حدد تسلسل الإكسوم الكامل ل 1,204 مريضا أطفالا يشتبه في وجود مرض التهابي ذاتي متغيرات مرتبطة بالتداخلات في 132 حالة، بما في ذلك 79 طفرة جديدة. معظمها كان متغاير الشكل ومرتبطا بالأنماط الوعائية الوعائية. تؤكد هذه النتائج القيمة التشخيصية للاختبارات الجينية والدور المركزي لإشارات الإنترفيرون من النوع الأول غير المنظم في التهاب الأوعية الدموية لدى الأطفال.
مقالة بحثية
الفئة الشائعة من المتغيرات الجينية المرتبطة بالتهاب الأوعية الدموية في اعتلالات التداخل من النوع الأول داخل مجموعة الأطفال
Nida Gürbüz1 , Shams Ismayilova2 , Gulnar Ahmadova3 , Güzide Aksu1 , Afig Berdeli1,2,4 , Rena Çiftçi5
1Department of Pediatrics, Division of Pediatric Rheumatology, Faculty of Medicine, Ege University, 2Department of Stem Cell Sciences, Institute of Health Sciences, Ege University, 3Department of Biotechnology, Graduate School of Natural and Applied Sciences, Ege University, 4Department of Molecular Medicine, Faculty of Medicine, Ege University, 5Department of Physics, Faculty of Science, Ege University
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يتم تشخيص التهاب الأوعية الدموية للأطفال تقليديا من خلال التقييم النسيجي المرضي؛ ومع ذلك، تستخدم بشكل متزايد أساليب التصوير البصري الأقل تدخلا في الممارسة السريرية. على الرغم من هذه التطورات، يظل تحديد سبب أحادي التكوين الأساسي أمرا أساسيا لفهم آليات المرض، والتنبؤ بالتشخيص، وتوجيه استراتيجيات علاجية مستهدفة. تتكون اعتلالات التداخلية من النوع الأول من مجموعة متنوعة من الاضطرابات المناعية التي تتميز بإشارات الإنترفيرون المكونة وظهور متكررة في الأوعية الدموية أو الطب الوعائي. يساهم التنشيط المستمر لمسارات استشعار الأحماض النووية وضعف التوازن الخلوي في خلل البطانة الداخلية والتهاب الأوعية الدموية المزمن.
تقدم هذه الدراسة سير عمل شامل للتحليل الجيني للكشف عن المتغيرات المرتبطة بالتهاب الأوعية الدموية في الجينات المرتبطة بالاعتلال التداخلي داخل مجموعة أمراض الالتهاب الذاتي لدى الأطفال. تم إجراء تسلسل الإكسوم الكامل على 1,204 مريض يشتبه في إصابتهم باضطرابات التهابية ذاتية. تم تحليل المتغيرات التي تؤثر على مناطق الترميز ومواقع التوصيل باستخدام خط أنابيب معلوماتية حيوية مستند إلى إرشادات الكلية الأمريكية للوراثة الطبية والجينومية، مدمجا تقنيات التصفية الإحصائية ومعالجة الإشارات المستوحاة من تحويلات فورييه المنفصلة (DFT) والتوزيعات الإحصائية لتحسين أولوية وتفسير المتغيرات.
تم تحديد متغيرات مرتبطة بالتداخلية في 132 مريضا طفلا تم تقييمهم من خلال قاعدة بيانات عيادات روماتيزم. بشكل عام، تم اكتشاف 92 متغيرا فريدا، بما في ذلك 13 متحورا ممرضا أو محتملا تم الإبلاغ عنها سابقا، و79 متغيرا جديدا لم تكن موجودة في قواعد البيانات العامة حتى فبراير 2026. شملت المظاهر السريرية في الغالب حمى متكررة، وأعلام وعائية، وظهور التهاب ذاتي معقد.
شملت المتغيرات جينات مرتبطة باضطراب إشارات الإنترفيرون والتنشيط المناعي الفطري، بما في ذلك المسارات المرتبطة بتنشيط STING، واستقلاب الأحماض النووية، وخلل حركة الداخل الخلوي. يظهر هذا السير متعدد التخصصات الفائدة التشخيصية المحتملة لتحليل الجينوم في التهاب الأوعية الدموية لدى الأطفال ويبرز أهمية الإشارات الإنترفيرونية المستمرة في إصابات الأوعية الدموية وأمراض الالتهاب الذاتي.
المقدمة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
كان التهاب الأوعية الدموية للأطفال يشخص تقليديا من خلال التقييم النسيجي المرضي، والذي لا يزال المعيار الذهبي. ومع ذلك، أصبحت استراتيجيات التشخيص الحديثة تفضل بشكل متزايد الأساليب الأقل توغلا، خاصة الأساليب المعتمدة على التصوير. على الرغم من هذه التطورات، فإن تحديد سبب أحادي التكوين الأساسي يعد أمرا بالغ الأهمية في التهاب الأوعية الدموية في الأطفال، حيث يوفر رؤى حاسمة حول آليات المرض، والتوقعات المرضية، وفرص العلاج المستهدف 1,2.
يجب الاشتباه في التهاب الأوعية الدموية في الطفولة لدى الأطفال الذين يعانون من التهاب جهازي وتورط متعدد الأعضاء. يتطلب الأمر أخذ تاريخ طبي شامل، وفحوصات مخبرية، ودراسات تصويرية، وفي بعض الحالات خزعات الأنسجة لتحديد التشخيص واستبعاد المقلدين. الكشف المبكر والعلاج ضروريان لأن الأمراض غير المعالجة قد تؤدي إلى مضاعفات مهددة للحياة أو عواقب طويلة الأمد1.
تشمل اعتلالات التداخلية من النوع الأول طيفا متنوعا من الاضطرابات المناعية أحادية التكوين والمعقدة، والتي تتميز بتنشيط مستمر لمسار التداخل من النوع الأول وخصائص الأوعية الدموية أو العلاجية المتكررة3،4. الإحساس غير المنظم للأمسيد النووية وضعف التوازن الخلوي داخل الخلية هما آليات ممرضة مركزية تربط الإنتاج المستمر للإفراط في الإنترفيرون بالالتهاب والأصابع الوعائية. تسبب طفرات زيادة الوظيفة في TMEM173 (STING1) اعتلال الأوعية الدموية المرتبط ب STING مع بداية في مرحلة الطفولة (SAVI)، بينما تعطل طفرات COPA السائدة جسديا حركة الشبكة الإندوبلازمية-جولجي، مما يؤدي إلى تنشيط STING غير طبيعي ونمط وعائيمن 3 إلى 5. تؤكد الاعتلالات التداخلية الإضافية الناتجة عن عيوب في جينات أيض الأحماض النووية (TREX1، RNASEH2A/B/C، SAMHD1، ADAR1، وIFIH1) على العلاقة الميكانيكية بين اختلال تنظيم الإنترفيرون وأمراض الأوعيةالدموية 3 (انظر الشكل 1).
الشكل 1. هيكل ممرضي مفصل لاعتلاليات التداخلية من النوع الأول الذي يدفع خلل البطانة الجسدية وإصابات الأوعية الدموية الدقيقة في مجموعات الأطفال. (يسار) السياق الجهازي لاعتلال التداخلي من النوع الأول لدى الأطفال: التمييز بين الذات وعدم التمييز الذاتي والاستشعار الشاذ للأماضيد النووية في المضيف يثيران الالتهاب الذاتي الجهازي. تتميز الأنماط السريرية بشكل بارز باعتلال الأوعية الدموية الجلدية المبكر والتورط الجهازي، وغالبا ما تظهر على شكل آفات جلدية شبيهة بالشيلبلين. (في المنتصف) التسلسل الميكانيكي للعيوب الجينية إلى خلل التنظيم الجهازي: تؤدي طفرات فقدان الوظيفة في إنزيمات تصفية الأحماض النووية (مثل DNASE1، TREX1) إلى تراكم غير طبيعي للحمض النووي النووي والحمض النووي الريبي داخل السيتوبلازم. في الوقت نفسه، تؤدي طفرات اكتساب الوظيفة في حساسات مثل STING1 إلى تنشيط مسار cGAS-STING بشكل مستقل عن المحفزات الفيروسية. هذا الاستشعار داخل الخلايا الممرضة ينشط عوامل تنظيم الإنترفيرونات بشكل مفرط، مما يؤدي إلى تخليق مستمر لإنترفيرونات النوع الأول (IFN-α/β). ينشئ إنتاج السيتوكين المزمن حلقة تضخيم جهازية ذاتية الاعتماد عبر مستقبلات IFNAR1/2، تتفاقم بسبب ضعف آليات الإزالة وضوابط التغذية الراجعة الإيجابية. (يمين) النتيجة المرضية: الارتباط المستمر ل IFN-α/β المنتشرة بمركب مستقبلات الخلايا البطانية يحفز تنشيط JAK-STAT المستمر. هذا الاضطراب التوازن الداخلي المستمر يسبب إجهادا مستمرا في البطانة ويضعف آليات الاسترخاء الفسيولوجي. على مستوى الشعيرات الدموية، تسبب هذه الحالة المفرطة الالتهابية إصابة مباشرة في الخلايا البطانية، وسماكة كبيرة في جدار الأوعية الدموية، وتجلط الأوعية الدقيقة اللميعية، مما يؤدي إلى نقص التروية النسيجية الشديد واعتلال الأوعية الدموية الدقيقة النخر دون مسارات مناعية ذاتية بوساطة الأجسام المضادة الذاتية. الاختصارات: cGAS-STING = محفز جينات الإنترفيرون السينثاز الدوري GMP-AMP؛ DNASE1 = ديوكسي ريبونوكلياز 1؛ GoF = كسب الوظيفة؛ IFN = الإنترفيرون؛ IFNAR = مستقبل ألفا/بيتا الإنترفيرون; IRF = عامل تنظيم الإنترفيرون؛ JAK-STAT = محول ومحفز وفعال النسخ؛ STING1 = محفز استجابة الإنترفيرون، المتفاعل cGAMP 1؛ TREX1 = ثلاثة إكسونولياز لإصلاح الأساسيات 1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تم تطوير هذا النهج لاكتشاف المتغيرات الجينية المرتبطة بالاعتلال التداخلي في مجموعات الأطفال المصابين بالالتهاب الذاتي، حيث قد تواجه الطرق التقليدية تحديات تحليلية في تحديد الأولويات المبكرة للطفرات النادرة، وتلعب تباين العدلات دورا حاسما في التنبؤ بخطر الانتكاس6. في الأدبيات، تم توضيح دور اختلال تنظيم إشارات الإنترفيرون في التهاب الأوعية الدموية الصغيرة من خلال تحليلات الخلايا الواحدة، مما يبرز ميزة تسلسل الإشارات الكاملة (WES) للتشخيص المبكر في مجموعات الأطفال6.
قد تظهر متلازمات الالتهاب الذاتي الأحادية مع التهاب الأوعية الدموية أو مظاهر شبيهة بالتهاب الأوعية الدموية. على سبيل المثال، يمكن ل SAVI تقليد التهاب الأوعية الدموية في الأوعية الدموية الصغيرة أو المتوسطة7. وبالمثل، يمثل التهاب المفاصل مجهول السبب لليافعين (JIA) مجموعة غير متجانسة من الأمراض الالتهابية التي تبدأ في الطفولة والتي قد تستمر حتى مرحلة البلوغ وترتبط باضطراب يشبه الاعتلال التداخلي، مما يؤكد الحاجة إلى التحليل الجيني في مجموعات الأطفال8.
اعتلال التداخلات من النوع الأول هي أخطاء مناعية فطرية مندلية تتميز بتنشيط حساسات مضادة للفيروسات تثيرها الأحماض النووية المشتقة من المضيف، وتمثل فشلا في التمييز بين الذات وعدم التمييز بين الذات 3,4. تعرف هذه الاضطرابات بزيادة في إشارات الإنترفيرون من النوع الأول، وغالبا ما توفر المظاهر الجلدية أدلة تشخيصية مهمة. يرتبط SAVI بطفرات اكتساب الوظيفة في TMEM173 ويظهر مع اعتلال الأوعية الدموية الجلدية المبكر والتهاب رئوي. طفرة p.V155M هي المتحور رقم10 الأكثر شيوعا المبلغ عنها. SAVI هو مرض نادر يسبب الالتهاب الذاتي مرتبط بطفرات STING1، ويتميز بمرض الرئة الخلالي المبكر (ILD) والآفات الجلدية، وقد يحاكي سريريا الذئبة الحمراء الجهازية (SLE)11. كما تم ربط إشارات الإنترفيرون من النوع الأول المضطرب في التهاب الأوعية الدموية المرتبط بالأجسام السيتوبلازمية المضادة للعدلات (ANCA). في AAV، يكون توقيع الإنترفيرون من النوع الأول سائدا في التهاب الأوعية الدموية المرتبط بالتهاب الأوعية الدموية المجهري/ميلوبروكسيداز المرتبط ب ANCA (MPA/MPO-AAV) ويرتبط بالتوقعات الكلوية، مما يبرز مساهمة المتغيرات النادرة في اختلال تنظيم الإنترفيرون12.
قد تظهر متلازمات الالتهاب الذاتي الأحادية مع التهاب الأوعية الدموية أو مظاهر شبيهة بالتهاب الأوعية الدموية. على سبيل المثال، يمكن ل SAVI تقليد التهاب الأوعية الدموية في الأوعية الدموية الصغيرة أو المتوسطة7. سابقا، تم وصف أكبر مجموعة عالمية من المرضى الحاملين لطفرات STING1 المفعلة، مما وفر توصيفا سريريا ومناعيا موسعة لفيروس SAVI13. على مدى العقدين الماضيين، تم إحراز تقدم ملحوظ في فهم التعرف على مسببات الأمراض من قبل الخلايا المسببة للدم وغير المسببة للدم. يتم اكتشاف المكونات الميكروبية من خلال مستقبلات مشفرة بالجرثومة، وهي خطوة أساسية في بدء هذه الاستجابة14. في عام 2006، ثبت أن نقل الحمض النووي إلى أنواع خلايا مختلفة يحفز زيادة تنظيم الإنترفيرونات من النوع الأول بطريقة مستقلة عن المستقبلات الشبيهة بالتول (TLR). في هذا السياق، تم تحديد STING، وهو بروتين عابر للغشاء متمركز في الشبكة الإندوبلازمية، في عام 2008 كوسيط رئيسي لاستجابات الإنترفيرون من النوع الأول للحمض النووي الصناعيوالفيروسي 13. تؤدي طفرات اكتساب الوظيفة في STING1 إلى نوع من النوع الأول يعرف باسم SAVI9˒10˒14. يتميز هذا المرض الشديد بتغيرات بالتهاب جهازي مبكر، واعتلال الأوعية الدموية الجلدية، ومرض الرئة الخلالي (ILD)14. SAVI نادر، حيث تم الإبلاغ عن 52 مريضا من 37 عائلة حتى الآن، ومعظم الحالات تحدث بشكل جديد، رغم أنه تم توثيق وراثة سائدة وراثية أيضا. سابقا، تم وصف أكبر مجموعة عالمية من المرضى الحاملين لطفرات STING1 المنشطة، مما وفر توصيفا سريريا ومناعيا موسعة لطفرات SAVI 9,10,11˒14.
تم تطوير هذا البروتوكول لتمكين الكشف المبكر عن متغيرات جينية مرتبطة بالاعتلال التداخلي من خلال التحليل الجيني القائم على WES في المرضى الأطفال الذين تظهر لديهم سمات التهابية ذاتية، حيث أن الطرق التقليدية غالبا ما تكون غير كافية لتحديد الطفرات النادرة وقد تفوت فرص التدخل المبكر. تظهر الأدبيات أن دور زيادة تنظيم الإنترفيرون في الأنماط الظاهرية الشبيهة بالتهاب الأوعية الدموية قد تم توضيحه من خلال دراسة اضطرابات مندل، مما يبرز بشكل أكبر ميزة WES في اكتشاف المتحورات النادرة 4,7,12.
الهدف الأساسي من هذه الطريقة هو دمج مبادئ معالجة الإشارات القائمة على الفيزياء مع النمذجة الحوسبية البيوفيزيائية المبسطة لدعم اكتشاف المتغيرات في بيانات WES لاعتلاليات التداخلية من النوع الأول، مع تفسير التأثيرات اللاحقة على مسارات إشارات الإنترفيرون، وخاصة سلسلة محول إشارة جينوس كيناز ومنشط النسخ (JAK-STAT). يهدف هذا النهج الاستكشافي إلى تعزيز تحليل المناطق الجينومية التي تتأثر كثيرا بضوضاء التسلسل والتغطية غير الموحدة للاضطرابات المناعية، حيث يؤدي تنشيط الإنترفيرون غير المنظم إلى دفع الأنماط الوعائية الطبيعية. تركز سير العمل المعلوماتية الحيوية القياسية عادة على مقاييس الجودة القياسية، مما قد يترك مجالا لمزيد من التصفية الداعمة عند تحديد المتغيرات في مناطق معقدة في جينات مثل STING1 أو TREX1. من خلال تطبيق تقنيات معالجة الإشارات المستوحاة من تحويلات فورييه المنفصلة (DFT) والتوزيعات الإحصائية، تستخرج هذه الطريقة السمات الجينومية الأساسية من تسلسلات النيوكليوتيدات، وتربط القواعد (A, T, C, G) إلى مؤشرات ثنائية لتحليل أنماط الطفرات15. علاوة على ذلك، يتضمن النمذجة الفيزيائية الحيوية لمسارات الإنترفيرون سلوك العتبة وتضخيم الإشارة التراكمي لتقييم كيف يمكن للمتغيرات الجينية أن تحافظ على خلل البطانة، مع التركيز على دور مسار JAK-STAT في نقل إشارات الإنترفيرون من النوع الأول (IFN-α/β).
تم تصميم هذا التطبيق الاستكشافي لدراسة ملفات المحاذاة في المناطق ذات التغطية المنخفضة. بينما توفر الأدوات الحاسوبية القياسية ترشيح المتحورات الأولية، يحقق النموذج الداعم فيما إذا كان التقييم القائم على SNR يمكن أن يوفر بوابة نوعية ثانوية لمتغيرات النيوكليوتيد المشفرة (SNVs) المتأثرة بتوزيع القراءة غير المتجانس. يستخدم هذا النهج القائم على الفيزياء تحسين نسبة الضوضاء في الضوضاء لتقييم جودة النمط الجيني ونسب القراءة الطفيفة. في الأدبيات الأوسع، كشفت النمذجة العشوائية المماثلة عن استجابات متدرجة في مسارات JAK-STAT بدلا من ديناميكيات الكل أو لا شيء، مما أتاح التنبؤ بشكل أفضل بإنتاج الإنترفيرون16. مسار JAK-STAT، الذي يتم تفعيله بواسطة ارتباط الإنترفيرونات من النوع الأول (IFNs) بمستقبلات IFNAR1/IFNAR2، يتضمن كيناز جانوس (JAK1، TYK2) الذي يفسفر STAT1 وSTAT2، مكولا مركب ISGF3 مع IRF9 لنقل نووي ونسخ ISG17. يمكن نمذجة ذلك باستخدام المعادلات التفاضلية العادية (ODEs) لاستقراء IFN-β:
حيث تمثل المعلمات المذكورة معدل الفسفرة، وإزالة الفسفرة، والتغذية الراجعة السلبية عبر SOCS1، مما يبرز التضخيم المعتمد على العتبة17. تشمل التفاصيل الإضافية تكوين هومويدايمر STAT1 لإشارات IFN-γ، لكن في اعتلاليات التداخلية من النوع الأول، يؤدي التنشيط المستمر إلى تعبير مفرط عن ISG. تأخذ المحاكاة العشوائية أيضا في الاعتبار التباين، باستخدام خوارزميات جيلسبي لنمذجة الضوضاء في ارتباط المستقبل والليجاند والاستيراد النووي، كاشفة عن تباين خلية إلى أخرى في استجابات IFN16. تعد هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للباحثين الذين يدرسون التهاب الأوعية الدموية الذاتي الالتهابي، حيث توفر إطارا كميا يربط بين المتغيرات واختلال تنظيم المسارات، مثل التفاعلات الممتدة التي تتضمن تأثيرات باراكرين:
حيث تمثل المعلمات المذكورة معدل الإنتاج، والتدهور، والتعزيز الباراكريني18. يمكن للمستخدمين الذين لديهم وصول إلى بيانات تسلسل عالية الإنتاجية وموارد حاسوبية تطبيق هذا النهج لتحديد أولويات المتغيرات المرشحة واستكشاف تأثيرات المسارات المحتملة.
تم التخطيط لهذه الدراسة باستخدام نهج متعدد التخصصات في الروماتيزم والوراثة لتحديد المتغيرات المرتبطة بالتهاب الأوعية الدموية في الجينات المرتبطة بالاعتلال التداخلي في مجموعة كبيرة من الأطفال الذين يظهرون خصائص التهابية ذاتية، باستخدام بروتوكول التحليل الجيني القائم على تسلسل الإكسوم السريري (CES)/WES بسبب الصعوبات في تصنيف الأوعية الدموية ومحدوديات الأساليب التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، هدفت الدراسة إلى التأكيد على القيمة التشخيصية للتقييم الجيني في التهاب الأوعية الدموية في الأطفال.
تصنيف تشابل هيل لالتهاب الأوعية الدموية لعام 2012 لا يشمل التهاب الأوعية الدموية الذاتي أحادي التكوين19. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد تكرار المتغيرات المرتبطة بالاعتلال التداخلي التي تم اكتشافها لدى مجموعة من المرضى الأطفال الذين يعانون من أعراض التهاب ذاتي، والمساهمة في توسيع قاعدة بيانات الأمراض النادرة، والتأكيد على أهمية التقييم الجيني في التهاب الأوعية الدموية لدى الأطفال.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الطب بجامعة إيجي. تم جمع جميع عينات الدم الطرفية بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى أو أوصيائهم القانونيين، وفقا لإعلان هلسنكي. تم تصميم هذه الدراسة ذات المركز الواحد بأثر رجعي لتقييم تكرار المتغيرات المرتبطة بالاعتلال التداخلي بين المرضى الذين يخضعون لتحليل جيني لمرض يشتبه في الالتهاب الذاتي ولتحقيق علاقتها بالتهاب الأوعية الدموية. بين عامي 2022 و2025، تم تضمين عينات دم محيطية أرسلت إلى مختبر الطب الجزيئي بجامعة إيجي مع تشخيص أولي لمرض التهاب ذاتي. خضعت ما مجموعه 1,204 عينات لتحليل جيني. تم استخدام CES/WES كنهج تسلسل من الجيل القادم (NGS) يستهدف الإكسونات والتسلسلات الإنترونيكية المجاورة. تم تصنيف المتغيرات باستخدام معايير ACMG وتحليل المعلوماتية الحيوية. تم استبعاد المتحورات الحميدة والمحتملة الحميدة. من بين هذه الدفعة، تم تضمين 132 حالة أطفال تم تحديد متغيرات مرتبطة بالاعتلال التداخلي واستوفين معايير الإدراج في المجموعة النهائية للدراسة.
ضمن هذه المجموعة من طب الأطفال، تم استرجاع البيانات السريرية من قاعدة بيانات عيادات روماتيزم. بشكل عام، تم تحديد 92 متغيرا جينيا فريدا بين 132 مريضا، بما في ذلك 13 متحورا ممرضا أو محتملا تم الإبلاغ عنها سابقا وتم توثيقها في قواعد بيانات عامة للمتغيرات (مثل ClinVar) و79 متحورا جديدا غائبا عن قواعد البيانات العامة حتى فبراير 2026. كانت معظم المتحورات متغاير الشكل ومرتبطة بأنماط شبيهة ب CAPS أو بعروض التهاب الأوعية الدموية الذاتي المعقدة. استخدم WES نهج NGS مستهدفا المناطق المشفرة للبروتين (الإكسونات) والتسلسلات الإنترونيكية المجاورة للكشف عن متغيرات موقع التوصيل والتنظيم. على الرغم من أن WES يغطي حوالي 1٪–2٪ من الجينوم البشري، إلا أنه يلتقط ما يقرب من 85٪ من الطفرات المعروفة المسببة للأمراض، مما يجعله أداة فعالة للغاية للكشف عن المتحورات النادرة.
شمل سير العمل المخبري استخراج الحمض النووي الجيني من الدم المحيطي، وتجزئة الحمض النووي، وتحضير المكتبة المرتبطة بالمكيلات، وتخصيب الإكسوم باستخدام مجسات التقاط تعتمد على التهجين عبر سحب البيوتين-ستريبتافيدين. تم إجراء تسلسل مزدوج عالي الإنتاجية على منصة تسلسل كرات الحمض النووي النانوية، محققا عمق تغطية متوسط يتراوح بين 100–200x لضمان اكتشاف المتحورات بشكل موثوق. شمل التحليل المعلوماتي الحيوية محاذاة الجينوم المرجعي، واستدعاء المتغيرات، والتعليق باستخدام قواعد بيانات متغيرة مختاراة، مع إجراء تصنيف المتغيرات وفقا لإرشادات الكلية الأمريكية لعلم الوراثة الطبية والجينوميات (ACMG). تم تصنيف المتغيرات كمتغيرة تم الإبلاغ عنها سابقا أو جديدة. تم التحقق من صحة المتغيرات المختارة بواسطة تسلسل سانجر.
بالإضافة إلى خطوط الأنابيب المعلوماتية الحيوية القياسية، تم تطبيق مبادئ معالجة الإشارات القائمة على الفيزياء والنمذجة الحاسوبية المبسطة لتقييم عمق التسلسل، وتوحيد التغطية، وخصائص الإشارة إلى الضوضاء، مما يوفر طبقة استكشافية وتكميلية لتحليل عمق التسلسل الخام والتغطية الإقليمية. علاوة على ذلك، تم استخدام مفاهيم النمذجة الفيزيائية الحيوية لتقييم التأثير التراكمي للمتغيرات الجينية المرتبطة بالتهاب الأوعية الدموية.
يعمل هذا الإطار متعدد التخصصات كنموذج مختبري أولي لدراسة خصائص تصفية المتغيرات في سياق بحثي استكشافي، لا سيما لتوجيه استراتيجيات علاجية مضادة للإنترفيرون. تشمل القيود انخفاض الحساسية للمتغيرات الفسيفسائية منخفضة المستوى والحاجة إلى التحقق الوظيفي من النتائج الجديدة. تشمل التطبيقات المحتملة التشخيص المبكر لالتهاب الأوعية الدموية لدى الأطفال، واتخاذ قرارات علاجية شخصية، وتوسيع قواعد بيانات المتحورات ذات الصلة بالمناعة والروماتيزم والطب الوعائي.
تجزئة الحمض النووي
تم نقل عشرين ميكرولتر من الحمض النووي المخفف إلى أنابيب PCR معقمة جديدة. إلى كل أنبوب، أضيف 2 ميكرولتر من مخزن التجزئة/الأدينيل و3 ميكرولتر من خليط إنزيم التجزئة/الأدينيل؛ كان حجم التفاعل الكلي 25 ميكرولتر. تم خلط الخليط برفق، وتم طرد مركزه لفترة وجيزة، وتم تشغيل برنامج التجزئة على جهاز الدورة الحرارية. فور الانتهاء، تم تطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة ووضعها على الثلج. كانت النتيجة المتوقعة حجم متوسط لجزء DNA يتراوح بين 200–300 قطعة حراسة.
ربط المحول
إلى كل منتج تجزئة، أضيف 2.5 ميكرولتر من محول التسلسل، يليه 10 ميكرولتر من خليط الربط الرئيسي (بدون دوامة). تم تفريغ الخليط بلطف لضمان التجانس، وتم تفريغه لفترة وجيزة، وحضنه عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع فتح غطاء جهاز الدورة الحرارية. بعد الحضانة، تم تجميع الأنابيب لفترة وجيزة وتركها على الثلج.
التنقية القائمة على الخرزات
تمت إضافة ثلاثين ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية إلى كل عينة وخلطها جيدا عن طريق التوصيل حتى يتم الحصول على تعليق متجانس. تم حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم وضعت الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة 3 دقائق. بعد أن تنظف السائل الفائق، تم إزالته بعناية. تم غسل الحبيبة مرتين ب 100 ميكرولتر من 80٪ إيثانول، وتمت إزالة الإيثانول المتبقي بعد الغسل النهائي. ثم تجف الخرزات بالهواء على الحامل المغناطيسي لمدة تصل إلى 5 دقائق. تمت إضافة تسعة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكليز، وأعيد تعليق الحبيبة عن طريق الأنابيب وحضنتها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد فصل مغناطيسي لمدة 3 دقائق، تم نقل 7.5 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب PCR جديد معنون.
تضخيم PCR
تم تخفيف بادئات النسخ الصناعي (IVT) (20 ميكرولتر من مخزون البرايمر + 80 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز). لتفاعل PCR (الحجم الإجمالي 17.5 ميكرولتر)، تمت إضافة 2.5 ميكرولتر من برايمر IVT 1، و2.5 ميكرولتر من برايمر IVT 2، و12.5 ميكرولتر من خليط التضخيم الرئيسي للمكتبة. تم وضع الخليط بلطف على القناة، وتم تنفيذ برنامج PCR-3.
التنقية بعد PCR
تمت إضافة خمسة وعشرين ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية إلى كل منتج PCR. بعد 5 دقائق حضانة بدرجة حرارة الغرفة وفصل مغناطيسي، تم غسل الخرزات مرتين ب 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪. بعد التجفيف بالهواء لمدة تصل إلى 5 دقائق، أضيف 11 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. تم نقل عشرة ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب جديد. تم قياس تركيز المكتبة؛ الهدف: >25 نانوغرام/ميكرولتر.
التجميع والتهجين (عينات لكل مجموعة)
تم تجميع المكتبات مع ثماني عينات مرضى في كل مجموعة (93.75 نانوغرام لكل عينة، بإجمالي 750 نانوغرام). تم تعديل الحجم إلى 12.5 ميكرولتر باستخدام مياه خالية من النوكلياز إذا لزم الأمر. تم حضان خليط التهجين مسبقا عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تمت إضافة محلول الحجب، وأوليجونكليوتيدات الحجب الشامل، ومسبار التقاط الإكسوم، والماء الخالي من النوكلياز، ومحسن التهجين بشكل متسلسل. تم إطلاق برنامج التهجين لمدة 16 ساعة (18:00–10:00).
التقاط الأهداف المهجنة على خرز الستربتافيدين
تم غسل خرز الستريبتافيدين ثلاث مرات باستخدام حاجز الربط. بعد التهجين لمدة 16 ساعة، يضاف الخليط إلى الخرزات ويحتضن عند حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع خلط لطيف كل 5 دقائق. تم الغسل باستخدام مخزن غسل الالتقاط 1 في درجة حرارة الغرفة، تلاها ثلاث غسلات باستخدام مخزن غسل الالتقاط المسبق (48 درجة مئوية) 2، بما في ذلك الحضانة عند 48 درجة مئوية. بعد الغسل النهائي، أعيد تعليق الحبيبة في 23 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
تحضير الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)
تمت إضافة أربعة وعشرين ميكرولتر من مخزن TE، وتم تغيير الخليط عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم وضع فورا على الثلج. تمت إضافة خليط رئيسي يحتوي على حاجز ربط الجبيرة وليغاز DNA سريع، وتم تشغيل برنامج SS-2 (37 درجة مئوية، 30 دقيقة) لتدوير الحمض النووي أحادي السلسلة. تمت إضافة حاجز الهضم وخليط إنزيمات الهضم، وتم تشغيل برنامج SS-3 (37 درجة مئوية، 30 دقيقة). ثم أضيف 3.75 ميكرولتر من حاجز توقف الهضم. تمت إضافة خمسة وثمانين ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية، تلتها تنقية خرزات قياسية. تم نقل خمسة عشر ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب جديد؛ كان التركيز المتوقع 0.8–2 نانوغرام/ميكرولتر.
تحضير كرة نانوية للحمض النووي (DNB)
تم استخدام منتجات ssDNA لتكوين DNB. تمت إضافة خلطات مخازل تكوين DNB، ومخزن TE منخفض EDTA، وخلطات إنزيم DNB 1 و2. تم تشغيل برامج DNB-1 و DNB-2 بشكل متسلسل. بعد الانتهاء، أضيف 20 ميكرولتر من مخزن توقف تفاعل DNB وخلطه بلطف (5–8x) باستخدام رؤوس ماصة عريضة السبطانة؛ كان التركيز المتوقع من 8 إلى 40 نانوغرام. تم تحميل DNBs المحضرة على منصة تسلسل كرات الحمض النووي النانوية للتسلسل عالي الإنتاجية.
معالجة بيانات التسلسل وتحليل الإشارات
تم التحكم في جودة قراءات التسلسل الخام باستخدام FastQC (v0.11.9) وfastp (v0.23.1). تم تحسين عتبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) البالغة 20 ديسيبل باستخدام تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) مقابل مجموعة بيانات مرجعية للمتغيرات المعروفة الالتهابية الذاتية، مع موازنة معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) البالغ <1٪ وحساسية مستهدفة تبلغ >95٪ للمتغيرات منخفضة التردد؛ تم التخلص من القراءات التي تسقط تحت هذا العتبة ال20 ديسيبل. تم إجراء محاذاة مع الجينوم المرجعي لاتحاد الجينوم Human Build 38 (GRCh38) المرجعي واستدعاء المتغيرات الأولي باستخدام BWA-MEM (v0.7.17) ومجموعة أدوات تحليل الجينوم (GATK، v4.2.6).
بالنسبة لخطوات معالجة الإشارات القائمة على الفيزياء، تم تحويل تسلسلات النيوكليوتيدات إلى إشارات رقمية ثنائية (0 تمثل البيورينات؛ 1 تمثل البيريميدينات). لحساب DFT، تمت معالجة الإشارة الثنائية بنافذة منزلقة N = 512 زوج قواعد وتداخل بنسبة 50٪ (حجم خطوة 256 بيتاب) للحفاظ على دقة جينومية محلية. تم تعريف DFT على أنها:
لتصفية التشويشات في التسلسل عالي التردد دون الإفراط في تنعيم متغيرات النيوكليوتيد الأحادي الحقيقية (SNVs)، والتي تظهر كانتقالات محلية حادة وعالية التردد، تم معايرة مرشح رقمي منخفض التمرير برمجيا. تم تحديد تردد القطع المطبع الأمثل (fc) بشكل تكراري عن طريق مسح نطاق 0.05–0.25 دورة/قاعدة. اختارت خوارزمية التحسين fc = 0.15 دورات/قاعدة، وتعرف بأنها نقطة التحول التي يحتفظ فيها طيف قوة الإشارة ب ≥85٪ من التباين الكلي لمتغيرات التحكم المعروفة ذات الإيجابية الحقيقية مع إزالة الضوضاء التقنية الخلفية. تم تطبيق التصفية المعتمدة على DFT باستخدام سكريبتات مخصصة مكتوبة بلغة بايثون (الإصدار 3.9)، مع استخدام مكتبات NumPy (الإصدار 1.23.0) وSciPy (الإصدار 1.9.1)، لتقليل الضوضاء عالية التردد مع الحفاظ على الميزات الطيفية المرتبطة بالطفرات. تم معايرة معلمات التصفية بشكل تكراري برمجيا لمنع التلميع المفرط للإشارات النادرة المتغيرة. يتم تلخيص سير العمل المتكامل لمعالجة الإشارات والنمذجة الفيزيائية الحيوية في الشكل 2.
النمذجة الفيزيائية الحيوية والعشوائية لإشارات الإنترفيرون
للتحقيق في النتائج الوظيفية للمتغيرات المحددة، تم نمذجة ديناميكيات مسار JAK–STAT باستخدام المعادلات التفاضلية العادية (ODEs) المعرفة كما يلي:
تم تنفيذ محاكاة المعادلات التفاضلية الحتمية باستخدام COPASI (محاكي المسارات المعقد، الإصدار 4.36) وتم تأكيدها بواسطة سكريبتات بايثون مخصصة باستخدام وحدة scipy.integrate.solve_ivp. تم تحديد ظروف أولية واقعية بيولوجيا، وأجريت تحليلات حساسية على ثوابت معدل التضخيم باستخدام SALib (مكتبة تحليل الحساسية بلغة بايثون، v1.4.5). تم دمج حركيات الإشارة IFN-α التي بوساطة TYK2 لمحاكاة تضخيم STAT2 المدفوع بزيادة الوظيفة.
تم إدخال التأثيرات العشوائية باستخدام صياغة لانجفين:
dX = f(X) dt + g(X)dW
بالإضافة إلى ذلك، أجريت محاكاة عشوائية لجيليسبي باستخدام مكتبة بايثون GillesPy2 (v1.7.0) لنمذجة الانفجار النسخي وتنشيط الجين المحفز بالإنترفيرون (ISG) المحفز بالإنترفيرون الناتج عن IFN β غير متجانس. تم تنفيذ دوال التأخير الموزعة التي تمثلها صيغ نواة غاما في بايثون باستخدام التكامل العددي لمحاكاة آليات التغذية الراجعة النسخية المؤجلة. تم تنفيذ جميع خطوط الأنابيب الحسابية، بما في ذلك تصفية الإشارات والنمذجة الرياضية، على بيئة حوسبة عالية الأداء (HPC) تعتمد على لينكس.
الشكل 2. إطار متكامل لمعالجة الإشارات والنمذجة الفيزيائية الحيوية لإشارات JAK-STAT. 1: مرحلة معالجة الإشارة: رسم خريطة ثنائية لتسلسلات النيوكليوتيدات (البيورينات = 0، البيريميدينات = 1) تليها ترشيح قائم على DFT. لاحظ عتبة SNR الحرجة عند 20 ديسيبل لاستدعاء المتغيرات بدقة. 2: النمذجة الفيزيائية الحيوية: محاكاة معدلات التضخيم القائمة على المعادلات التبسيطية حيث تؤدي الاضطرابات الصغيرة في الظروف الأولية إلى تحولات عتبة في الإشارات المستمرة. 3: النمط الظاهري البيولوجي: نمذجة متغيرات كسب الوظيفة في TYK2 في مسار IFN-α، مما يؤدي إلى تفعيل STAT2 المتزايد وأنماط الاعتلال التداخلي الناتجة. الاختصارات: DFT = تحويل فورييه المتقطع؛ IFN-α = الإنترفيرون ألفا؛ JAK-STAT = محول ومحفز وفعال النسخ؛ ODE = المعادلة التفاضلية العادية؛ نسبة SNR = نسبة الإشارة إلى الضوضاء؛ STAT2 = محول الإشارة ومنشط النسخ 2؛ TYK2 = كينازين التيروسين 2. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يلخص الشكل 2 دمج معالجة الإشارات المعتمدة على DFT مع مكونات النمذجة التعددية والمتغيرة والاحتمالية المستخدمة في سير العمل الحسابي الاستكشافي. يدمج هذا البروتوكول الشامل علم الوراثة الجزيئي المتقدم، وتقنيات التسلسل عالي الإنتاجية، وخوارزميات معالجة الإشارات، والنمذجة الفيزيائية الحيوية لدعم اكتشاف وتفسير المتغيرات المرتبطة بالاعتلال التداخلي في التهاب الأوعية الدموية الذاتي الالتهابي لدى الأطفال.
الإطار الإحصائي وتوزيع احتمالية رسم الإشارة
لتقنين رسم الخرائط الرقمية لتسلسلات الجينوم قبل ترشيح الإشارات، تم إنشاء إطار تحويل ثنائي يعتمد على الكيمياء الحيوية للنوكليوتيدات. لكل نافذة جينومية هيكلية بطول N، يتم تعيين البيورينات {A, G} إلى قيمة رقمية 0، ويتم تعيين البيريميدينات {C, T} إلى 1. وفقا للفرضية الصفرية (H0) لتوزيع جينوم خلفي غير متحيز ومنتظم، يتبع هذا التحويل الثنائي إطار تجربة برنولي. تعرف دالة كتلة الاحتمالية (PMF) للإشارة الخريطة X كما يلي
P(X = x) = px(1 - p)1-x ل x ∈ {0,1}
حيث يمثل p = 0.5 احتمال مواجهة بقايا بيريميدين عبر مسار خلفية غير محدد. عند مقياس هذا التحويل عبر قواعد متسلسلة لحساب كثافة الطيف الطاقي (PSD) عبر DFT، يتصرف توزيع الضوضاء الخلفية التراكمي كمسار عشوائي، يتقارب إلى توزيع ضوضاء بيضاء غاوسي وفقا لمبرهنة الحد المركزي. وبالتالي، فإن طيف القدرة المعدل لهذا التوزيع الصفري يتبع توزيعا كاي تربيع (χ2) بدرجتين من الحرية. للحفاظ على عتبة دلالة إحصائية صارمة (α = 0.05)، تم حساب عتبة شدة القدرة الحرجة لتعريف ارتفاع إشارة متغير ممرض حقيقي تحليليا باستخدام تكامل كثافة الاحتمالات التالي:
العتبة = - In(a) ×a 2
حيث يمثل σ2 التباين التشغيلي لأرضية الضوضاء الجينومية الخلفية المحلية. أي ذروة طيفية تتجاوز هذا الحد (p < 0.05، ما يعادل SNR > 20 ديسيبل) كانت تعطى أولوية للبوابات الترشيحية في الأسفل في السيليكو، مما يضمن أن الاستدعاء المتنوع يعتمد على البيانات وأقل تأثرا بضوضاء التسلسل العشوائي.
الكفاءة التشغيلية وتحليل التكاليف (الشكل 3)
من منظور التنفيذ الانتقالي والسريري، تم مقارنة كفاءة العمليات، ووقت الإنجاز السريري (TAT)، والجدوى الاقتصادية لهذا البروتوكول المتكامل مقابل المسارات التشخيصية التقليدية، مثل تسلسل سانجر المتسلسل أو لوحات الجينات المستهدفة المقيدة. بينما تمتد الرحلات التشخيصية التقليدية لالتهاب الأوعية الدموية للأطفال أو اعتلالات التداخلية من النوع الأول المشتبه بها غالبا من 8 إلى 12 أسبوعا بسبب الاختبارات التكرارية لجين واحد، فإن سير العمل المبسط—الذي يشمل WES عالي الإنتاجية، والتهجين المحسن لمدة 16 ساعة، وترشيح إشارات DFT المتوازي على مجموعة الحوسبة عالية الأداء (HPC)—يحقق إجمالي TAT سريري يبلغ 10–14 يوما من استلام العينة الأولي حتى التقرير الجزيئي النهائي. علاوة على ذلك، وبفضل تعدد العينات الفعال (تجميع ثماني عينات مرضى لكل كتلة هجينة)، تبلغ تكلفة الكاشف الأساسي والتسلسل حوالي 250–300 دولار لكل مريض، مقارنة باللوحات الشاملة التقليدية التي غالبا ما تتجاوز 1200–1800 دولار. يشير هذا الدمج لكل من الجدول الزمني التشخيصي وأطر التكلفة إلى أن سير عمل المعلومات الحيوية المقترح المستوحى من الفيزياء قد يكون قابلا للتنفيذ والتوسع لمختبرات الوراثة السريرية الروتينية.
النتائج
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
في هذه المجموعة المكونة من 132 مريضا تم تحديد متغيرات مرتبطة بالاعتلال التداخلي، تم تحديد طيف واسع من المتغيرات الجينية (الجدول 1). من بين المرضى، كان 53 (40.2٪) من الإناث، و79 (59.8٪) من الذكور. كان متوسط العمر 10.2 سنوات (النطاق: 0–18 سنة). تم توفير بيانات على مستوى المريض المقابلة للدفعة النهائية في الجدول التكميلي S1.
الجدول 1: توزيع وتصنيف المتغيرات الجينية المرتبطة باعتلال التداخلي من النوع الأول التي تم تحديدها ضمن مجموعة الأطفال الالتهابية الذاتية (n = 132). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول
كانت الجينات الأكثر تأثرا هي ADAR (25 مريضا، 18.94٪) وDNASE1 (24 مريضا، 18.18٪). كانت متغيرات DNASE1 من الفئة الثالثة حصريا (100٪ ضمن الجين؛ 18.18٪ من إجمالي الدفعة). وبالمثل، كانت غالبية متغيرات ADAR من الفئة 3 (24 مريضا، 96.00٪؛ 18.18٪ من المجموعة)، مع متغير واحد فقط من الفئة الثانية (4.00٪ ضمن الجين؛ 0.76٪ من المجموعة) (الجدول 2).
الجدول 2: المتحورات التي تم تحديدها في لوحة NGS للأمراض النادرة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول
كانت المتغيرات في STING1 (20 مريضا، 15.15٪) و RNASEH2B (14 مريضا، 10.61٪) شائعة أيضا. جميع نسخ STING1 كانت من الفئة 3 (100٪). في RNASEH2B، كان لدى 10 مرضى (71.43٪) متغيرات من الفئة الثالثة (7.58٪ من الدفعة)، بينما كان لدى 4 مرضى (28.57٪) متغيرات من الفئة الثانية (3.03٪ من المجموعة).
تم تحديد RNASEH2A الطفرات لدى 13 مريضا (9.85٪)، جميعهم يحملون متغيرات من الفئة الثالثة (100٪). كانت طفرات TREX1 موجودة في 10 مرضى (7.58٪)، بما في ذلك 8 متغيرات من الفئة الثالثة (80.00٪؛ 6.06٪ من المجموعة) و2 من الفئة الثانية (20.00٪؛ 1.52٪ من المجموعة).
تم اكتشاف متغيرات SAMHD1 في 9 مرضى (6.82٪)، حيث حمل 7 مرضى متغيرات من الفئة 3 (77.78٪؛ 5.30٪ من الدفعة)، ومريض واحد يحمل متحولا من الفئة 1 (11.11٪؛ 0.76٪)، ومريض واحد يحمل متحولا من الفئة 2 (11.11٪؛ 0.76٪).
تم العثور على RNASEH2C طفرات في 8 مرضى (6.06٪)، جميعهم من الفئة 3. تم تحديد DNASE1L3 طفرات في 6 مرضى (4.55٪)، بما في ذلك 5 متغيرات من الفئة 3 (83.33٪؛ 3.79٪ من المجموعة) ومتحور واحد من الفئة الثانية (16.67٪؛ 0.76٪). تم اكتشاف طفرات PSMB8 وCOPA لكل منهما في 5 مرضى (3.79٪)، وجميع المتحورات كانت من الفئة 3 (100٪). كانت طفرات DNASE2 و STAT4 موجودة في كل من 3 مرضى (2.27٪)، وتم تصنيف جميع المتحورات ضمن الفئة 3.
بشكل عام، شكلت متغيرات الفئة الثالثة الفئة السائدة بين جميع الجينات في المجموعة. المواقع المتغيرة المحددة، بما في ذلك استبدالات النيوكليوتيدات التفصيلية والتغيرات المقابلة في الأحماض الأمينية عبر الجينات المستهدفة، مدرجة في الجدول 3.
التحليل الاستكشافي لأداء معالجة الإشارة
لاستكشاف متانة وحساسية خط معالجة الإشارات المعتمد على DFT، تم إجراء اختبار مقارنة مع سير عمل استدعاء المتغيرات القياسي المعتمد فقط على GATK، مع التركيز بشكل خاص على المناطق الجينومية منخفضة التغطية (عمق < 30x). في المقارنة الأولية، أظهر تخطيط ترشيح DFT المتكامل اتجاها محتملا نحو تحسين الأولويات في مناطق منخفضة التغطية المختارة، مما يشير إلى تقدير استكشافي يصل إلى 96.8٪ تحت هذه الظروف المخبرية المحددة للتحكم في المختبر. ومن المهم أن هذه المعايير ومقاييس الكفاءة العددية تمثل نتائج أولية واستكشافية تم معايرتها ضمن سياق المجموعة المؤسسية المحددة، بدلا من خط أنابيب سريري معتمد عالميا. كما استعاد خط الأنابيب متغيرات إيجابية حقيقية تم تجاهلها سابقا في المناطق ذات الضوضاء العالية. علاوة على ذلك، تم تقليل FDR من 6.4٪ إلى 1.2٪، مما يبرز القوة المحتملة لمرشح التمرير المنخفض في القضاء على التشويشات في التسلسل عالي التردد. من بين المتغيرات الجديدة التي تم تحديدها في المجموعة، تم تصنيف 14 نوعا (يمثل 17.7٪ من النتائج الجديدة)، تقع في الغالب في مناطق تغطية غير منتظمة في STING1 وTREX1، في البداية كقطع أثرية منخفضة الجودة حسب عتبات الخوارزميات القياسية، لكنها تم استعادتها والتحقق منها بنجاح بواسطة تسلسل سانجر وفقا لبروتوكول تعزيز الإشارة إلى الضوضاء. تشير هذه الملاحظة التحليلية إلى أن تقييم خصائص الإشارة الفيزيائية قد يكون أداة مفيدة في سير العمل الاستكشافي للبحث.
مقارنة مقارنة مع سير العمل القياسي
لتقييم الأداء المقارن لهذا الإطار المتكامل، تم إجراء تحليل مقارنة مقارنة جنبا إلى جنب مقابل خطي استدعاء متغيرين قياسيين: سير عمل أفضل ممارسات GATK (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) وDeepVariant (الإصدار 1.5). تم حساب مقاييس الأداء باستخدام مجموعة تحقق عالية الثقة من المجموعة، تم تقييمها عبر مناطق جينومية منخفضة التغطية (عمق < 30x) والمناطق الجينومية عالية الضوضاء. يتم تلخيص البنية المقارنة في الجدول 4.
المعامل الكمي والتحقق من صحة النماذج الحاسوبية
لتأسيس الأطر الفيزيائية الحيوية والعشوائية من الناحية الكمية، تم تعديل المعادلات التفاضلية ومحاكاة جيليسبي باستخدام قيم حركية تجريبية معايرة وفقا لظروف التحكم التجريبية. تتتبع محاكاة الود المفتوحة المستمرة التركيز المطلق لمادة STAT2 المفسسفر ([STAT2p]) على مدى 720 دقيقة بعد محاكاة تعرض الإنترفيرون من النوع الأول. في نموذج الحاسوبية من النوع البري (WT)، أظهر شلال الإشارة توهين تجانسي سريع، يتميز بذروة تفعيل عند t = 45 دقيقة تليها إزالة سريعة مدفوعة بتغذية راجعة سلبية مبرمجة (k3 = 0.45 دقيقة-1) عبر تعبير SOCS1 محاكاة. على النقيض من ذلك، كشف نمذجة تغيرات كسب الوظيفة (GoF) في مسارات STING1 وTYK2 عن تحولات عتبة شديدة، مما أدى إلى حالة التهابية مفرطة مستمرة وغير مخففة. يتم تلخيص التغيرات في عمر نصف الإشارة (t1/2) وتغيرات الطي في الحالة المستقرة في الجدول 5.
بيان توفر البيانات
https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level البيانات السريرية المقابلة للدفعة النهائية مقدمة في الجدول التكميلي S1. تم توفير عتبات معالجة الإشارات الرقمية المنفصلة، والتركيبات الرياضية، وإعدادات بيئة البرمجيات، والمعلمات الحسابية اللازمة لتكرار محاكاة ترشيح DFT ومحاكاة المسارات الفيزيائية الحيوية (المعادلات التفاضلية ونماذج العشوائية) للجمهور. لضمان وصول دائم وغير مقيد للقراء، تم إيداع إطار عمل النسخ هذا على GitHub وأرشفت بشكل دائم في زينودو عبر DOI:https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. مكتبات البرمجيات مفتوحة المصدر القياسية ومنصات الحوسبة الرقمية المستخدمة في هذا السير العمل، مثل NumPy وSciPy وCOPASI، متاحة للجمهور.
الشكل 3. لوحة القصة التشغيلية وبنية خطوط الأنابيب المعتمدة على البيانات لتحديد ونمذجة الفيزياء الحيوية للمتغيرات المرتبطة بالنوع الأول من التداخلية. يحدد المخطط سير عمل تجريبي وحسابي زمني، من أربع مستويات، يدمج التحليل السريري للمجموعات مع معالجة الإشارات البيولوجية. (أ) تدرج المجموعات وخط أنابيب NGS: سير العمل لمجموعة الأطفال الالتهابية الذاتية (n = 132) التي تخضع لعلاج WES. يعرض الإدخال مسارات نقاط Phred الخام التمثيلية لمراقبة جودة FastQ، وتنتقل إلى استدعاء متغيرات GATK/DeepVariant وتوليد مصفوفة VCF النهائي. (ب) معالجة الإشارات القائمة على DFT: الترجمة الخوارزمية للنص الجينومي إلى إشارات جينومية رقمية لتقليل الضوضاء. يرسم الرسم البياني المدمج المدفوع بالبيانات توزيع طيف الطاقة، ويحدد ترددات المتحورات الممرضة (طفرات الإشارة) مقابل ضوضاء خلفية جينومية مع عتبة SNR تبلغ >20 ديسيبل. (ج) في بوابة التنظيم السيليكو : قمع أولوية متعدد الطبقات يدمج إرشادات المرض من ACMG ذات الخمس طبقات، وHGMD، وInfevers لإعطاء الأولوية ل 79 متغيرا جديدا و13 متحولا تم الإبلاغ عنها. (د) التحقق من النمذجة الفيزيائية الحيوية الوظيفية: طبقة التحقق البيولوجي. يتم دمج إطار التعادل التفاضلي الحتمي ومنحنيات محاكاة جيليسبي العشوائية كمكونات رسومية، حيث ترسم استعادة المسار لمدة 720 دقيقة والإشارات المستمرة للحركية الخلوية المتحولة من النوع البري مقابل المحاكاة. الاختصارات: ACMG = الكلية الأمريكية لعلم الوراثة والجينوم الطبي؛ DFT = تحويل فورييه المتقطع؛ GATK = مجموعة أدوات تحليل الجينوم؛ HGMD = قاعدة بيانات طفرات الجينات البشرية؛ NGS = تسلسل الجيل القادم؛ ODE = المعادلة التفاضلية العادية؛ نسبة SNR = نسبة الإشارة إلى الضوضاء؛ VCF = تنسيق استدعاء متغير؛ WES = تسلسل الإكسوم الكامل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 3: التعليق الشامل والتحكم في قاعدة بيانات المواقع للمتغيرات الجينية المرتبطة بالتداخلية من النوع الأول داخل مجموعة الأطفال (n = 132). معايير ACMG (من إرشادات ACMG/AMP لعام 2015): تم تجميع رموز أدلة ACMG/AMP حسب قوة الأدلة. شملت الأدلة القوية جدا PVS1، الذي يشير إلى متغيرات فقدان الوظيفة المتوقعة في الجينات حيث يعتبر فقدان الوظيفة آلية مرضية معروفة. شملت الأدلة القوية PS1–PS4، التي شملت تغييرات الأحماض الأمينية المثبتة سابقا، وحدوث الأحماض الأمينية المؤكدة من جديد، وأدلة وظيفية داعمة، وزيادة تكرار المتحورات لدى الأفراد المصابين. شملت الأدلة المتوسطة PM1–PM6، بما في ذلك الموقع في مجال حرج أو نقطة ساخنة طفرية، غياب أو تكرار منخفض جدا في قواعد بيانات السكان، حدوث التحول في الاضطرابات المتنحية، تغيرات طول البروتين، تغييرات جديدة في الإحساس الخاطئ عند البقايا مع التنوع الممرضي المعروف، وافتراض حدوث الحدث الحديث. شملت الأدلة الداعمة PP1–PP5، بما في ذلك الفصل المشترك، وقيود الإحساس الخاطئ الخاص بالجينات، وأدلة السيليكو ، وخصوصية النمط الظاهري، وتقارير سابقة موثوقة عن المرضية عندما لا تتوفر أدلة مستقلة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول
الجدول 4: مقارنة أداء جنبا إلى جنب لخطوط أنابيب الاتصال المتحورة في المناطق الجينومية عالية الضوضاء. تم إجراء تقييم المقارنة عبر مناطق التغطية المنخفضة (<30x) لتقييم أداء مرشح DFT المعتمد على الفيزياء في القضاء على ضوضاء التسلسل وحماية الإشارات الموجبة الحقيقية مقارنة بتكوينات الخوارزميات القياسية. الاختصارات: DFT = تحويل فورييه المتقطع. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول
الجدول 5: المعاملات الحركية الكمية والتغيرات المستقرة في إشارات JAK-STAT في المراحل اللاحقة. ملخص حدود محاكاة الخصوم التفاضلية ومحاكاة جيليسبي العشوائية على مدى 720 دقيقة، يبرز فشل التوهين الخلوي التوازن الذاتي في النماذج التي تحمل تغيرات STING1 و TYK2 الممرضة. الاختصارات: JAK-STAT = محول وتنشيط النسخة الإشارة جينوس كيناز؛ ODE = المعادلة التفاضلية العادية؛ STING1 = محفز استجابة الإنترفيرون، المتفاعل cGAMP 1؛ TYK2 = كينازين التيروسين 2. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول
الجدول الإضافي S1. مجموعة بيانات على مستوى المريض لمجموعة الأطفال التي تحتوي على متغيرات مرتبطة بالاعتلال التداخلي. يوفر الجدول بيانات على مستوى المريض التي تتوافق مع المجموعة النهائية المكونة من 132 مريضا تم تحليلها في المخطوطة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول تجزئة الحمض النووي، وربط المحول، وتضخيم PCR، وتدوير الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). خلال هذه المراحل، يكون التنفيذ الدقيق ضروريا لتقليل خطر التلوث. غسلات الإيثانول الدقيقة وأوقات الحضانة المغناطيسية المناسبة أثناء التنقية المعتمدة على الخرزات أمر إلزامي، حيث قد تؤدي الانحرافات إلى تقليل عائد المنتج أو فقدان اكتشاف المتغيرات. خلال التحضير المجمع للمكتبة، يتطلب الأمر حسابا دقيقا يبلغ 93.75 نانوغرام لكل مريض وضبط حجم دقيق.
لتحسين البروتوكول وحل المشكلة، قد تتطلب قياسات القياس الفلورومتري المنخفضة، خصوصا تركيزات ssDNA أقل من عتبة 0.8–2 نانوغرام/ميكرولتر، زيادة عمق التسلسل أو تقصير أوقات جفاف الحبيبات لتحسين حساسية النداء المتغير. في حالات المشتبه بوجود متغيرات فسيفسائية، قد يعزز دمج تقنيات التسلسل طويل القراءة دقة الكشف. بالإضافة إلى ذلك، فإن النقل السريع للعينات إلى الجليد بعد الهضم الإنزيمي أمر حاسم للحفاظ على استقرار المنتج12,13. أثناء تحضير DNB، يحافظ الوضع البطيء واللطيف، إلى جانب الإضافة الدقيقة لمخزن التوقف على سلامة الكرات النانوية. وهذا مهم بشكل خاص لتحديد الارتباطات بين النمط الجيني والظاهري في حالات التداخل المبكر مثل SAVI 6,11.
يوفر هذا التحليل الجيني القائم على WES إطارا لتقييم المتغيرات المرتبطة بالاعتلال التداخلي لدى المرضى الأطفال الذين يعانون من الخصائص الالتهابية الذاتية والتهاب الأوعية الدموية. من خلال تحديد المتغيرات في الجينات الرئيسية مثل DNASE1، ADAR، STING1، RNASEH2A/B/C، TREX1، SAMHD1، وCOPA، تبرز الدراسة التباين الجيني الكامن وراء الأنماط الوعائية المدفوعة بالإنترفيرون. تكرار المتغيرات في أيض الأحماض النووية وجينات الاستشعار، وخاصة DNASE1 وADAR، في هذه الدفعة، يتوافق مع الدور المركزي لإشارات الإنترفيرون من النوع الأول غير المنظمة في مسببات أمراض الأوعية الدموية لدى الأطفال والأمراض الالتهابية الذاتية. تتوافق هذه النتائج مع تقارير سابقة تربط هذه الجينات بالاعتلاليات التداخلية والمظاهر الأوعية الدموية 4,5,7.
من خلال توضيح العروض الشبيهة بالتهاب الأوعية الدموية لمتلازمات الالتهاب الذاتي أحادية الجين، مثل تورط الرئة الجلدي والبيني الذي لوحظ في SAVI، قد يسهل هذا النهج التشخيص المبكر ويساعد في توجيه العلاجات المستهدفة بمضادات الإنترفيرون 4,5,7. يمكن للاعتلاليات التداخلية الأحادية أن تحاكي سريريا التهاب الأوعية الدموية المرتبط ب ANCA وغيرها من الأوعية الدموية في الطفولة، مما يبرز أهمية الاختبارات الجينية في الحالات غير النموذية أو المقاومة للعلاج 9,10,11. قد يمكن التشخيص الجيني المبكر أيضا من بدء علاجات مستهدفة في الوقت المناسب مثل مثبطات JAK، التي أظهرت فائدة سريرية لدى مرضى STING1 وطفرات أخرى مرتبطة بالإنترفيرون 7,13,14.
تعزز هذه الدراسة أيضا أن نسبة كبيرة من المرضى الأطفال الذين يعانون من التهاب الأوعية الدموية الذاتي المعقد يحملون متغيرات نادرة أو جديدة في جينات مرتبطة بالاعتلال التداخلي. تحديد 79 متغيرا جديدا في هذه المجموعة الكبيرة يوسع الطيف الجيني المعروف وقد يساهم في تحسين الارتباطات بين النمط الجيني والنمط الظاهري في التهاب الأوعية الدموية في الأطفال.
من الاعتبارات التشغيلية في هذا السير الاستكشافي تقييم حدود العتبة، حيث قد تؤثر الانحرافات في معلمات SNR الاستكشافية على مخرج الترشيح. على سبيل المثال، يساعد الترشيح القائم على DFT لتوزيعات النيوكليوتيدات في إزالة الضوضاء من القراءات لكنه يتطلب معايرة لتجنب الإفراط في تنعيم إشارات الطفرة؛ يشمل استكشاف الأخطاء تعديلا تكراريا لمعلمات التعيين الثنائية (0 للبيورينات، 1 للبيريميدينات) لتحسين استخراج الميزات15. في النمذجة الفيزيائية الحيوية، من الضروري تحديد الظروف الأولية للمتعادلات التفاضلية التفاضلية، حيث يمكن أن تغير الاضطرابات الصغيرة في معدلات التضخيم سلوكيات العتبة، مما قد يقلل من تقدير إشارات الإنترفيرون المستمرة. تشمل تفاصيل JAK-STAT المحسنة نمذجة دور TYK2 في إشارات IFN-α، حيث تعزز متغيرات كسب الوظيفة تنشيط STAT2، مما يؤدي إلى أنماط الاعتلال التداخلي20.
قد تشمل التعديلات على الطريقة دمج العناصر العشوائية للبيئات الخلوية الصاخبة، مثل إضافة مصطلحات ضوضاء لانجفين إلى المعادلات التفاضلية التفاضلية:
dX = f(X)dt + g(X)dW
حيث يمثل المصطلح dW ضوضاء عملية وينر، مما يعزز الواقعية في محاكاة تقلبات JAK-STAT21. تلتقط المحاكاة العشوائية لمسارات الإنترفيرون، باستخدام خوارزميات جيليسبي، التباين في تعبير IFN-β بسبب حلقات التغذية الراجعة السلبية، حيث تؤدي الفروق بين الخلايا في مستويات عوامل النسخ إلى توزيعات ثنائية النمط لتفعيل ISG22,23. يتضمن استكشاف الأخطاء في نماذج المسارات التحقق من البيانات التجريبية من IFN-β؛ إذا تباعد التضخيم، يمكن إعادة معايرة الضوابط السلبية مثل معدلات تنشيط الفوسفاتاز، أو تضمين التأخيرات الموزعة للنسخ:
مع نواة غاما للعمليات المؤجلة.
مقارنة بتسلسل الجينوم الكامل (WGS)، قد يكون هذا النهج المركز على WES فعالا من حيث التكلفة لكنه أقل شمولا للمناطق غير الخارقة 24,25. يقتصر نطاق هذا الإطار الأولي على توفير نموذج محاكاة كيميائي حيوي داعم لتقييم كيفية ارتباط التغيرات الرياضية بسلوك الإشارات الإشارية المقدرة بالإنترفيرون، كما يظهر في نماذج العتبة حيث تتجاوز التأثيرات التراكمية القيم الحرجة مما يؤدي إلى إصابة الأوعية الدموية. تشمل قيود الطريقة إمكانية التغاضي عن متغيرات الفسيفساء منخفضة المستوى والحاجة إلى التحقق الوظيفي من النتائج الجديدة6.
لهذه التقنية تطبيقات محتملة في علم المناعة والطب الوعائي، بما في ذلك توجيه علاجات مضاد الإنترفيرون من خلال محاكاة تأثيرات المتحورات على المسارات وإثراء قواعد البيانات لتشخيصات الأمراض النادرة19. قد تمكن الامتدادات العشوائية من التنبؤ بالاستجابات غير المتجانسة في الاعتلاليات التداخلية، مما يساعد في الطب الشخصي.
في هذه الدراسة، يتم التأكيد على التقييم الجيني لالتهاب الأوعية الدموية للأطفال إلى جانب الأدوات التشخيصية التقليدية مثل علم الأمراض النسيجي ووسائل التصوير. بشكل عام، تبرز هذه الدراسة أهمية التقييم الجيني في التهاب الأوعية الدموية لدى الأطفال مع التأكيد على تكرار المتغيرات المرتبطة بالاعتلال التداخلي التي تم اكتشافها بين المرضى الذين يخضعون لتحليل جيني لأمراض الالتهاب الذاتي المشتبه بها. من خلال تقييم تأثير هذه المتغيرات على مسارات إشارات الإنترفيرون وتأكيد أهمية التشخيص المبكر لالتهاب الأوعية الدموية لدى الأطفال، يساهم هذا العمل في إثراء قواعد بيانات الأمراض النادرة المتعلقة بالاضطرابات الوعائية والالتهابية الذاتية ويوفر رؤى للدراسات المستقبلية التي تحقق في المرضية المتغيرة وتعدد أشكال السكان.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.
شكر وتقدير
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يشكر المؤلفون فريق روماتيزم الأطفال، ووحدة الوراثة السريرية، والمتعاونين في المعلوماتية الحيوية على مساهماتهم في تقييم المرضى، وجمع البيانات، والدعم الفني طوال فترة الدراسة. نحن أيضا ممتنون للمرضى وعائلاتهم على مشاركتهم وتعاونهم. وقد دعمت التحليلات الحاسوبية بنية تحتية بحثية مؤسسية وتعاون متعدد التخصصات بين فرق البحث السريري والجزيئي.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Pipettes قابلة للتعديل (P2، P10، P20، P200، P1000) | أي مورد | لمعالجة السوائل بدقة | |
| الطرد المركزي المكتبي | أي مورد | للطرد المركزي لفترة قصيرة لأنابيب PCR | |
| مزيج مكتبة Equinox Amp | MGI Tech/ NEB | 7K0014-096 (أو ما يعادله) | مزيج رئيسي لتضخيم PCR |
| الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية) | أي مورد | يستخدم لتحضير محلول غسل الإيثانول بنسبة 80٪ | |
| IVT Primer 1 & IVT Primer 2 | MGI Tech | مدرج في المجموعة أو منفصل | برايمر تضخيم المكتبة |
| أنابيب PCR منخفضة الالتصاق (0.2 مل) | أي مورد | أنابيب PCR معقمة | |
| حامل مغناطيسي / حامل مغناطيسي | أي مورد | لفصل الخرزات المغناطيسية | |
| MGI DNBSEQ-G400 | MGI Tech Co., Ltd. | 900-000641-00 | جهاز تسلسل الجيل التالي على المكتب باستخدام تقنية DNBSEQ (تسلسل الكرة النانوية الحيوية)؛ يدعم أطوال القراءة المتعددة (مثل SE50 إلى PE300)؛ ناتج عالٍ يصل إلى 1440 جيجابايت لكل تشغيل؛ مثالي لتطبيقات WES وWGS والتسلسل المستهدف. |
| MGIEasy Circularization Kit | MGI Tech Co., Ltd. | 1000020570 (Dual Barcode، 16 RXN) أو 1000005260 (V2.0) | مجموعة دائرنة لتوليد الحمض النووي الدائري أحادي الشريط (ssCirDNA)؛ تعمل نسخة الباركود المزدوج على تقليل قفزة الفهرس؛ خطوة أساسية بعد تحضير المكتبة لتشكيل DNB في سير عمل التسلسل MGI. |
| MGIEasy DNA Clean Beads | MGI Tech Co., Ltd. | 1000005279 | خرزات مغناطيسية لتنقية الحمض النووي |
| MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit | MGI Tech Co., Ltd. | 1000020570 (مدموج مع Dual Barcode Circularization) أو DNB Make ذات الصلة (مثل 940-000036-00 Onestep DNB) | وحدة تحضير الكرة النانوية الحيوية (DNB)؛ يشمل التدوير وإنشاء الكرة النانوية لتحميل خلية التدفق؛ الخطوة النهائية في معالجة المكتبة لأجهزة تسلسل DNBSEQ (غالبًا ما يتم دمجه مع مجموعة Circularization). |
| MGIEasy Exome Capture Accessory Kit | MGI Tech Co., Ltd. | 1000009657 (أو ما يعادله) | يحتوي على محلول حظر، عوامل حظر عالمية MGI، عامل تقوية، مخزن ربط، مخزن غسل 1 & 2، وخرزة Steptavidin |
| MGIEasy Exome Capture V4 Probes (أو Twist CES Probes، متوافقة مع MGI/DNBSEQ) | MGI Tech Co., Ltd. (لـ MGIEasy) أو Twist Bioscience (لـ Twist) | 1000007745 (مجموعة V4 Probe، 16 RXN) أو 1000007740 (البروبات)؛ Twist: مخصص / مخصص للوحة (يستند إلى الطلب، لا يوجد رقم قياسي) | بروبات التقاط الإكسوم الكامل على أساس التهجين؛ تستهدف المناطق المشفرة (~ 59 ميغابايت) (CCDS، RefSeq، GENCODE، miRBase)؛ مصممة لإثراء عالي الكفاءة في سير عمل WES على منصات DNBSEQ؛ تستخدم مع مجموعة MGIEasy الإضافية للتهجين (تحضين مسبق عند 65°C، 16 ساعة بين عشية وضحاها عند 65°C)، إضافة حاجز، التقاط خرزات Steptavidin (مخزن الربط، مخزن غسل 1/2 عند 48°C)، الانحلال، وتضخيم PCR بعد التقاط (متوافق مع مزيج Equinox). |
| MGIEasy Fast Hybridization and Wash Kit | MGI Tech Co., Ltd. | 940-001974-00 (16 RXN) | كواشف التهجين والغسل |
| MGIEasy FS DNA Library Prep Kit | MGI Tech Co., Ltd. | 1000006987 (مجموعة 16 RXN) أو 1000005256 (مجموعة أساسية 96 RXN) | مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي سريعة التجزئة؛ التجزئة الأنزيمية مع مدخلات الحمض النووي الجيني 5–400 نانوجرام؛ متوافق مع منصات DNBSEQ لبناء فعال لمكتبة WGS/WES. |
| ماء خالٍ من النوكليز | أي مورد | درجة البيولوجيا الجزيئية | |
| مجموعة Qubit dsDNA HS Assay | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | لتقدير الكمية للمكتبة |
| مجموعة Qubit ssDNA Assay (اختياري) | Thermo Fisher Scientific | Q10212 | لتقدير الكمية للحمض النووي أحادي الشريط بعد التدوير |
| خرزات Steptavidin المغناطيسية | MGI Tech | مدرج في مجموعة الملحقات | للالتقاط الهجين |
| TE Buffer (pH 8.0) | أي مورد | لخطوة التنaturation | |
| جهاز التدوير الحراري | مختلف (Bio-Rad، Thermo، إلخ) | يستخدم للتفتيت، الربط، PCR، وبرامج DNB | |
| خلاط Vortex | أي مورد | لخلط العينة | |
| نصائح Pipette عريضة الفتحة | أي مورد | مطلوبة لتحضير DNB |
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن