التعرف النصي على مؤشرات المرشحين المرتبطة بنظام رينين-الأنجيوتنسين والاختبار الخارجي لنموذج تشخيصي لارتفاع ضغط الدم

ملخص

باستخدام مجموعات بيانات النسخ النسبي للدم العامة، حددت هذه الدراسة مؤشرات حيوية مرشحة مرتبطة بنظام رينين-أنجيوتنسين (RAS) لارتفاع ضغط الدم. أسفرت المعلوماتية الحيوية وتعلم الآلة عن توقيع مكون من ثمانية جينات تم اختباره في مجموعة مستقلة قائمة على الدم، يربط بين التغيرات النصية في RAS والتوقيعات المناعية والالتهابية التي تتطلب مزيدا من التحقق.

الملخص

هدف هذا العمل إلى تحديد العلامات الحيوية المرشحة المرتبطة بنظام رينين-أنجيوتنسين (RAS) المرتبطة بارتفاع ضغط الدم، وبناء نموذج تشخيصي مرشح مختبر خارجيا، والتحقق من صحة الجينات المختارة في نموذج خلايا بطانية مستحثة من Ang II. تم تحليل مجموعتين من بيانات المصفوفة الدقيقة العامة، GSE75360 و GSE74144. تم إجراء تحليل التعبير التفريقي باستخدام ليما، تلاه إثراء GO/KEGG، وتحليل GSEA المصنف مسبقا، وتحليل تسرب المناعة CIBERSORT، وتفاعل البروتين والبروتين، وبناء الشبكات التنظيمية، واختيار الميزات المعتمد على التعلم الآلي باستخدام الانحدار اللوجستي والغابة العشوائية. تم تطوير نموذج انحدار لوجستي يعتمد على الجينات المختارة في GSE75360 وتم اختباره خارجيا في GSE74144. تم إجراء التحقق التجريبي في اختبارات HUVEC المستحثة من Ang II باستخدام اختبارات qRT-PCR، وWestern blating، وELISA، وCST3/FURIN لفقدان وزيادة الوظيفة، تلاها تحليلات CCK-8، ترانسويل، الالتهابات، الإجهاد التأكسدي، ووظائف البطانة. في عام GSE75360، تم تحديد 173 جينا معبر عنه تفاضلا، بما في ذلك 18 جينا معبر عنه تفاضلي مرتبط ب RAS. تم اختيار ثمانية جينات مرشحة، LRP1، CTSD، MTHFR، AUTS2، FURIN، CST3، FCER1G، وTBXAS1، من خلال تحليلات تعلم آلي مشتركة. أشارت تحليلات الإثراء وتسلل المناعة إلى أن هذه الجينات مرتبطة بشكل رئيسي بالتوقيعات المناعية والالتهابية. أظهر نموذج الجينات الثمانية تمييزا عاليا في GSE75360 وحافظ على أداء متوسط في GSE74144. في HUVECs المعالجة ب Ang II، تم رفع تنظيم معظم الجينات المرشحة على مستوى mRNA، وتم التحقق من صحة CST3 وFURIN وTBXAS1 على مستوى البروتين. غير تعديل CST3 وFURIN القدرة على البقاء البطانية الناتجة عن AngII من AngII في الانتقال، والهجرة، والتعبير عن علامات الالتهاب/الالتصاق، وتراكم متلازمة ROS، والقراءات الوظيفية المرتبطة ب eNOS/NO. حددت هذه الدراسة مؤشرات حيوية مرشحة مرتبطة ب RAS، والتوقيعات المرتبطة بالمناعة في ارتفاع ضغط الدم، وطورت نموذجا تشخيصيا مرشحا تم اختباره خارجيا. تدعم نتائج المختبر الصلة الوظيفية ل CST3 وFURIN في الاستجابات البطانية المستحثة بواسطة Ang II، مما يستدعي مزيدا من التحقق السريري والميكانيكي.

المقدمة

تركز هذه الدراسة على ارتفاع ضغط الدم، وهو مرض مزمن في القلب والأوعية الدموية منتشر عالميا¹. ارتفاع ضغط الدم يزيد بشكل كبير من خطر المضاعفات الصحية الخطيرة، بما في ذلك الأحداث القلبية الدموية والأوعية الدموية الدماغية بالإضافة إلى تلف الكلى. هذا يشكل تهديدا خطيرا لجودة حياة المرضى وطول عمرهم، بينما يخلق عبئا اجتماعيا واقتصاديا كبيرا ^2,3. حاليا، يعتمد تشخيص وعلاج ارتفاع ضغط الدم بشكل رئيسي على مراقبة ضغط الدم وأدوية ارتفاع ضغط الدم. ومع ذلك، ونظرا لأن أسباب ارتفاع ضغط الدم معقدة ومتنوعة، فإن العديد من المرضى لا يستجيبون بشكل كاف للعلاجات الحالية، وتظل الطبقات الجزيئية محدودة ^4,5. وبناء عليه، هناك حاجة لتحديد العلامات الحيوية المرشحة والتوقيعات النصية المرتبطة بارتفاع ضغط الدم، مع تجنب الإفراط في تفسير النتائج المستندة إلى الدم كآليات نهائية على مستوى الأنسجة.

في السنوات الأخيرة، حظي نظام الرينين-الأنجيوتنسين (RAS) باهتمام كبير في مسببات وتقدم ارتفاع ضغط الدم⁶. أظهرت الدراسات الحالية أن التعبير غير الطبيعي للجينات المرتبطة ب RAS مرتبط ارتباطا وثيقا باضطرابات تنظيم ضغط الدم وتلف الأعضاء المستهدفة، لكن الشبكات الجزيئية والعوامل التنظيمية الرئيسية غير مفهومة بالكامل⁷. نظرا لأن ارتفاع ضغط الدم أصبح معروفا بشكل متزايد كاضطراب يتعلق باضطراب الأوعية الدموية والمناعة والالتهاب، توفر خلايا الدم المحيطية وخلايا الدم البيضاء أنسجة بديلة متاحة يمكنها التقاط التغيرات الجهازية المرتبطة ب RAS⁸. في هذه الدراسة، تم اختيار مجموعة الجينات المرتبطة ب RAS من خلال GeneCards وPubMed، وبالتالي شملت جينات مسار RAS المعتمدة والجينات التي أبلغ عنها الأدبيات بأنها مرتبطة وظيفيا بإشارات RAS.

تستخدم هذه الدراسة مجموعتين من البيانات الميكروآراي المتاحتين للجمهور (GSE75360 و GSE74144)، باستخدام منهجيات المعلوماتية الحيوية وتعلم الآلة لتحليل النسخ النصي. تشمل الطرق المحددة تحليل التفاضل الليما، وتحليلات إثراء GO/KEGG/GSEA، وتحليل تسرب المناعة CIBERSORT، وبناء شبكات مثبطات مضخة البروتون، وبناء وتقييم نماذج التشخيص القائمة على التعلم الآلي. تكمن مزايا هذه الطرق في قدرتها على تحليل بيانات النسخ النصي واسعة النطاق، واختبار النتائج خارجيا عبر مجموعات البيانات، ودمج الأساليب التحليلية التكميلية لبناء النماذج المرشحة. افترضنا أن ملفات النسخ النصي لخلايا الدم يمكن أن تحدد مؤشرات حيوية مرشحة مرتبطة ب RAS، المرتبطة بارتفاع ضغط الدم والتوقيعات المناعية المرتبطة بها. لذلك، كان هدفنا تحديد الجينات المرشحة المرتبطة ب RAS، وتوصيف سياقها الوظيفي، وبناء نموذج تشخيصي مرشح مختبر خارجيا، بدلا من إنشاء آليات جزيئية حاسمة أو أداة تشخيصية دقيقة جاهزة سريريا.

البروتوكول

نظرة عامة على سير عمل التحليل

يوضح التصميم العام لهذه الدراسة لتحليل النسخ والتحليل المعتمد على التعلم الآلي في الشكل 1، والذي يشمل الخطوات الرئيسية: جمع الجينات المرتبطة بنظام رينين-أنجيوتنسين (RASRGs)؛ فحص الجينات المعبر عنها تفاضليا مرتبطة ب RASRDEGs من مجموعات بيانات ارتفاع ضغط الدم؛ تحليل الإثراء الوظيفي (GO/KEGG/GSEA)؛ تحليل تسرب المناعة (CIBERSORT)؛ بناء التفاعل بين البروتين والبروتين (PPI) والشبكات التنظيمية؛ اختيار الجينات الرئيسية المعتمد على التعلم الآلي (الانحدار اللوجستي، الغابة العشوائية [RF]); وتقييم نموذج تشخيص ارتفاع ضغط الدم. قائمة كاملة بالبرمجيات وقواعد البيانات والأدوات الإلكترونية المستخدمة في هذه الدراسة متوفرة في جدول المواد.

تحميل البيانات

تم الحصول على مجموعات بيانات ارتفاع ضغط الدم GSE75360⁸ و GSE74144 (الإنسان العاقل) عبر حزمة R GEOquery⁹ من قاعدة بيانات GEOquery¹⁰. GSE75360 مشتقة من خلايا الدم الأحادية النواة المحيطية (المنصة: GPL10558) شملت 10 عينات من ارتفاع ضغط الدم و11 عينة ضابطة؛ GSE74144 المستمدة من خلايا الدم البيضاء (المنصة: GPL13497) شملت 14 عينة من ارتفاع ضغط الدم و8 عينات ضابطة (الجدول 1). تم تحديد RASRGs المشفرة للبروتين (1,264) في البداية عبر GeneCards¹¹ (الكلمة المفتاحية: "نظام رينين-أنجيوتنسين") وPubMed (الكلمة المفتاحية: "نظام رينين-أنجيوتنسين")^12,13. أدى تقاطع هذه المجموعات مع الجينات في GSE75360/GSE74144 إلى 1,159 RASRG نهائيا،¹⁴. تمت معالجة مجموعتي البيانات بشكل منفصل لأنهما تم توليدهما على منصات ميكروآراي مختلفة. تم إجراء التعليق على المجسات وفقا لملفات التعليقات التوضيحية لمنصة GPL المقابلة، واستخدمت مصفوفات تعبير الجين المصحح للتحليلات اللاحقة. تم استخدام مخططات الصندوق لمقارنة توزيعات التعبيرات قبل وبعد التطبيع.

جينات الرينين-أنجيوتنسين المعبر عنها بشكل تفاضلي مرتبطة بارتفاع ضغط الدم

تم تصنيف العينات في مجموعة البيانات GSE75360 إلى مجموعة ارتفاع ضغط الدم ومجموعة الضبط. تم استخدام برنامج ليما لإجراء تحليل تفاضلي للتعبير الجيني بين المجموعتين¹⁴، مع تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) بواسطة عتبة |logFC| > 0.45 وقيمة p < 0.05. تم عرض نتائج هذا التحليل التفاضلي عبر مخططات البراكين (تم إنشاؤها باستخدام حزمة R ggplot2).

للحصول على RASRDEGs، تم مقارنة DEGs التي تحقق العتبة أعلاه (|logFC| > 0.45، قيمة p < 0.05) مع جينات مرتبطة ب RASRGs (RASRGs)، وتم عرض نتيجة التقاطع عبر مخطط فين. لاحقا، تم تصور أنماط التعبير لوحدات RASRDEGs المحددة كخريطة حرارية باستخدام خريطة Pheatmap لحزمة R، وتم عرض تحديد المواقع الكروموسومي ل RASRDEGs عبر خرائط كروموسومات تم إنشاؤها باستخدام حزمة R RCircos¹⁵.

التحقق من صحة الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي وتحليل منحنى ROC

تم إنشاء مخطط بين المجموعات لتحليل فروق تعبير RASRDEG بين ارتفاع ضغط الدم/التحكم في GSE75360¹⁶، واستخدم مخطط PROC في حزمة R لرسم منحنيات ROC وحساب AUC (0.5–0.7: دقة منخفضة؛ 0.7–0.9: متوسط؛ >0.9: عالية) لفعالية تشخيص RASRDEG.

تحليل الارتباط

تم إجراء تحليل الارتباط لسبيرمان على تعبير RASRDEG في GSE75360؛ تم عرض النتائج عبر Heatmap (حزمة R ggplot2) (|r| < 0.3: ارتباط لا/ضعيف؛ 0.3–0.5: ضعيف؛ 0.5–0.8: متوسط؛ >0.8: قوي).

تحليل الإثراء ل GO و KEGG

GO (علم الجينات الأنطولوجي، إصدار 2024، http://geneontology.org/) هو مورد واسع الاستخدام للإثراء الوظيفي واسع النطاق، يغطي ثلاثة مجالات: العمليات البيولوجية (BP)، المكونات الخلوية (CC)، والوظائف الجزيئية (MF)¹⁷. KEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينات، الإصدار 109.0، 2024، https://www.genome.jp/kegg/) تخزن بيانات عن الجينومات والمسارات الحيوية والأمراض والأدوية¹⁸.

تم إخضاع RASRDEGs لتعليقات GO وتحليل إثراء مسار KEGG باستخدام حزمة R clusterProfiler¹⁹. طريقة اختبار الإثراء: اختبار الهندسة الفائقة؛ طريقة تصحيح الاختبارات المتعددة: طريقة بنجاميني-هوشبرغ (BH). معيار الفرز: القيمة p المعدلة < 0.05.

تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA)

بالنسبة لتقييم GSEA على مستوى المجموعة، تم تصنيف جميع الجينات التي تم اختبارها في تحليل التعبير التفريقي GSE75360 بترتيب تنازلي حسب logFC واستخدمت كقائمة جينات مدخلة ل clusterProfiler¹⁹. لم يتم تطبيق أي ترشيح مسبق بنظام DEG قبل GSEA. مجموعة جينات c2 من MSigDB²⁰. المعاملات: البذرة = 2022، 10–500 جين في كل مجموعة؛ معايير الفحص: تم تصحيح p < 0.05 (طريقة Benjamini-Hochberg، BH)، FDR < 0.25²¹.

بناء نموذج تشخيص ارتفاع ضغط الدم

لتحديد الجينات الرئيسية المرتبطة بارتفاع ضغط الدم، استخدمنا نوعين من خوارزميات التعلم الآلي: الانحدار اللوجستي والغابات العشوائية (RF). فحص الانحدار اللوجستي (متغير ثنائي يعتمد على اللازم: ارتفاع ضغط الدم/التحكم) RASRDEGs بدرجة p < 0.05. الغابة العشوائية (RF, R package randomForest): parameters set.seed(520), ntree = 1000; تم استخراج مؤشر MeanDecreaseGini (مؤشر الأهمية المتغيرة)، وتم اختيار أفضل 15 RASRDEG. تم فحص RASRDEGs بقيمة p < 0.05 كمعيار.

تم تطبيق خوارزمية RF (الغابة العشوائية)، وهي طريقة تعلم جماعي تحت فئة Bagging (تكامل عدة أشجار قرار)، عبر حزمة R randomForest²² (المعلمات: set.seed(520)، ntree = 1000). تم استخراج MeanDecreaseGini (الذي يعكس الأهمية المتغيرة بمتوسط انخفاض النقاء أثناء تقسيم العقد) لجينات الميزات، وتم اختيار أفضل 15 RASRDEG. وأخيرا، تم رسم مخطط فين للجينات التي تم فحصها بواسطة الانحدار اللوجستي والراديو الراديوي لتحديد الجينات الرئيسية المرتبطة بارتفاع ضغط الدم.

التحقق من صحة نموذج تشخيص ارتفاع ضغط الدم

تم بناء نموذج الانحدار اللوجستي بناء على جينات رئيسية؛ تم حساب القيمة المتوقعة الخطية (η) كالتالي:

تم استخدام حزمة R pROC¹⁶ لرسم منحنيات ROC وتقييم فعالية النموذج في التنبؤ بمخاطر ارتفاع ضغط الدم. تم إنشاء صورة نوموغرامية عبر حزمة R rms²³ لعرض مساهمة كل جين رئيسي في نموذج الانحدار اللوجستي (مما يعكس الارتباط بين الجينات الرئيسية ومخاطر ارتفاع ضغط الدم). تم إنشاء منحنيات معايرة لتقييم الاتساق بين احتمالات ارتفاع ضغط الدم المتوقعة والفعلية؛ تم إجراء تحليل منحنى القرار (DCA، حزمة R ggDCA²⁴) لتقييم المنفعة السريرية للنموذج (الفائدة الصافية) في GSE75360 و GSE74144.

GSEA أحادي الجين

يستكشف GSEA دور الجينات المرتبطة بجين معين في العمليات البيولوجية/المسارات/الأمراض من خلال تحليل تعبيره، مما يساعد في فهم الدور الوظيفي للجين. لكل جين بؤري في GSE75360، تم تقسيم العينات عند الوسيط إلى مجموعات عالية ومنخفضة التعبير. ثم تم إجراء تحليل التعبير التفريقي عبر جميع الجينات المختبرة، وتم تصنيف قيم logFC على مستوى الجينوم من الأعلى إلى الأدنى قبل GSEA باستخدام clusterProfiler¹⁹. لم يتم تطبيق أي ترشيح مسبق بنظام DEG قبل GSEA. المعاملات: البذرة = 2020، 10–500 جين في كل مجموعة (مجموعة جينات c2 من MSigDB²¹). معايير الفحص: p < 0.05 (تم تصحيح الوصف p باستخدام طريقة BH).

تحليل تسرب المناعة (CIBERSORT)

قامت خوارزمية CIBERSORT²⁵ (المبنية على الانحدار الخطي المتجه الداعم) بفك التعقيد من مصفوفة النسخ لتقدير تركيب الخلايا المناعية في عينات مختلطة (تم اختيار بيانات ذات درجة تخصيب خلايا المناعة > 0). تم عرض مصفوفة تسلل الخلايا المناعية النهائية ل GSE75360 عبر مخطط شريطي للنسبة. تم استخدام ارتباط سبيرمان لتحليل الروابط الرئيسية بين الخلايا المناعية والخلايا المناعية والجينات بالخلايا المناعية، مع تقديم النتائج كخريطة حرارية للارتباط (خريطة حزمة R) ومخطط فقاعة الارتباط (R package ggplot2) على التوالي.

شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)

شبكات مثبطات مضخة البروتون هي أنظمة من البروتينات المترابطة التي تنظم العمليات البيولوجية عبر التفاعلات. باستخدام قاعدة بيانات STRING²⁶، تم بناء شبكة PPI للجينات الرئيسية (الحد الأدنى لدرجة التفاعل: 0.150، ثقة منخفضة). تم اختيار جينات المحور المرتبطة برينين بالأنجيوتنسين من خلال فحص الجينات المتفاعلة. قاعدة بيانات GeneMANIA^{رقم 27}، التي تحدد جينات متشابهة وظيفيا باستخدام مجموعات بيانات جينومية وبروتينية، استخدمت للتنبؤ بجينات متشابهة وظيفيا لجينات RAS الرئيسية وبناء شبكة تفاعل بروتينية.

بناء شبكة تنظيمية

شبكة mRNA-TF: تنظم عوامل النسخ (TFs) التعبير الجيني عبر التفاعل بعد النسخ مع الجينات المستهدفة. تم استرجاع TFs التي تستهدف جينات المركز وعلاقاتها التنظيمية من قاعدة بيانات ChIPBase²⁸، وتم تصور شبكة mRNA-TF باستخدام Cytoscape²⁹.

شبكة mRNA-miRNA: تعدل الميكروRNA عدة جينات مستهدفة (قد يتم تنظيم الأهداف الفردية بالتزامن مع عدة miRNAs). تم استخدام StarBase v3.0³⁰ لتحديد miRNA المرتبطة ب RASRDEGs، وتم تصور شبكة mRNA-miRNA عبر Cytoscape.

شبكة mRNA - الدواء: تم استخدام قواعد بيانات السموم³¹ للتنبؤ بأهداف دوائية مباشرة/غير مباشرة لجينات المحور. تم عرض شبكة mRNA والدواء (التي تظهر تفاعلات جينية-دوائية) باستخدام Cytoscape لإكمال بناء الشبكة.

نموذج HUVEC المستحث بواسطة ANG II

تم الحفاظ على خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs) عند 37°C في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون_. تم الحفاظ على الخلايا في وسط كامل لزراعة الخلايا البطانية مع إضافة مصل الأبقار الجنيني والمضادات الحيوية وفقا لتعليمات المورد. لتأسيس نموذج إصابة بطانة مرتبطة بارتفاع ضغط الدم في المختبر، تم علاج HUVECs بالأنجيوتنسين II (Ang-II؛ 100 نانومتر) لمدة 48 ساعة. تم استخدام الخلايا المعالجة بالمركبات كمجموعة ضابطة.

في تجارب التدخل الجيني، تم نقل RNA صغير متداخل يستهدف CST3 أو FURIN (si-CST3 و si-FURIN)، وsiRNA السلبي المقابل للتحكم (si-NC)، وبلازميدات فرط التعبير CST3 أو FURIN (oe-CST3 و oe-FURIN)، والتحكم الفارغ الناقل المقابل (oe-NC) إلى HUVECs باستخدام كاشف ترانسفيكشن تجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد النقل، تعرضت الخلايا ل Ang II ثم تم حصادها للتحقق من التعبير والاختبارات الوظيفية. تم تأكيد كفاءة الإبطال والإفراط في التعبير بواسطة qRT-PCR وتغطية الغرب.

qRT-PCR

تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من HUVECs باستخدام مادة استخلاص RNA قياسية، وتم توليد حمض نووي مكمل باستخدام مجموعة النسخ العكسي. تم استخدام الكيمياء الخضراء SYBR لاختبار qRT-PCR. تم تطبيع مستويات التعبير من LRP1، CTSD، MTHFR، AUTS2، FURIN، CST3، FCER1G، TBXAS1، IL-6، TNF-α، VCAM1، ICAM1، وeNOS إلى GAPDH. وتم حسابها باستخدام طريقة 2^−ΔΔCt.

البلوط الغربي

لتحليل البلوت الغربي، تم استخراج البروتينات باستخدام محلول تحلل RIPA وقياسها باستخدام اختبار BCA. تم حل كميات البروتين المتساوية بواسطة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF. بعد الحجب، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة أولية ضد CST3 أو FURIN أو TBXAS1 أو GAPDH ثم مع أجسام مضادة ثانوية مناسبة. تم اكتشاف الأشرطة بواسطة التوألؤ الكيميائي، وتم تطبيع الكثافة إلى GAPDH. تم قياس CST3 المفرز في المواد الفائقة في الزراعة باستخدام مجموعة ELISA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

قابلية الخلايا للبقاء

تم تقييم بقاء الخلايا باستخدام اختبار مجموعة عد الخلايا 8 (CCK-8). باختصار، تم زرع HUVECs المنقولة والمعالجة ب Ang II في صفائح بئر 96، وتم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر عند 0 و24 و48 و72 ساعة بعد إضافة كاشف CCK-8. تم تقييم هجرة الخلايا باستخدام غرف ترانسويل. بعد التدخلات المشار إليها، تم زرع الخلايا في الغرف العلوية، وتم تثبيت الخلايا المهاجرة على سطح الغشاء السفلي وصبغها وعددها تحت المجهر في حقول مختارة عشوائيا.

اختبار الالتهاب

لتقييم التنشيط الالتهابي، والإجهاد التأكسدي، ووظيفة البطانة، IL-6، TNF-α، VCAM1، ICAM1، وeNOS.تم اكتشاف مستويات mRNA بواسطة qRT-PCR. تم قياس مستويات أكسيد النيتريك (NO) في المادة الفائقة للزراعة باستخدام مجموعة اختبار NO التجارية، وتم اكتشاف مستويات أنواع الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا (ROS) باستخدام فلورة DCF وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

التحليل الإحصائي

تم إجراء معالجة النمذجة والنمذجة في R. تم تقييم المتغيرات المستمرة للاستقرار باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. في المقارنات بين مجموعتين، استخدمت اختبارات t للعينات المستقلة للمتغيرات الموزعة بشكل طبيعي، بينما استخدمت اختبارات مجموع الرتبة ويلكوكسون للمتغيرات غير الطبيعية. بالنسبة لثلاث مجموعات أو أكثر، تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه مع اختبار لاحق مناسب عند تحقيق الطبيعية وتجانس افتراضات التباين؛ وإلا، كان يتم تطبيق اختبار كروسكال-واليس. تم تحليل بيانات الدورة الزمنية لاختبار CCK-8 باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه. تم حساب معاملات الارتباط في سبيرمان لتحليلات الارتباط. ما لم يذكر خلاف ذلك، تظهر النتائج التجريبية كمتوسط ± SD، واعتبر ال p ذو الذيلين < 0.05 دلالة.

النتائج

تنظيف مجموعات بيانات ارتفاع ضغط الدم

لضمان موثوقية التحليلات اللاحقة، خضعت مجموعات البيانات GSE75360 و GSE74144 أولا لتوضيح الفحص وتطبيع البيانات باستخدام حزمة R limma. توزيعات قيم التعبير الجيني قبل وبعد التطبيع موضحة في الملف التكميلي 1—الشكل التكميلي S1A-D، حيث يمثل اللون البرتقالي عينات ارتفاع ضغط الدم والأزرق يمثل عينات التحكم.

بالنسبة ل GSE75360: قبل التطبيع (الملف التكميلي 1—الشكل الت...

المناقشة

ارتفاع ضغط الدم هو اضطراب قلبي وعائي معقد يشمل اضطراب التهاب المفعول الروماتو، وتنشيط التهاب المناعة، وإصابات الأوعية الدموية، وخلل البطانة الداخلية. في هذه الدراسة، استخدمنا أولا مجموعات بيانات النسخ النسبي للدم العامة وطرق التعلم الآلي لتحديد المؤشرات الحيوية المرشحة المرتبطة ب RAS ولبناء نموذج تشخيصي مرشح تم اختباره خارجيا. ثم قمنا بتوسيع هذه النتائج في المعلوماتية الحيوية من خلال التحقق التجريبي في نموذج HUVEC المستحث بواسطة Ang II. تعزز هذه الاستراتيجية المشت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
96-well cell culture plates			يُستخدم لاختبارات قابلية الخلايا الحيوية CCK-8
Angiotensin II (Ang II)			يُستخدم لإحداث إصابة بطانية في HUVECs عند 100 نانومول لمدة 48 ساعة
Antibiotic solution			يُضاف إلى وسط زراعة الخلايا البطانية وفقًا لتعليمات المورد
BCA protein assay kit			يُستخدم لتحديد تركيز البروتين لغربلة البلوتين
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)			يُستخدم لتقييم قابلية HUVECs للحياة/الانتشار
Chemiluminescence detection reagent			يُستخدم لتصور نطاقات البروتين في البلوتين الغربي
ChIPBase v2.0	Sun Lab / Research Resource	N/A	قاعدة البيانات المستخدمة لاسترداد علاقات عوامل النسخ - الهدف للجينات الأساسية
CIBERSORT	Stanford University / Newman Lab	N/A	خوارزمية فك تعقيد الخلايا المناعية المستخدمة لتقدير وفرة 22 نوعًا من الخلايا المناعية
clusterProfiler (R package)	Bioconductor	N/A	حزمة R المستخدمة لتحليلات GO و KEGG و GSEA
CO2 cell culture incubator			يُستخدم لزراعة HUVECs عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2
Comparative Toxicogenomics Database (CTD)	NC State University / Mount Desert Island Biological Laboratory	N/A	قاعدة البيانات المستخدمة للتنبؤ بالتفاعلات بين الجينات والأدوية
Complete endothelial cell culture medium			يُستخدم لزراعة HUVECs
Computer workstation with internet access	Any standard research computing platform	N/A	يُستخدم لتنزيل البيانات والمعالجة المسبقة والتحليل الإحصائي والتصور
CST3 ELISA kit			يُستخدم لكشف CST3 المفرز في محلول الثقافة الخلوية
CST3 overexpression plasmid (oe-CST3)			يُستخدم لتجارب CST3 في HUVECs
Cytoscape	Cytoscape Consortium	N/A	البرنامج المستخدم لتصور شبكات تنظيمية mRNA-miRNA و mRNA-TF و mRNA-drug
DCF fluorescent probe/ROS assay reagent			يُستخدم لكشف مستويات ROS داخل الخلايا
Empty-vector control plasmid (oe-NC)			يُستخدم كتحكم في التعبير الزائد
Fetal bovine serum			مكمل يُضاف إلى وسط زراعة الخلايا البطانية
FURIN overexpression plasmid (oe-FURIN)			يُستخدم لتجارب FURIN في HUVECs
GeneCards	Weizmann Institute of Science	N/A	قاعدة البيانات المستخدمة لتنظيم الجينات ذات الصلة بـ RAS
GeneMANIA	University of Toronto	N/A	أداة قائمة على الويب لتحديد الجينات ذات الصلة وظيفيًا
GEO database	NCBI	N/A	قاعدة البيانات العامة المستخدمة للوصول إلى مجموعات البيانات GSE75360 و GSE74144
GEOquery (R package)	Bioconductor	N/A	حزمة R المستخدمة لتنزيل مجموعات البيانات GEO
ggDCA (R package)	CRAN / GitHub source used by authors	N/A	حزمة R المستخدمة لتحليل منحنى القرار
ggplot2 (R package)	CRAN	N/A	حزمة R المستخدمة لتصور البيانات
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)			نموذج الخلية المستخدم في تجارب الإصابة البطانية المستحثة بـ Ang II
limma (R package)	Bioconductor	N/A	حزمة R المستخدمة للتطبيع وتحليل التعبير التفاضلي
MSigDB	Broad Institute	N/A	قاعدة بيانات مجموعة الجينات المستخدمة لـ GSEA
Negative control siRNA (si-NC)			يُستخدم كتحكم في الخفض
Nitric oxide assay kit			يُستخدم لقياس مستويات NO في محلول الثقافة
pheatmap (R package)	CRAN	N/A	حزمة R المستخدمة لتوليد الخرائط الحرارية
Primary antibody against CST3			يُستخدم لغربلة البلوتين
Primary antibody against FURIN			يُستخدم لغربلة البلوتين
Primary antibody against GAPDH			يُستخدم كتحكم في تحميل غربلة البلوتين
Primary antibody against TBXAS1			يُستخدم لغربلة البلوتين
pROC (R package)	CRAN	N/A	حزمة R المستخدمة لتوليد منحنيات ROC وحساب AUC
PubMed	U.S. National Library of Medicine	N/A	قاعدة بيانات الأدبيات المستخدمة لتكملة تنظيم الجينات ذات الصلة بـ RAS
PVDF membrane			يُستخدم لنقل بروتين غربلة البلوتين
qRT-PCR primers			يُستخدم لكشف الجينات المرشحة والعلامات الالتهابية/البطانية
R software	R Foundation for Statistical Computing	N/A	بيئة الحوسبة الإحصائية المستخدمة لجميع التحليلات
randomForest (R package)	CRAN	N/A	حزمة R المستخدمة لاختيار الميزات بواسطة الغابة العشوائية
RCircos (R package)	CRAN / Bioconductor-associated resource	N/A	حزمة R المستخدمة لتصور التوطين الكرموسومي لـ RASRDEGs
Reverse transcription kit			يُستخدم لتوليف الحمض النووي التكميلية
RIPA lysis buffer			يُستخدم لاستخراج البروتين الكلي
rms (R package)	CRAN	N/A	حزمة R المستخدمة لإنشاء الرسم البياني
RNA extraction reagent			يُستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من HUVECs
Secondary antibodies			يُستخدم لغربلة البلوتين
siRNA targeting CST3 (si-CST3)			يُستخدم لتجارب الخفض من CST3
siRNA targeting FURIN (si-FURIN)			يُستخدم لتجارب الخفض من FURIN
starBase v3.0	Sun Lab / Research Resource	N/A	قاعدة البيانات المستخدمة لتحديد تفاعلات miRNA-target
STRING	STRING Consortium	N/A	قاعدة البيانات المستخدمة لبناء شبكة تفاعل البروتين-البروتين
SYBR Green qPCR reagent			يُستخدم لكشف qRT-PCR
Transfection reagent			يُستخدم لنقل siRNAs ومتلازمات التعبير الزائد إلى HUVECs
Transwell chambers			يُستخدم لاختبارات هجرة HUVECs