التصوير الكمي للخلية الحية لشكل النواة وديناميكيات الكروماتين أثناء التطور والإجهاد البيئي في جذر الأرابيدوبسيس ثاليانا

Summary

تستخدم هذه العملية المجهر الكونفوكلي بالتزامن مع نواة فلورية وخط علامة كروماتين في الأرابيدوبسيس ثاليانا لتسجيل ديناميكيات النواة والكروماتين في جذور الأرابيدوبسيس ودراسة التغيرات في هذه الديناميكيات استجابة للإشارات التطورية والبيئية.

Abstract

النواة هي العضية المميزة للكائنات حقيقية النواة. على عكس النظرة الكلاسيكية للنوى الساكنة، فإن شكل النواة ديناميكي في الخلايا الحية. الشكل النووي المتغير أو المشوه هو سمة مميزة للسرطان في خلايا الحيوانات والإجهاد البيئي في النباتات. تتفاعل بروتينات الغلاف النووي مع الكروماتين لتنظيم تعبير الجينات. للأسف، لا يعرف الكثير عن تأثير الإجهاد اللاأحيائي على شكل النواة، والحركة، وديناميكيات الكروماتين. لمواجهة هذه المشكلة، طورنا خط أنابيب باستخدام المجهر الكونفوكلي وبرنامج تتبع الجسيمات لقياس ديناميكيات النوى والكروماتين في جذور الأرابيدوبسيس تحت السيطرة وحالة الإجهاد اللاحيوي. تستخدم هذه الطريقة التصوير الكونفوكلي خط علامة مزدوج مميز بالفلورية – بروتين الغلاف النووي والكروماتين – لإجراء تصوير الخلايا الحية للجذر في النبات النموذجي أرابيدوبسيس ثاليانا تحت ظروف محكومة وإجهاد مملحي. يتم تحليل هذه الأفلام الملتقطة لقياس ديناميكيات النووي والكروماتين باستخدام برنامج معالجة الصور مفتوح المصدر Fiji/ImageJ بمساعدة إضافة TrackMate. للتحقق من صحة هذه الطريقة، قمنا بتصوير وقياس حركة الكروماتين في الجذور المسيطرة والملحية، مما كشف عن انخفاض في سرعة الكروماتين تحت ظروف الإجهاد الملحي. تسمح هذه الطريقة بتصوير الخلايا الحية الكمي لشكل نواة الجذور وديناميكيات الكروماتين أثناء تطور النبات والإجهاد البيئي، مما يمكن من تحليل التغيرات في ديناميكيات النوى والكروماتين الناتجة عن الضغوط اللاحيوية.

Introduction

شكل النواة يختلف بين أنواع الخلايا المختلفة وأثناء التطور في جذور الأرابيدوبسيس ثاليانا ^1,2. على سبيل المثال، الشكل النووي كروي في المناطق العظمى النشطة القسمة. على عكس المنطقة المريستيمية، فإن النوى في منطقة انتقال الجذور ومنطقة التمدد أقل كروية. علاوة على ذلك، تمر النوى في الخلايا المتمايزة، مثل شعيرات الجذور، عبر قاعدة شعر الجذر المشدودة وتتحول بنشاط إلى نوى ممدودة ^3,4,5. التغيرات الديناميكية في شكل وحركة النواة ضرورية لعمل الخلية ^6,7. تؤدي عيوب في شكل النواة إلى ضعف وظيفي مثل انخفاض حركة النواة ^1,3. في الخلايا الثديية، ترتبط التغيرات في شكل الخلية والنواة مباشرة بتغيرات في التعبير الجيني وتخليق البروتين⁸.

خلال الطور التداخلي، يتم تنظيم الحمض النووي للخلية على شكل كروماتين. الحمض النووي في الكروماتين مجمع حول الهيستونات، مما يمكنه شد وتخفيف الحمض النووي لتغيير التعبير. وبالمثل، فإن تموضع الكروماتين بالنسبة للغلاف النووي والقرب من المحيط النووي مهم أيضا لتعبير الجينات⁹. الإجهاد البيئي، مثل الإجهاد الأسموزي، يغير شكل النواة وبالتالي يغير تعبير مجموعة من الجينات الحساسة للمس في جذور A. thaliana ¹⁰. في هذا السياق، يعد من المهم دراسة شكل النواة وديناميكا الكروماتين من خلال تصوير التايم لابس الحي للخلايا. أحد الجوانب الرئيسية في ديناميكا النواة هو سرعة حركة النوى، حيث أن التموضع النووي داخل الخلية يحفز التعبير الجيني، وإعادة تموضع النواة تتطلب حركة نووية¹¹. سرعة حركة الكروماتين داخل النواة مهمة أيضا، حيث أن تموضع الجينات داخل النواة أمر حاسم لتحديد تعبير الجينات¹².

سابقا، كان شكل النواة وديناميكا الكروماتين يتم تصويرهما وقياسهما بشكل منفصل؛ ونتيجة لذلك، بقيت العلاقة بين الشكل النووي وديناميكيات الكروماتين غير مستكشفة. من خلال تصوير النوى والكروماتين في نفس الوقت، يمكن ملاحظة مواقعهما بالنسبة لبعضهما البعض، مما قد يكشف عن حركات مثل دوران النواة وحركة الكروماتين داخل النواة التي يصعب أو يستحيل إثباتها بخلاف ذلك. في هذه الطريقة، نقدم تقنية تصوير خلية حية لتصوير وقياس شكل النواة عبر بروتين الغلاف النووي الخارجي الموسوم بالفلورية WPP تفاعل المجال 1 (WIP1)¹³ والكروماتين عبر ديناميكيات هيستون مركزي H3 (CENH3)¹⁴ في نفس الوقت تحت ظروف الإجهاد المتحكم والملح، بهدف تمكين تحليل التغيرات في ديناميكيات النوى والكروماتين الناتجة عن الضغوط اللاحيوية. لتمكين هذه الطريقة، قمنا بإنشاء خط WIP1-GFP/CENH3-mRFP من A. thaliana. بالإضافة إلى ذلك، درسنا ديناميكيات الكروماتين بطريقة كمية باستخدام إضافة TrackMate في برنامج ImageJ/Fiji مفتوح المصدر. اختبرنا تقنيات ديناميكية خط فلورية مزدوج وديناميكا كروماتين معروضة هنا تحت ظروف إجهاد الملح واكتشفنا تغيرا في شكل وديناميكيات البؤر المركزية بسبب ظروف الإجهاد. هذه الطريقة البسيطة والقابلة للتكرار مثالية لتتبع ديناميكيات النوى والكروماتين عالية الإنتاجية في جذور الأرابيدوبسيس تحت ظروف إجهاد غير حيوية مختلفة.

Protocol

1. نمو شتلات A. thaliana

1. تحضير وسائط النمو
   1. ضع 800 مل من الماء النقي في كأس سعة 1 لتر على طبق تحريك. أضف قضيب تحريك إلى الكأس.
   2. شغل طبق التحريك عند 600 دورة في الدقيقة.
   3. أضف 10 جرام من السكروز إلى الكأس.
   4. أضف 2.16 جرام من وسط نمو موراشيغي وسكوغ (MS) إلى الكأس.
   5. أضف 5 ملغ من الأجار إلى كل من زجاجتين بسعة 1 لتر ميديا.
   6. ضع علامة على إحدى الزجاجات ب "1/2 MS" وعلى الأخرى ب "100 mM NaCl".
   7. ضع ملصقات على غطاءي الزجاجات بشريط أوتوكلاف.
   8. أضف 5.84 جرام من NaCl إلى الزجاجة الموسومة ب "100 ملليمويل NaCl".
   9. املأ الكأس ب 1 لتر من الماء النقي.
   10. أعد الكأس إلى طبق التحريك وانتظر حتى يذوب السكروز والميكروفون.
   11. اسكب محتويات الكأس في أسطوانة متدرجة بسعة 1 لتر.
   12. صب 500 مل من محتويات الأسطوانة المتدرجة في كل زجاجة.
   13. وسط نمو الأوتوكلاف ومياه نقية بسعة 250 مل مع دورة سائلة لمدة 60 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
       ملاحظة: عند استخدام الأوتوكلاف والماء، تأكد من أن الأغطية مرتخية لتجنب الانفجارات المحتملة.
   14. أعد تثبيت أغطية وسائط النمو.
   15. قم بقلب زجاجات وسائط النمو 7 مرات لضمان توزيع الأجار بشكل كامل.
   16. خزن وسط النمو في ثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الحاجة، ثم اغسل الميكروويف ليصبح سائلا.
2. تثبيت صفائح النمو والبذور
   1. في غطاء التدفق، استخدم مسدس ماصات لوضع 50 مل من وسط النمو في كل من عشرة ألواح (الشكل 1A).
   2. أثناء تصلب الوسط، نظف بذور WIP1-GFP x CENH3-mRFP عن طريق غضبها في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1 مل من الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقائق (الشكل 1B).
      ملاحظة: عند التعامل مع الإيثانول، تأكد من عدم وجود لهب مفتوح في المنطقة.
   3. بعد 10 دقائق، في غطاء التدفق، أزل الإيثانول وشطف البذور مرتين بمقدار 1 مل من الماء المعقم (الشكل 1C).
   4. بعد تثبيت الوسط، استخدم ماصة بسعة 1000 ميكرولتر لوضع البذور النظيفة على ألواح النمو في صفين من 14 بذرة لكل طبق (الشكل 1D).
   5. ضع علامة دائمة على الألواح وأغلقها بشريط ميكروبور قبل مغادرة غطاء التدفق (الشكل 1E).
3. الشتلات المنبت
   1. لف ألواح النمو بورق الألمنيوم وقم بتسميتها على البرودة في ثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن يومين (الشكل 1F).
   2. بعد الطبقات الباردة، أزل الألواح من الثلاجة واتركها عموديا تحت أضواء النمو (~80 ميكرومول/م²/ث) لمدة لا تقل عن 4 أيام (الشكل 1G).
   3. انقل نصف الألواح إلى وسط نمو NaCl بقوة 100 ملليمتر في غطاء التدفق، ثم أغلق وتضع علامات على الألواح (الشكل 1H).
   4. انمو الصفائح تحت أضواء النمو لمدة يومين قبل التصوير (الشكل 1I).

2. تصوير الخلايا الحية لنوى جذر A. thaliana والكروماتين

1. تحضير الشرائح
   1. بيبت 60 ميكرولتر من الماء النقي على شريحة زجاجية (الشكل 2A).
   2. ضع 3 جذور شتلة من A. thaliana عمرها 6 أيام في الماء (الشكل 2B).
   3. ضع غطاء منزلق بمقاس 22 مم × 22 مم #1.5 فوق الجذور دون تغطية الأوراق (الشكل 2C).
2. إعدادات المجهر الكونفوكالي
   1. اضبط وقت التعرض للليزر على 1000 مللي ثانية (1 ثانية).
   2. في جهاز دمج الليزر، اضبط ليزر 488 نانومتر على 50٪ للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) و561 نانومتر على 50٪ للبروتين الفلوري الأحمر (RFP) (الشكل 2D). صورة بعدسة 20× موضوعية بدون تكبير بصري. إذا كنت تسجل لأكثر من 10 دقائق، قلل من الشدة لتقليل التبييض الضوئي.
   3. اضبط حجم خطوة شريحة Z إلى 0.3 ميكرومتر.
   4. اضبط الفترة إلى دقيقة واحدة ومدة الكلية إلى 10 دقائق.
3. التصوير
   1. حدد موقع الجذور واختر حتى 20 شريحة z-slice والتقط صورا بحجم 16-بت.
   2. ابدأ التايم لابس.
   3. احفظ التايم لابس كملف TIFF باستخدام ضغط بدون فقدان.
   4. انقل البيانات إلى الكمبيوتر للتحليل.

3. تتبع وتحليل البيانات

ملاحظة: سيحتاج أحدهم إلى نسخة فيجي من برنامج ImageJ مفتوح المصدر (الإصدار 1.54 الموصى به)، والذي يأتي مع TrackMate مثبت مسبقا.

1. التهيئة
   1. افتح صورة J/فيجي.
   2. انقر واسحب ملف .vsi إلى نافذة التطبيق الرئيسية ImageJ/Fiji (الشكل 3A).
   3. سيظهر طلب بعنوان خيارات استيراد الصيغ الحيوية ؛ انقر حسنا في أسفل اليمين (الشكل 3B).
   4. سيظهر طلب بعنوان خيارات سلسلة الصيغ الحيوية . تأكد من اختيار السلسلة 1 وانقر على موافق في أسفل اليسار (الشكل 3C).
      ملاحظة: قد يستغرق تحميل الملف دقيقة واحدة، خاصة إذا كان يحتوي على العديد من طبقات Z أو نقاط الزمن.
   5. بمجرد فتح الصورة (الشكل 3D)، قسم الإشارات عن طريق التنقل عبر نافذة ImageJ الرئيسية إلى Image > اللون > تقسيم القنوات (الشكل 3E). سيخلق ذلك نافذتين منفصلتين، واحدة للنوى الموسومة ب GFP وأخرى للكروماتين الموسوم ب RFP (الشكل 3F).
2. المعالجة المبدئية للكروماتين
   1. حدد أي من النافذتين يتوافق مع الكروماتين.
   2. انقر على نافذة الكروماتين (الشكل 3F) وطبق عملية مشروع Z عن طريق التنقل في نافذة ImageJ الرئيسية إلى مكدسات > الصورة > مشروع Z (الشكل 4A).
   3. غير نوع الإسقاط إلى أقصى شدة وتأكد من تفعيل All Time Frames ، ثم اضغط على موافق (الشكل 4B).
   4. افتح قائمة التباين بالضغط على Ctrl+Shift+C أو التنقل في نافذة ImageJ الرئيسية لضبط الصورة > ضبط > السطوع/التباين (الشكل 4C).
   5. حرك الشريط الثاني (المسمى Maximum) إلى اليسار حتى يصبح الكروماتين مرئيا بسهولة (الشكل 4D).
3. تتبع الكروماتين
   1. انتقل إلى الإضافات (الشكل 5A).
   2. انقر على السهم الأسفل في قائمة الإضافات للتمرير إلى خيار التتبع (الشكل 5A).
   3. انقر على التتبع، ثم TrackMate.
   4. ستظهر الإعدادات الأولية. تأكد من دقة إعدادات المعايرة، ثم اضغط التالي (الشكل 5B).
   5. اختر كاشف العتبة واضغط التالي (الشكل 5C).
   6. في نافذة الصورة، انتقل إلى الإطار الأخير من التايم لابس (الشكل 5D).
   7. بجانب عتبة الشدة، اضغط على تلقائي، ثم اضغط المعاينة.
   8. اضبط عتبة الشدة واضغط على معاينة. قم بضبط العتبة ومعاينتها مرارا حتى يشمل المعاينة كل الكروماتين ويحتوي على ضوضاء قليلة، ثم اضغط التالي (الشكل 5D).
   9. سيتم اكتشاف العتبات الأولية؛ انقر التالي (الشكل 5E).
   10. قم بضبط العتبة يدويا حتى يظهر الكروماتين فقط، ثم اضغط التالي (الشكل 5F).
   11. تسمح هذه الصفحة بتصفية النقاط. تجاهل هذا واضغط التالي (الشكل 6A).
   12. اختر متتبع LAP البسيط واضغط التالي (الشكل 6B). يكون متتبع LAP قابلا للتطبيق عندما لا تندمج أو تنقسم الأجسام المتتبعة.
   13. اضبط أقصى مسافة ربط إلى 5 ميكرون، وأقصى مسافة إغلاق الفجوات إلى 15 ميكرون، وأقصى فجوة إطار عند إغلاق الفجوات إلى 1. انقر التالي (الشكل 6C).
   14. سيتم التتبع. ستظهر المسارات في نافذة الصورة الأصلية. انقر التالي (الشكل 6D).
   15. تسمح هذه الصفحة بتصفية المسارات. اضغط على زر + الأخضر في أسفل اليسار لإنشاء فلتر، ثم اختر عدد الأماكن في وضع المسار واضغط على التلقائي (الشكل 6E).
   16. تأكد من أن الوضع مضبوط على الأعلى. هذا سيقضي على البقع التي تظهر وتختفي بسرعة.
   17. انقر التالي (الشكل 6E).
   18. تسمح صفحة خيارات العرض بتصدير البيانات كملف csv. في أسفل الصفحة، اضغط على زر المسارات ، ثم التصدير إلى CSV (الشكل 7A).
   19. تسمح هذه الصفحة برسم الرسم المدمج؛ تجاهله واضغط على التالي.
   20. في الصفحة الأخيرة، احفظ الفيديو باستخدام Capture Overlay واضغط على التنفيذ. انقر عليه، ثم انتقل إلى الملف > احفظ كصورة GIF > (الشكل 7B).
4. تحليل السرعة الأساسي
   1. افتح CSV المسارات في برنامج جداول بيانات.
   2. احذف جميع الأعمدة ما عدا TRACK_ID، POSITION_X، POSITION_Y، POSITION_T، FRAME، وRADIUS.
   3. الأماكن في كل مسار ستكون غير مرتبة. لترتيبها، أولا قم بتجميد الصفوف الأربعة العليا ثم أنشئ عمودا جديدا بعنوان TRACK_FRAME وانسخ والصق هذه الصيغة في العمود: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. اختر عمود TRACK_FRAME ، انقر عليه بزر الفأرة الأيمن، ثم اضغط على ترتيب ورقة الفرز من أ إلى ياء. يجب أن تكون الأماكن داخل كل مسار الآن مرتبة.
   5. للتأكد من عدم وجود أماكن مفقودة في منتصف أي مسارات، أنشئ عمودا جديدا واستخدم هذه الصيغة: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). تأكد من أن أول مكان في كل مسار يعيد "NA" والباقي 1.
   6. أنشئ عمودا للسرعة (ميكرون/إطار) والصق الصيغة التالية فيه: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). سيستخدم هذا مبرهنة فيثاغورس لحساب المسافة بين نقطتين.
   7. لترجمة ذلك إلى السرعة (ميكرون/ثانية)، أنشئ عمودا جديدا والصق الصيغة التالية فيه: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). هذا سيحدد الثواني والإطار ويترجم الميكرونات إلى الإطار وفقا لذلك.

Results

تصوير الخلايا الحية للغلاف النووي وديناميكيات الكروماتين
أنشأنا خط علامات فلورية مزدوجة، يشمل بروتين الغلاف النووي الخارجي WIP1-GFP والكروماتين المركزي CENH3-mRFP (الشكل 8). تم نقل الشتلات التي عمرها 4 أيام إلى صفيحة التحكم أو الصفائح التي تحتوي على NaCl بوزن 100 ملليمتر لمدة يومين. بعد يومين من الحضانة، لوحظ تثبيط واضح لنمو الجذر عند معالجة الملح، كما تم الإبلاغ سابقا¹⁵. تم استخدام كل من الجذور الضابطة والمعالجة ب...

Discussion

الطريقة المعروضة هنا مثالية لتتبع ديناميكيات الكروماتين. مقارنة بطرق التصوير الخلوي الحية السابقة التي تحتوي على تصوير منفصل، يسمح التصوير المتزامن للنوى والكروماتين باستكشاف العلاقة بين ديناميكيات النوى والكروماتين. قد يكشف هذا عن حركات مثل دوران النوى وحركة الكروماتين داخل النواة يصعب إثباتها بخلاف ذلك.

كطريقة تصوير خلايا حية، من المهم جدا وجود خط فلوري مع إشارات ثابتة طوال العملية. إذا تسبب التبييض الضوئي في تعطيل الإشارات خلال فترة مرور الوقت، فيجب تقليل ق...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ وسائط موراشيغي وسكوغ (MS)	عالم بيولوجي	30630058
أشرطة 3M micropore	أمازون	A-1530-0
برنامج الاستحواذ	أوليمبوس/أوبينيتس	سيلسينز
أغار	عالم بيولوجي	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
غطاء الغطاء	جينيسي	29-116
شريحة زجاجية	جينيسي	29-101
الصورة/فيجي	مفتوح المصدر	https://imagej.net/software/fiji/downloads ؛
المجهر	أوليمبوس/أوبينيتس	IX83
كلوريد الصوديوم	فيشر ساينتيفك	BP358-212
قرص دوار	يوكوغاوا	CSU-W1
أطباق بتري مربعة	Simport	26-275
سكروز	عالم بيولوجي	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987