مقالة منهجية

بناء عضويات سرطان الثدي البشرية وقياس الضرر الناجم عن الحمض النووي الناتج عن دوكسوروبيسين بناء على اختبارات المذنبات

64 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71299

⸱

يوليو 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يؤسس هذا البروتوكول نموذج عضويات سرطان الثدي البشرية (BCOs) ويقيم كمية الضرر الناتج عن الدوكسوروبيسين باستخدام اختبار المذنب. تم إثبات جدوى تطبيق اختبار المذنب على ال BCOs، وتم توفير سير عمل قابل للتكرار والتوسع والتشغيل للكشف عن تلف الحمض النووي الناتج عن DOX في BCOs.

الملخص

سرطان الثدي هو أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين النساء حول العالم ويظهر تباينا كبيرا. يستخدم دوكسوروبيسين (DOX) على نطاق واسع في علاج سرطان الثدي، وتتمثل آليته الأساسية في تحفيز كسور مزدوجة الحمض النووي وتحفيز موت الخلايا. في هذا البروتوكول، تم إنشاء نموذج BCO بشري لتقييم التلف النووي الناتج عن DOX بشكل كمي. تم عزل خلايا سرطان الثدي الأولية من أنسجة أورام مشتقة من المريض عبر تفكك ميكانيكي وإنزيمي ثم تم زراعتها في مصفوفة ثلاثية الأبعاد لتوليد الخلايا الكيميائية المبكرة. ثم عولجت العضويات بمادة DOX بمقدار 8 ميكرومولار لمدة ساعتين. تم تقييم تلف الحمض النووي بعد ساعتين من العلاج. بعد المعالجة، تم تفكيك الأعضاء إلى خلايا منفردة، وتم دمجه في أغاروز منخفض نقطة الانصهار، وتم تركيبها كهروفوريا تحت ظروف قلوية. بعد الرحلان الكهربائي، تم تصور أنماط هجرة الحمض النووي كهياكل مذنبات تحت المجهر الفلوري وتحليلها كميا باستخدام برنامج OpenComet لتحديد نسبة الحمض النووي للذيل (٪ DNA الذيل). نجح اختبار المذنب في اكتشاف تلف الحمض النووي في وحدات الحمض النووي البريطانية. مقارنة بمجموعة الضابطة، أظهرت البكرات الكيميائية المعرضة لمادة DOX بمقدار 8 ميكرومولار لمدة ساعتين ذيول مذنب طويلة بعد تفكك العضويات والرحلان الكهربائي. كشف التحليل الكمي أن نسبة الحمض النووي للذيل كانت أعلى بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة، مما يشير إلى تحفيز تلف الحمض النووي. تدعم هذه الطريقة الحساسة للغاية الدراسات السمية والدوائية الديناميكية لمادة DOX وتوفر منصة تقنية قوية لتقييم تلف الحمض النووي في أنظمة BCO المشتقة من المرضى.

المقدمة

سرطان الثدي هو ورم خبيث ينشأ من أنسجة ظهارة الثدي نتيجة التغيرات الجينية، واضطراب الهرمونات، وعوامل مرضية أخرى. يعد هذا المرض أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين النساء حول العالم ويظهر أنماطا وبائية فريدة وتباينا كبيرا داخل الأورام 1,2. DOX، وهو عامل علاج كيميائي من الخط الأول، يتداخل مع الحمض النووي، ويثبط نشاط توبويزوميراز II، ويؤدي إلى كسور خيوط الحمض النووي، مما يؤدي في النهاية إلى تحفيز الاستماتة المبرمجة في خلايا الورم3. أنظمة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية محدودة في قدرتها على إعادة تلخيص التنظيم الخلوي المعقد وتباين أورام الثدي. على النقيض من ذلك، فإن BCOs هي هياكل ثلاثية الأبعاد مشتقة من أنسجة الورم لدى المرضى تحتفظ بالخصائص الرئيسية للورم الأصلي، بما في ذلك تركيب الخلية، وبنية الأنسجة، والأنماط الظاهرية الجزيئية. ومن الجدير بالذكر أن نماذج BCO تظهر توافقا عاليا مع الاستجابات السريرية للأدوية؛ بالنسبة لعامل علاجي معين، تصل التوافق السلبي إلى 100٪، وتصل التوافق الإيجابي إلى 98٪ بين المعالجين البدلاء والمريض المقابل4.

تعمل BCOs كنموذج متقدم في المختبر يعيد تلخيص السمات الهيكلية والوظيفية الرئيسية للأورام الأولية، وقد تم تطبيقها على نطاق واسع للتحقيق في تكون الأورام، وتطور المرض، والمقاومة العلاجية5. عادة ما يعتمد بدء الورم في سرطان الثدي على تعطيل تعاوني لعدة جينات مثبطة للأورام مثل TP53 وPTEN وRB1 وNF1، حيث أن التغيرات الجينية الفردية غير كافية لدفع التحول الخبيث للظهارة الثدية الطبيعية. يصاحب هذا العمل فقدان قطبية الخلية، وعدم تنظيم معماري، وتكاثر غير منضبط 6,7,8.

اختبار المذنب (المعروف أيضا باسم الرحلان الكهربائي الهلامي أحادي الخلية، SCGE) هو طريقة كلاسيكية لتقييم تلف الحمض النووي على مستوى الخلية الواحدة. تم تقديم هذه التقنية لأول مرة بواسطة ريدبرغ ويوهانسون في عام 1978، ثم تم تطويرها لاحقا بواسطة أوستلينغ ويوهانسون، اللذين أسسا اختبار المذنب المحايد لاكتشاف انكسارات الحمض النووي ذات السلسلتين الدوائيتين. في عام 1988، دمج سينغ وزملاؤه ظروف الرحلان الكهربائي القلوية، مما مكن من اكتشاف كسور الحمض النووي أحادية السلسلة، والمواقع اللاقاعدية، والآفات القلوية، مما وسع بشكل كبير من تطبيق الاختبار9. المبدأ الأساسي لاختبار المذنب هو أن حركة الحمض النووي الكهربائي تعتمد على سلامة الحمض النووي. بعد تضمين الأغاروز وتحلل الأغشية الخلوية والبروتينات، تهاجر شظايا الحمض النووي التالفة نحو الأنود أثناء الرحلان الكهربائي لتشكل "ذيل المذنب"، بينما يبقى الحمض النووي سليما بالقرب من موقع التحميل، مكونة "رأس المذنب"10. تسمح معايير مثل طول الذيل، ونسبة الحمض النووي للذيل (نسبة حمض نووي للذيل)، وعزمة ذيل الزيتون بتقييم شبه كمي أو كمي لتلف الحمض النووي، ويمكن استخدام تصاميم تجريبية زمنية لتقييم قدرة إصلاح الحمض النووي. نظرا لحساسيته العالية، ومتطلبات إدخال العينة المنخفضة، وبساطة الإجرائية النسبية، تم استخدام اختبار المذنب على نطاق واسع في علم السموم الوراثي، وعلم الأحياء السرطاني، ودراسات استجابة الأدوية، خاصة لتقييم تلف الحمض النووي الناتج عن العوامل الكيميائية والعلاج الإشعاعي، بالإضافة إلى آليات مقاومة خلايا الورم. الاختبار حساس للغاية للظروف التجريبية والتغيرات الإجرائية، وتعتمد قابلية التكرار والمقارنة بين المختبرات على سير العمل الموحد وتحليل الصور الآلي11. في السنوات الأخيرة، أدى دمج برامج التصوير عالية الإنتاجية، ونماذج العضويات، وأنظمة تحرير الجينات إلى تعزيز فائدة اختبار المذنب في دراسة آليات تلف وإصلاح الحمض النووي وتقييم استجابات علاج الأورام.

مقارنة باختبارات تلف الحمض النووي التقليدية مثل التلوين الفلوري المناعي γ-H2AX أو قياس تدفق الهواء، يوفر اختبار المذنب وسيلة مباشرة لقياس تكسير خيوط الحمض النووي الفيزيائية على مستوى الخلية الواحدة. نظرا لأن هذه المنهجية تعمل بشكل مستقل عن تعبير البروتين أو خصوصية الأجسام المضادة المحددة، فإنها تقضي فعليا على النتائج السلبية الكاذبة الناتجة عن اختلافات في حالات دورة الخلية أو الانحرافات في مسارات استجابة تلف الحمض النووي12. علاوة على ذلك، وعلى عكس الزراعة أحادية الطبقة التقليدية ثنائية الأبعاد، فإن النموذج العضوي ثلاثي الأبعاد المستخدم في هذه الدراسة يعكس بشكل أكثر دقة البنية المكانية المعقدة، والتفاعلات المصفوفية خارج الخلية، وتدرجات نفاذ الأدوية للأورام داخل الجسم. بينما تبالغ نماذج خطوط الخلايا التقليدية في تقدير السمية الجينية بسبب التعرض المفرط للأدوية الصناعية، تقوم منصة العضوية بتقييم تلف الحمض النووي الناتج عن DOX ضمن بيئة دقيقة تشبه الظروف الفسيولوجية السريرية بشكل كبير، مما يعزز بشكل كبير موثوقية وقيمة الترجمة لهذا النموذج13.

على الرغم من المزايا الكبيرة لاختبار المذنب المدمج مع العضوية الذي تم إثباته في هذه الدراسة لتقييم تلف الحمض النووي، إلا أن تطبيقه العملي يتطلب دراسة دقيقة لعدة قيود تقنية ومعايير قابلية التطبيق المتعلقة بإدخال العينة. يتطلب البروتوكول تفككا إنزيميا شاملا لكنه لطيف للعضويات لإنتاج تعليق خلية واحدة عالي الصلاحية. كثافة البذور التي تتراوح بين 15,000–20,000 خلية أولية لسرطان الثدي لكل 100 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي (~200 خلية/1 ميكرولتر) تحافظ على الإشارات الباراكرينية بين الخلايا اللازمة لتكوين كرة قوية مع منع النخر المركزي الناتج عن فرط الكثافة واستنزاف المغذيات السريع. فيما يتعلق بالنافذة العلاجية، يتطلب هذا الاختبار معايرة دقيقة لتركيز DOX ومدة التعرض لمنع موت الخلايا المفرط (>20–30٪). التعرض للمخدرات فوق القاتلة يولد وفرة من مذنبات "القنفذ"، التي تخفي إشارات تلف الحمض النووي الحقيقية وتحير تفسير البيانات. فيما يتعلق بقيود الاختبار، فإن انخفاض معدل التدفق الطبيعي لاختبار المذنب القلوي القياسي يجعله غير كاف لفحص الأدوية عالي الإنتاجية. علاوة على ذلك، تتطلب هذه التقنية توحيدا صارما للإجراءات التجريبية — بما في ذلك استقرار الالتصاق بالجل، ومدة اللف القلوية، وتجانس الرحلان الكهربائي — حيث يمكن حتى الانحرافات التشغيلية الدقيقة أن تسبب أخطاء نظامية كبيرة.

في الختام، يؤسس هذا البروتوكول وحدات BCO البشرية ويظهر جدوى تطبيق اختبار المذنب لقياس تلف الحمض النووي الناتج عن DOX. بعد معالجة 8 ميكرومولار DOX لمواد BCO المكتملة المكتملة، تم تقييم تلف الحمض النووي باستخدام اختبار المذنب. يتيح هذا النهج تقييما مستقرا ومباشرا للتلف الناتج عن DOX في الحمض النووي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى سوتشو ووتشونغ الشعبي (رقم الموافقة 20251w03) وأجريت وفقا للمعايير الأخلاقية الطبية. قدم جميع المشاركين في هذا البحث موافقة مكتوبة مستنيرة.

1. بناء وحدات البناء البشرية

  1. نقل وتخزين أنسجة سرطان الثدي
    1. ضع فورا أنسجة سرطان الثدي البشرية المستأصلة حديثا في محلول حفظ الأنسجة المبرد مسبقا (4 درجات مئوية).
      ملاحظة: تأكد من بقاء الأنسجة مغمورة بالكامل أثناء النقل.
  2. التفكك الميكانيكي لأنسجة سرطان الثدي
    1. قم بجميع الإجراءات في خزانة السلامة البيولوجية. ضع نسيج سرطان الثدي في طبق زراعة بحجم 6 سم وقم بإزالة الأنسجة الدهنية الظاهرة باستخدام مشرط ومقطط معقم.
    2. أضف 3 مل من PBS إلى طبق الزراعة بحجم 6 سم واغسل المنديل ثلاث مرات.
    3. استنشاق وتخلص من محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS).
    4. كرر الخطوات 1.2.2 و1.2.3 مرتين إضافيتين.
    5. انقل نسيج سرطان الثدي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل باستخدام مقص جراحي معقم وقطع النسيج إلى شظايا صغيرة بحجم حوالي 2 × 5 مم.
  3. الهضم الإنزيمي لأنسجة سرطان الثدي
    1. أضف 1 مل من محلول التفكك العضوي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
    2. أضف 8 مل إضافية من محلول تفكك العضوية إلى أنبوب الطرد المركزي بسعة 15 مل.
    3. حضن أنبوب الطرد المركزي بسعة 15 مل على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    4. حرك الأنبوب على جهاز الهضم لمدة دقيقة واحدة كل 10 دقائق أثناء الهضم.
    5. بعد 40 دقيقة، أضف 6 مل من PBS إلى أنبوب الطرد المركزي بسعة 15 مل لإنهاء الهضم.
      ملاحظة: أضف PBS مباشرة إلى خليط الهضم لإيقاف النشاط الإنزيمي.
  4. عزل خلايا أورام الثدي الأولية ودمج الأعضاء
    1. ضع مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل.
    2. أضف 1 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل إلى مصفاة الخلية.
      ملاحظة: جهز وسط زراعة الخلايا بالكامل باستخدام 500 مل من الوسط القاعدي، و50 مل من مصل البقر الجنيني، و5 مل من البنسلين-ستريبتومايسين.
    3. استنشق 1 مل من تعليق الأنسجة المهضوم من أنبوب الطرد المركزي بسعة 15 مل ووضعه على مصفاة الخلية.
    4. كرر الخطوة 1.4.3 حتى يمر نظام التعليق بالكامل عبر المصفاة.
    5. اشطف مصفاة الخلايا بمقدار 1 مل إضافي من وسط زراعة الخلايا الكامل.
    6. قم بطرد المركزي بأنبوب الطرد المركزي بسعة 50 مل عند 350 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
    8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    9. قم بعمل نظام الطرد المركزي في نظام التعليق عند 370 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    10. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
    11. أضف 100 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل وامزجه جيدا.
      ملاحظة: حافظ على كثافة بذور تتراوح بين 15,000–20,000 خلية أولية لسرطان الثدي لكل 100 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي (200 خلية/1 ميكرولتر). هذا يحافظ على الإشارات الباراكرينية بين الخلايا لتكوين كرة قوية ويمنع النخر المركزي.
    12. يتم توزيع 25 ميكرولتر من خليط المصفوفة-الخلية في الغشاء القاعدي في كل بئر من صفيحة مكونة من 24 بئرا.
    13. اقلب صفيحة 24 بئر وحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح ببلمرة مصفوفة الغشاء القاعدي.
    14. أضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة BCO إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا.
      ملاحظة: تستخدم BCOs الزراعة باستخدام وسط جاهز تجاري بتركيبة خاصة.
    15. حضن اللوحة في حاضنة رطبة عند 37°C مع 5٪ CO₂.
      ملاحظة: بعد التلقيح في المصفوفة خارج الخلية، تم زراعة BCOs لمدة 7–10 أيام للسماح بتطور هيكلي ثلاثي الأبعاد بشكل صحيح. اعتبرت العضويات مستقرة بالكامل وجاهزة للعلاج الدوائي عندما أظهرت أشكال ثلاثية الأبعاد كثيفة وكروية وبلغت قطرها المتوسط حوالي 50–100 ميكرومتر، دون علامات نخر مركزي. بمجرد استيفاء هذه المعايير النهائية، تم علاج BCOs لاحقا ب DOX.

2. الكشف عن تلف الحمض النووي الناتج عن DOX في وحدات التحليل الهوائية باستخدام اختبار المذنب

تم تكييف البروتوكول التجريبي من إرشادات محددة وتم تحسينه أكثر ليتناسب مع ظروف مختبرية محددة14.

تحذير: نفذ جميع إجراءات مناولة DOX—بما في ذلك وزن المسحوق الجاف، تحضير محلول المخزون، والتخفيف المتسلسل للمحاليل العاملة—حصريا داخل خزانة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية معتمدة أو غطاء أبخرة كيميائي. تجنب تماما أي تلاعب على مقاعد المختبر المفتوحة. ارتد قفازات نيتريل مزدوجة الطبقات واحمي الدواء من الضوء طوال جميع الإجراءات. وأخيرا، فصل جميع المواد الاستهلاكية الملوثة ب DOX (مثل رؤوس الماصات وأنابيب الطرد المركزي الدقيق) فقط ك 'نفايات سامة خلويا' للتخلص المتخصص؛ لا تخلط هذه العناصر مع النفايات البيولوجية الخطرة بشكل روتيني.

  1. معالجة DOX لمواد BCOs
    1. استنشق وتخلص من وسيط الثقافة المستهلكة.
    2. أضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة BCOs الطازج إلى كل بئر
    3. قم بإزالة 4 ميكرولتر من الوسط من كل بئر وتخلص منه
    4. أضف 4 ميكرولتر من محلول DOX بقوة 1 ملليمولار إلى كل بئر.
      ملاحظة: لتحديد تركيز العمل النهائي 8 ميكرومتر، حدد حجم المخزون المطلوب باستخدام معادلة التخفيف القياسية: C1V1 = C2V2. حيث يمثل C1 تركيز مخزون DOX الأولي (1 mM)، وC2 هو التركيز المستهدف (8 ميكرومتر)، وV2 هو حجم البئر النهائي (500 ميكرولتر). حل V1 يعطي 4 ميكرولتر. وبالتالي، يتطلب البروتوكول إضافة 4 ميكرولتر من مخزون DOX بحجم 1 ملليمول إلى ال 496 ميكرولتر المتبقي من وسط الزراعة في كل بئر، ثم الخلط جيدا لضمان توزيع متجانس.
    5. حضن الصفيحة في حاضنة بزاوية 37°C مع 5٪ CO₂ لمدة ساعتين.
  2. تفكك وحدات التأمين البريطانية
    1. استنشق وتخلص من وسط زراعة BCO من صفيحة 24 بئرا.
    2. أضف 500 ميكرولتر من محلول تفكك العضوية إلى كل بئر.
    3. قم بعمل مقطع للأعلى والأسفل مرارا وتكرارا لتعطيل مصفوفة الغشاء القاعدي والهياكل العضوية بالكامل.
    4. حضن الصفيحة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقائق.
    5. نقل 500 ميكرولتر من التعليق الناتج من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
    6. قم بعمل جهاز الطرد المركزي في نظام التعليق عند 350 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
    8. أضف 1 مل من وسط الزراعة الكامل إلى أنبوب الطرد المركزي بسعة 15 مل لإعادة تعليق حبيبة الخلية ثم نقل التعليق الناتج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    9. قم بعمل جهاز الطرد المركزي في نظام التعليق عند 350 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    10. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي، تبقى الحبيبات العضوية في أنبوب الطرد المركزي.
  3. إعادة تعليق الخلايا وتضمين الأغاروز
    1. سخن كتلة التسخين المعدنية إلى 95 درجة مئوية.
    2. ضع 1 مل من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار (LMP) في كتلة تسخين معدنية وحضن لمدة 10 دقائق لضمان الذوبان الكامل.
    3. بيبت 100 ميكرولتر من الأغاروز المنصهر المنصهر 0.5٪ منخفض في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على BCOs.
    4. انقل العينات فورا إلى حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واتركها تتوازن لمدة 10 دقائق.
    5. اخلط جيدا وفورا 50 ميكرولتر من تعليق الخلية-الأغاروز على شريحة مجهرية.
  4. تحلل الخلايا وفك الحمض النووي
    1. اغمر الشرائح في محلول تحلل بارد وحضن عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 12 ساعة.
    2. قم بإزالة الشرائح من محلول التحلل وغمرها فورا في محلول اللف القلوي.
      ملاحظة: لتحضير محلول اللف القلوي، قم بإذابة 0.6 جرام من NaOH في 4.975 مل من الماء فائق النقي، ثم أضف 250 ميكرولتر من 200 ملليمتر EDTA. لتحضير مخزن الرحلان الكهربائي القلوي، قم بإذابة 12 جرام من NaOH في 995 مل من الماء فائق النقي، ثم أضف 5 مل من 200 ملليمول EDTA.
      تحذير: NaOH في عازل اختبار المذنب هو قاعدة قوية شديدة التآكل قادرة على التسبب في حروق جلدية وعينية شديدة. أثناء تحضير المحلول، أضف حبيبات NaOH الصلبة إلى الماء ببطء وتدريجي وتحت تحريك مغناطيسي مستمر. لا تصب الماء مباشرة على الحبيبات الجافة، لأن التفاعل العنيف للحرارة يمكن أن يسبب غليان السائل الكاوي وتناثره. علاوة على ذلك، استخدم كل المسحوق الجاف الذي يوزن حصريا داخل غطاء أبخرة كيميائي لمنع استنشاق الغبار المسبب للتآكل.
    3. اغمر الشرائح في محلول التحليل وحضن الشرائح عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة.
  5. الرحلان الكهربائي
    1. انقل الشرائح من محلول اللف القلوي إلى غرفة الرحلان الكهربائي.
    2. أضف 1 لتر من مخزن الرحلان الكهربائي القلوي إلى خزان الرحلان الكهربائي لضمان الغمر الكامل للشرائح.
    3. قم بالرحلان الكهربائي عند 25 فولت و300 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة.
  6. غسل وتثبيت الشرائح
    1. اغمر الشرائح في 5 مل من الإيثانول 70٪ وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يشكل الإيثانول خطرا شديدا على الاشتعال. عند إجراء تحضيرات كبيرة الحجم أو تجفيف الأنسجة، حافظ على تهوية قوية في بيئة التجربة. عزل منطقة التشغيل بشكل صارم عن جميع مصادر الإشعال، بما في ذلك اللهب المفتوح (مثل موقد الكحول) والشرر الكهروستاتيكي. بعد الاستخدام، قم بإغلاق حاويات المواد الكيميائية فورا وتثبيتها داخل خزانة تخزين مقاومة للانفجار وقابلة للاشتعال.
    2. ضع الشرائح في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واتركها تجف لمدة 15 دقيقة.
  7. تلوين الحمض النووي والتصوير
    1. أضف 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت بالحمض النووي إلى 10 مل من الماء فائق النقي.
      تحذير: عامل هذه العوامل المداخلة للأحماض النووية كطفرات محتملة والتعامل معها باحتياطات صارمة. لمنع التلوث المتبادل في أماكن العمل الروتينية، أنشئ منطقة تلوين مخصصة لحمض النووي مزودة بماصات مخصصة. إذا كنت تستضيف صبغات الأجاروز المنصهرة، دع الجل يبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية قبل إضافته لمنع استنشاق الأبخرة الخطرة والصبغية. وأخيرا، تخلص من جميع محاليل التلوين المستهلكة وجل النفايات في حاويات مخصصة لخطر الأحماض النووية.
    2. اغمر الشرائح في محلول التلوين المعد في الخطوة 2.7.1 وحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    3. قم بغسل واحد لمدة 5 دقائق بماء فائق النقاء بسعة 5 مل.
    4. جفف الشرائح في الهواء لمدة 15 دقيقة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    5. تصور هياكل المذنبات باستخدام مجهر فلوري مع مرشح إثارة أخضر واكتشاف التألق الأحمر.

3. معالجة البيانات

  1. إجراء تحليل كمي آلي لصور اختبار المذنبات باستخدام إضافة OpenComet في فيجي (التوزيع الرسمي) للحصول على معلمات متعلقة بتلف الحمض النووي.
    ملاحظة: فيما يتعلق بالتحليل الإحصائي، شمل هذا العمل فقط المذنبات عالية الدقة وواضحة الصور التي تظهر شكلا سليما دون تداخل. وعلى العكس، استبعد بروتوكول الفحص مذنبات 'القنفذ' أو 'الشبح' (التي تظهر رأسها مصغرا وذيلا واسعا، مما يشير إلى موت المبرمج أو النخر الشديد)، بالإضافة إلى الصور ذات الحواف الضبابية، أو تجمع الخلايا، أو الشوائب الخلفية.
    1. افتح برنامج فيجي (الشكل الإضافي 1A).
    2. انقر على الإضافات في شريط القائمة (الشكل الإضافي 1A).
    3. اختر OpenComet (الشكل الإضافي 1B).
    4. انقر على تصفح تحت ملفات الإدخال واختر صور اختبار المذنب للتحليل (الشكل التكميلي 1C).
    5. انقر على تصفح تحت دليل الإخراج وحدد مجلد الوجهة لملفات الإخراج (الشكل التكميلي 1C).
    6. انقر على الجري لبدء التحليل الآلي (الشكل التكميلي 1C). تختتم هذه الخطوة سير عمل معالجة البيانات وتحليلها.
      ملاحظة: لكل مجموعة تجريبية، قامت هذه الدراسة بقياس نسبة الحمض النووي للذيل (٪DNA الذيل) من اختيار عشوائي لا يقل عن 50 خلية. استخدم التحليل الإحصائي اللاحق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لمقارنة متوسطات المجموعات، حيث اعتبر p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تأسيس منظمات التأمين البريطاني

نجحت هذه الدراسة في إثبات عضويات سرطان الثدي من عينات الأنسجة الورمية الأولية. في المرحلة الأولى من الزراعة، لوحظ عدد كبير من الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا الصغيرة بوضوح، مع توزع الخلايا بطريقة متفرقة نسبيا وتفتقر إلى تنظيم كروي ثلاثي الأبعاد واضح. أظهرت بعض الخلايا أشكال دائرية أو قريبة من الدائرة، مما يشير إلى أن الخلايا المشتقة من الأورام نجت وتكيفت مع المصفوفة خارج الخلية لكنها لم تؤسس بعد هياكل عضوية مس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمثل اختبار المذنب تقدما كبيرا في طرق تقييم السمية الجينية. نظرا لدقتها في خلية واحدة والتصور المباشر لأنماط تلف الحمض النووي بناء على الهجرة الكهروفوريتية، تقدم هذه التقنية مزايا واضحة مقارنة باختبارات السمية الجينية التقليدية15.

تؤثر عدة خطوات حاسمة خلال العملية التجريبية على قابلية التكرار وتفسير البيانات. أولا، يجب أن تظل ظروف التحلل ومدة التحلل متسقة لتقليل التغير بين الدفعات. عند التعامل مع خلايا سرطان الثدي الأولية، يجب على الباح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه الدراسة مشروع مركز أبحاث الهندسة في مقاطعة جيانغسو للعلاج الجزيئي المستهدف والتشخيص المرافق في الأورام (SGK2202319)، وفريق البحث المبتكر في مؤسسة جيانغسو للتعليم العالي في مجال العلوم والتكنولوجيا (2021)، وبرنامج مركز أبحاث التكنولوجيا الهندسية في كلية جيانغسو المهنية (2023)، والمؤسسة الرئيسية للعلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين (منحة رقم 24KJA310008)، البرامج الرئيسية لكلية الصحة المهنية في سوتشو (szwzy202406)، مشروع مختبر الدولة الرئيسي لطب الإشعاع والحماية، جامعة سوتشو (رقم GZK1202506)، وبرنامج المواهب الصحية في دونغوو (DWWS2024002، DWWS2025009، DWWS2025013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO culture medium
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTComplete cell culture medium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Water bath
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistical analysis software
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pImage processing software / image
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Low-melting-point agarose 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrifuge
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Lysis solution
MatrigelMogenel Biotechnology82755The basement membrane matrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid dissociation solution

المراجع

  1. Xiong X, Zheng LW, Ding Y, Chen YF, Cai YW, Wang LP, et al. Breast cancer: pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  2. Giaquinto AN, Sung H, Newman LA, Freedman RA, Smith RA, Star J, et al. Breast cancer statistics 2024. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2024;74(6):477-95.
  3. Kciuk M, Gielecińska A, Mujwar S, Kołat D, Kałuzińska-Kołat Ż, Celik I, et al. Doxorubicin—An Agent with Multiple Mechanisms of Anticancer Activity. Cells. 2023;12(4):659.
  4. Glibetic N, Bowman S, Skaggs T, Weichhaus M. The Use of Patient-Derived Organoids in the Study of Molecular Metabolic Adaptation in Breast Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(19):10503.
  5. Leung D, Kaur J, Richardson G, Jardé T. Breast cancer organoids: Advancements and applications in precision medicine. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2025;214:104914.
  6. Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature. 2016;534(7605):47-54.
  7. Hua Z, White J, Zhou J. Cancer stem cells in TNBC. Semin Cancer Biol. 2022;82:26-34.
  8. Neal JT, Li X, Zhu J, Giangarra V, Grzeskowiak CL, Ju J, et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  9. He X, Chen F, Zhou L, Sun Y, Liu Q, Chen W, et al. The comet assay: A contemporary approach for detecting genomic instability. DNA Repair (Amst). 2025;154:103899.
  10. Ladeira C, Moller P, Giovannelli L, Gajski G, Haveric A, Bankoglu EE, et al. The Comet Assay as a Tool in Human Biomonitoring Studies of Environmental and Occupational Exposure to Chemicals-A Systematic Scoping Review. Toxics. 2024;12(4):270.
  11. Moller P, Gajski G, Geric M, Giovannelli L, Azqueta A, Haveric A, et al. The comet assay as a tool in human biomonitoring studies: Effects of confounding factors. Mutat Res Rev Mutat Res. 2025;796:108566.
  12. Collins A, Moller P, Gajski G, Vodenkova S, Abdulwahed A, Anderson D, et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: a compendium of protocols. Nat Protoc. 2023;18(3):929-89.
  13. Caipa Garcia AL, Phillips DH. Organoids for Genotoxicity Assessment. Methods Mol Biol. 2026;2986:491-510.
  14. Cardoso R, Dusinska M, Collins A, et al. In vivo mammalian alkaline comet assay: method adapted for genotoxicity assessment of nanomaterials. Front Toxicol. 2022;4:903896.
  15. Kyrylenko S, Chorna I, Klishchova Z, Yanko I, Roshchupkin A, Deineka V, et al. Elucidation of Potential Genotoxicity of MXenes Using a DNA Comet Assay. ACS Applied Bio Materials. 2024;7(12):8351-66.
  16. Rodrigues D, Coyle L, Fuzi B, Ferreira S, Jo H, Herpers B, et al. Unravelling Mechanisms of Doxorubicin-Induced Toxicity in 3D Human Intestinal Organoids. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1286.
  17. Bankoglu EE, Schuele C, Stopper H. Cell survival after DNA damage in the comet assay. Arch Toxicol. 2021;95(12):3803-13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233

مقالات ذات صلة