقابلين على الجانبين الأيسر والأيمن من النصف البطني. تسلط الأسهم الزرقاء الضوء على التحول الناتج في المنظور النسبي لهذه المعالم البطنية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (D) رسم تخطيطي يوضح كيف يؤثر شكل الدماغ وسمك فاصل الشريط (طبقة واحدة مقابل طبقتين) على التموضع الرأسي لمجموعة PAM وبالتالي على عمق المكدس Z المطلوب. (ه) رؤى جانبية تمثيلية (إسقاط Y) لمداخن Z كونفوكالية مصبوغة ب TH من ظروف تثبيت مثالية (علوية) ومشوهة (سفلية). شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الاختصار: PAM = البروتوسوكيرا الأمامي الإنسي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2. تدريب Labkit والتقسيم التفاعلي. (أ) واجهة المستخدم الرسومية Labkit. تعرض التعليقات (الخربشات) في فئتين: المقدمة (الأحمر) والخلفية (زرقاء). (B) نتيجة التقسيم التي تم توليدها مباشرة بعد التدريب على الخربشات المعروضة في A. الأحمر يشير إلى لون المقدمة؛ الأزرق يشير إلى لون الخلفية. شريط السلم = 5 ميكرومتر. (C) تداخل بين شرائح Z المتجاورة. تم دمج صور شريحة واحدة للميتوكوندريا الموسومة بالبروتين الفلوري من أدمغة ذبابة مختلفة على طول المحور Z. الشرائح 1 و3 نسخ متطابقة من نفس الصورة، بينما الشرائح 2 و4 تنشأان من أدمغة مختلفة. سهام صفراء، التوقعات تتسرب من الشريحة 2 إلى الشريحة 1. الأسهم الخضراء، التوقعات تتسرب من الشريحة 4 إلى الشريحة 3. شريط المقياس = 3 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3. المعالجة اللاحقة لأقنعة تقسيم Labkit وقياس الخلايا العصبية ^TH+. (أ) قناع Raw Labkit الثنائي (سماوي علوي) وطبقة مع قناة TH الأصلية (السفلى). لاحظ وجود نقاط صغيرة وفيرة وعدم اكتمال لأجسام الخلايا العصبية. (ب) القناع بعد إزالة الضوضاء الشكلية وملء الثقوب (الأرجواني، الأعلى)؛ التراكب مع قناة TH (في الأسفل). (ج) قناع ثنائي منقح (أحمر، علوي) من سطح TH ملمس لصالح B وإعادة التغطية؛ التراكب مع قناة TH (في الأسفل). (D) الجزء العلوي: طبقة من الأقنعة الخام (السماوي) والمصقولة (الحمراء)، تبرز المناطق التي تم تصحيحها بعد المعالجة. الأسفل: عرض أقصى شدة يظهر بقع DAPI النهائية (الأرجواني) مرتبة على قناة TH (باللون الأخضر). لاحظ أن البقعتين في الزاوية العلوية اليمنى تنشأان من مجموعة PAM المقابلة. تم استخدام الفلتر 4 للتوضيح. (ه) التحقق الكمي في نموذج مرض باركنسون باستخدام تركيبات مرشحات متعددة. تظهر ذبابة nSyb-QF2>SNCA (نموذج PD) التي تبلغ من العمر ثلاثة أسابيع انخفاضا كبيرا في عدد الخلايا العصبية PAM ^TH+ مقارنة بعناصر التحكم nSyb-QF2 في عدة مرشحات (الأعلى). يتم توفير البيانات الخام في جدول بيانات (في الأسفل). الفلتر 1: 1.2، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" تحت 0.0001']; الفلتر 2: 1.2، ['"الجودة" فوق 94.5، "متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" أقل من 0.001']; الفلتر 3: 1.2، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" أقل من 0.01']; الفلتر 4: 1.2، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" أقل من 0.05']; الفلتر 5: 0.6، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" أقل من 0.001']; الفلتر 6: 0.6، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" تحت 0.01']; الفلتر 7: 0.9، ['"الجودة" فوق 94.5,"متوسط الشدة Ch=aSizeC+2" أقل من 0.01']; n = 57 دماغا (ضابطة)، n = 65 دماغا (PD); اختبار t للطالب، p < 0.0001 (****). تم تربية الذباب عند درجة حرارة 29 درجة مئوية. أشرطة السلم = 5 ميكرومتر (A–D). تعرض البيانات كمتوسط ± SD. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1. ماكرو فيجي لفصل قناة TH من ملفات الصور المحولة وحفظ مكدس الإخراج.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2. Fiji macro لمحاولة تدريب مجموعات Z إلى عمق Z-slice شائع وربطها في ملف TIFF بتقنية التايم لابس لتدريب مصنفات Labkit.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 3. مصنف Labkit المدرب مسبقا يستخدم لاختبار سير عمل تقسيم PAM TH.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 4. سكريبت MATLAB لمعالجة أقنعة Labkit دفعات، وتوليد نقاط DAPI، وتطبيق تركيبات المرشحات، وتصدير عدد الخلايا العصبية ^TH+ .يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

كان قياس خلايا DA في عنقود PAM ذبابة الفاكهة تحديا كبيرا تاريخيا. هنا، نقدم سير عمل شبه آلي يدمج تصنيف البكسلات المعتمد على التعلم الآلي مع برامج تحليل الصور لمعالجة هذه المشكلة الطويلة الأمد. تمكن هذه الطريقة من الكشف على مستوى الدفعات عن التغيرات في خلايا TH⁺ في مجموعة PAM بين مجموعات نفس التجربة، مما يدعم الدراسات المقارنة في نماذج مرض باركنسون¹⁸.

عند اختيار المرشح الأمثل لتجربة معينة، يمكن للمستخدمين اختيار المرشح الذي يتوافق بشكل أفضل مع الفحص البصري للصور الخام، أو الرجوع إلى النطاق و/أو المتوسط المبلغ عنه لأعداد عصبونات PAM البرية في الأدبيات^12,13. ومع ذلك، يجب الحذر: فقد أبلغت دراستان فقط عن أعداد تجمعية لمرض PAM، ولا علاقة لأي منهما بمرض باركنسون، وتظهر القيم المبلغ عنها تناقضا كبيرا. علاوة على ذلك، قد يزداد الانحراف المعياري مع التقدم في العمر، مما يعقد مقارنات الدراسات المتقاطعة. لذلك، يجب استخدام المراجع القائمة على الأدبيات فقط كدليل تقريبي، وليس كمعيار مطلق. نعترف بأن هذا الخط لا يعطي عددا مطلقا خاليا من الأخطاء (الشكل 3D). ومع ذلك، طالما أن المقارنات تقتصر على مجموعات ضمن نفس دفعة التجارب (أي عدم تجميع البيانات عبر دفعات مختلفة في رسم بياني واحد)، يمكن استخدام الطريقة لاكتشاف الفروق النسبية بين الأنماط الجينية أو ظروف العلاج داخل دفعة.

من خلال تجربتنا، يجب تجنب الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة مع AF488 بسبب الخلفية العالية، ويجب تجنب AF546 بسبب ارتفاع التوهين في الإشارة على محور Z. كما وجدنا أن حضانة وغسل DAPI الشاملين ضروريان لتحقيق نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء ووضوح الإشارات النووية، مما يؤثر مباشرة على أداء التقسيم الآلي. يعد DAPI أفضل من Hoechst لهذا التطبيق، حيث أن تلوينها التفضيلي للهتروكروماتين يولد بقعا نووية أكثر سطوعا ووضوحا، مما يسهل الكشف بدقة أكبر.

مناقشة استكشاف الأخطاء لأوضاع الفشل الشائعة

أعطال متعلقة بالصبغ. مهارة التشريح هي عامل رئيسي محدد لجودة البيانات. تقع مجموعة PAM بشكل سطحي وسهلة التلف عند إزالة الكيسين الخلفيين والدهون من الجسم الظهري إلى هذه المنطقة. يجب التعامل مع الملقط بحذر لتجنب ثقب أو ضغط منطقة PAM. غالبا ما يحدث التشوه البطني في اللحظة التي يقطع فيها الحبل العصبي البطني، مما يسبب ميل أو انحناء الدماغ عند وضعه على شريحة زجاجية؛ يمكن أن يصبح هذا التشوه ثابتا بشكل دائم بعد حضانة الأقدام الكهربائية. يجب على المستخدمين تجربة زوايا الملقط أثناء القطع لإيجاد أفضل التقنية. إذا لوحظ ميل بعد التشريح، قد يؤدي الضغط اللطيف على المنطقة المرتفعة إلى عكس التشوه (مقبول إذا لم تكن المنطقة المضغوطة هي المنطقة المعنية).

فشل التقسيم. عادة ما ينشأ التقسيم الضعيف من بيانات التدريب غير المتنوعة بما فيه الكفاية. يجب تدريب مصنف لابكيت على مجموعة تمثيلية من الصور تغطي كامل نطاق جودة التلوين داخل الدفعة، بما في ذلك الأفضل والمتوسط والضعيف. خلال التصحيح التكراري، أعط الأولوية لملاحظة الإيجابيات الكاذبة والسلبية الكاذبة التي تشعر بالثقة تجاهها. تجنب تصحيح المناطق الغامضة أو غير المؤكدة، لأن ذلك قد يضلل المصنف ويؤثر على الأداء.

فشل في الكشف الجزئي. يتطلب تحسين المعلمات استكشافا منهجيا على مجموعة صغيرة من العينات الممثلة. اختبر أقطار نقاط تقديرية مختلفة وعتبة مرشح الجودة، أو حتى أنواع المرشحات التي تتجاوز مرشح "الجودة الأعلى" المستخدم في هذا البروتوكول. يقدم معالج إنشاء النقاط خيارات تصفية متنوعة (مثل الشدة). يشجع المستخدمون على تكييف عتبات وأنواع المرشحات لتناسب بياناتهم المحددة، وإجراء ضبط تجريبي قبل المعالجة الدفعية.

لماذا يظل العد اليدوي لخلايا عنقود PAM صعبا للغاية؟ تتميز مجموعة PAM بخصائص تشريحية وتلوين فريدة تجعل طرق العد اليدوي التقليدية غير كافية. أولا، يحدد فلورية المناعة الTH في السيتوسول لخلايا الدوبامين العصبية ذبابة الفاكهة بشكل رئيسي حلقة سيتوبلازمية رفيعة تحيط بفراغ نووي كبير غير مصبوغ. وبالتالي، تظهر النواة المصبوغة ب DAPI وحجرة السيتوبلازم ^TH+ تداخل مكاني ضئيل. هذا النقص الأساسي في التداخل يمنع استراتيجية التصنيف المباشرة ل "نقطة DAPI داخل قناع TH". ثانيا، يتكون تجمع PAM من أكثر من 100 خلية عصبية مكتظة بكثافة مرتبة في بنية ثلاثية الأبعاد تشبه العنب. أثناء التنقل عبر أكوام Z الكونفوكلية، تظهر الخلايا العصبية وتختفي تدريجيا—بعضها يدخل الطائرة، وأخرى تخرج—مما يخلق عبئا معرفيا عاليا وتغيرا كبيرا بين المراقبين. اعتمدت أحدث دراسة لقياس خلايا PAM DA على العد اليدوي باستخدام إضافة عداد الخلايا من ImageJ. ورغم أن هذا النهج مناسب تماما للمجموعات الصغيرة مثل PPM1/2 أو PPL1، إلا أن هذا النهج يصبح مكلفا للغاية عند تطبيقه على مجموعة PAM، خاصة في الدراسات التي تتطلب عشرات أو مئات العينات.

لماذا تعتبر بنية الغابات العشوائية في Labkit مناسبة بشكل خاص لتقسيم الخلايا العصبية التورونية الميثوليكية؟ ينفذ لابكيت مصنف بكسل عشوائي قائم على الغابات متكيف بشكل استثنائي مع التحديات الخاصة بصور عنقود PAM المصبوغة ب TH. تحسب الخوارزمية متجه ميزات شامل لكل بكسل عن طريق تطبيق سلسلة من مرشحات التحول، بما في ذلك الضباب الغاوسي، وفرق الغاوسيان، ومقدار التدرج الغاوسي، واللابلاس للغاوسية، والقيم الذاتية الهيسية—كل منها يتم تقييمه عند عدة مقاييس سيغما (1، 2، 4، 8). تلتقط هذه الميزة متعددة المقاييس بشكل فعال خصائص النسيج والحواف التي تميز الجزء الداخلي النووي عن الخلفية خارج الخلية. ومن المهم أن الغابات العشوائية تتطلب بيانات تدريب أقل بكثير من أساليب التعلم العميق، يمكن للمستخدمين تحسين المصنف بشكل تكراري باستخدام تعليقات متقطعة على ما لا يقل عن 20-40 صورة تمثيلية. كل تكرار يضيف أشجار قرارات جديدة إلى المجموعة، والتي تصوت معا لتصنيف كل بكسل. تستوعب هذه العملية بشكل جوهري التغيرات من دفعة إلى دفعة في ظروف التلوين والتصوير — وهي ميزة حاسمة نظرا للتباين البيولوجي المتأصل في التهجينات الجينية لذبابة الفاكهة ودراسات الشيخوخة. باستخدام هذا النهج، يمكن اكتشاف فقدان خلايا ^TH+ في نماذج باركنسون التي تعبر عن السينوكلين α، ويمكن مقارنة تأثيرات المعززات والمثبطات الجينية على أعداد عصبونات عنقود PAM ضمن دفعة تجريبية.

ومن المهم أنه لغرض التدريب، يتم ربط الأكوام المقطوعة على طول البعد الزمني بدلا من تكديسها على محور Z. يعد هذا الاختيار التصميمي حاسما لتدريب المصنفين الأمثل. تصنيف البكسلات ثلاثي الأبعاد في لابكيت يأخذ في الاعتبار معلومات الفوكسل عبر شرائح Z المتتالية، وهو أمر ضروري لحل حلقة TH الرقيقة السيتوبلازمية التي تحدد شكل خلايا PAM بدقة. إذا تم تكديس العينات الفردية عموديا في مكدس Z واحد فائق السماكة، فإن شرائح Z عند حدود العينات المجاورة ستصبح متجاورة مكانيا داخل المكدسة. وبالتالي، ستعامل الفوكسلات التي تنتمي إلى عينات بيولوجية مختلفة كهياكل مجاورة ضمن نفس الحجم ثلاثي الأبعاد. خلال التدريب التفاعلي، قد تلتقط الخربشة المرسوم بالقرب من مثل هذا الحد ميزات من عينتين مختلفتين في نفس الوقت، مما يربك المصنف (الشكل 2B، الأسهم). علاوة على ذلك، يمكن أن تسقط الإشارات الإيجابية الكاذبة القادمة من عينة واحدة إلى حجم العينة المجاورة، مما يؤدي إلى خربشات تصحيحية خاطئة تنتشر عبر تكرارات التدريب اللاحقة، مما يولد أشجار قرار ترمز قواعد بيولوجية لا معنى لها. يحافظ دمج العينات على طول محور الزمن على السلامة المكانية لكل حجم فردي، مما يسمح لنوايا المرشح ثلاثية الأبعاد بالعمل حصريا داخل العينات البيولوجية وليس عبرها فقط، مع تمكين التدريب الفعال ومتعدد العينات في جلسة Labkit واحدة.

الاعتبارات المنهجية والقيود

هناك عدة تحفظات مهمة تستحق النقاش. أولا، هذا البروتوكول محسن خصيصا لمجموعة PAM وقد لا يعمم على مجموعات DA أخرى (مثل PPM1/2/3، PPL1) أو إلى خلايا ^TH+ في الفصوص البصرية. تستفيد منطقة PAM من كثافة DAPI المتفرقة نسبيا، حيث تكون النوى منفصلة جيدا في الفضاء ثلاثي الأبعاد، مما يتيح اكتشافا قويا وواضحا لنقاط DAPI. على النقيض من ذلك، هذا السير غير قابل للنقل بسهولة إلى مجموعات DA أخرى مثل PPL1 أو PPM1/2. في تلك المناطق، من المرجح أن تتداخل الخلايا العصبية مع أنوية غير DAP الملطخة ب DAPI أو تتداخلها. نظرا لانخفاض عدد خلايا DA في هذه المجموعات الصغيرة (غالبا أقل من 10 خلايا لكل مجموعة)، حتى بعض التصنيفات الخاطئة قد تؤدي إلى أخطاء كبيرة نسبيا، مما يجعل الطريقة أقل موثوقية في مثل هذه التطبيقات. ثانيا، التلوين المناعي بتقنية TH يحدد أيضا الأعصاب العصبية والبسكوات المحورية داخل العصبية. على الرغم من التعليقات التصحيحية أثناء التدريب، تنتج هذه المسارات الليفية أحيانا إشارات TH قوية وقد يتم تصنيفها بشكل خاطئ كمقدمة من قبل المصنف. ومع ذلك، فإن هذه المناطق في عنقود PAM غالبا ما تكون خالية من النوى المصبوغة ب DAPI؛ لذا، تساهم الفوكسل الإيجابية الكاذبة في المنطقة الغنية بالعصب من عنقود PAM بشكل ضئيل في العد النهائي للعصبونات. ثالثا، يعمل تصنيف البكسلات في Labkit على ميزات النسيج المحلية داخل جوار محدود (تستجيب نوى المرشح الافتراضية لحوالي 16 × 16 بكسل). يضمن هذا التصميم الكفاءة الحاسوبية ويتيح التقسيم التفاعلي في الوقت الحقيقي، لكنه يعني أيضا أن المصنف لا يمكنه الاستفادة من السياق التشريحي العالمي. وبالتالي، قد تتطلب العيوب النادرة أو التغيرات في التلوين التي تختلف بشكل كبير عن مجموعة التدريب إلى مراجعة كل حالة على حدة. وأخيرا، خط أنابيب معالجة الدفعات الموضح هنا—الذي يدمج تقسيم Labkit مع اكتشاف النقاط وتحويل المسافة من DAPI—يولد قنوات إخراج وتركيبات مرشحات متعددة. يجب على المستخدمين التحقق بشكل منهجي من معايير المرشح المثلى لظروفهم التجريبية الخاصة بدلا من اعتماد العتبات الافتراضية المقدمة في هذا البروتوكول دون نقد.

التطبيقات المستقبلية

بعيدا عن نموذج باركنسون الموضح هنا، يمكن تطبيق هذا المسار شبه الآلي مباشرة على أي نموذج ذبابة الفاكهة يتضمن قياس كمية الخلايا العصبية DA في مجموعة PAM، بما في ذلك دراسات التعلم والذاكرة، والدافعية، وتنظيم النوم، والتنكس العصبي المرتبط بالعمر. على وجه التحديد، قد تجعل قدرة هذه الطريقة على معالجة دفعات مناسبة ل: (1) فحوصات الأدوية ذات الإنتاجية المتوسطة إلى العالية: يصبح اختبار عدة مركبات واقية عصبية عبر الجرعات أكثر قابلية للتنفيذ دون زيادة متناسبة في جهد العد اليدوي. (2) فحوصات المعدل الجيني: قياس عدد عصبونات PAM في مئات الهزيجات الجينية (مثل خطوط RNAi، خطوط التعبير) لتحديد المعززات أو المثبطات لتسمية α-سينوكلين. (3) دراسات الشيخوخة الطولية: تتبع فقدان عصبونات PAM عبر نقاط زمنية متعددة مع تقليل عبء العد اليدوي. علاوة على ذلك، فإن سير عمل التقسيم القائم على Labkit لا يقتصر على تلوين TH؛ مع إعادة التدريب المناسبة، يمكن تكييفها لقياس مجموعات عصبية أخرى في دماغ ذبابة الفاكهة ، بشرط أن تشترك في ميزتين رئيسيتين مع عنقود PAM: كثافة منخفضة نسبيا من النوى المصبوغة ب DAPI وتداخل طفيف جدا من تصبغ العصابات. بعيدا عن Labkit والبرامج ثلاثية الأبعاد المستخدمة هنا، يمكن تنفيذ المنطق العام لهذا الخط—تصنيف البكسلات المعتمد على التعلم الآلي متبوعا بالكشف النقطي وتحويل المسافة—في منصات تحليل الصور ثلاثية الأبعاد مدعومة أخرى، مما يزيد من سهولة الوصول والمرونة لمجتمع البحث الأوسع.

باختصار، نقدم سير عمل شبه آلي لاكتشاف الفروق الجماعية في أعداد الخلايا العصبية TH⁺ في عنقود PAM. من خلال دمج تصنيف البكسلات المعتمد على Labkit مع الكشف النقطي وتحويل المسافة، تتيح هذه الطريقة مقارنة أعداد الخلايا العصبية TH⁺ بين المجموعات التجريبية والمجموعة الضابطة ضمن نفس الدفعة، مع تقليل عبء العد اليدوي مع زيادة حجم العينة. التوسع من عشرات إلى مئات العينات يزيد من وقت الحوسبة بشكل متناسب، لكن الجهد اليدوي الإضافي يقتصر بشكل رئيسي على تنظيم الملفات والتحقق الفوري من الجودة. بينما لم يحظ تجمع PAM باهتمام كبير في أبحاث مرض باركنسون حتى الآن، إلا أن ذلك يعود إلى حد كبير إلى القيود التقنية وليس لعدم الصلة البيولوجية. من خلال توفير أداة قياس عملية للكمية، سيسهل بروتوكولنا في المستقبل التحقيق فيما إذا كانت عصبونات PAM تتدهور في نماذج اضطراب الشخصية ويستكشف مساهمتها المحتملة في الأعراض غير الحركية، مثل نقص الشم وتراجع التحفيز. نتوقع أن يسهل هذا البروتوكول دراسات مقارنة على مستوى دفعات حول التنكس العصبي الدوباميني، والمرونة المشبكية، وفحص الأدوية الوقائية في نظام ذبابة الفاكهة .

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
برنامج معالجة الصور ثلاثي الأبعاد - Bitplane Imaris 8.0+	أوكسفورد إنسترومنتس	http://www.bitplane.com/	برنامج تحليل الصور ثلاثية الأبعاد المستخدم في هذه الدراسة
4',6-دياميدينو-2-فينيليندويل (DAPI)	ثيرمو فيشر العلمي	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	مركز بلومينغتون لمخزون ذبابة الفاكهة	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	مركز بلومينغتون لمخزون ذبابة الفاكهة	600605
دوسيل سيلغارد 184	شركة تات لي للهندسة المحدودة	https://www.tatlee.com.sg/
ملقط دومونت ستايبل 3C دوموكسل، 0.04/0.08 مم	علوم المجهر الإلكتروني	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 كونفوكال	أوليمبوس	https://www.olympus-global.com/
الجسم المضاد الثانوي الممتص عبر المضاد المضاد للأرانب IgG (H+L)، أليكسا فلور 647	ثيرمو فيشر العلمي	A-21244
ImageJ/فيجي (1.53q)	فيجي/إيميج جي	https://imagej.net/software/fiji/
لاب كيت	فيجي/إيميج جي	https://imagej.net/plugins/labkit/
دبابيس دقيقة، من الفولاذ المقاوم للصدأ، قطر 0.15 مم	أوسترليتز	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
مصل الماعز العادي، المحلول الصلب المصاب بالليوفيليز	سيغما-ألدرتش	566380
برامج الحوسبة العددية - بايثون	بايثون	3.8+
برنامج الحوسبة العددية - Matlab	العمل الرياضي	R2016a+	برامج الحوسبة العددية المستخدمة في هذه الدراسة
أوكتيل فينول إيثوكسيلات (Triton X-100)	بيو-رادي	1610407
محلول بارافورمالديهايد 4٪ في PBS	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية	SC-281692
طبق زراعة خلايا البوليسترين	نيست ساينتيفك	706001
تركيب برو لونغ الذهبي المضاد للتصبغ	ثيرمو فيشر العلمي	P36934
هيدروكسيلاز رابيت المضاد للتيروسين (TH)	تجمد الحبوب	P40101-0
أزيد الصوديوم	سيغما-ألدرتش	S2002
ستيريوسكوب	أوليمبوس	SZ51
Sterican Einmalkanü 27 G grau 0.40 × 12 مم	ستيريكان	D-34209
حقنة، 1 مل	تيرومو	DVR-5175
شريط لاصق شفاف	3M سكوتش 600، واضح	600