التعامل مع الأنفاق والإثراء البيئي لتكرار تصوير البليثيسموغرافيا الكامل للجسم في الفئران

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراءات التعامل مع الأنفاق وتحسين البيئة لتكرار تصوير البليثيسموجرام الكامل للجسم لتقليل التباين التنفسي المرتبط بالتوتر أثناء الدراسات الطولية على الفئران.

الملخص

يستخدم تصوير البلثيسموغرافيا المتكرر للجسم الكامل (WBP) على نطاق واسع لتقييم وظائف الجهاز التنفسي في الفئران بشكل طولي. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي التوتر الناتج عن التعامل إلى تباين فسيولوجي يربك تأثيرات العلاج ويقلل من قابلية التكرار التجريبي. قد تؤدي طرق التعامل التقليدية مع الذيل إلى استجابات مستمرة للتوتر وضعف التعود عبر الجلسات المتكررة، مما قد يؤثر على نتائج التجارب. يصف هذا البروتوكول طرق محسنة للتعامل والتخزين تدمج معالجة الأنفاق وإثراء البيئة لجلسات WBP المتكررة. تلقت ستة فئران برية من النوع 129S1/SvImJ (3 ذكور و3 إناث) معالجة الأنفاق وإثراء بيئي مستمر طوال دراسة استمرت 10 أسابيع. خضعت الحيوانات لجلسات متكررة من WBP، وتم تحليل فترات التكيف في المراحل الأساسية، والدراسة المبكرة، والوسطى، والدراسة المتأخرة. تم قياس تكرار التنفس أثناء وضع الحجرة الأولي (f، 0–2 دقيقة) والأساس المستقر (Fالأساسي، 8–10 دقائق) لتقييم أنماط التكيف الطولي. لوحظت تغييرات تدريجية عبر الجدول الزمني للدراسة تحت الظروف المطبقة. انخفض متوسط تكرار التنفس الأولي من 345 ± 111 نفسا في الدقيقة عند البداية إلى 267 ± 43 نفسا في الدقيقة خلال جلسات الدراسة المتأخرة، مصحوبا بانخفاض معامل التباين (32٪ إلى 16٪). كما انخفضت قياسات التنفس الأساسية من 255 ± 67 إلى 193 ± 43 نفسا/دقيقة (p = 0.033)، مما يتوافق مع تحسن استقرار القياس خلال الجلسات اللاحقة. أظهرت الملاحظات السلوكية تأقلما هادئا مع أقل قدر ممكن من التبرز، والتبول، أو الاضطراب. يوفر هذا البروتوكول نهجا عمليا للمختبرات التي تجري تقييمات تنفسية متكررة في الفئران. ارتبط التعامل مع الأنفاق وتثيب البيئة بالتكيف التدريجي وتقليل التباين التنفسي خلال دراسات ضغط الدم الطويل الطولي.

المقدمة

يتيح تصوير البكثرة للجسم بالكامل (WBP) تقييما غير جراحي لوظيفة الجهاز التنفسي لدى القوارض الواعية غير المقيدة، وأصبح أداة لا غنى عنها للدراسات الطولية في فسيولوجيا الجهاز التنفسي، وسموم الاستنشاق، ونمذجة الأمراض ^1,2. تجعلها المزايا الأساسية للتقنية، بما في ذلك طبيعتها غير الجراحية وملاءمتها للقياسات المتكررة، ذات قيمة خاصة لتتبع التغيرات التنفسية عبر تقدم المرض، والتدخلات العلاجية، أو دورات التعرض. أبرز غلااب وبراون² أن تصوير الجسم المتعدد للجسم غير الجراحي للرأس هو طريقة موثوقة لقياسات وظائف الرئة المتكررة في الفئران الواعية، ويوفر أدوات أساسية للبحث الانتقالي في أمراض مجرى الهواء بما في ذلك العدوى التنفسية الناشئة. ومع ذلك، تعتمد جودة وقابلية تكرار قياسات WBP بشكل حاسم على تحقيق حالات تردد تنفسية منخفضة تتوافق مع السكون السلوكي، والذي قد يتأثر بالإجهاد الناتج عن التعامل مع التعامل. يمثل التعامل مع الضغط مصدرا معروفا جيدا لكنه غالبا ما لا يقدر بالكاد للتغيرات التجريبية، مما قد يربك القياسات الفسيولوجية ويضعف جودة البيانات. عادة ما تتضمن الممارسة المخبرية القياسية التعامل مع الذيل، حيث تمسك الفئران بالذيل لنقلها والتحكم^{بها 3،4}.

عادة ما تتضمن الممارسة المخبرية القياسية التعامل مع الذيل، حيث تمسك الفئران بالذيل لنقلها والتلاعب. أظهر جوفيا وهيرست³ أن التعامل مع الذيل يسبب القلق لدى الفئران، حيث أظهرت الحيوانات التي تم التعامل معها سلوكا مرتفعا يشبه القلق في المتاهة المرتفعة مقارنة بالتحكم التي تتعامل مع النفق. يرتبط هذا الاستجابة القلقية بتغيرات في المعايير الفسيولوجية. استخدم راسيد وآخرون ⁴ ضغط الدم الكبير لقياس تأثيرات الجهاز التنفسي للإجراءات المخبرية الروتينية، ووجدوا أن التقييد والتعامل مع الجسم يغير الحجم الصغير بشكل كبير بطريقة تعتمد على الجنس، مع استمرار التأثيرات لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد الإجراء. تؤكد حجم ومدة هذه التأثيرات الناتجة عن التعامل أن قياسات التنفس التي تم الحصول عليها بعد التعامل مع الذيل بفترة قصيرة قد تعكس فسيولوجيا الإجهاد الحاد بدلا من وظيفة الأساس المستقرة.

تكشف الأدبيات الأوسع حول ضبط النفس والتعامل مع التوتر عن تأثيرات تتجاوز الاستجابات السلوكية الفورية. استعرض بوينيتسكي وموستوفسكي⁵ التأثيرات الواسعة لضغط التقييد على العمليات الفسيولوجية والمناعية والغدد الصماء والتطور، مؤكدين أن الالتشويش الناتج عن التوتر غالبا ما لا يتم توثيقه بشكل كاف في المقالات البحثية. بالنسبة للدراسات التنفسية تحديدا، تزداد المشكلة سوءا بسبب الحاجة إلى تكرار القياسات. قد يؤدي كل حدث في التعامل إلى إعادة ضبط استجابة الإجهاد، مما يحد من التعود التدريجي وينتج قياسات أساسية غير متسقة عبر النقاط الطولية. قارن ديلورم وموس¹ بين طرق تصوير التسلسل المقيد وغير المقيد في الفئران التي لديها اختلافات فسيولوجية معروفة بين السلالات، ووجدوا أنه رغم أن أنظمة الحجرة الواحدة غير المقيدة وفرت تحليلا محسنا لتفاعل مجرى الهواء، إلا أن تحدي الحصول على قياسات أساسية قابلة للتكرار لا يزال قائما.

برز التعامل مع الأنفاق، حيث تدخل الفئران النفق طوعا للنقل، كبديل قائم على الأدلة يقلل بشكل كبير من القلق الناتج عن التعامل مع الحيوانات. تم إثبات فعالية هذه الطريقة عبر سلالات وسياقيات تجريبية متعددة. أظهر جوفيا وهيرست³ أن الفئران التي تم التعامل معها عبر الأنفاق أظهرت استعدادا أكبر للتفاعل مع المتعاملين وسلوكا أقل يشبه القلق في اختبارات المتاهة المرتفعة مقارنة بالفئران التي تم التعامل معها بالذيل، مع ملاحظة فوائد حتى عندما كانت الأنفاق غير مألوفة. والأهم من ذلك، أن هذه الفوائد تمتد إلى ما بعد فترة ما بعد المعالجة مباشرة. ^درس سينسيني وآخرون تأثيرات تقنية التعامل وتكرار التعامل بين الجنسين، ووجدوا أن التعامل المتكرر مع الذيل يقلل من السلوكيات المرتبطة بالرفاهية، مثل الحفر، ويزيد من سلوكيات يشبه اليأس لدى الذكور، في حين كان التعامل بالأنفاق مفضلا لدى كلا الجنسين ومرتبطا بسلوكيات اقتراب أكثر إيجابية وردود فعل دفاعية أقل. علاوة على ذلك^{، أظهر} ديفيز وآخرون أن فوائد التعامل غير الذيل تستمر خلال الإجراءات المعقدة. أظهرت الفئران التي تعرضت للتعامل مع الذيل طوال تجربتها المختبرية، بما في ذلك أثناء إجراءات التقييد، استجابة متزايدة للمحفزات البيئية وسهولة التعامل أقل مقارنة بالفئران التي تم التعامل معها حصريا باستخدام الحجامة أو طرق النفق.

بعيدا عن التعامل مع اختيار الطريقة، قد يؤدي التعود المنهجي على الإجراءات التجريبية إلى تقليل التباين الناتج عن الإجهاد. ^درس سورلي وآخرون 8 تدريب الفئران على تصوير البليثيسموغرام الرأسي للخارج، وهو نظام قائم على التقييد، ووجدوا أن خمسة أيام متتالية من التدريب حسنت التحمل، حيث أظهرت الفئران تحسنا في الاستقرار السلوكي بحلول اليوم الثاني، رغم أن معايير التنفس استقرت خلال 5 دقائق خلال جميع الجلسات. وبالمثل^{، أظهر} أوينو وآخرون أن التعامل اللطيف المتكرر مع ذكور فئران C57BL/6 قبل الاختبارات السلوكية قلل من السلوك الشبيه بالقلق في اختبارات المتاهة المرتفعة وحسن الإدراك المكاني، مما يشير إلى أن الاتصال المتكرر مع المتعاملين يمكن أن ينتج تأثيرات تعود قابلة للقياس. تشير هذه النتائج إلى أن دمج طرق التعامل غير المنفرة مع بروتوكولات التعود المنهجية قد يوفر فوائد تراكمية لتقليل التباين الفسيولوجي أثناء القياسات المتكررة.

يمثل الإثراء البيئي عاملا إضافيا يمكن أن يؤثر على استجابة التوتر والفسيولوجيا الأساسية، رغم أن تأثيراته معقدة وتعتمد على السياق. بينما يعزز الإثراء عادة الرفاهية الإيجابية، قد يؤدي الإثراء المفرط أو غير المتوقع بشكل متناقض إلى زيادة التباين الفسيولوجي والسلوكيات المرتبطة بالتوتر في بعض السياقات التجريبية^10,11. النهج المتوازن الذي يحافظ على العناصر الأساسية المستقرة، مثل المواد المتداخلة، مع توفير تجديد قابل للإدارة من خلال التدوير الدوري لعناصر الإثراء قد يحسن الرفاهية دون إدخال التباين المربك¹². لا يزال التفاعل بين الإثراء وطريقة التعامل وبروتوكولات التعود غير مدرس في سياق القياسات التنفسية المتكررة، مما يبرز الحاجة إلى بروتوكولات متكاملة تعالج العوامل الثلاثة في آن واحد.

على الرغم من الاعتراف المتزايد بتأثيرات التحكم على القياسات الفسيولوجية، إلا أن البروتوكولات الموحدة المصممة خصيصا لتقليل توتر التعامل خلال جلسات ضغط الدم المتكرر لا تزال محدودة. تعتمد بروتوكولات تنفس الدم البيضاء الحالية عادة على فترات تأقلم ممتدة (10–30 دقيقة في كل جلسة) للسماح بتسرع التنفس الناتج عن التوتر بالاندراج، لكنها نادرا ما تعالج طريقة التعامل الأساسية أو تقيم بشكل منهجي ما إذا كان التكيف التدريجي يحدث عبر الجلسات. علاوة على ذلك، لا تقيم معظم الدراسات ما إذا كانت الحيوانات تحقق حالات فسيولوجية تتوافق مع السكون السلوكي، مثل تكرارات التنفس التي تقترب من نطاقات أبلغ عنها الأدبيات على أنها مرتبطة بحالات السكون أو المرتبطة بالنوم، أو بدلا من ذلك تنتقل من التوتر الحاد إلى الإثارة المزمنة منخفضة المستوى. هنا، نقدم بروتوكولا يدمج التعامل مع الأنفاق، والتثريب البيئي المتوازن، وجلسات إعادة تثبيط الدم البيضاء عبر دراسة طولية استمرت 10 أسابيع. نحن نصف نهجا مرتبطا بتغيرات تدريجية في تكرار التنفس يتوافق مع التعود، بما في ذلك تقليل تكرارات التنفس الأولية عبر الجلسات وقياسات أساسية تقترب من نطاقات أبلغ عنها الأدبيات بأنها مرتبطة بحالات السكون أو المرتبطة بالنوم. ومن المهم أن هذا البروتوكول يعرض ليس فقط كتحسين لرفاهية الحيوان، بل أيضا كاعتبار تصميم تجريبي قد يساعد في تقليل التباين وتحسين الاتساق أثناء القياسات التنفسية الطولية.

البروتوكول

قم بتنفيذ جميع الإجراءات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (بروتوكول IACUC #23-103) في جامعة ميامي. فئران منزلية في منشأة فيفاريوم معتمدة من AAALAC مع الحفاظ على الظروف البيئية وفقا للمعايير المؤسسية.

1. اختيار الحيوانات وظروف السكن

1. اختيار وتحضير الحيوانات للدراسة
   1. اختر الحيوانات من مستعمرة تربية معتمدة أو احصل عليها من بائع تجاري. لهذه الدراسة، استخدم ستة فئران برية من النوع البري 129S1/SvImJ (3 ذكور، 3 إناث).
   2. الحفاظ على الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) في منشأة معتمدة من AAALAC مع مراقبة صحية روتينية وفقا للمعايير المؤسسية.
   3. تأكد أن الحيوانات تبلغ حوالي 6 أشهر (شباب بالغين) عند بدء الدراسة.
      ملاحظة: الفئران في هذه الدراسة تعرضت سابقا لإدارة الأنفاق كجزء من الاعتناء الروتيني. بالنسبة للفئران الساذجة، نفذ فترة تكييف قبل بدء جلسات WBP (انظر الخطوة 3.2).
2. ابدأ الإجراءات التجريبية عندما تصل الفئران إلى العمر المناسب لأهداف الدراسة. في هذه الدراسة، كانت الفئران تبلغ من العمر حوالي 6 أشهر (شباب) عند بداية جلسات ضغط الدم الطبيعي. لإمكانية التكرار، استخدم فئران ضمن نطاق عمر محدد (مثل ±شهر واحد) وأبلغ عن الأعمار المحددة المستخدمة، حيث قد يؤثر العمر على معايير التنفس الأساسية وحركة التعود.

2. بروتوكول الإثراء البيئي

1. توفير مواد تعشيش مستمرة
   1. ضع مربعا قطنيا مضغوطا واحدا (حوالي 5 سم × 5 سم، ~2.5 جم) في كل قفص عند كل تغيير في القفص.
   2. انقل معظم هيكل العش الحالي سليما إلى القفص الجديد أثناء تبديل القفص باستخدام كلتا اليدين.
   3. إذا تجاوزت المادة المتراكمة حوالي 10 جرام (تقريبا ضعف الكتلة الأصلية)، قم بإزالة أقدم وأكثر الأجزاء مضغوطا من القاع مع الحفاظ على هيكل القبة الخارجي.
   4. أضف مربع قطني جديد (5 سم × 5 سم) إلى القفص النظيف لدعم استمرار بناء العش وصيانته.
   5. استبدل مواد التعشيش فقط إذا كانت رطبة بشكل واضح (تلوث البول يغطي >25٪ من السطح) أو إذا تم تدمير العش ولم يعاد بناؤه خلال 48 ساعة (الشكلان 1A و1C).
      ملاحظة: حافظ على بنية العش لتقليل التوتر المرتبط بتغيير الأقفاص والحفاظ على إشارات شم ولمسية متسقة طوال فترة الدراسة. جودة الأعشاش تعد مؤشرا على رفاهية الحيوانات وحالتها الصحية¹³.
2. قيم بناء الأعشاش أسبوعيا باستخدام الإجراءات الموحدة التالية
   1. عند كل تغيير في القفص، انقل العش السليم بحذر إلى سطح نظيف باستخدام كلتا اليدين دون الإخلال بالهيكل.
   2. قم بتصوير العش من الأعلى مباشرة مع وضع الكاميرا على بعد 30–40 سم عموديا على السطح لرؤية البنية العامة وتكوين الفوهات.
   3. صور العش من الجانب على ارتفاع العش لتوثيق سلامة الجدران وخصائص القبة.
   4. قم بتقييم العش باستخدام مقياس ديكون المعياري ذو الخمس نقاط¹³، حيث 1 = مادة التعشيش لم تمسها إلى حد كبير و5 = عش على شكل قبة مع فوهة واضحة. راجع الشكل 1A–1C لأمثلة أعشاش الدرجة 5.
   5. أعد العش بحذر إلى القفص النظيف.
      ملاحظة: توفر صور الأعشاش الأسبوعية توثيقا موضوعيا لجودة العش طوال الدراسة. قد يشير تدهور بناء الأعشاش إلى مرض أو توتر أو مخاوف رفاهية أخرى تتطلب اهتماما بيطريا.
3. توفير الإثراء المدوب الذي يتغير أسبوعيا
   1. اختر عنصرا إثراء وضعه في القفص. استخدم الورق الممزق (ورق أبيض عادي، بحجم حفنة صغيرة)، مناشف ورقية (2–3 أوراق، غير معطرة، بيضاء، مطوية أو مجعدة)، أو ملاجئ ورقية (أنابيب كرتونية أو صناديق صغيرة).
   2. تدوير عناصر الإثراء أسبوعيا وفقا لجدول محدد مسبقا (مثلا، الأسبوع 1: ورق ممزق؛ الأسبوع الثاني: مناشف ورقية؛ الأسبوع 3: أنبوب كرتوني؛ الأسبوع 4: أكرر) للحفاظ على التجديد القابل للتعامل.
      ملاحظة: التناوب الأسبوعي يوفر متعة جديدة دون أن يثقل الفئران. تجنب المواد البلاستيكية المخصبة، مثل الأكواخ البلاستيكية، أو الكرات، أو الهياكل الصلبة، التي قد تزيد من التغير الفسيولوجي¹¹. استبدل جميع عناصر الإثراء في كل تغيير للقفص.

الشكل 1. مؤشرات تنفيذ البروتوكول ورفاهية الدراسة الطولية لتصوير المتعدد للجسم الكامل (WBP). (أ) عش عالي الجودة ممثل (درجة ديكون 5) من قفص أنثوي يظهر هيكل قبة متقن مع فوهة محددة. (ب) نفق مناولة بولي كربونات شفاف (حوالي 10 سم طوله × 5 سم قطر داخلي) مدمج مع مواد تعشيش في قفص المنزل. ظلت الأنفاق في أقفاص بشكل دائم كأدوات إثراء ومناولة طوال فترة الدراسة. (ج) جودة العش التمثيلية في الدراسة المتأخرة (الأسبوع العاشر) تظهر درجة مستدامة 5 في بناء العش في أقفاص الذكور والإناث. (د) درجات جودة العش خلال فترة الدراسة التي استمرت 10 أسابيع. تمثل كل نقطة بيانات درجة العش الأسبوعية للقفص باستخدام مقياس ديكون القياسي ذو الخمس نقاط¹³، حيث 1 = مادة تعشيش غير ملموسة و5 = عش قبة كامل مع حفرة. حافظ كلا القفصين على جودة العش الثابتة 5 طوال مراحل الدراسة. تشير المنطقة الخضراء المظللة إلى الدرجات المرتبطة بظروف الرفاهية المثلى (الدرجات 4–5). تشير مراحل الدراسة إلى مناطق خلفية ملونة تتوافق مع الخط الأساسي (الأسبوع 0)، الدراسة المبكرة (الأسبوع 2–3)، منتصف الدراسة (الأسابيع 5–7)، والدراسة المتأخرة (الأسبوع 8–10). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تنفيذ إدارة الأنفاق

1. جهز أنفاق المناولة
   1. استخدم أنفاق بولي كربونات شفافة (طول 100 مم أو 130 مم × قطر داخلي 50 مم) بحواف ناعمة ومستديرة (الشكل 1B).
   2. ضع نفقا واحدا بشكل دائم في كل قفص منزلي كجزء من إثراء القفص.
   3. لا تزيل الأنفاق بين أحداث التعامل.
      ملاحظة: إبقاء النفق في قفص المنزل يسمح له بالحصول على روائح مألوفة من القفص ويرتبط ببيئة المنزل بدلا من التعامل مع الإجراءات. غالبا ما تستخدم الفئران الأنفاق كملاجئ أو مواقع للأعشاش.
   4. عند كل تغيير للقفص، امسح داخل النفق بكمية صغيرة من الفراش المستخدم من القفص السابق قبل وضعه في القفص النظيف.
   5. استخدم أنفاق المعقم أو اغسلها بنفس عامل التعقيم المستخدم في تنظيف الأقفاص إذا كان هناك حاجة للتعقيم بين الاستخدامات. اشطف الأنفاق جيدا واترك الأنفاق لتجف في الهواء قبل إعادتها إلى القفص.
      ملاحظة: الحفاظ على استمرارية الشم يساعد في تقليل التوتر المرتبط بالروائح غير المألوفة. الأنفاق قابلة للاستخدام وقابلة للاستخدام بنظام العقم.
2. الفئران الحالة إلى التعامل مع الأنفاق
   1. بالنسبة للفئران البالغة الساذجة، نفذ فترة تكييف لا تقل عن أسبوع إلى أسبوعين قبل بدء جلسات ضغط الدم البيضاء ^14,15.
   2. ضع أنفاق بولي كربونات شفافة (انظر الخطوة 3.1) بشكل دائم في قفص المنزل واترك من 3 إلى 7 أيام للتعرف السلبي.
   3. بعد التعرض السلبي، قم بجلسات يومية للتعامل اللطيف. شجع الفئران على دخول النفق طوعا، ثم رفع النفق أفقيا لمدة 30–60 ثانية قبل إعادة الفأر إلى القفص.
   4. قيم التعود الناجح باستخدام المعايير التالية: دخول النفق الطوعي خلال 10–30 ثانية، السلوك الهادئ داخل النفق دون محاولات هروب أو إصدار أصوات، واستخدام النفق التلقائي للراحة أو الاستكشاف أثناء الملاحظات الروتينية في القفص^14،15.
   5. ابدأ جلسات WBP بمجرد استيفاء جميع معايير التعود.
      ملاحظة: الفئران في هذه الدراسة تعرضت سابقا لمعالجة الأنفاق كجزء من العناية الروتينية قبل بدء جلسات ضغط الدم الكبير.
3. تنفيذ التعامل غير النفعي
   1. ارتد قفازات نيتريل خالية من المسحوق لجميع إجراءات التعامل.
   2. استخدم التعامل مع الأنفاق كطريقة رئيسية للتعامل مع الأفق. إذا كان الفأر داخل النفق، ارفع النفق أفقيا بيد واحدة تدعم القاعدة.
   3. إذا كان الفأر خارج النفق، ضع فتحة النفق على بعد 5–10 سم من الفأر وترك 10–30 ثانية للدخول الطوعي دون مطاردة أو إجبار.
   4. إذا لم تدخل الفأرة خلال 30 ثانية، شجع على التحرك نحو النفق باستخدام يد مكبسية موضوعة خلف الفأرة دون أن تلامس.
   5. إذا لم تدخل الفأرة بعد محاولتين (الحد الأقصى 60 ثانية)، استخدم طريقة الحجامة. ضع يدا مسطحة بالقرب من الفأر، ودع الاقتراب الطوعي لمدة 10–20 ثانية، ثم التقط الفأر بلطف بكلتا يديك مع تجنب التعامل مع الذيل.
   6. استخدم طريقة التعامل التي تؤدي إلى سلوك هادئ، ويعرف بأنه غياب النطق، أو محاولات الهروب، أو التغوط المرتبط بالتوتر.
4. نقل الفئران إلى غرفة التصوير المتعدد
   1. انقل الفأر من النفق إلى اليدين المكبوتتين قبل وضعه في الحجرة.
   2. ثبت النفق أفقيا واميل الطرف الخلفي (الجانب الذيلي) للأعلى تقريبا بزاوية 10–20°.
   3. دع الفأر يتراجع خارج النفق، الأرجل الخلفية أولا، إلى اليدين المتشابكتين.
   4. اخفض كلتا يديك داخل الحجرة ودع الفأر يخطو طوعا على أرضية الحجرة خلال 5–10 ثوان.
      ملاحظة: توفر طريقة النقل من الأفق إلى اليدين إلى الحجرة تحكما محسنا أثناء وضع الحجرة.
   5. بدلا من ذلك، نقل الفأر مباشرة من النفق إلى الحجرة عن طريق إمالة النفق فوق فتحة الحجرة.
      ملاحظة: النقل المباشر من النفق إلى الحجرة يوفر تحكما أقل أثناء التركيب واستخدم بشكل أقل في هذه الدراسة.
   6. لا تقلب النفق عموديا أو تهزه.
   7. أغلق غطاء الحجرة فورا بعد وضع الفأر وأعد النفق إلى القفص المنزلي.
      الخطوة الحاسمة: لا تمسك الفئران من ذيلها في أي وقت أثناء الدراسة. إذا لم يدخل الفأر النفق خلال 30 ثانية أو يقترب من يد مكبسة، شجع على الحركة بلطف باستخدام الفراش الناعم دون مطاردة أو إجبار التفاعل. اسمح للماوس باختيار النفق أو الاقتراب اليدوي بناء على التفضيل الفردي. الصبر خلال الجلسات الأولى يساعد في بناء ارتباطات إيجابية مع التعامل غير المنفور^3،7.

4. بروتوكول جلسة WBP

1. جهز نظام الطباعة المتعددة
   1. قم بمعايرة جهاز البليثيسموغراف للجسم بالكامل مرة واحدة يوميا قبل جمع البيانات.
   2. مع فراغ الغرف وإغلاقها، ابدأ تسلسل المعايرة الآلي عبر برنامج تحليل التنفس FinePointe (الهدف: 18–22 سم H₂O). تأكيد المعايرة الناجحة عندما يتجاوز نطاق تدفق الصندوق الفعال ±40 مل/ثانية لكل موقع.
   3. اضبط تدفق الانحياز على 1.0 لتر/دقيقة لكل غرفة.
   4. راقب درجة حرارة الحجرة (22°م–24°م) والرطوبة باستمرار باستخدام الحساسات الرقمية.
   5. ضع الغرف في مكان هادئ مع إضاءة ثابتة وأقل اهتزازا.
      ملاحظة: حافظ على حالة الغرفة باستمرار طوال الجلسات. تغير تقلبات درجات الحرارة أنماط التنفس وتحير المقارنات الطولية¹.
2. إجراء جلسات WBP خلال مرحلة يومية منتظمة
   1. قم بإجراء جميع القياسات خلال نفس نافذة زمنية من دورة الضوء.
   2. قم بإجراء الجلسات بين الساعة 08:00 و10:00 (تشغيل الأنوار الساعة 06:00) وتجنب أول ساعتين بعد الإشعال عندما تتغير الإيقاعات اليومية.
3. نقل الفئران إلى غرفة التجارب
   1. انقل أقفاص المنزل إلى غرفة التجارب على عربة قبل حوالي 15 دقيقة من بدء الجلسة.
   2. اسمح للفئران بالتأقلم مع بيئة الغرفة التجريبية مع البقاء في قفصها المنزلي المألوف.
   3. ضع أقفاص المنزل بالقرب من غرف التصوير المتعدد الطبقات.
   4. استخدم التحكم بالأنفاق (انظر الخطوات 3.3–3.4) لنقل كل فأر من القفص المنزلي إلى الأيدي المغلفة ثم إلى الحجرة.
   5. تعامل مع الفئران بهدوء وقلل من الحركات المفاجئة أثناء النقل.
      ملاحظة: النقل الفردي بالفأرة يستغرق بضع ثوان فقط.
4. ضع الفأر في الحجرة
   1. انقل الفأرة برفق من اليدين المغطاة إلى الحجرة (انظر الخطوة 3.4).
   2. أغلق غطاء الحجرة على بعد 5 ثوان من وضع الفأرة.
5. ابدأ التكيف والتسجيل
   1. ابدأ بتسجيل إشارات التنفس باستخدام برنامج تحليل التنفس.
   2. امنح 10 دقائق للتكيف دون إزعاج أو تدخل.
6. مراقبة الاستقرار السلوكي أثناء التكيف
   1. راقب الفأر باستمرار طوال فترة التكيف.
   2. سجل حركة مفرطة، أو استمرار الجمود المصحوب بعلامات التوتر (مثل الوضعية المتصلبة)، أو محاولات الهروب المتكررة دون فترات من السلوك الهادئ في سجل الجلسة.
   3. الاعتراف بأن مثل هذه الجلسات قد توفر بيانات أوليةصالحة؛ ومع ذلك، قد تكون قياسات الأساس Fغير موثوقة.
   4. الجلسات التي لا توجد فيها فترات هدوء ملحوظة خلال نافذة التكيف لاحتمال استبعادها من التحليلات الأساسية وفقا لمعايير الدراسة الخاصة.
   5. احتفظ بجميع الجلسات في هذه الدراسة، حيث لم تستوف أي منها معايير الاستبعاد بناء على سلوك التكيف.
      الخطوة الحرجة: فترة التكيف التي تبلغ 10 دقائق ضرورية لتقييم التعود. على الرغم من أن بعض البروتوكولات تستخدم فترات تأقلم تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة، إلا أن الفئران المهيأة في هذه الدراسة وصلت إلى أنماط تنفسية مستقرة خلال 8-10 دقائق، مما جعل التكيف الممتد غير ضروري وقد يكون غير مفيد بسبب زيادة الحركة.
7. مراقبة سلوك الفئران أثناء التكيف
   1. راقب الفئران باستمرار طوال فترة التكيف التي تستمر 10 دقائق من خلال المراقبة البصرية للغرف.
   2. لاحظ مؤشرات التوتر الواضحة، بما في ذلك التغوط، التبول، محاولات الهروب المستمرة، أو الجمود المطول.
   3. سجل وجود وكمية تقريبية من حبيبات البراز والبول في الحجرة بعد كل جلسة.
      ملاحظة: توفر هذه الملاحظات تقييما نوعيا لمستويات التوتر وتقدم التعود لكنها لم تسجل رسميا باستخدام مخطط الظهر الموحد في هذه الدراسة.
8. تحليل مقاييس التنفس في مرحلة التكيف
   1. استخدم برنامج تحليل التنفس لحساب تردد التنفس تلقائيا من إشارات الضغط باستخدام خوارزمية كشف التنفس الافتراضية وإعدادات العتبة الافتراضية في هذا البرنامج.
   2. اكتساب إشارات التنفس تحت ظروف تدفق هواء مستقرة (انظر الخطوة 4.1) باستخدام معايير الاكتساب القياسية.
   3. احسب متوسط تردد التنفس لفترتين: fابتدائي (0–2 دقيقة)، يمثل الاستجابة الأولية للإجهاد والفسيولوجيا الفورية بعد التعامل، وfالأساس (8–10 دقائق)، الذي يمثل تكرار التنفس الأساسي المستقر.
   4. استبعد الفترات التي تحتوي على تشوهات حركة ظاهرة، تعرف بأنها انحرافات ضغط غير تنفسية أو موجات غير منتظمة مرتبطة بحركة الحيوانات أو اضطرابات الحجرة.
      ملاحظة: افحص بصريا مجموعة فرعية من التسجيلات (حوالي 10٪) للتأكد من الكشف الدقيق للتنفس بواسطة الخوارزمية الآلية. أكد التحقق اليدوي التوافق بين الكشف الآلي وأنماط التنفس الملحوظة.
9. تابع البروتوكول التجريبي إذا كان ذلك مناسبا
   1. استمر في التدخلات التجريبية بعد فترة التأقلم التي تبلغ 10 دقائق وفقا لتصميم الدراسة (مثل توصيل الأدوية بالهواء، تحدي نقص الأكسجين، اختبار التمارين).
      ملاحظة: لم تجر أي تدخلات تجريبية خلال جلسات تقييم التعود في هذه الدراسة. تم الحصول على مقاييس التنفس المبلغ عنها (الأساس الأولي وF) خلال جلسات التكيف فقط دون إجراءات إضافية.
10. أعد الفأر إلى قفص المنزل
    1. استخدم التحكم بالأنفاق أو اليدين المكبوتة لنقل الفأر من الحجرة إلى القفص المنزلي.
    2. راقب الفأر لمدة 5 دقائق بعد الجلسة لتأكيد السلوك الطبيعي، بما في ذلك الحركة التلقائية، والتنظيف، والتفاعل مع رفاق القفص، وفحص الطعام والماء.
    3. مدد فترة المراقبة واستشر الطاقم البيطري إذا استمر سلوك غير طبيعي لأكثر من 15 دقيقة، بما في ذلك الجمود الطويل (>5 دقائق)، أو صعوبة في التنفس، أو انحناء الوضعية، أو الفشل في التفاعل مع زملائه في القفص.
       ملاحظة: لم تلاحظ سلوكيات غير طبيعية بعد الجلسة في هذه الدراسة.
11. حافظ على تكرار جلسات ثابت
    1. أجر جلسات ضغط الدم البيضاء بانتظام طوال فترة الدراسة الطولية (10 أسابيع في هذا البروتوكول).
    2. قم بأداء جلسات أسبوعية لتتبع تقدم التعود.
    3. حدد جدولة الجلسات في أوقات منتظمة من اليوم (انظر الخطوة 4.2) للحفاظ على الاتساق اليومي والإجرائي.

النتائج

تطبيق هذا البروتوكول لإدارة الأنفاق وبروتوكول الإثراء البيئي على ستة فئران من النوع البري 129S1/SvImJ (3 ذكور، 3 إناث) خلال دراسة طول طول 10 أسابيع لضغط الدم الأبيض أسفر عن أدلة على التكيف التدريجي وتحسين الاستقرار الفسيولوجي. تم الحصول على قياسات تردد التنفس خلال جلسات متكررة لضغط الدم البيضاء أجريت على فترات طولية منتظمة، مع تحليل البيانات من أربع مراحل دراسة: الأساس (الأسبوع 0)، الدراسة المبكرة (الأسبوع 2–3)، منتصف الدراسة (الأسبوع 5–7)، والدراسة المتأخرة (الأسبوع 8–10). يعرض

المناقشة

يصف هذا البروتوكول نهجا متكاملا يجمع بين التعامل مع الأنفاق، وإثراء البيئة، والتعرض المتكرر في سياق التوازن الطولي للبشعة. في ظل هذه الظروف، أظهرت قياسات تردد التنفس استقرارا تدريجيا عبر جلسات متكررة، متوافقا مع انخفاض الإثارة والتعود التدريجي. يبدو أن هناك عدة عوامل تنفيذ مهمة لنجاح أداء البروتوكولات. أولا، يجب إدخال مناولة الأنفاق قبل بدء الإجراءات التجريبية. في هذه الدراسة، تعرضت الفئران سابقا لإدارة الأنفاق؛ ومع ذلك، أظهرت الدراسات السابقة أن الفوائد يمكن أن تحدث أيضا مع فترات تقوية ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Aspen Chip Bedding	Lab Supply	Aspen 323	فراش رقاقات خشب الأسبن. تم التعقيم قبل الاستخدام؛ وضعه على عمق حوالي 1 سم على أرضية القفص.
Autoclaved Water	Facility-provided	Not applicable	مياه بلدية معقمة يتم توفيرها حسب الحاجة عبر زجاجات المياه القياسية.
Cardboard Tube	Facility-generated	Not applicable	لفافة ورق مرحاض من الورق المقوى العادي. يتم استخدامه كعنصر إثراء وملاذ يتم تدويره.
Crink-I-Nest (Irradiated)	The Andersons / Lab Supply	CNKR	مواد إثراء من الورق الممزق. معقمة بالأشعة غاما. يتم توفيرها كمصدر إثراء دوري كل أسبوع بالتناوب.
FinePointe Software	Data Sciences International	No catalog number	برنامج لجمع البيانات التنفسية وتحليلها، الإصدار 3.0. يتم استخدامه لجمع بيانات WBP وحساب المعلمات.
Individually Ventilated Cage (IVC) Rack	Allentown	EP5000E	رف IVC مع نظام التهوية الأوتوماتيكي، سعة 140 قفص. نظام عالي الكثافة ذو وجهين.
Irradiated Rodent Chow	Envigo	T.2918.15	نظام غذائي قياسي معقم للأقدام. يتم توفيره حسب الحاجة عبر قنينة سلكية.
Mouse Transfer Tunnel	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	نفق بولي كربونات شفاف، طول 100 ملم وقطر داخلي 50 ملم. قابل للتعقيم وإعادة الاستخدام. يستخدم لإجراءات نقل الحيوانات منخفضة الإجهاد.
Nestlets (Irradiated)	Lab Supply	IRR	مربعات تعشيش قطنية مضغوطة (حوالي 5 سم × 5 سم، 2.5 جم لكل منها). معقمة بالأشعة غاما. يتم توفيرها كمصدر إثراء ثابت؛ واحدة لكل قفص.
Nitrile Gloves, Powder-Free	Kimberly-Clark	KC500	قفازات فحص خالية من البودرة من النيتريك. يتم ارتداؤها خلال جميع إجراءات الاتصال مع الحيوانات.
Non-Woven Gauze Sponge	Pivetal	21295040	إسفنجة من الشاش غير معقمة وغير منسوجة، 4 طبقات، 4 بوصات × 4 بوصات (10.16 سم × 10.16 سم). يتم استخدامها كمصدر إثراء.
Paper Towel	Tork (Essity)	MB 540A	منشفة يد متعددة الطيات بيضاء اللون. يتم استخدامها كمصدر إثراء دوري.
Smartphone Camera	Apple	No catalog number	كاميرا هاتف iPhone الذكي. يتم استخدامها لتوثيق تقييم العش أسبوعيًا.
Whole-Body Plethysmography System	Data Sciences International	10222C (2-site); 770621 (4-site)	نظام FP Series غير المقيد لقياس حجم الجسم الكامل للفئران. متوفر في تكوينات 2 و4 مواقع.