تقييم لحظي وغير جراحي لوظيفة الميتوكوندريا باستخدام مطيافية رامان الرنين

ملخص

نقدم طريقة غير جراحية في الوقت الحقيقي لمراقبة صحة الميتوكوندريا باستخدام مطيافية رامان الرنين (RRS). استخدمنا نظام RRS لقياس حالات الأكسدة والاختزاز في الميتوكوندريا وطورنا مقياسا لصحة الميتوكوندريا، وهو نسبة الميتوكوندريا المخفضة بالرنين (3RMR)، والذي يظهر استجابة أسرع لتغيرات الأكسجة مقارنة بتحليل غازات الدم التقليدية.

الملخص

على الرغم من أن الميتوكوندريا مركزية في المرض وتكوين المرض، إلا أن الفهم الميكانيكي لديناميكيات صحة الميتوكوندريا لا يزال مكلفا وغير متاح. لسد هذه الفجوة، تستخدم هذه الدراسة مطيافية رامان الرنين (RRS) لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، باستخدام نظام محمول يقدم قياسات فورية وغير جراحية وكمية لحالات الأكسدة السيتوكرومية في كبد الفئران. في هذا البروتوكول، نعرض استخدام هذه التقنية، بما في ذلك الإعداد، وجمع البيانات، ومعالجة البيانات. تقدم هذه الدراسة تجربة إثبات مفهوم تبرز قدرة RRS على قياس التغيرات اللحظية في حالة الأكسدة والاختزاز للميتوكوندريا – وبالتمديد، وظيفة الميتوكوندريا. لفترة وجيزة، تم توصيل جهاز RRS بمضخة ليزر بالإضافة إلى كمبيوتر جمع البيانات ووضع على بعد 1 سم من كبد الجرذ.  تم اختيار معايير الاستحواذ وفقا لبروتوكول كبد الفئران؛ تم قياس حالات الأكسدة والاختزاز في ظروف مؤكسجة وإقفاري باستخدام اختبار إجهاد الأكسجين. تم تتبع التغيرات في حالات الأكسدة الميتوكوندرية طوال اختبار إجهاد الأكسجين.

المقدمة

تلعب الميتوكوندريا دورا حيويا في وظيفة الخلايا والتوازن الخلوي. الميتوكوندريا هي المحركات الرئيسية لاستقلاب الخلايا، حيث تنظم توليد ATP عبر الفسفرة التأكسدية. كما أنها تعمل كعضيات إشارة تحدد مصير الخلية من خلال تنظيم مسارات الاستماتة، بالإضافة إلى إشارات ROS وCa^{+2 1}. لذا، يمكن أن يؤدي خلل الميتوكوندريا ^{إلى أمراض} تنكسية عصبية وعضلية وقلبية وعائية متنوعة^. على الرغم من الدور الحاسم الذي تلعبه الميتوكوندريا في تقدم الأمراض، إلا أن تقييم وظيفة الميتوكوندريا قد يكون غازيا ومكلفا ومحدودا.

يتم قياس المؤشرات الرئيسية لوظيفة الميتوكوندريا، مثل معدل استهلاك الأكسجين، والفسفرة التأكسدية، ونشاط المجمعات المختلفة ضمن سلسلة نقل الإلكترونات (ETC)، من خلال قياس التنفس الصناعي. يتكون ETC من أربعة مجمعات (I–IV) مدمجة في الغشية الداخلية للميتوكوندريا (IMM). تنقل هذه المجمعات، بمساعدة إنزيمات مساعدة أخرى، الإلكترونات من ركائز مختزلة مثل NADH وFADH2 إلى المستقبل النهائي للإلكترونات، O₂، الذي يختزل بعد ذلك إلى ماء. تتطلب معظم اختبارات قياس التنفس المعاصرة، مثل Seahorse وOrobros O2k، معالجة الأنسجة، مما يحد من تطبيقها في البحث الانتقالي ^4,5. قياس جهد الغشاء الميتوكوندري (MMP) هو طريقة أخرى لتقييم خلل الميتوكوندريا، تستخدم الفلوروفورات الكاتيونية المحبة للدهون مثل JC-1، إلى جانب التصوير المجهري، حيث تتفلور الميتوكوندريا المتزاوجة (الصحية) وغير المترابطة (التالفة) بأطوال موجية مختلفة⁶. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الاختبارات منخفضة الحساسية⁵. الصبغة نفسها يمكن أن تكون ذات سمية عالية عند^{تركيزات} عالية. وأخيرا، وبطريقة مشابهة لقياسات قياس التنفس، تتطلب هذه التقنية أيضا معالجة الأنسجة. تم مؤخرا استخدام تقنيات تعتمد على التحليل الطيفي كطرق غير جراحية لتقييم صحة الميتوكوندريا. على سبيل المثال، تم استخدام مطيافية الرنين المغناطيسي للفوسفور (P-MRS)، وهي طريقة تقيم الأيض الخلوي من خلال قياس تركيزات المستقلبات المحتوية على الفوسفور، لتوصيف الأنسجة الدهنية الهندسية التي تخضع للتمايز⁷. ومع ذلك، تتطلب هذه التقنية أيضا معدات وتدريبا متخصصا.

أظهرت مجموعتنا مؤخرا تقنية فورية، غير جراحية، ومحددة للغاية لقياس حالة الأكسدة الميتوكوندرية كمؤشر على بقاء الأعضاء باستخدام مطيافية رامان الرنين (RRS). يستخدم RRS التشتت غير المرن للفوتونات لقياس حالات الأكسدة الاختزالية للسيتوكروم الميتوكوندرية. حلقات البورفيرين في أجزاء الهيم من جزيئات مثل السيتوكروم الميتوكوندرية، والهيموغلوبين، والميوغلوبين تنتج طيف رامان مميز يعتمد على حالة أكسدتها عند إثارتها بليزر بطول موجة 441 نانومتر⁸. على الرغم من أن نظام RRS يستخدم طول موجي 441 نانومتر، إلا أنه يمكن أيضا استخدام ليزرات بأطوال موجية 420 نانومتر و405 نانومتر، وكل منها يعزز بشكل تفضيلي مركب سيتوكروم مختلف. يتم مقارنة الطيف المستخرج من عينة غير معروفة محل اهتمام مع مكتبات مسجلة مسبقا للميتوكوندريا السليمة المؤكسدة بالكامل أو المختزلة، مما ينتج نسبة الميتوكوندريا المختزلة إلى الكلية أو متوسط حالة الأكسدة الاختزالية لسيتوكروم ETC في الموقع . تعرف هذه النسبة بأنها نسبة رامان الميتوكوندرية المختزلة بالرنين (3RMR).

هناك 3 حسابات/أنواع مميزة من 3RMR: 3RMR الميتوكوندري (mito-3RMR)، 3RMR المركب III (cIII-3RMR)، والثلاثي RMR المركب IV (cIV-3RMR). يتم حساب كل من هذه المؤشرات من خلال نسبة تقليل إلى العدد الكلي لمكون معين. على سبيل المثال، سيكون 3RMR ل cIII هو نسبة العدد الإجمالي للcIII في النسيج (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). وينطبق نفس النمط على cIV. لذا، يشير 3RMR-cIII إلى نسبة cIII المختزل إلى إجمالي مقدار cIII، ويشير 3RMR-cIV إلى نسبة cIV المختزل إلى إجمالي مقدار cIV. من خلال تحليل الانحدار، إما أن حالات الأكسدة الاختزالية الميتوكوندرية (ميتو-3RMR) تحسب باستخدام مكتبات طيفية للميتوكوندريا السليمة، أو يتم حساب حالات الأكسدة الاختزالية المعقدة الفردية (cIII-3RMR و cIV-3RMR) باستخدام مكتبات الطيفية cIII و cIV. أظهر منشور^{حديث بعنوان 9} أن ميتو-3RMR يمثل المتوسط المرجح لحالات الأكسدة الاختزال cIII و cIV (أو cIII-3RMR و cIV-3RMR). من المهم ملاحظة أن cI و cII ليسا نشطين في رامان أو معززانين رنينا عبر طول موجي 441 نانومتر. وبالتالي، لا يتم حسابها عند حساب ميتو-3RMR.

وباستخدام هذه الأنواع من 3RMR، كنا نحدد النطاق الأمثل ل 3RMR. في الأعضاء "الصحية"، تبقى الميتوكوندريا سليمة ولديها إمداد كاف من الأكسجين. على النقيض من ذلك، قد لا يكون لدى الأعضاء التالفة توصيل أو استخدام كاف للأكسجين، مما يؤدي إلى تراكم الإلكترونات في مجمعات ETC. تراكم الإلكترونات يسبب "إجهاد اختزالي"، حيث ينقل الميتوكوندريا من الحالة المؤكسدة إلى الحالة المختزلة ويزيد من قيم 3RMR. بدأت عدة دراسات^{8، 9، 10، 11، 12} تتراوح بين القلوب والكبد في نماذج القوارض والخنازير، في تسليط الضوء على النطاق الأمثل "الصحي" ل 3RMR، والذي يقترح أن يكون بين 10 و30. على سبيل المثال، تعرض بيري وآخرون قلوب الثدييات لنقص الأكسجين، حيث أظهر معدل 3RMR بنسبة 30٪ أنه يوفر التوازن الأمثل للحساسية والنوعية للكشف عن نقص الأكسجين⁸. وقد تم تأكيد هذا الاتجاه بشكل أكبر في دراسات إضافية على أنسجة القلب^{11، 12}، وترقيعات الكبد¹⁰. بالإضافة إلى ذلك، أظهر نيوجين وآخرون ^أن قيم 3RMR تنخفض إلى قيم منخفضة جدا (مؤكسدة) للأنسجة التي توقف فيها الأيض، مع مستويات 3RMR (7.667 ±± 4.926) في الكبد الدافئ الإقفاري غير القابل للزرع بعد 3 ساعات من التروية الآلية الطبيعية، مقارنة بقيم 3RMR فوق 10 (~12–15) للكبد الدافئ الإقفاري الطازج^{والقابل} للزرع 9.

بعيدا عن هذه العروض حول كيفية قياس 3RMR لجدوى الأنسجة، فإن حساسية وخصوصية وسهولة استخدام RRS تجعله قابلا للتطبيق العالي على العديد من أنواع الأبحاث الأخرى التي تتأثر فيها الأيض الخلوي ووظيفة الميتوكوندريا. في دراسات سابقة، تم استخدام RRS للكشف عن التنكس البقعي والزرق في الفئران من خلال تقييم النشاط الأيضي لمحاور عصبي العقدة الشبكية غير الميليلين عند رأس العصب البصري¹³. بالإضافة إلى ذلك، استخدم للكشف عن تثمر الشريان الأبهر (CoA) في نموذج الفئران لمرض القلب الخلقي، وهو تشخيص غالبا ما يغفل^في فحوصات القلب للمواليد الجدد. تم الاستفادة من هذه التقنية لفهم وظيفة الأعضاء وقدرتها على البقاء تحت ظروف تجريبية مختلفة ذات صلة في مجال زراعة الأعضاء، بما في ذلك الدراسات التي تقيم صلاحية الأعضاء على نظام التروية خارج الجسم ^10,11، أو تقييم إعادة الأكسجة بعد التخزين البارد الساكن¹⁴، أو التخفيف من إصابة إعادة التروية في الكبد الدافئ الإقفاري 9.

تسعى هذه الورقة إلى إثبات أن RRS أداة حساسة وفورية لتقييم صحة الميتوكوندريا. تم تعريض الكبد الكامل من نموذج الجرذان لمستويات متفاوتة من نقص التروية وإعادة تروية الأكسجين كاختبار إجهاد لتقييم استجابة الميتوكوندريا. في اختبار إجهاد الأكسجين هذا، يتعرض الكبد الطازج لتدفق تروية أولي لمدة 5 دقائق، و5 دقائق من نقص التروية، و5 دقائق من إعادة التروية. تم إجراء قياسات 3RMR، بالإضافة إلى اللاكتات، وK+، وضغط جزئي للأكسجين (pO2) طوال اختبار الإجهاد. لوحظ استجابة أسرع لتغيرات الأكسجة باستخدام 3RMR مقارنة بالمحللات التقليدية للغازات الدموية. من خلال هذه التجارب، يتم تسليط الضوء على استخدام RRS ليس فقط للدراسات الميكانيكية، بل أيضا كطريقة تشخيصية بالإضافة إلى كونه منصة اختبار علاجية. لذا، قد يكون البروتوكول المشترك مفيدا لمجموعة متنوعة من الباحثين العاملين في مجال الميتوكوندريا. بشكل عام، يمكن أن يكون لمرض RRS، بطبيعته غير الجراحية والفورية والمحددة للغاية، تأثير كبير على الأيض الخلوي.

البروتوكول

تم الحفاظ على جميع الحيوانات في التجارب وفقا لإرشادات المجلس الوطني للبحوث وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في مستشفى ماساتشوستس العام (بوسطن، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية).

1. إعداد واستخدام RRS

1. وصف الجهاز:
   ملاحظة: نظام RRS المحمول (شركة Pendar Technologies؛ المنتج لأغراض البحث فقط) يستخدم ليزر 441 نانومتر بسبب تعزيز رنين طيف رامان من السيتوكروم الميتوكوندرية مع هذا الطول الموجي. يعمل الليزر بين 4 مللي واط و8 ميغاواط.
   1. توصيل مصدر إثارة ليزر بمسبار مخصص عبر كابل ألياف بصرية. يضيء المجس بقعة ليزر قطرها 2 مم على النسيج، ويجمع الطيف المنبعث. يمر الطيف بعد ذلك عبر مرشح تمرير النطاق ويتم جمعه بواسطة مصفوفة جهاز مرتبط بالشحنة (CCD). يتم جمع الطيف كل ثانية على مدى 180 ثانية ويحسب متوسطا لإنشاء طيف خام منخفض الضوضاء للتحليل.
   2. يقارن البرنامج هذا الطيف المحصل على المكتبات الطيفية المقاسة مسبقا من خلال تحليل الانحدار.
2. إجراء المكتبات المسبقة للتسجيل
   ملاحظة: في التجارب المقدمة في هذه الورقة، تم إنشاء واستخدام مكتبات الميتوكوندريا المركبة والثالثة المركبة وIV والهيموغلوبين والميوغلوبين. تم التقاط إشارات RRS لجميع المكتبات في صندوق أسود عند درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية). يتم توفير هذه الملفات المكتبية مع برنامج التحليل بشكل منفصل. ومع ذلك، اعتمادا على النسيج المعني ووجود جزيئات أخرى نشطة في الرامان، يمكن إنشاء مكتبات أخرى أيضا من خلال تكييف البروتوكول التالي بشكل مناسب. تتوفر أطياف RRS الخام للهيموغلوبين والميوغلوبين ومكتبات III/IV المركبة المؤكسدة/المختزلة في الشكل 1 الإضافي.
   1. مكتبات الهيموغلوبين (الشكل الإضافي 1C):
      1. اجمع دم القوارض الطازج عن طريق تفريغ الدماء من الحيوانات. أكسجت الدم المجمع باستخدام 100٪ أكسجين، أو إزالة أكسجته باستخدام 100٪ نيتروجين، في كوفيت زجاجي، مع إضافة ثنائي الصوديوم ديثيونيات.
      2. قس RRS لكل حالة عبر جدار الكوفيت الزجاجي لمدة 10 دقائق، مع وضع مسبار RRS على بعد 9 مم من الكوفيت الزجاجي.
      3. استخدم القمم الطيفية عند 1356 ^سم-1 للتحقق من الحالة غير المؤكسجة، واستخدم القمم عند 1376 ^سم-1 لتأكيد الحالة المؤكسجة.
   2. مكتبات الميتوكوندريا المخفضة/المؤكسدة (الشكل 1)
      1. عزل الميتوكوندريا من قلوب القوارض المتجانسة والنقية في كوفيت زجاجي. ضع مسبار رامان على بعد 9 مم من الكوفيت الزجاجي وقس أطياف هذه الميتوكوندريا عبر جدار الزجاج.
      2. خلق ظروف مؤكسدة بالكامل من خلال توفير تدفق أكسجين بنسبة 100٪ إلى الميتوكوندريا. تحقق من الحالة المؤكسدة من خلال غياب ذروة RR المخفضة عند 1357 ^سم-1.
      3. خلق ظروف مخفضة بالكامل عن طريق تعريض الميتوكوندريا ل 100٪ نيتروجين مع كميات صغيرة من كبريتيد الهيدروجين. تحقق من الحالات المختزلة من خلال غياب ذروة مؤشر RR المؤكسد عند 1371 ^سم-1.
   3. المركب المؤكسد/المختزل III/IV (الشكل الإضافي 1A,B):
      1. عزل المجمع الثالث والرابع كما هو موصوف في أماكن أخرى 9,15,16,17. باختصار، استخدم عينة مخزونية من الميتوكوندريا المعزولة (تعادل 200 نانومول من السيتوكروم أ) كمادة بداية.
      2. تخفيف الميتوكوندريا إلى 10 نانومول من السيتوكروم A/mL في العزل C البارد جدا (50 ملليمول تريس، 1 ملليمولار MgSO_4، الرقم الهيدروجيني 8.45). ثم أضف 10٪ مع الحمض n-β-D-dodecyl مالتوسيد (DM) قطرة قطرة قطرة إلى تركيز نهائي 1٪، مع الخلط بلطف على الثلج.
      3. قم بعمل الطرد المركزي بجهاز الطرد المركزي عند 40,000 × جرام لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. طبق المادة الفائقة على عمود زجاجي بقطر 2.5 سم × 20 سم تم تعبئته سابقا براتنج تبادل متوازن مع 5 أعمدة من حجم المخزن C (يحتوي على 0.02٪ w/v DM).
      4. بعد الغسل بحجمين عمودين من المخزن C، تقوم بتركيب مركبات الميتوكوندريا المائلة بتطبيق تدرج NaCl خطي من 0 إلى 400 ملمول في نفس المخزن المؤقت وتجمع المائل في كسور 4 مل.
      5. الكسور الخضراء التي تحتوي على المركب الرابع كانت تخرج بالقرب من منتصف التدرج (~180 مل NaCl)، قبل الكسور الحمراء التي تحتوي على المركب III. تركيز الكسور المجمعة التي تحتوي على كل مركب في 20–30 نانومول من السيتوكروم a/mL.
      6. بمجرد عزل المجمعات الفردية، تعرض كل منهما لظروف مؤكسدة ومختزلة. تقليل عينة 11 مللي مولار من Complex III في مخزن Tris باستخدام 2 مل من الأسكوربات (1 M) لتقليل السيتوكروم c1 و2 مل من HS (هيدروسلفيت) لتقليل السيتوكروم_{b و} b_H بالكامل.
      7. اختزال عينة 18.67 مللي مول من المركب الرابع في مخزن تريس على عدة خطوات، حيث يخضع المركب الرابع لعملية أكسدة حفازية متعددة الخطوات. لتقليل الخليط الكبير IV بالكامل، أضف جروتين من H₂O₂ (10 mM)، تليها 2 مل من HS.
      8. اجمع أطياف المكتبة بعد كل إضافة لالتقاط كل خطوة من الدورة. أضف أطياف مؤكسدة ومختزلة بالكامل إلى المكتبة المرجعية النهائية لتمثيل الحالات المستقرة للمركب الرابع.
      9. جهز جميع العينات في قارورة زجاجية بسعة 1 مل واحتفظ بها في وضع ثابت على بعد 9 مم من عدسة المجس ووضعها في صندوق أسود لمنع تلوث الضوء. اجمع أطياف RRS لمدة 600 ثانية لكل مركب وحالة أكسدة.
      10. التحقق من نقاء cIII وcIV المعزولين كما هو موصوف سابقا^{في 17}، والتحقق من كفاية مكتبات الطيف المعزولة cIII وcIV في تفسير الطيف الكامل للميتوكوندريا كما هو موصوف في ورقة حديثة⁹.
   4. مكتبات الميوغلوبين (الشكل الإضافي 1D):
      1. باستخدام تدفقات مماثلة من الأكسجين والنيتروجين (مع ثنائي ثيونيت الصوديوم المذاب)، تغير تشبع الأوكسيميوغلوبين في مستخلص الميوغلوبين القلبي بين 0٪ و100٪. تحقق من طيف رامان عبر قمم العلامات عند 1355 ^سم-1 و1376 ^سم-1.

ملاحظة: معظم المكونات الطيفية المفصلة أعلاه، مثل الهيموغلوبين أو الميتوكوندريا المؤكسدة/المختزلة، هي جزيئات تحتوي على هيم ويتم تحفيزها بنفس الطول الموجي. يتجنب هذا النظام تداخل الإشارات من خلال إنشاء مكتبة انحدار لكل جزيء بناء على إشارته الطيفية الفريدة. يتم تشغيل الأطياف المتناثرة التي تم الحصول عليها عبر خوارزمية انحدار ضد المكتبات المختارة. تعطي خوارزمية الانحدار عاملا لكل طيف مكتبة يمثل أفضل تقدير لمساهمته النسبية في الطيف المسجل، وبالتالي تركيزه النسبي في النسيج. نظرا لأن الخوارزمية تستخدم أفضل توافق عبر نطاق من أرقام الموجات، فإن الفروق الصغيرة في موقع أو شدة القمم الطيفية لمكونات المكتبة المختلفة تسمح للانحدار بتمييز حتى الكروموفورات ذات الصلة الوثيقة. من خلال خوارزمية الانحدار والمكتبات الطيفية، يمكن لنظام RRS تقسيم الإشارة الكلية المتناثرة إلى مكونات مختلفة حسب قمم الطيفية الفريدة، متجنبا تداخل الإشارة من جزيئات تحتوي على هيم. لإظهار العلاقة بين الهيموغلوبين والميتوكوندريا، تم تضمين الشكل التكميلي 2 ، الذي يوفر صورا للأطياف المأخوذة من تروية الكبد، والمقسمة إلى الإشارة المقاسة، وخط التوافق، والبقايا غير المفسرة الناتجة عن الاختلافات في القمم الطيفية الفردية. في اللوحة أ، يتم اختيار مكتبات انحدار الميتوكوندريا المختزلة والمؤكسدة والمختزلة والأكسدة. خط التوافق الأفضل الذي تم اختياره عبر المكتبات وتحليل الانحدار يتداخل بدقة مع الإشارة المقاسة، ولا يوجد الكثير من البقايا غير المفسرة. في اللوحة B، يتم اختيار مكتبات الميتوكوندريا المؤكسدة والمأخزة فقط. نظرا لوجود بنية متبقية كبيرة غير مفسرة، فإن الذروة الطيفية للميتوكوندريا تتحرك عدة أرقام موجية عن قمة الهيموغلوبين، التي لم تدرج في تحليل الانحدار. علاوة على ذلك، في الأشكال الإضافية لنغوين وآخرين^، يشرح المؤلفون العلاقة بين الميتوكوندريا والمركبات الفردية (cIII و cIV)، وكذلك العلاقة بين المجمعات^{الفردية 16}، حيث يظهر المركب III قمم أكثر حدة وأقل ترددا، بينما يظهر المركب IV نطاقات أوسع ومتزاحمة للأعلى. علاوة على ذلك، يظهر المؤلفون أن مكتبات المركب الثالث والمعقد الرابع المختزل تفسر بالكامل الطيف المقاس للميتوكوندريا الكاملة المختزلة، مما يؤدي إلى بقايا غير مفسرة قليلة.

الشكل 1: المكتبات الطيفية للميتوكوندريا المؤكسدة والمأخزلة بالكامل. تم الحصول على أطياف مكتبة RRS بعد تزويد الميتوكوندريا المعزولة ب (A) 100٪ أكسجين، أو 100٪ نيتروجين (B) للوصول إلى الحالات المؤكسدة والمختزلة على التوالي. تم تأكيد هذه الحالات بوجود قمم علامات RR (C) المؤكسجة ومنخفضة (D). يتوافق التحول في هذه القمم مع تغيرات في أنماط الاهتزاز الجزيئية في وجود الأكسجين. يتم تطبيع شدة كل قمة إلى وحدة شدة عشوائية واحدة (AU)، حيث يكون تعزيز الحالة المختزلة أكبر باستخدام هذا الطول الموجي البالغ 441 نانومتر من الإثارة هذا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. جمع البيانات باستخدام RRS

1. إعداد الجهاز:
   1. قم بتوصيل وحدة الطيف (الموجودة داخل صندوق مدمج) بمزود الطاقة للتيار المستمر (DC) وإلى محول الطاقة باستخدام الكابلات المرفقة. وحدة المقياس الطيفي تحتوي على قابس دائري واحد مع انبعاجات محاذاة.
   2. محاذاة الانبعافات في المقبس الدائري مع تلك الموجودة في الكابل الذي يتصل بمحول الطاقة. لا حاجة لتنظيف المجاري قبل توصيل المنافذ (الشكل 2).
   3. وصل الكمبيوتر الذي يجري التحليل بنفس محول الطاقة الذي يربط مقياس الطيف بمزود الطاقة باستخدام الكابلات المرفقة.
   4. ضع مسبار الليزر في حامل المجس. قم بضبط موقع هذا المسبار في بداية التجربة.
   5. افتح برنامج التحكم في مقياس الطيف (برنامج الطاقة الخلوية).
2. إعداد البرمجيات:
   ملاحظة: يتم توفير ملفات الإعدادات ومكتبات الانحدار لأنواع الأنسجة المختلفة مع النظام. تتضمن هذه الملفات معلومات عن المكتبات التي يجب أن يشملها نظام RRS في الانحدار، وعدد الأطياف المدرجة في نافذة الانحدار، ومعايير أخرى مثل طاقة الليزر. يمكن تغيير الإعدادات الافتراضية وحفظ ملف إعدادات جديد لاستخدامه في التجارب المستقبلية. لقطات الشاشة للبرنامج الموضح أدناه تعرض في الشكل الإضافي 3.
   1. عند فتح برنامج التحكم في المطياف، يظهر رسم بياني يعرض نسبة 3RMR، تشبع الأكسجين (StO₂) وتشبع الميوغلوبين. هذه الشاشة هي المكان الذي ستعرض فيه هذه المقاييس، إذا تم اختيارها، في الوقت الحقيقي طوال القياسات. انقر على تبويب الإعدادات في أسفل يسار الصفحة.
   2. تحت تبويب المعلومات ، أدخل معلومات الجلسة تحت اسم الجلسة، وأي تفاصيل ضرورية تحت تبويب وصف الجلسة .
   3. هناك وضعان لجمع البيانات. استخدم وضع الفحص الفوري لتجميع الأطياف حتى يتم تحقيق مقاييس الجودة المحددة (مثل نافذة الهدف أو الانحدار/عدد الأطياف)، ثم توقف عن التسجيل. استخدم الوضع المستمر لتسجيل الأطياف حتى يتم الضغط على زر التوقف. في كلا الوضعين، يتم تخزين جميع البيانات، سواء نتائج 3RMR أو الأطياف الفردية، تلقائيا. تستخدم هذه التجربة الوضع المستمر.
   4. بمجرد إدخال جميع معلومات الجلسة، انقر على تبويب النظام .
   5. تحت ملف الإعدادات، اختر البروتوكول المناسب للمشروع (لتروية كبد الجرذان اللاخلوي، اختر بروتوكول كبد الجرذان اللاخلوي ). سيقوم هذا بتعديل نوع القياس، ومتوسط طول القياس (نافذة الانحدار)، بالإضافة إلى الهدف المطلوب.
      1. لإنشاء ملف إعدادات جديد، قم بتعديل أي من المكونات الذكرة أعلاه، ثم اضغط على زر الحفظ . يجب أن تحفظ هذه المعايير كملف إعدادات منفصل يمكن استيرادها إلى النظام.
      2. لاستيراد ملف إعدادات جديد، انقر على القائمة المنسدلة بجانب الإعداد الافتراضي (التعديل) واختر استيراد ملف إعدادات جديد. انقر على ملف الإعدادات الجديد ليتم استيرادته.
   6. تحت مكتبات الانحدار، اختر وتأكد من تركيبة المكتبات المستخدمة في جمع البيانات والتحليل. تم اختيار مكتبات الميتوكوندريا المختزلة والمؤكسدة [ميتو فقط] لهذا التجربة. قد يختار مستخدمون آخرون استخدام مكتبات تشمل أيضا الهيموغلوبين أو الميوغلوبين أو مجمعات أخرى موجودة تحت المكتبة المتقدمة.
   7. اختر وتأكد من وضع عرض النافذة المفضل.
      1. وضع العرض التكيفي: استخدم وضع العرض التكيفي لإضافة طيف فردي إلى الطيف المتوسط حتى يتم الوصول إلى أقصى هدف سيغما. إذا لم يتم الوصول إلى هدف السيغما، يتوقف التسجيل عندما يصل إلى الحد الأعلى لنافذة الانحدار المحددة (أي الحد الأقصى لعدد الأطياف التي طلب منها تسجيلها). سيتم عرض نتائج القياس على الشاشة بعد تحقيق الحد الأدنى من هدف السيغما.
      2. وضع العرض الثابت: استخدم وضع العرض الثابت لإضافة أطياف فردية إلى الطيف المتوسط حتى يتم تضمين العدد المستهدف من الأطياف (يتم ضبطه تحت الطول المتوسط).
   8. بمجرد اكتمال إعدادات النظام، انقر على تبويب الحبكة .
   9. تحت السلسلة الرئيسية، اختر المكونات التي سيتم رسمها وعرضها على الشاشة أثناء القياسات.
   10. تأكد من أن جميع مكونات القياس المختارة تتماشى مع البروتوكول المطلوب.
3. جمع البيانات:
   ملاحظة: يجب أخذ قياسات رامان في مكان مظلم. قبل بدء جمع البيانات، تأكد من أن مساحة العمل محمية قدر الإمكان من الضوء. إذا لم يكن بالإمكان حماية الغرفة من الضوء تماما، فإن نظام RRS يأتي بغطاء أسود مع فتحة مستطيلة في المنتصف (موضح في الشكل 2)، يمكن من خلالها وضع مجسات الليزر. يمكن أن يغطي الصندوق العينة/الجزء من العضو الذي تؤخذ منه قياسات RRS. عند العمل مع ليزر RRS، تجنب التعرض المباشر أو المطول للعين. لا تسلط الليزر مباشرة على العين أو على الأسطح العاكسة. قم بتفعيل الليزر فقط عندما يكون موضوعا مباشرة على النسيج المطلوب. ليزر RRS هو ليزر من الفئة 3R عند استخدامه بقوة 4 مللي واط، ومن الفئة 3B عند استخدامه بقوة 10 مللي واط. الليزر آمن للاتصال بالأنسجة.
   1. اختر الإعدادات المحفوظة مسبقا المناسبة، ومعلمات التسجيل، وملفات المكتبة.
   2. ضع مسبار الليزر مباشرة فوق النسيج/العضو المعني. ضع المجس بشكل عمودي قدر الإمكان وعلى بعد 1 سم من النسيج. استخدم مسطرة لقياس بدقة 1 سم من سطح العضو. اضبط المجس ليكون أقرب من 1 سم إذا لم تكن الإشارة واضحة. ومع ذلك، تأكد من ألا يلمس المجس النسيج أبدا.
      ملاحظة: يمكن حمل المجس باليد، لكن ينصح باستخدام حامل أو حامل يمكن تعديله ويبقى مستقرا. ضع المجس بشكل عمودي قدر الإمكان وعلى بعد 1 سم من النسيج. يمكن استخدام مسطرة لقياس 1 سم بدقة من سطح العضو. يمكن ضبط المجس ليكون أقرب من 1 سم إذا لم تكن الإشارة واضحة. ومع ذلك، يجب ألا يلمس المجس النسيج أبدا.
   3. تأكد من أن النقطة الليزرية في الفص الجانبي الأيسر، بالقرب من الوريد البواب.
   4. تأكد من أن جميع المكتبات المحددة، وإعدادات الانحدار، ونظام الهدف سيغما، ونافذة الانحدار، وأنماط الاكتساب صحيحة وكما هو مرغوب فيها.
      1. تأكد من أن الغرفة مظلمة قدر الإمكان. تأكد من أن المجس لا يحتوي على أي تلوث، خاصة دم، على النافذة. في حالة التلوث، استخدم مناديل خالية من الوبر وغير كاشطة مع 70٪ كحول إيزوبروبيل لتنظيف نافذة الكوارتز، ثم تجفيفها جيدا بمسح جاف قبل المتابعة.
      2. في حالة التلوث الشديد، امسح المجس بأكبر قدر ممكن من الدقة كما هو موضح أعلاه. ثم معايرة الجهاز بوضع الليزر في حاوية مظلمة مبطنة بشريط أسود والضغط على زر Take Dark . تستغرق المعايرة حوالي 5–10 دقائق. بغض النظر عن التلوث، قم بمعايرة الجهاز مرة واحدة في الشهر، وسيرسل رسائل تذكير تلقائية.
         ملاحظة: شرح كل مقياس مراقبة جودة، أمثلة على هذه مقاييس مراقبة الجودة، والإشارة الطيفية الخام التي تم الحصول عليها من التسجيلات المثلى وغير المثالية (الملف التكميلي 1، الشكل 3، الشكل التكميلي 3). تم تحسين معايير مراقبة الجودة هذه للكبد الكامل من نموذج الفئران. أي بروتوكول جديد تم تطويره يستخدم نموذجا مختلفا للعضو/حيوان يجب أن يقوم بتحسين وتعديل هذه المقاييس وفقا لذلك.
   5. في الصفحة الرئيسية، انقر على زر ابدأ لبدء جمع البيانات. اعتمادا على الإعدادات المختارة، سيأخذ البرنامج التسجيلات حتى يتم الوصول إلى قيمة الخطأ المستهدفة (سيغما) أو 180 ثانية. اكتمل الآن جمع البيانات.
      1. استنتاج جودة إشارة RRS من هذه الرسوم والقيم للسماح بتعديل موضع المسبار أو ظروف القياس (الشكل 3). إذا لم تستوف إشارة RRS المستلزمة هذه المعايير لمراقبة الجودة، قم بضبط المجس ليكون عموديا قدر الإمكان وحوالي 9 مم من السطح إلى نافذة المسبار.
   6. بمجرد اكتمال جمع البيانات/البروتوكول التجريبي، تخلص من الكبد/الأنسجة بالكامل في صندوق مخاطر بيولوجية. نظف أي نظام أو سطح كان على اتصال بالعضو/الأنسجة بنسبة 70٪ إيثانول.
      1. إذا كنت تعمل مع نظام تفريغ، استخدم ماء DI ممزوجا بمنظف إنزيمي (7.8 مل مخفف في 1 لتر من ماء منزوع الأيونات [DI])، يليه ماء DI نظيف.
         ملاحظة: سيتم حفظ كل تسجيل كملف تحليل منفصل تحت ملف جلسة جديد. يتم رسم نتائج قوة إشارة الميتوكوندريا 3RMR وقوة الميتوكوندريا (r3RMR) في النافذة الرئيسية. يمكن أيضا عرض الطيف الخام. سيتم عرض مؤشرات فحص الجودة الأخرى، مثل قوة الإشارة المتبقية وقوة الإشارة الكلية، تحت تبويب Spectrum .
4. تحليل البيانات:
   1. بعد الانتهاء من جمع البيانات، انقر على مجلد المراجعة في أسفل الشاشة لفتح ملف التجربة ورؤية النتائج.
   2. بدلا من ذلك، افتح ملف نصي يحتوي على النتائج. اختر ملف الجلسة الذي يثير اهتمامك. سيتم فتح ملف تحليل يحتوي على جميع القياسات التي تم الحصول عليها. كل معلمة وقيمة سيغما الخاصة بها سيكون لها عمود خاص بها. على سبيل المثال، سيتم إدراج قيم 3RMR التي يتم الحصول عليها في كل ثانية تحت العمود "3RMR"، وقيمة سيغما تحت "sigma_3RMR".
   3. سيحتوي الصف الأخير من كل عمود على القيم النهائية لكل معلمة في ملف الجلسة ذاك. استخدم هذه القيمة للرسم.
   4. كرر الخطوات لكل ملف جلسة/كل تسجيل. تم الحصول على القيم حسب الرغبة.

الشكل 2: إعداد جهاز RRS. مخطط لإعداد نظام RRS. يتم توصيل المجس عبر كابل ألياف بصرية بنظام RRS، الذي يحتوي على مصدر الإثارة الليزرية ومطياف. ثم يتصل هذا الإعداد بأي لابتوب يحتوي على تطبيق التحكم في الطيف لجمع البيانات وتحليلها. كل من الكمبيوتر ووحدة الطيف متصلان بمقبس كهرباء. يجب أخذ قياسات RRS في الظلام. إذا لم يكن بالإمكان حماية الغرفة من الضوء تماما، يأتي نظام RRS مع غطاء أسود مع فتحة مستطيلة في المنتصف، حيث يمكن وضع مسبار الليزر. يغطي الصندوق العينة/الجزء من العضو الذي تؤخذ منه قياسات RRS. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: أمثلة على الآثار ومقاييس مراقبة الجودة لآثار الجودة دون المستوى والمسارات ذات الجودة المثلى. الإشارة المتبقية (الضوضاء) معلمة بقوس برتقالي، والإشارة الميتوكوندرية تحمل حوامل خضراء. (أ) مثال على تتبع إشارة رامان دون المستوى الأمثل. الإشارة المتبقية كبيرة جدا بحيث لا يمكن تمييزها عن الإشارة الميتوكوندرية. القمم الطيفية لا يمكن تمييزها طوال الإشارة المقاسة. (ب) مثال على تتبع إشارة رامان المثلى. الإشارة الميتوكوندرية أكبر بشكل واضح ومتميزة عن الإشارة المتبقية. القمم الطيفية من القياس المحصل يمكن تمييزها. (ج) مقاييس مراقبة الجودة التي تم الحصول عليها من كل إشارة. بشكل عام، الإشارة الكلية التي تحصل عليها في القراءة دون المستوى الأدنى أقل من القراءة المثلى. يتم قياس إشارة ميتوكوندرية أكبر في التسجيل الأمثل مقارنة بالتسجيل دون الأمثل، حيث تمثل إشارة الميتوكوندريا 17٪ و14٪ من إجمالي الإشارة على التوالي. تم قياس الإشارة بخطأ 4.3٪ في القراءة المثلى، مقارنة بخطأ 18.5٪ في القراءة غير المثالية. وبالمثل، تمثل الإشارة المتبقية غير المفسرة 11٪ من إجمالي الإشارة في التسجيل غير المثالي، بينما تمثل 3.6٪ في النسخة المثلى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تقييم صحة الميتوكوندريا باستخدام RRS

ملاحظة: تم استخدام تقنية مطيافية رامان الرنين (RRS) لتطوير مقياس قابلية الميتوكوندريا (3RMR) يشير إلى صلاحية الأعضاء المزروعة. تهدف هذه الدراسة إلى إظهار كيف تنعكس التغيرات في الأكسجة – وبالتمديد في التنفس الخلوي – في اتجاهات 3RMR مقارنة بمؤشرات الضرر التقليدية مثل اللاكتات وK⁺. يستخدم اختبار إجهاد الأكسجين هنا، حيث بعد 5 دقائق من التروية المستمرة، يتوقف تدفق التروية المؤكسجة لمدة 5 دقائق، ثم يستأنف لمدة 5 دقائق. يتم أخذ قياسات RRS، بالإضافة إلى عينات التدفق والخروج من البرفيوزات طوال اختبار الإجهاد.

1. الحصول على الكبد:
   1. تخدير الحيوانات في غرفة تحفيز باستخدام 3٪–5٪ من الإيزوفلوران. تصفية البخار الزائد بالفحم النشط.
   2. أجر استئصال كامل للكبد على ذكور فئران لويس (150 جم). قم بربط فروع وريد البوابة. حقن 50 وحدة وحدة من هيبارين الصوديوم عبر الوريد الداخلي. قم بتقلب الوريد البابي بقسطرة 16 جرام أثناء الجراحة، وغسل الكبد ب 50 مل من المحلول الملحي.
   3. ضع الكبد المشتري على التجميد في طبق بتري يحتوي على 30 مل من محلول جامعة ويسكونسن (UW).
2. إعداد نظام التروية الآلية تحت الحرارية (SNMP) وقياسات رامان بالرنين:
   1. قم بإعداد جهاز RRS كما هو موضح سابقا. قم بتعيين بروتوكول كبد الجرذان غير الخلوي على برنامج التحكم في المطياف، الذي يضبط وضع العرض تلقائيا على العرض التكيفي، ومتوسط الطول إلى 180، والهدف سيغما إلى 1.5. كما يختار 3RMR والفلورة كمعايير قياس، بالإضافة إلى Mito فقط كمكتبة الانحدار. اضبط وضع الاكتساب على الوضع المستمر.
   2. قم بإعداد نظام SNMP كما هو موضح في مكان آخر¹⁸.
      1. باختصار، تأكد من أن إعداد التروية يتكون من غرفة تفريغ، ومضخة تدهوري، وأكسجين غشائي، ومصيدة فقاعات.
      2. توصيل الأكسجين بمزيج جوي (95٪ أوسيد الأكسجين_و5 ٪ ثاني أكسيد الكربون₂)؛ حافظ على مقدار_{pO 2} بين 400–500 ملم زئبق. راقب الضغط داخل الكبد باستخدام حساس ضغط وابق بين 3–5 ملم زئبق. اجمع العينات عبر منافذ العينة.
   3. بمجرد إعداد البرنامج ونظام التروية، قم بتوصيل القناة التي تخترق الPV بأنبوب التدفق في آلة التفريغ. حافظ على إعداد العضو، والبيرفوسيت، والتروية عند درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية)، دون الحاجة إلى حمام مائي.
   4. أوصل البرفوسات إلى العضو عبر القنية في الفولتينا باستخدام مضخة التهوية.
      1. لتحضير البرفوزات، اخلط 500 مل من ويليامز ميوسط خالي من الفينول الأحمر مع 5 جرام من ألبومين مصل البقر (BSA)، و12 ملغ من ديكساميثازون القابل للذوبان في الماء، و5 مل من البنسلين-ستريبتومايسين، و5 مل من إل-جلوتامين، و2.5 ميكرولتر من الإنسولين، و1000 وحدة هيبارين.
      2. حرك جميع المكونات على طبق التحريك لمدة حوالي 20 دقيقة، أو حتى تذوب جميع المكونات. زيادة تدفقات التروية لتصل إلى ضغوط إنتاج تتراوح بين 3–5 ملم زئبق.
   5. ثم ضع مصدر ليزر RRS في حامل المجس وضعه على ارتفاع 1 سم فوق أكبر فص في الكبد، بالقرب من الكتلة الزجاجية قدر الإمكان. أوقف تدفق التروية عند 5 دقائق (T₅) واستأنفه عند 10 دقائق (T₁₀). قم بإجراء اختبار الإجهاد عند 15 دقيقة (T₁₅).
   6. قم بأخذ قياسات RRS طوال اختبار الإجهاد؛ خذ قياسات التدفق الداخل والخارج كل 5 دقائق، بدءا من T₀ (الشكل 4). رسم قيم 3RMR، بالإضافة إلى مستويات K⁺ الخارجة ومستويات اللاكتات ل T₀، T₅،_{T 10}، T₁₅ (n = 3) (الشكل 5).
   7. احسب معدل استهلاك الأكسجين (OCR) عند T₀،_{T 5}،_{T 10}،_{T 15} عن طريق ضرب الضغط الجزئي للتدفق والتدفق للأكسجين (_{pO 2}) في معامل ذوبانية الأكسجين في البلازما (0.00314). رسم OCR ل T₀، T₅، T₁₀، T₁₅ (الشكل 5).
      ملاحظة: تظهر آثار الطيف النموذجية للرنان رامان في الحالات المثقبة (T₅)، الإقفارية (T₁₀)، والإعادة التغذية (T₁₅) من كبد واحد (الشكل 6)

الشكل 4: مخطط يصور التدفق التجريبي. تم إجراء استئصال كامل للكبد على إناث فئران لويس. تم وضع الكبد المستخرج على تروية آلية دون الحرارية وتم تزويده بالبيرفوسات المؤكسج خلال أول 5 دقائق. يتدفق البرفيوزات إلى الكبد عبر الوريد البابي ويعاد تدويره عبر مضخة التهوية (تدفق التروية الموضح بالأسهم الزرقاء). تم إيقاف التروية المؤكسجة لمدة 5 دقائق عند T5 وأعيد استئنافها لمدة 5 دقائق أخرى عند T10. 3RMR قياسات تم أخذها خلال اختبار الإجهاد (موضحة كليزر الليزر). تم الحصول على عينات من البرفوسيت عند T0 وT5 وT10 وT15. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

تعرض الكبد الطازج لفترات من نقص التروية وإعادة التروية باستخدام اختبار إجهاد الأكسجين. ثم تمت مقارنة التغيرات اللحظية في 3RMR طوال اختبار الإجهاد مع معدل استهلاك الأكسجين، واللاكتات الخارجة، والبوتاسيوم الناتج عن تحليل البرفوسيت عند T₀،_{T 5}،_{T 10}،_{T 15}. في الظروف الصحية، من المتوقع أن تكون قيم 3RMR بين 10٪ و30٪ (الشكل 5A). كما هو متوقع، تقع قيم 3RMR عند T_{0 وT 5} ضمن هذا النطاق، حيث كان الكبد يزود ببيرفوسات مؤكسج باستمرار بين هاتين النقطتين الزمنيات (الشكل 5A). ومع ذلك، فإن قيمة 3RMR في نهاية الفترة الإقفارية (T₁₀) خارج النطاق الأمثل (الشكل 5A). تشير هذه الزيادة إلى انتقال الميتوكوندريا إلى حالتها المخفضة، حيث تتراكم الإلكترونات عبر سلسلة النقل بسبب فقدان الأكسجين. عند T_10، يستأنف التدفق المؤكسج؛ تبدأ فترة إعادة التروية. في نهاية فترة إعادة التروية (T₁₅)، تعود قيم 3RMR إلى المستويات المثلى (الشكل 5A) مع استعادة نشاط ETC مع إعادة إدخال الأكسجين كمستقبل إلكتروني نهائي. تظهر هذه التغيرات في تدفق الأكسجين أيضا في الأطياف الخام. تتميز أطياف RRS الخام عند T_{0 وT 15} بخصائص طيفية مشابهة لتلك الخاصة بالميتوكوندريا المؤكسدة (الشكل 6A,C)، مثل ذروة المؤشر الطيفي عند 1371 ^سم-1 (الشكل 6D,F). وبالمثل، تظهر أطياف رامان الخام عند T₁₀ (الشكل 6B) علامات RR منخفضة، مثل ذروة المؤشر الطيفي عند 1357 ^سم-1 (الشكل 6E). في الختام، يحدد RRS التحولات في حالات الأكسدة الميتوكوندرية في الوقت الحقيقي، وهو ما يظهر في الإشارة الطيفية الخام، وكمؤشر لصحة الميتوكوندريا (3RMR).

يمكن ل RRS أيضا حساب قيم 3RMR بناء على حالات الأكسدة الاختزالية في cIII و cIV. لوحظ نمط مشابه في قيم cIII و cIV 3RMR (الشكل 5B). عند T₀، لوحظت قيم 3RMR مؤكسدة بالكامل ل cIV، وقيم 3RMR ضمن النطاق الأمثل ل cIII. هذا التوازن في الأكسدة بين المجمعين فسيولوجي، حيث تتدفق الإلكترونات من cIII إلى cIV ليتم أكسدها بسرعة. عند بداية نقص التروية، لوحظ زيادة في مستويات 3RMR لكل مركب. خلال فترة الإقفاري، يؤدي تراكم الإلكترونات عبر ETC إلى زيادة الإجهاد الاختزالي على cIII و cIV، مما يؤدي إلى زيادة cIII-3RMR و cIV-3RMR. ومع ذلك، عند إعادة إدخال الأكسجين، تنخفض قيم 3RMR لكلا المركبين إلى المستويات المثلى: cIV مؤكسد بالكامل وcIII فسيولوجيا مخفضة (الشكل 5B). تظهر اتجاهات 3RMR في كلا المجمعين أن توقف الأكسجين يؤثر على كامل منطقة ETC، ولا يوجد مجمع فردي معرضا بشكل خاص لإقفارية عدم التدفق.

من ناحية أخرى، لم تنعكس التغيرات في ديناميكيات الأكسجين في مؤشرات الضرر وتحليلات غازات الدم التي تم الحصول عليها من تحليل البرفوزات. عند بداية نقص التروية، من المتوقع أن يرتفع اللاكتات وK⁺ ، حيث تبدأ الخلية بالاعتماد على التنفس الهوائي، وتتحلل تدريجيا لإطلاق K⁺ بين الخلايا. نتوقع أيضا انخفاض الضبط الضوئي الحرم (OCR)، لأن الخلايا لا تنتج طاقة كافية لمواصلة التنفس الخلوي. حتى بعد فترة من نقص التروية بدون تدفق، لم تظهر معدلات استهلاك الأكسجين أي علامات على الضرر. تظل مستويات اللاكتات الخارجة وK⁺ ثابتة نسبيا طوال اختبار الإجهاد، رغم التغيرات في الأكسجة (الشكل 5D–E).

الشكل 5: التغيرات في 3RMR والعلامات الحيوية التلف طوال اختبار إجهاد الأكسجين. يتم تصوير بداية نقص التروية وفترات إعادة التروية من خلال خطوط منقطة في الدقيقتين 5 و10 على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تصوير فترات التدفق المؤكسج بخطوط زرقاء، وفترات الإقفار بخطوط حمراء. (أ) قيم 3RMR في جميع أنحاء اختبار الميتوكوندريا. تزداد قيم 3RMR عند إيقاف التدفق المؤكسج وتنخفض إلى المستويات المثلى عند إعادة بدء التدفق. (B) قيم 3RMR للمركب III والمعقد IV. توقف التدفق يؤدي إلى تقليل في كلا المجمعين. (ج) متوسط قيم التدفق الخارجي K⁺ طوال اختبار الإجهاد. تبقى قيم ^K+ ثابتة طوال اختبار الإجهاد، رغم التغيرات في ديناميكيات الأكسجة. (د) متوسط مستويات لاكتات التدفق الخارجي طوال اختبار الإجهاد. يبقى إنتاج اللاكتات ثابتا طوال اختبار الإجهاد. (ه) معدلات استهلاك الأكسجين عند T₀،_{T 10}،_{T 15}. نظرا لأن قيم_{pO 2} هي قياسات قائمة على التدفق، لم يكن بالإمكان حساب OUR لفترة نقص التروية بدون تدفق. لم تلاحظ تغييرات ذات دلالة إحصائية (قيمة p: 0.2500) (n = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: آثار طيفية خام نموذجية لكبد جرذ طازج طوال اختبار الإجهاد. ملفات طيفية كاملة للكبد في حالات (أ) مؤكسدة، (ب) إقفارية، و(ج) متحمسا. يكون التحول من علامة RR المؤكسجة إلى علامة RR المختزلة مرئيا عند التكبير في القمة الطيفية للميتوكوندريا، مع وجود مربع أحمر في كل ملف طيفي. (D–F) توجد قمم علامات RR المؤكسدة (1371 ^سم-1) في حالات (D) المؤكسدة و(F) المعاد الاندماج وتحمل خطا أحمر منقط. يوجد ذروة مؤشر RR مخفضة (1357 ^سم-1) في حالة (E) الإقفارية ويحدد بخط أزرق متقطع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: آثار طيفية للمركب الثالث المختزل والمؤكسد، المركب الرابع، الهيموغلوبين، والميوغلوبين. (أ) Complex III، (B) مركب IV، (C) هيموغلوبين، و(D) ميوغلوبين. يقوم تحليل الانحدار بتشغيل الأطياف المجمعة مقابل هذه المكتبات الطيفية (إذا تم اختيارها)، مما يعطي عاملا لكل طيف مكتبة يمثل أفضل تقدير ملاءمة لمساهمته النسبية في الطيف المسجل وبالتالي تركيزه النسبي في النسيج. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: مثال على استخدام مكتبات الانحدار لتفكيك الجزيئات التي تحتوي على الهيم المتداخلة (الهيموغلوبين والميتوكوندريا المؤكسدة/المختزلة). (أ) تم اختيار آثار طيفية خام من نسيج الكبد المثقوب بالبيرفوسات الخلوي، مع جميع مكتبات الانحدار الضرورية، مثل الهيموغلوبين، الهيموغلوبين المؤكسد، الميتوكوندريا المختزلة، والميتوكوندريا المؤكسدة. من الواضح أن خط الملاءمة الأفضل، المستمد من المكتبات وتحليل الانحدار، يتداخل بشكل أنيق مع الإشارة المقاسة، مع القليل من البقايا غير المفسرة. (ب) أثر طيفي خام من نفس النسيج، ولكن مع اختيار مكتبات الميتوكوندريا المؤكسدة والمقلصة فقط. نظرا لوجود بنية متبقية كبيرة غير مفسرة، فمن الواضح أن الذروة الطيفية للميتوكوندريا تتحرك عدة أرقام موجية عن قمة الهيموغلوبين، التي لم تدرج في تحليل الانحدار. يظهر هذا الشكل أن مقياس الطيف عالي الدقة وتحليل الانحدار مقابل الطيف بأكمله قادران على التمييز بين الأطياف المتقاربة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: التقاط شاشة للبرنامج. (أ) نافذة رئيسية تعرض قيم القياس عبر الزمن. سيتم عرض 3RMR وStO2 وأي سلاسل مختارة أخرى هنا أثناء القياس. بالإضافة إلى ذلك، سيتم عرض قوة الإشارة لكل سلسلة كخط متقطع على الرسم البياني، وقيمة تحتها على الجانب الأيمن من الشاشة. على سبيل المثال، الخط الصلب الملتقط هنا يمثل 3RMR للنسيج، والخط المتقطع يمثل r3RMR (قوة الإشارة ل 3RMR). إذا أراد أحدهم رؤية جودة الطيف المسجل، يمكنه النقر على تبويب عرض الطيف (الموضح بدائرة باللون البنفسجي). (ب) شاشة تعرض الطيف الخام للأنسجة. هذا هو التبويب الذي يمكن من خلاله تقييم جودة الإشارة من خلال قوة الطيف المقاس مقابل الضوضاء المتبقية. (ج) تبويب يظهر الاتجاهات في السلاسل عبر التجربة. إذا كنت تجري، على سبيل المثال، عدة قياسات 3RMR خلال تجربة، فسيتم عرض كل قياس عبر الزمن في هذا التبويب. سيتم عرض الاتجاهات في سلاسل أخرى، إذا تم اختيارها، هنا أيضا. يمكن الوصول إلى هذا التبويب بالنقر على زر الاتجاهات في الشاشة الرئيسية (بدائرة خضراء على الصفحة A). (د) تبويب المعلومات، حيث يمكن إدخال معلومات تجريبية مثل اسم الجلسة والوصف. (E) تبويب النظام، حيث يمكن رفع بروتوكولات محملة مسبقا. على سبيل المثال، إذا اخترت بروتوكول LiverContAcell، سيضبط هذا البروتوكول مكتبة الانحدار، نافذة الانحدار المستهدفة، والسيغما وفقا لبروتوكول التروية اللاخلوية لكبد الفئران. لاستيراد بروتوكول، يمكن للمرء النقر على استيراد الإعدادات من الملف واستيراد البروتوكول المطلوب. إذا أراد أحدهم إنشاء بروتوكوله الخاص، يمكنه اختيار المكتبات اللازمة من قائمة مكتبة الانحدار (F) المنسدلة، وضبط نافذة الإشارة المستهدفة والانحدار، بالإضافة إلى الإنذارات، والنقر على الحفظ (الممثل بالقرص) في أسفل اليسار. (و) تبويب الحبكة، حيث يمكن اختيار السلسلة التي سيتم عرضها على النافذة الرئيسية. إذا كان الشخص يعيد تحليل طيف، وأراد إضافة المزيد من السلاسل إلى قياساته السابقة، يمكنه اختيار السلسلة المهمة من تحت قسم Recal. أثناء إعادة المعايرة (Recal)، يعيد البرنامج تحليل الأطياف الخام المقاسة ويعرض نتائج السلاسل المختارة حديثا. يمكن أيضا اختيار عرض قوة الإشارة لسلاسل مختارة من هذا التبويب. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: شرح كل مقياس مراقبة جودة.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تسلط هذه الدراسة الضوء على طريقة غير جراحية، في الوقت الحقيقي، وحساسة للغاية لقياس صحة الميتوكوندريا باستخدام نظام مطيافية رامان الرنين المحمول الذي يتكون من ليزر في مسبار مدمج، متصل بكابل ألياف بصرية بمضخة ليزر. استخدمت هذه الطريقة ليزر 441 نانومتر لتحفيز الميتوكوندريا، التي تنتج إشارات طيفية فريدة تعتمد على حالة الأكسدة الخاصة بها. وبالتالي، يستطيع RRS قياس كل حالة من حالات الميتوكوندريا من خلال توقيعاتها الطيفية ومقارنة الأطياف المنبعثة مع المكتبات الطيفية المقاسة مسبقا باستخدام تحليل الانحدار. ثم تم إنشاء مقياس صحة الميتوكوندريا بناء على نسبة الميتوكوندريا المختزلة إلى الكلية: نسبة رامان الميتوكوندرية المنخفضة الرنين (3RMR).

تركز هذه الورقة على إظهار التغيرات اللحظية في 3RMR كدالة للأكسجة مع الأنسجة الأصلية دون الحاجة إلى معالجة العينات. تم تحقيق ذلك من خلال اختبار إجهاد الأكسجين: بعد 5 دقائق من التروية المؤكسجة المستمرة، يتوقف تدفق التروية لمدة 5 دقائق ويعاد تشغيله لمدة 5 دقائق أخرى. يتم إجراء قياسات 3 RMR طوال اختبار الإجهاد. نموذج اختبار الإجهاد، حيث ننتقل بين فترات الإقفاري والفترات المؤكسجة، يسمح لنا بتتبع التغيرات المستمرة في حالات الأكسدة الميتوكوندرية – وبالتمديد، وظيفة الميتوكوندريا. بعبارة أخرى، يسمح لنا اختبار إجهاد الأكسجين بتتبع الاتجاهات في 3RMR كدالة للأكسجة. نسب مجموعتنا ارتفاع قيم 3RMR إلى الظروف الإقفارية، مما يعطل تدفق التروية، مما يؤدي إلى تراكم الإلكترونات التي تمر عبر ETC، حيث أن O₂ غير متوفر كمستقبل إلكتروني نهائي. هذا التراكم للإلكترونات يسبب حالة مختزلة، مما يترجم إلى زيادة في قيم 3RMR. ومع ذلك، عند إعادة إدخال الأكسجين₂، من المتوقع أن تستأنف الميتوكوندريا السليمة نشاط ETC وتتعافى إلى حالات الأكسدة الفسيولوجية، حيث تبقى عناصرها البنيوية والوظيفية سليمة.

كما هو متوقع، لوحظ في هذه الورقة زيادة مستمرة في 3RMR في الوقت الحقيقي طوال فترة الإقفاري (الشكل 5A). وبالمثل، يعود 3RMR تدريجيا إلى المستويات المثلى طوال فترة إعادة التروية (الشكل 5A). يظهر هذا التغير في الوقت الحقيقي في حالات الأكسدة الميتوكوندرية أيضا في الرسم الطيفي، حيث تتحول ذروة الميتوكوندريا من الحالة المؤكسدة (1371 ^سم-1) إلى الحالات المختزلة (1357 ^سم-1) طوال فترة الإقفاري، وتعود إلى الحالة المؤكسدة في نهاية إعادة التروية (الشكل 6). تظهر أيضا قمم علامات RR مخفضة أخرى خلال فترة الإقفاري. على عكس اختبارات صحة الميتوكوندريا التقليدية، فإن رامان الرنين حساس بما يكفي لقياس حالات الأكسدة الاختزالية في المعقد III والمعقد الرابع، مما قد يوفر وفرا رؤية ميكانيكية حول التأثير المحدد لإصابات نقص التروية على ETC. في الميتوكوندريا السليمة، تمر الإلكترونات عبر مجمعات مختلفة في ETC، بدءا من المركب I، حتى تصل إلى O₂ كمستقبل إلكتروني نهائي. توقف تدفق الأكسجين يمكن أن ينقل كل مركب إلى حالة منخفضة، حيث تتراكم الإلكترونات على طول ETC. كما هو متوقع، لوحظ زيادة في الوقت الحقيقي في قيم 3RMR للcIII وcIV عند بداية نقص التموية. هذا يشير إلى أن غياب O₂ يؤثر على ETC بأكمله، وليس على مركب محدد (الشكل 5B). كما سنناقش أدناه، فإن حساسية RRS تسهل دراسات ميكانيكية مفصلة وتهدف إلى تطوير علاجات مستهدفة للرجال.

تقليديا، نتوقع أيضا ملاحظة مستويات مرتفعة من اللاكتات في الأعضاء الإقفارية، لأنها تعتمد على الأيض اللاهوائي في غياب الأكسجين لإنتاج ATP. وبالمثل، كان من المتوقع زيادة في مستويات K⁺ في الأعضاء التالفة، حيث تتعطل سلامة الغشاء في الخلايا، مما يسمح بتدفق K⁺ بين الخلايا. أخيرا، قد يكون لدى الخلايا المتضررة بشدة معدل أيض أقل، لأن مسارات الأيض لديها تتأثر بالنفايات الأيضية الناتجة عن نقص التروية وROS، مما يؤدي إلى انخفاض استهلاك الأكسجين. ومع ذلك، لا تلاحظ أي تغييرات في استهلاك اللاكتات أو K⁺ أو الأكسجين خلال أو بعد فترة الإقفاري. في الواقع، لا تشير القيم إلى توقف تدفق الأكسجين، حيث تبقى ثابتة نسبيا طوال اختبار الإجهاد (الشكل 5B–D). بشكل أساسي، باستخدام اختبار إجهاد الأكسجين، تظهر هذه الدراسة أن قيم 3RMR تعكس تحولات حالات الأكسدة الميتوكوندرية أثناء إعادة تروية نقص التروية بشكل أسرع وفي الوقت الحقيقي وأكثر حساسية من مؤشرات الضرر التقليدية (الشكل 5). ندرك أن هذه الدراسة قارنت بين ديناميكيات 3RMR والمؤشرات غير المباشرة لصحة الميتوكوندريا، مثل اللاكتات وOCR، بدلا من المقارنات المباشرة في المراحل اللاحقة مثل NAD+/NADH وATP. على الرغم من أن هذه الدراسة لا تربط صراحة التغيرات في 3RMR بتركيزات ATP/NADH، إلا أن العمل السابق ^9,14 أظهر أن 3RMR يتنبأ بالتغيرات في هذه العلامات الحيوية في المراحل اللاحقة. على سبيل المثال^{، أظهر} نغوين وآخرون أن الكبد الدافئ الإقفاري (WI) الذي يحتوي على 3 ساعات مع قيم منخفضة 3RMR (<10٪) لديه تركيزات ATP ونسب NAD/NADH أقل بشكل ملحوظ مقارنة بكبد 1 ساعة في WI (قيم 3RMR ~15٪). بالإضافة إلى ذلك، لم ير جاين وآخرون ¹⁴ فروقا ذات دلالة إحصائية في نسبة NAD+/NADH أو EC في المجموعات التي لم تكن لديها فروق ذات دلالة إحصائية في نسبة 3RMR لديهم. كما لاحظوا أن نسب NAD+/NADH وEC كانت مختلفة بشكل ملحوظ في الكبد المصاب بالإقفارية الباردة (CI) لمدة 24 ساعة أثناء التروية اللاخلاوية مقارنة بالتروية الخلوية، التي أظهرت أيضا قيم 3RMR ذات دلالة إحصائية. مجتمعة، تظهر هذه النتائج قيم 3RMR لتعكس التغيرات في القياسات المباشرة لوظيفة الميتوكوندريا وETC.

على الرغم من أن هذه الورقة تستخدم RRS طوال فترة تروية مدتها 15 دقيقة لإثبات أداء النظام، إلا أن دراسات منشورة أخرى أثبتت فائدة RRS في الدراسات الطولية. وبشكل أكثر تحديدا، في عمل سابق، أظهرنا أن RRS يكمل المؤشرات الحيوية التقليدية خلال فترات الترويد الطويلة للأعضاء، حيث يوفر فهما لصحة ووظيفة الميتوكوندريا تختلف بشكل كبير عن الطرق التقليدية. على سبيل المثال، استخدمت الدراسة نظام RRS لتقييم جدوى كبد الفئران الباردة القابلة للزرع (24 ساعة SCS) وغير القابلة للزرع (72 ساعة SCS) خلال تدفق الدم تحت الطبيعي. على الرغم من أن الاستجابة الأولية للأكسجة في كلا المجموعتين كانت متشابهة، إلا أن نسبة 3RMR في الكبد غير القابل للزرع زادت مع تدفق الدمية، بينما بقي 3RMR للكبد القابل للزرع ثابتة خلال SNMP. وبالمثل، كانت مستويات البوتاسيوم وزيادة الوزن الكلي في الكبد ذات التوازن 72 ساعة أعلى طوال فترة SNMP مقارنة بكبد 24 ساعة في الفاصل الثامن. أظهرت الدراسة فائدة RRS في تكمل المؤشرات الحيوية التقليدية خلال فترات التروية الطويلة. في دراسة أخرى، استخدمنا RRS لفهم ديناميكيات إعادة الأكسجين والتعافي الأيضي لكبد الفئران الإقفارية الباردة⁽CI). قمنا بتغذية كبد إقفاري طفيف (15 دقيقة من نقص التروية الباردة) والكبد الإقفاري البارد لمدة 24 ساعة باستخدام بيرفوسات غير خلوي أو يحتوي على حمض الدم الأحمر (pRBC). عندما تم حقن الكبد بفاصل 24 ساعة بالبيرفوسات اللاخلوي، لاحظنا انخفاضا كامنا في 3RMR مقارنة بحقن pRBC. عزت الدراسة هذا التأخير في زيادة 3RMR إلى تراكم الإلكترونات في السيتوكروم الميتوكوندرية أثناء نقص التروية الباردة، والتي يمكن نقلها بسرعة إلى جزيئات الأكسجين الوفيرة في حالة البرفوسات المعتمدة على pRBC. ومع ذلك، بالاقتران مع مؤشرات أخرى للإصابة، نلاحظ ضررا أكبر في الكبد بحجم 24 ساعة في الحلقة المكثفة التي تم ترميخها ب pRBC. خلصت الدراسة إلى أن قياس الأكسجة الميتوكوندرية في الوقت الحقيقي عبر RRS يمكن أن يوفر رؤية حول استعادة الميتوكوندريا، مما قد يكون مفيدا لتحسين استراتيجيات التروية الطويلة. في جوهر الأمر، تشير النتائج إلى أن دمج المؤشرات الحيوية التقليدية (مثل اللاكتات، OCR، ATP) مع رؤى مدفوعة بنظام RRS حول حالات الأكسدة والاختزاز الميتوكوندرية وديناميكيات الأكسجة يوفر تقييما أكثر شمولا لاستعادة الميتوكوندريا.

استخدمت دراسات أخرى RRS كمنصة اختبار للعلاجات التي قد تخفف من إصابة نقص التروية وإعادة التروية في ETC⁹. في فترات طويلة من نقص التروية، تتراكم الإلكترونات داخل ETC، مع قدرة الإلكترونات على الهروب عبر المجمعات المختلفة، خاصة أثناء إعادة التروية. فهم حالة الأكسدة الاختزالية للمجمعات الفردية كوظيفة لنقص التروية وإعادة التروية يمكن أن يوفر فهما أعمق لموقع الإصابة مع إمكانية تدخلات أكثر استهدافا. على سبيل المثال، استخدمت مجموعتنا RRS لتطوير تدخلات علاجية لخلل الوظيفة المركبة III في كبد الخنزير الحراري الدافئ. في دراسة أجراها نغوين وآخرون (2026⁾⁹، تم وضع كبد 1 ساعة و3 ساعات من كبد ال WI على SNMP لمدة 3 ساعات. كما ذكر سابقا، من المعروف أن الكبد الذي يستمر ثلاث ساعات في WI يعاني من تلف في ETC، مما يؤدي إلى فرط الأكسدة وانخفاض الأيض. على الرغم من أن قيم 3RMR للكبد الطازج و1 ساعة في النفخ كانت ضمن النطاق الأمثل طوال فترة التروية، لاحظنا انخفاضا مستمرا لقيم 3RMR لكبد 3 ساعات من النفاذ، لتصل إلى ما دون النطاق الأمثل (10٪) عند 3 ساعات. بالإضافة إلى ذلك، لم نلاحظ أي فروق في قيم 3RMR ل cIV بين أي من المجموعتين، حيث تم أكسدة cIV بالكامل في كل مجموعة. فرط أكسدة cIII، مع حالة أكسدة اختزاز صحية لوحظت في cIV، يشير إلى فرط أكسدة ناتجة عن إعادة التروية في المعقد III. وبفضل هذه المعرفة، تمكن نيوجن وآخرون (2026)⁹من اختيار علاج يمكنه التغلب على خلل cIII: الميثيلين الأزرق (MB)، الذي يعمل كوسيلة نقل إلكترونية بين cI وسيتوكروم c، متجاوزا cIII وينقل الإلكترونات مباشرة إلى cIV. عكست نتائج 3RMR التأثير العلاجي ل MB على الميتوكوندريا، حيث ارتفعت قيم 3RMR أثناء SNMP في كبد 3 ساعات WI لتعكس نقل الإلكترونات مباشرة إلى cIV، وإعادة بدء الأيض الكبدي. كما تم التحقق من تأثير التخفيف من MB من خلال تقليل تدفق اللاكتات الخارج وتحسين معدلات استهلاك الأكسجين. في جوهر الأمر، مكنت خصوصية RRS من تطوير مسار علاجي مصمم لاحتياجات الميتوكوندريا بعد نقص التروية الدافئ.

خلال هذه الورقة، نقدم مطيافية رامان الرنين كطريقة غير جراحية، في الوقت الحقيقي، ومحددة للغاية لقياس صحة الميتوكوندريا. تظهر الدراسة كيف يمكن لنظام RRS قياس التحولات الطفيفة في حالات الأكسدة والاختزاز دون إزعاج النسيج قبل أن تؤثر هذه التغيرات الفسيولوجية لاحقا. ومع ذلك، من المهم ملاحظة القيود العديدة لنظام رامان الرنين. أولا، يتطلب RRS تحديد جميع الجزيئات التي تم تعزيزها رنينا في النسيج وأخذها في الاعتبار خلال الانحدار، حيث يكون لكل جزيء عوامل تعزيز مختلفة لأخذ قوة الإشارة النسبية في الاعتبار. على الرغم من أننا أنشأنا مكتبات طيفية لجميع هذه المكونات عند طول موجي ونسيجة معينة، قد يحتاج المستخدم إلى إنشاء والتحقق من مكتبات جديدة لكل نسيج وطول موجي محل اهتمام. علاوة على ذلك، قد تحتوي بعض الأنسجة على عناصر طيفية معقدة، مما قد يصعب قياس السيتوكروم الميتوكوندرية الموجودة بتركيزات أقل. على سبيل المثال، كبد الخنازير أو الإنسان يحتوي على بيتا كاروتين، والدم يحتوي على الهيموغلوبين، وكلاهما يمتلك إشارات طيفية قوية تضيف إلى عدد التوقيعات الطيفية التي يحتاج RRS إلى أخذها في الاعتبار أثناء الانحدار. أخيرا، الليزر المستخدم في هذه القياسات بقطر شعاع 441 نانومتر يبلغ 2 مم وعمق اختراق أقل من 1 مم. قد تؤدي هذه القياسات المحلية والسطحية إلى زيادة خطأ أخذ العينات، حيث قد يتم تجاهل الاختلافات في حالة الأكسدة والاختزاز في أجزاء أخرى من العضو. لتجاوز مثل هذه التحديات، يمكن أخذ قياسات من خزعات مأخوذة من نواة العضو، أو يمكن لإعداد متعدد الليزرات إجراء قياسات على مساحة سطح أكبر لتوفير فهم أكثر اكتمالا لصحة الأعضاء بالكامل.

في الختام، نظهر أن مطيافية رامان الرنين حساسة للتغيرات الطفيفة في ديناميكيات الميتوكوندريا مقارنة بمحللات غازات الدم. يقدم هنا شرح مفصل لإعداد وتشغيل النظام. نسلط الضوء على الطبيعة غير الجراحية، عالية التحديد، والتقييم في الوقت الحقيقي لعلاج RRS، ونشرح كيف يمكن استخدامه كنهج تشخيصي وميكانيكي. كما نؤكد على استخدامه في تطوير مسارات علاجية محددة لخلل وظيفة الميتوكوندريا. قد تركز الدراسات المستقبلية على تكييف نظام RRS لتقييم صحة الميتوكوندريا من خلال الخزعات، أو شرائح الأنسجة المقطوعة بدقة، أو منتجات أخرى مشتقة من الأنسجة، بما في ذلك الأنسجة البشرية لأغراض البحث الانتقالي. يقدم اعتماد RRS نهجا قويا في أبحاث الأيض، مما يحسن فهمنا للعمليات الحيوية الخلوية بسهولة أكبر مقارنة بالطرق التقليدية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	يستخدم لإبرام الوريد البابي
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	يستخدم لتصفية البخار الزائد أثناء التخدير
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	تكوين المحلول المصفّى
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	تكوين المحلول المصفّى
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	تكوين المحلول المصفّى
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	يستخدم لتدفق المحلول المصفّى عبر الكبد
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	يستخدم لتدفق المحلول المصفّى عبر الكبد
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	يستخدم لأكسجة المحلول المصفّى.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	تكوين المحلول المصفّى
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	لتحليل غازات الدم
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	الاتصال بـ Pendar Technologies للاستفسارات حول هذا المنتج